一种单链片段抗体-多肽融合蛋白及其应用的制作方法

专利名称：一种单链片段抗体-多肽融合蛋白及其应用的制作方法
-^单链片^:#多^!^白;^其应用絲领域本发明属于生物和医药4支术领域，M涉及一种单链片段抗l多lil虫合蛋白及其 应用。 背景牀Her2是乳腺癌恶化的标志。近年研究发现，约25-30%的乳腺癌病人的癌组织细胞 表达一种4^细胞生长因子受体2 (Human Epidermal Growth Factor Receptor 2， Her2 )， Her2蛋白是乳腺癌恶化的^^才射己。目前通过阻断Her2受体来治疗乳腺癌的途径主要有抗Her2单克隆抗体、酪氨齢敫 酶抑制剂和传统的反义基因方法等。其中，抗Her2单克隆抗体，如^^^Herceptin,通 过阻断受体蛋白起作用，但由于乳腺癌细月&Her2受体是在基因水平过量表达，而新的 Her2蛋白仍在源源不断iik^成并输ii^细月^！, 4卜充丧失的受体。而且鉴于心脏毒性 和过壽t^， ^N元的用量不可能无限制;^口大。另一方面，Hercq)tin只作用于Her2if争 膜蛋白的细月&陶分，其胞内部分的酪^t^J敫i^乃可被邻^^被阻断的M生长因子 受体激活来传导增殖信号。与酪#^1酶抑制剂^^主只针对 网络系统的某一环节， 而Her24言号i^可以通过旁i^途径传导。it"卜，酪氨敏敫酶抑制剂不能直才妇中制过量表 达的Her2基因，更不能彻^i也阻断Her2蛋白的合成。更重要的是，酪氨酸敫酶也是正 常细胞所必需，佳月勘卬制剂干扰了很多正常组织细胞的信号传导途径，引起多种毒 副作用。传统的反U因方法包4甜争异性的反XS核苷酸和核糖酶(ribozyme)均曾 用于抑制乳腺癌细月&Her2基因表达的实验研究。但是由于这些传统的^JC^因方法抑 制基因表达的岁i^较弱，因此不能满足临床应用的需求。Andrew Z. Fire和Craig C. Mello两位科学家于1998年报tt现了核糖核酸干扰(Ribonucleic Acid Interference, RNAi)现象，并于2006年获得诺贝尔医学奖。2001年， Tuchl等把长度约为19-234tt对、人工合成的外源性(Small Interfering RNA, siRNA)导 入哺享L动物细胞内，能诱导出特异i似中制互补序列基因表达的RNAi岁纽。与传统的抑 制基因表itX具^XS核苷酸和核糖酶tb4支，siRNA沉fl^因表达的效应^^虽大数十 倍至数百倍，期中制疾病基因治疗疾病的潜力"fc^大于传统的itt因工具。目前， RNAi应用的主要障碍在于如何在临床应用时^4争异的RNAi导入目标细月&l包浆内起作 用，特别是导入过量表达目标基因的肺瘤细胞内。针对肿瘤的把向治疗要求^4元癌药物il基因物质高效特异:^lr送到癌细胞内，需 ^^以下;i^^^f牛①胂瘤细月&4面表达特异性的^V受体，il些受体只在癌细 胞大量表达，而^jE常组织细JI^^^表絲表达极少；②受体与相应的配M抗体结合后可通过细胞内吞作用^目应的受体/抗体或受体/配基复^4勿导入细胞内；③ 细月^^vl^4勿后，可以通过细胞内的消化系统，如i^^等分离复^4勿，feS己M 抗体连4矣的药物#^^胞浆中。Her2受^^合上述輩巴向导入的前提条件，因为它只大量表达于癌细月包表面，在 正常组织细胞中表达甚少，这也A^细月^lr有恶'^4型的机制。另夕卜，Her2受粘 配絲抗体结合后，可通过细胞内吞作用循环到细胞内。研究证明，Her2受体/抗 体复^4辆皮吞入细月^，复^^会净紛离，如果复M同时结合了化疗药物tt因物 质，这些物质#^被吸收^#^文到胞浆中。因此，Her2抗体或配基携带的抗癌药物 只攻击Her2高表达的癌细胞，并飽侦利把药物带入细胞内。单链抗体片段(ScFv),是指通祖因重组技术，人工表达保留了与^^、特异性 结合的免疫球蛋白Fab片段中的简^p分，由一段重链和一段l^y且成，两链之间通 iiM多肽铰Mi^l妄。ScFv既保留了^^识别和结合的特性，又去除了"fit抗体中免 ^f、性最强的Fc段，同时其衬小，可以与荷正电的多肽重M^融M白，便于携 带基因物质。^f青蛋白是一种碱性蛋白，能与基因物质结合。我们^^I的A^f青蛋白多肽一段 短肽，它保留了富4^^性# 的序列，同样具有结合基因物质的功能。如果能筛选并构建出这样一种物质，即既能应有于导向携带siRNA双链分子， 又可特异I^4^^Her2阳性癌细胞，ii^减少细月汰面Her2 M，并可通过RNA 干护CA基因水平减少Her2mRNA表达，则可望彻^i也阻断Her2的过量表达。 发明内容本发明为了解决上述技术问题，提供了一种单链片段抗I多AU^妙白，该蛋 白是一种具有结合Her2受体和携带抗癌siRNA药物双向功能的融合蛋白，可以作为 抗癌siRNA的药物栽体。本发明通过以下方案实现该目的本发明的一种单链片革殳抗I多^U^^白，所述的单链片,殳抗体为Her2-ScFv， 所述的多肽为^t青蛋白片段多肽。该单链片段抗^多^Ui錯白的序列是如SEQ ID NO.l所示的序列。本方明的一种单链片段抗体-多^l虫合蛋白的基因序列的表ii^ 体包括pAcGP67B载体，其表ii^f^争化的宿主细胞包括s 昆虫细胞。本发明的一种单链片段抗体-多^1虫*白作为抗癌siRNA的药物栽体的应用。本发明的方案*^如下1. 构建具有结合Her2受体和携带siRNA药物双向功能的融合蛋白的质粒；2. 构建的pACgp67B-Her2-scf^protamine质粒小量4^;3. 酶切鉴定Her2单链片段抗体与鱼精蛋白多肽构建的质粒 pACgp67B-Her2陽sc^隱protamine;4. pACgp67B-Her2-scf^protamine质粒大量4^;5. Her2隱sc^-protamine的观'J序；6. 绘制质粒图；7 .Her2单链片段抗体与^^青蛋白多肽的融錯白在sS昆虫细胞中的表达与纯化8. Her2单链片賴:抗体与^f青蛋白多肽的融M白的鉴定 9 .Her2单链片段抗体与^#蛋白多肽的融*白浓度测定 10.检验Her2单链片段抗体与^f青蛋白多肽的融M白具有结合癌细月^面 Her2受体和^i宿DNA的双向功能。 本发明有以下优点1. 本发明构建的Her2单链片段抗体与^f青多肽的融M白具有结合Her2受体和 携带抗癌siRNA药物的双向功能；鱼精多肽带正电荷，能与带负电荷的DNA质粒栽 体结合，并可i^i宿这些DNA衬，经与癌细胞Her2受体介导叙细胞内。在体外细 月^咅养实验中，应用Her2-ScFv与经删节的^T青蛋白片^ai虫好白携带报告基因，能 大大提高报告基因在Her2阳性的乳腺癌细胞中的表达。与同源的Her2阴性细胞比较， 报告基因表达肯汲高8到10倍。SiRNA与DNA都是携带大量负电荷的衬，也能 被荷正电的^l青多li^i宿。2. 本发明筛选并构建Her2-ScFv与^^青蛋白片段多肽的融妙白，应用于导向携 带siRNA双链衬，特异WW认Her2阳性癌细胞。本发明构建的Her2单链片段 抗体与^晴多肽的融M白成功^fe4元癌siRNA药物定向导入目标癌细胞中，开发了 非病毒载体工具，加速RNAi技术应用于临床。3. 该融合蛋白既可利用ScFviiLit减少细胞表面的Her2分子，也可通过RNA干 护C/人基因水平减少Her2 mRNA表式可望彻^i也阻断Her2的过量表达。此融合蛋白 的成功开发为^1新型的抗癌基因药物奠定坚实的勤出，将为治疗晚期乳腺癌提供有 效的武器。


图1是pACgp67B-Her2-sc^-protamine用Bamffl和Xhol的Hi刀鉴定图； 图2是pACgp67B-Her2-scf^-protamine用Hindm的^^刀鉴定图；图3是Her2-scf^pratamine的测序图谱与理论序列的t时图； 图4是pAcGP67B-Her2-ScFv-protamine质粒的简图；图5是Her2单链片段抗体与^T奮蛋白多肽的融錯白经过Weston blot进行鉴定图。图6是根据标准蛋白的^JL梯度和紫夕卜分ititl计的读数平均^^^J的标准曲线；图7是GFP siRNA与不同量的Her2单链片段抗体与^f青蛋白的多l^l虫好白和L -蛋白珠行免疫共^i定结果图；图8是通it 文良Northern Blot 4&则细胞内GFP siRNA的^J:结果图；图9是共聚焦显微#^^^则siRNA经Her2单链片段抗体与^T青蛋白多肽的融合蛋白导入细胞后的分布情况结果图。絲实财式实施例1.构建具有结合Her2受体和携带siRNA药物双向功能的融M白的质粒。 M因坊中查到Her2单链片段抗体的4^f列后，用引物软^H殳计相关引物。 设计的Her2-ScFv引物 正引物Ncol为内切酶5,-GGGCCA^GGCCCAGGTGCAGCTGT^GCAGTCTGGGGCAGAG-3, 反引物Notl为内切酵5，-TTGCGGCCGCTCCGGAATTCACCTAGGACGGTCAGCTTGGTCCC隱3， 设计的^f青多肽引物 正引物Notl为内切酶5，-CCGGAGCGGCCGCAA^GGCCAGGTACAGA^GCTG隱3, 反引物PpuMI作为内切酶，终止密码子和6个组氨酸5，-GCCGGGTCCCAGGAAAGGArCAGATCTGCATTAATGGTGGTGGTGATGATGAGATCTGTGTCTTCTACATCTCGGTCTG-3 ，通过PCR克隆相关目的片^a:, Her2-ScFv的PCRAJl体系1: 50ul体系: ddH20 37ul dNTP 5ul 正引物 lul 反引物 lul 10 xPCR Buffer 5ul EasypfU lul ^f青多肽的PCR^jS体系2: 50ul体系 ddH20 37ul dNTP 5ul 正引物 lul 反引物 lul 10xPCRBuffer 5ul EasypfU lul PCR^循环预变性94 °C 5min 变性94°C30S 、 退火 48.5°C 30S 卜 30 Cycles 延伸72°C lmin > 絲延伸72°C 10min PCR产物酶切Her2 ScFv的PCR产物用Nco I和Not I内切^^刀开 50ul体系Her2ScFv的PCR产物 20 ulddH20 20 ul Ncol 2ul Notl 2ul 10 x Buffer 5ul Her2 ScFv的PCR产物^系在37。C水浴4小时。 ^l青多肽的PCR产物用Notl和PpuMI内切Hi刀开50ul体系 _^晴多肽的PCR产物 20 ul ddH20 20 ul PpuMI 2ul Notl 2ul 10 x Buffer 5ul 鱼精多肽的PCR产物酶体系在37。C水浴4小时。 pAcGP67B用Ncol和PpuM内切S^刀开 50ul体系 pAcGP67B 20 ul ddH20 20 ul PpuMI 2ul Notl 2ul 10 x Buffer 5ul pAcGP67B的i^刀体系在37。C水浴4小时。将上t个PCR产物进行切胶回收目的片段，将^fe7鉴定片段大小正确的PCR 产物4^[Ui样1%琼脂糖^^交电泳;将目的DNA片^JU干净的手术刀切下,it^ 1.5ml 离心管，^^v回4i^交前离心管称重；称重后，在1.51111离心管中加入以每毫ii劲口入1微fH^只的膜结合溶液；60。C水浴中;^E lOmin(Ji统全溶解)，每2-3^4中混匀一 次(i^交液应与膜结合溶^l贞色相同)；将柱子放样品##入柱子中(柱子的最大容量为 800uL)，室^i!Elmin,然后16000g x lmin离心；取下柱子，弃伊u出液，将柱子放 回原收集管中；力口入700ul washing buffer至收集管，室^^t^ lmin，然后16000gx lmin离心；力口入500ul Membrane washing solution至收集管，然后16000g x lmin离心； 取下收集管，弃流出液，再次16000gxlmin离心；将收集管^X在一支新的1.5mL 离心管中，加入50uL Nudease-Free Water (或无菌H20)M中央，静置片刻，然后 16000g x lmin离心，收集回j]缓粒DNA。 1鈔刀胶回收的目的片,更ii^亍连"l条 Her2ScFv 5ul Protamine 5ul pAcGP67B 5ul DNA Ligation Mix 15 ul PCR ^Jii^"l秦16°C x l小时 连接产物转化感受态细胞，CaC12制备感受态细胞DH5a。 在15ml试管中力口入3mlLB培养基,从平^Ji才4^一单克隆接种，37°C， 250rpm, 培养过夜，约16小时。取2ml过夜菌接入200ml新鲜的LB培养基，37°C, 260rpm， 培养，直至OD60OO.4"0.5,然后将菌液冰浴30"60分钟。4°C, 5000rpm x 5min离心 收集细菌，弃上清。用10ml0.1M的CaCl2轻轻吹打，充分悬浮，水浴10min。 4°C, 5000ipmx5min离心，弃上清。力口入2ml 0.1M的CaCl2轻轻吹打，充分悬浮，冰浴 30min即感受态制备完成。转^4受态细胞准备L5ml的离心管2支，冰浴预冷；分别取100ulDH5a感 受态细胞，各加入10ul连接产物，混合均匀；将上述"曰^^勿;^i:水上30min;将混 ^4勿转移至42。C水浴中温育90sec;将混^4勿4^多至水J^文置2min后，加入800ul的LB培养液，在4S^Ji37。C, 150rpm培养60min; 4000ipmx5min离心；弃800ul 的上清液，剩余IOO ul混匀后涂LA板；^^20ul IPTG和70ul Xgal';^/^后涂布在 LA^Ji进行蓝白斑筛选，然后4eJi步^^余的100ul菌液混匀后涂LA板；LA板置 37。C培养箱过夜培养；在过夜培养的LA ;^Ui挑取10个长得tb4支饱满的白色克隆， 分别加入6mlLA培养基中，在摇^Ji37。C， 250ipm培养16h。 实施例2 pACgp67BJIer2"ScfV誦protamine质粒小量^H:以12000g x 1 min离心收菌。(""^i^r^分用34ml菌液)，弃上清。加250ul水 浴BufferSl(含RnaseA)，涡旋振荡，使菌体充分悬浮。力口250ulBufferS2，温和混匀 6次。0tbit程不超过5min)加350ul Buffer S3,温和混匀6次。以12000 g x 10 min离 心。取上清，过DNA制*,以12000 g x 1 min，弃滤液。DNA制錄内力口 700ul Buffer Wl， 12000gxlmin，弃滤液。DNA制^f内加500ulBufferW2， 12000gxlmin, 弃滤液。再次以12000 g x 1 min离心。加40ul ddH20(或EB buffer)于DNA制备管的 膜中央，室温静置lin(50。C预热EBbuffer可能洗M^汰更好)。12000gxlmin离 心并收集S舰液，即质粒DNA。实施例3.酶切鉴定Her2单链片段抗体与鱼精蛋白多肽构建的质粒 pACgp67B-Her2-scfV-protamine进4t^^刀鉴定pACgp67B-Her2-scfV-protamine质粒片段① .Bamffl (CTGATCC)的酶切位点处于4259; Xhol (CTCGAG)的^i刀位 点处于1902;所以酶切后的条带大小为2357 bp，位置准确。如图1所示， pACgp67B-Her2-scf^-protamine用Bamffl和XhoI的Hi刀鉴定。M为maricer ,1,2， 3, 4， 5, 6, 7为不同克隆细菌扩增并M质粒DNA后酶切可见2027bp^Ji方有相 应的*，与预期条带的位置相吻合。② .Hindm (AAAGCTT)的^i刀位点处于2， 5328, 6256, 7292，所以^i刀后 的四个条带大小为5326 bp, 3423bp, 1036 bp， 928 bp,位置准确。如图2所示，pACgp67B-Her2-scf^-protamine用Hindm的i^fe7鉴定。M为marker ， 1， 2, 3， 4, 5, 6， 7为不同克隆细菌扩增并^t粒DNA后酶切可见4条不同的条带，与预期 絲的位置(5326bp, 3423bp, 1036 bp, 928bp)相吻合。。实施例4 pACgp67B-Her2誦sc^國protamine质粒大量城吸取0.5ml上述菌勵口入500 ml LA培养基中在摇^Ji 37°C ， 250rpm培养16h, 菌液密度大约为3"4xi()9细^/ml。将菌液收集在200ml离心管中，在4。C条件下， 以6000 g的逸复离心15 min。以同样的条f牛重复3次，把细菌收集在同一个离心管 中。将细菌沉淀重悬在20 ml Buffer Pl (佳月前力口入RNase A和LyseBlue reagent)中。 向离心管中力口入20 ml Buffer P2,并上下颠倒4-6次混匀，在室温(15~25°(:)下力 5 min，此时〉V給紋为蓝色。向离心管中力口入20 ml Buffer P3，并上下颠倒4-6次混匀， ^;水Ji^tf 30min，此时^給液蓝色褪去，变为无色。将上述液体在4。C, 20000g离 心30 min ,并iiki4收集含有质粒DNA的上清液。将上一步W^得的上清液4°C， 20000 g离心15 min， ^i4收集含有质粒DNA的上清液。向上清液中力口入42 ml 异丙醇以;W定其中的质粒DNA,并4。C , 20000 g离心15min，小心M上清液。 向质粒DNA ^i定中加入500 TE buffer( pH 8.0),并加入Buffer QBT至总容量5 ml。 寸詗QIAGEN-tip 100进行质^4^，取4 ml Buffer QBT力口入QIAGEN-tip 100柱子 进行平衡，并让液体在重力的作用下緩f曼^^。将步骤9所获得的含有质粒DNA的 液体加入柱子，让其在重力的作用下M;IH交4灸^t脂。用BufferQC先法，2 x 10ml。 用5mlBufferQF过;fM^t^^,用一个干净的离心管接;舰液。于洗脱液中加3.5ml 异丙醇以;;^^t粒DNA,并4。C, 15000 g离心30min。离心后将上清液小心絲。 室温下用2 ml 70%的酒精M粒DNA,然后在4°C， 15000 g离心10 min，离心后 小心絲上清液。^i定物风干10 min后加入250 的TE buffer (pH 8.0), 4^t粒 浓度测定应用紫外分光光度计测定质粒大量抽提后获得的 pACgp67B-Her2-scf^protamine质粒的^l^: 0.025 x 1000 x 50=1.25 ug/ul。实^fe例5 Her2"ScfV-protamine的效'傳^^才乇大连宝生物^S司进"f力则序，Her2-scfV-protamine的序列完全正确ANGCTrArAAGGAAAACAGCAGATGGTAAGCGCTATTGTnTATArGTGCTnTGGCGGCG GCGGCGCATTCTGCCTTTGCGGCGGATCTTGGATCCCGGGCCATGGCCCAGGTGCAGCTGGTGTACArGGGGCTCArCTATCCTGGTGACTCTGACACCAAATACAGCCCGTCCTTCCAAGGCCATGGCACCTCAGCCTCCCTGGCCArCAGTGGGTTCCGGTCCGAGGATGAGGCTGATTAITACTGCCTTTCNTGGACCCGGCAAAACCAAAT将Her2-ScFv-protamine的测序图谱与理论图语进行J^于，结果完全正确，如图3 所示，Her2-scf^protamine的观'J序图语中可以直观的进行4—则序列与理论序列的H^于， 可以看到我们插入的目标序列均完全正确的插^i确的位置。实施例6 ^"j质粒图《#^所构建质粒pAcGP67B-Her2-ScFv-protamine的质粒图，如图4所示，为 pAcGP67B-Her2-ScFv-protamine质粒的简图。这个质粒图阐明了质粒的英文全称为pAcGP67B-Her2-ScFv-protamine,序列的总狄为10713bp,以及目标序列Her2-ScFv, protamine和纯/fW亍各His-tag的插入位置，并说明相应的酶切位点等质粒信息。。这个 质粒图阐明了质粒的英文全称为pAcGP67B-Her2-ScFv-prolamine,序列的总长度为 10713bp,以及目标序列Her2-ScFv， protamine和纯/R^亍各His-tag的插入位置，齐4兌 明相应的S^刀位点等质粒信息。通顺粒可使本领域的专业技^/v员可以i^i4而全面 的理解;^发明。实施例7Her2单链片段抗体与^T青蛋白多肽的融好白在sf9昆虫细胞中的表达 与纯化Her2单链片賴:抗体与鱼^青蛋白多肽的融*白的表达pAcGP67B-Her2-ScFv-protamine质粒与杆状病4^转染sf9昆虫细胞(^j ] BD BaculoGold转染试剂盒)，接种2 x 106S 于60mm组织培^中，初始细胞密戯 在50-70%铺满。使细胞牢固贴壁(大约15min)。除去培养基，力口入lml转染《爰冲液 A。确认培^JDL的所有区域被转染緩沖液A覆盖,以防止细胞干^L亡。于一无菌15ml 离心管中混合0.5 |a g Baculo Gold TM线性DNA和2 ja g重组寿封多载体质^(含有目的 基因)。^^4勿静置5min后加入lml转染緩沖液B, 〉V給均匀。将lml转染緩冲液B/DNA溶液逐滴力口Al且织培^，每加入2到3滴便温和地 晃动培^mi以^^其与转染緩冲液A混匀。扭bit程期间，应该可以^JU形成的^i定 使得溶:^J^fe微乳状。27;li咅养4小时。4小时以后，除去转染溶液，并加入3ml Grace's Insect Cell Culture Medium。温和晃动培#^,然后除去培养基。力口入3ml新 鲜Gmce，s Insect Cell Culture Medium, 27。C培养4-5天。4-5 A^，收紅清，用其 感染更多细胞以扩增病毒，扩增病毒后行蛋白表达。Her2单链片段抗体与^T奇蛋白多 肽的融^f"白在sS昆虫细胞中的表iio注意生产目的蛋白时，病毒MOI应该在3 -10。接种9 x 106 S 于T75培养瓶中，力口7vE含有10ml S 培养勒含有10%胎牛血清)。T75培养弁理培养箱中27。C培养1小时。1小时吸去旧培养基才躺新鲜培养基， 并加入高滴度的病毒液，使MOI介于5 - 10之间。T75培养并11_￡培养箱中27。C培养 72小时。72小时后把细月&^上清吸到一个离心管中，4"C， 1000g离心10^4中收集细 胞。用预冷的PBS力口入细胞中重悬洗涤，4°C, 1000g离心10^4中收集细胞。辦所 有细胞沉淀于lml裂解緩冲液10mM Tris-HCl，pH7.5，200mM Nacl,l%Triton X-100,10mM NaF/10mM Sodium Pyrophosphate/10mM Sodium phosphate,l x photease inhibitor cocktail.。腦0g， 10min, 4。C离心禱液，收壯清。 纯化Her2单链片段抗体与^f青蛋白多狀的融*白先用3-5倍柱体积的Washing buffer洗Ni - NTA琼脂胶柱(Pierce)。待Washing buffer it^后，力口入蛋白上清液过柱，让其纟爰十曼流出。待上清液沭^，加入含有3-5 倍柱^^只的20mM咪峻洗涤Ni - NTA柱。力口入含有不同親的咪>^^爰沖液3倍柱体 积J^1i舰，^!分别为100mM， 250mM, 500mM和1000 mM,并分别收集;舰 液进行分析。实施例8 Her2单链片段抗体与^^青蛋白多肽的融M白的鉴定 我们成功构建了 Her2单链片段抗^^#蛋白多船虫*白的杆状病毒表絲 体(pAcGP67B-Her2-ScFv-Pratamine),质粒图镨可见图4，在sff昆虫细月W干状病毒 表达系纟棘达。我们4eii—载粘杆状病毒^M粒DNA (BacuoGold Bright DNA， BD Pharmingen公司)^^共转染SS细胞，叙己病毒载体颗粒，感染SS细胞，细 胞^if液过His-Tag蛋白分离4ii^i^屯化，表达出来的带有6个组氨舰巴(His-Tag) 的Her2单链片段抗体与^t青蛋白多，*白，用拍人IgG ^4元作为一抗的Western Blot鉴定分离的融妙白，如图5所示，Her2单链片段抗体与^f青蛋白多肽的融妙 白经过Weston blot进行鉴定图。Control为为感染病毒的细胞|1 白，而MOI-l， 3, 5, 10和15则分别是不同病毒与细月&it量比时的结果，可以见到大小为36KD的 目标条带，而且MOI:5和10时表达量较高。结^4明用pAcGP67B-Her2-ScFv-Protamine质冲:i^杆状病毒可以成功的表达出 Her2单链片l殳抗体与^l青蛋白多^il种融^^白。而且，在MO卜5和10，即病毒 与细l&it量比为5和10时的表ii^汰更好，表达出来的融合蛋白大小为36KD。实施例9 Her2单链片段抗体与^f青蛋白多肽的融M白^^测定Her2单链片段抗体与^^青蛋白多船虫M白经it4^i^纯^^,由于^M^内含 有较多的有才M勿质，需要通itit析去除有才/li^剂和超滤进fr^i宿。常用PBS, 4。C透 析48小时后进行超滤i^i宿。经it^E滤后用蛋白^测定试剂盒进fr浓度测定① .吸取180ulBSA(2mg/ml)于96孑Ul中的最靠边缘的第一孔，同一排的其它11 个孔中各加入60ul 0.9 %生理盐7jc;② .吸取120ul第一孔的液体加入一个盛有60ul生理盐水的第^5L并充分>'^^ 均匀；③ .用同样方法处J1^第十；L;④ .各吸取20ul上述稀释液体加入另外两排24个孔中； (D.各吸取20ul蛋白样品液体加入96孑li反中，^i^:l孔； .分别吸取5ul5 x的细胞辦';^口入样品孑L^BSA孔中；⑦ .以50:1的比例配制A + B 〉V曰洽液；⑧ .吸取200ul A + B齡胁Aji述^h孔中； . 96孑U1置37。C培养箱中孵育30 ^i中；⑩.将;fc^i:紫外分itibl计中进^^lL才財居标准蛋白的^l梯度和紫外分i^bl计的读数Ui^'麻准曲线将曲线进行 拟和后可得直狄其方程 Y412622+1.01542 X R=0.99666PO扁l如图6所示，根据标准蛋白的^i梯度和紫夕卜分ititl计的读数平均n^^标准 曲线，然后进行扣沐直线，并得到直线的相应方程式。将^^赠羊本的紫夕卜分iUeA读数值4Vv^r程可得相应的蛋白^yL)纯4te Her2单链片段抗体与^f青蛋白多肽的融 *白的浓^ 100ug/ml, 5 x 10、田月包可^^寻2ml融M白溶液。实施例10 Her2单链片段抗体与^f青蛋白多肽的融M白具有结合癌细月^面 Her2受体和^i宿DNA的双向功能,并負fe^目标DNA选棒性导入Her2阳性细月&i行 表达。我们进一步检验Her2单链片段抗体与^f青蛋白多肽的融M白携带siRNA和耙 向导入Her2阳性细胞的双向功能。① .Her2单链片段抗体与^#蛋白多肽的融*白与siRNA的结合力枱3则 我们用荧光素(FTTC)标记的GFPsiRNA与不同量的Her2单链片,殳抗体与^l青蛋白多脇虫^"白和L一蛋白J朱(L-proteinbeads:能结合人IgG)进行免疫共^i定， 通过分光计定4^则FITC-siRNA。结^示Her2单链片段抗体与^l青蛋白多^l^^白与siRNA的々^N吉合力约 为l: 6摩尔比。图7为GFPsiRNA与不同量的Her2单链片段抗体与^f青蛋白的多肽 融*白和L -蛋白珠行免疫共^i定，显示Her2单链片段抗体与^4青蛋白多ia虫M 白与siRNA的^结合力约为1: 6摩尔比。② .然后，我们用这种融好白携带GFPsiRNA (1: 6摩尔比)，处理Her2基因 表ii^体(pCMV-EAB2)转染的Hela细胞(效率达89% ),通过改良Northern Blot #^则细胞内GFP siRNA的*。图8所示为Her2单链片^史抗体与^f青蛋白多肽的融 M白負沐岁tfeteGFPsiRNA导入Her2阳性细胞。泳道l-3分别为100、 500、 1000 pmolsiRNA时细胞内4&则到的siRNA信号，f錄siRNA量的增加，胞内siRNA信号 M强。泳道4和5分别为Her2单链片段抗体携带GFPsiRNA处理组和Her2阴性细月^i且，可JO包内不育^^则到siRNA信号。结絲示Her2单链片段抗体与^f青蛋白多船虫妙白育沐岁&4fe GFP siRNA导 入Her2阳性细胞，而JIJl^r siRNA量的增加(100、 500、 1000 pmol),细胞内4S则到 的siRNA信号M强(泳道1-3)。而作为对照的不含^T奇蛋白多肽片段的Her2单链片 段抗^^夷带GFPsiRNA处JH且(泳道4浙Her2阴性细胞(泳道5 )则不肯^^则到siRNA 信号。说明Her2单链片段抗倘^f青蛋白多録妙白負^siRNA选棒l^也导入Her2 阳'l"生细月包内。③.共聚焦显樣i镜定位4企测Her2单链片段抗体与鱼精蛋白多肽融合蛋白导入 siRNA在细月包内的^^布。我们用共聚禁i微4i^fi^^则Her2单链片段抗体与^f青蛋白多liil^^白导入 FUC - siRNA在细胞内的分布，图9为共聚禁i微4t^f^^则siRNA经Her2单链片 段抗体与鱼精蛋白多肽的融合蛋白导入细胞后的分布情况。可见莹光siRNA分布于 Her2阳性Hela细胞的月錄中(A),而Her2阴性细月包内则没有siRNA(B)。发现siRNA 分布于Her2阳性Hela细胞的胞浆中，而Her2阴性细胞则没有siRNA。这些实验i正实 了 Her2单链片段抗体与A^青蛋白多肽的融M白携带siRNA和特^f"入Her2阳性细 月包的功能。序列表SEQIDNO:l〈110〉中山大学附属第二医院〈120〉 Her2单断離购鱼精多ttSfe^白作为繊si薩的l^体〈160> 1<170>〈210〉 1<211〉 960〈212〉脆〈213〉 Alff列〈220〉〈221> misc一feature <222> (1)…(960) <223〉 n巧或g或c或t <揚1atggcccagg tgcagctggt aagatctcct gtaagggttc c卿tgcccg ggaaaggcct aaatacagcc cgtccttcca gcctacttgc aatg眺cag catgacgtgg gatattgcag tggggccagg gcaccctggt tctggcggtg gcggatcgca ggacagaagg tcaccatctc tcctggtacc agcagctccc cggcccgcag gggtccctga gccatcagtg ggttccggtc accctctcgg gctgggtgtt atggccaggt acagatgctg agaagtcgca gacgaaggag cgccccaggt acagaccgaggcagtctggggcagaggtgaaaaagcccggggagtctctg60tggatacagctttaccagctact卿tcgcctgggtgcgc120ggagtacatggggctcatctatcctggtgactctgacacc180郷ccaggtcaccatctcagtcgacaagtccgtcagcact240tctgaagccctcggacagcgccgtgtatttttgtgcgaga300tagttccaactgcgcaaagtggcctgaatacttccagcat360caccgtctcctcaggtggaggcggttcaggcgg鄉tggc420gtctgtgttgacgcagccgccctcagtgtctgcggcccca480ctgctctggaagc鄉tcc3acattgggaataattatgta540aggaacagcccccaaactcctcatctatgatcacaccaat600ccgattctctggctccaagtctggcacctcagcctccctg660cgaggatgaggctgattattactgtgcctcctgggactac720cggcggaggaaccaagctgaccgtcctaggtgcggccgca780tcgcagccag鄉cggagcagatattaccgccagagacaa840gcggagctgcc卿cacggaggagagccatgaggtgttgt900atgtagaagacacagatctcatcatcaccaccaccattaa960
权利要求
1. 一种单链片段抗体-多肽融合蛋白，其特征在于，所述的单链片段抗体为Her2-ScFv。
2、 才財居权利要求l所述的一种单链片段抗l多脇虫M白，^#棘于，所述的多 狀为A^青蛋白片,殳多狀。
3、 才財居权利要求l所述的一种单链片段抗l多l^li妙白，其序列是如SEQIDNO. 1 所示的序列。
4、 一种含有编码权利要求1 -3之一所述的一种单链片段抗体-多li^妙白的基因 序列的表ii^体。
5、 才財居权利要求4所述的表ii^体，^#棘于，包才舌pAcGP67B载体。
6、 一种权利要求4或5所述的表ii^/^4争化的宿主细胞。
7、 根据权利要求6所述的宿主细胞，^4争4iE^于，包4舌sfi)昆虫细月包。
8、 权利要求1 -3之一所述的一种单链片段抗体-多M^^白作为抗癌siRNA的药 物载体的应用。
全文摘要
本发明提供了一种单链片段抗体-多肽融合蛋白及其应用，该蛋白是一种具有结合Her2受体和携带抗癌siRNA药物双向功能的融合蛋白，可以作为抗癌siRNA的药物载体。其中，单链片段抗体为Her2-ScFv，多肽为鱼精蛋白片段多肽。该单链片段抗体-多肽融合蛋白的序列如SEQ ID NO.1所示的序列。本发明构建的Her2单链片段抗体与鱼精多肽的融合蛋白具有结合Her2受体和携带抗癌siRNA药物的双向功能。本发明的融合蛋白能把抗癌siRNA药物定向导入目标癌细胞中，开发了非病毒载体工具，加速RNAi技术应用于临床。
文档编号C07K19/00GK101270163SQ200810027579
公开日2008年9月24日 申请日期2008年4月22日 优先权日2008年4月22日
发明者姚燕丹, 宋尔卫, 朱鹏程 申请人:中山大学