专利名称：：从人血浆组分FIV沉淀中分离纯化α1-抗胰蛋白酶的方法
技术领域：
：本发明涉及一种a1-抗胰蛋白酶的制备方法，尤其是从人血浆组分沉淀中分离纯化al-抗胰蛋白酶的方法。
背景技术：
：al-AT主要是由肝细胞合成的一种糖蛋白，分子量54KD，体内半衰期6d。al-AT是人血浆中最丰富的一种丝氨酸蛋白酶抑制剂，能抑制多种丝氨酸内切肽酶，如抑制弹性蛋白酶、胰蛋白酶、纤溶酶、胶原酶、凝血酶和Hageman因子等的活性。al-AT是血液中最主要的抗胰蛋白酶，占血清胰蛋白酶抑制活性的90%以上。dl-AT具有较强的血管通透性，在肺组织中浓度高，而且对弹性蛋白酶活性更专一，它的主要生理功能是抑制肺部弹性蛋白酶的活性，保护肺部不受弹性蛋白酶的酶解损伤。人体血浆中al-AT缺乏直接相关的疾病主要是肺和肝脏疾病。如阻塞性肺气肿、新生儿或成人呼吸窘迫综合征、肺部囊性纤维化、儿童肝硬化和新生儿肝炎等，病情严重导致患儿夭折。对于al-AT缺乏症的治疗主要是进行替代治疗和基因治疗。但由于基因疗法目前尚处于实验阶段，具有一定的局限性，因此al-AT替代或补充治疗此类疾病是主要方法。我国目前尚无该产品的生产，市场需求主要依靠进口产品来满足。国内外都开展了al-AT的生产研究。Gadek等应用两步沉淀过程制备临床应用的al-AT浓縮制剂，al-AT仅占浓縮制剂蛋白总量的5%。Glaser等建立了独特的cil-AT制备工艺，采用二硫苏糖醇处理结合硫酸铵沉淀，DEAE—纤维素层析，从Cohn，s低温乙醇工艺的废弃组分FIV-l中提纯出纯度70%的al-AT浓缩制剂。朱威等[9从Cohn组分FIV中提纯al-AT。将Cohn组分FIV抽提液经沉淀，超滤，离子交换及凝胶过滤后，提纯al-AT，用巴氏法灭活病毒，并考察其效果。用免疫单扩散、双向交叉免疫电泳、SDS-PAGE及合成基质法检测al-AT蛋白活性，用区带扫描法测其纯度达90%以上。上述工艺主要采用沉淀法或沉淀结合层析法纯化al-AT，产品纯度在70%-90%左右，纯度较低；本发明采用两步层析法纯化，设备仪器少，操作简单易行，产品纯度高，al-AT电泳纯度达到98%。
发明内容本发明的目的是为了弥补现有技术的不足，提供一种新的从人血浆组分FIV沉淀中分离纯化a1-抗胰蛋白酶的方法，以降低生产成本及提高纯度。为了达到上述发明目的，本发明采用了以下技术方案一种从人血浆组分FIV沉淀中分离纯化a1-抗胰蛋白酶的方法，其特征在于包括以下步骤(A)血浆沉淀预处理取FIV沉淀加溶解液稀释到蛋白含量2%~5%,pH8.0~8.5，离子强度0.09-0.12，温度控制在2-8。C搅拌过夜，按照0.5%~15%的比例(W/V)加入硅酸盐助剂在2-8'C搅拌lh，固液分离，取上清液，按照0.5%-15%的比例(W/V)再次加入硅酸盐助剂在2-8'C搅拌3h,固液分离，取上清液进样层析柱；(B)阴离子凝胶层析取凝胶，室温放置达到温度平衡后装柱，以缓冲液洗脱平衡，pH6.0~6.5，平衡量为柱体积的812倍，将上清液上样于平衡好的层析柱，用缓冲液洗脱，pH6.0~6.5，温度控制在28。C,洗柱810倍柱体积，于紫外光280nm波长下自动监测，记录层析图谱，选择性地收集以含有al-AT为主要成分的组分；(C)凝胶过滤层析取凝胶，室温放置达到温度平衡后装柱，以缓冲液平衡，将层析后收集的al-AT的组分调至pH7.0-7.5，上样于平衡好的Sephacryl5-200柱，用相同的缓冲液洗脱，同时于紫外光280nm波长下自动监测，记录层析图谱，选择性地收集al-AT的组分；(D)超滤脱盐浓縮；(E)巴氏病毒灭活将浓縮蛋白液加无热原注射用水稀释，加入保护剂，于60士0.5。C保温8~12小时，灭活血浆蛋白制品中的病毒；(F)冻干分装巴氏灭活的al-AT蛋白液经除菌过滤，转入冻干机真空冻干；(G)干热消毒分装的冻干粉针放置于保温库中保温，灭活病毒，转入成品库全检包装。本发明是以人血白蛋白生产过程中产生的弃料FIV组分沉淀为原料，采用层析技术分离纯化一种蛋白酶抑制剂即a1-抗胰蛋白酶(al-antitrypsin，al-AT)，建立al-AT浓缩制剂的生产工艺。本方法制备的产品纯度好、收率高，操作简单易行，同时占用设备少、劳动强度小、能耗低，以白蛋白生产的废弃物料作原料，生产成本低。图l为工艺流程图。具体实施方式本发明提供的技术方案是al-AT浓縮制剂的生产工艺，工艺步骤如下(A)FIV沉淀预处理取FIV沉淀加8~18mM的磷酸或30~35mM的醋酸盐缓冲液稀释到蛋白含量2%-5%，pH8.0-8.5，离子强度0.09-0.12，温度控制2-8'C搅拌过夜。按照0.5%-15%的比例(W/V)加入硅酸盐助剂，2-8'C搅拌lh，固液分离，分离温度控制在4°C,取上清液，按照0.5%-15%的比例(W/V)加入硅酸盐助剂，2-8'C搅拌3h，调节溶液pH5.5-6.5，固液分离，温度控制在4。C，取上清液进样层析柱。硅酸盐助剂为硅藻土、珍珠岩，添加剂的用量为每100毫升溶解液添加0.5克-15克。(B)离子交换层析取出DEAF-SepharoseFastFlow凝胶，室温放置达到温度平衡后装柱，以8~18mM的磷酸盐缓冲液、30~35mM的醋酸盐缓冲液或12~25mM的柠檬酸盐缓冲液洗脱平衡，pH6.0-6.5,平衡量为柱体积的8-12倍。将上清液上样于平衡好的层析柱，用8~18mM的磷酸盐缓冲液、30~35mM的醋酸盐缓冲液或12~25mM的柠檬酸盐缓冲液洗脱，pH6.0-6.5,流速控制在每小时2.0~4.5倍柱体积，温度控制在2-8'C，洗柱8-10倍柱体积。于紫外光280nm波长下自动监测，记录层析图谱，选择性地收集以含有al-AT为主要成分的组分。(C)凝胶过滤层析取SephacrylS-200凝胶，室温放置达到温度平衡后装柱，以818mM的磷酸盐缓冲液、30~35mM的醋酸盐缓冲液或12~25mM的柠檬酸盐缓冲液平衡，pH7.(K7.5，平衡量为柱体积的8~12倍。将层析后收集的al-AT的组分调至pH7.0~7.5，上样于平衡好的Sephacryl5-200柱，用相同的缓冲液洗脱，洗脱量为柱体积的8-12倍，流速控制在每小时1.5~3.5倍柱体积，洗脱温度控制在2~8°C。同时于紫外光280nm波长下自动监测，记录层析图谱，选择性地收集al-AT的组分。(D)超滤脱盐浓縮经层析纯化的al-AT溶液泵入超滤机，用无热原注射用水超滤脱盐，超滤膜截留分子量为IOOKD。(E)巴氏消毒将浓縮蛋白液加无热原注射用水稀释到蛋白含量1.5%-2.5%，pH6.4~6.8，加入甘氨酸和麦芽糖作为巴氏消毒的混合保护剂，甘氨酸含量控制在45-55mM，麦芽糖含量控制在25%~35%于60±0.5°。保温10小时，灭活血浆蛋白制品中的病毒o(F)冻干分装巴氏灭活的al-AT蛋白液过0.22um微孔滤膜除菌过滤，转入冻干机真空冻干，含水量控制在3%以下，冻干粉按500mg蛋白/瓶分装，转入待检品库。(G)干热消毒分装的冻干粉针放置于8(TC保温库中，保温60~72小时灭活病毒，转入成品库全检包装。实施例l:(1)FIV沉淀预处理称取Cohn法组分沉淀FIV3kg，加入15mM，pH8.0的磷酸氢二钠一磷酸二氢钠缓冲溶液50L，于28。C搅拌过夜，加入3kg硅藻土，在28'C搅拌1小时，高速离心分离，温度控制在4'C，滤液中加入珍珠岩l.5kg，2-8'C搅拌3h，以1MHCl调溶液pH6.2,高速离心分离，温度控制在4。C，取上清液为层析上柱液。(2)DEAE-S印haroseFastFlow阴离子交换层析取出DEAF-SepharoseFastFlow凝胶，室温放置以达到温度平衡，取6L凝胶装柱，以15mM，pH6.0的磷酸钠缓冲液平衡洗柱，平衡液用量8倍柱体积。将上柱液IOL上样于平衡好的DEAF-SepharoseFastFlow柱(9.5xll0cm)，用pH6.0,15mM的磷酸钠缓冲液洗柱，洗柱液用量8倍柱体积，流速2.2L/h，以pH6.0，20mM的柠檬酸一柠檬酸钠缓冲液洗脱，流速3.2L/h，洗脱温度控制在2-8°C。同时于紫外光280nm波长下自动监测，记录层析图谱，选择性收集含有a1-AT为主要成分的组分。(3)S印hacrylS-200凝胶过滤层析取SephacrylS-200凝胶5L，于室温放置2h达到温度平衡后装柱，以15mM，pH7.0的磷酸钠缓冲液平衡洗柱，平衡液用量10倍柱体积，以lMNaOH溶液将层析后收集的a1-AT组分调至pH7.2，上样于平衡好的Sephacryl5-200柱(7.5x90cm)，用相同的缓冲液以1.8L/h的流速洗脱，洗脱温度控制在2-8°C。同时于紫外光280nm波长下自动监测，记录层析图谱，选择性地收集a1-AT的组分。(4)超滤脱盐浓縮经层析纯化的a1-AT溶液泵入超滤机，用无热原注射用水550L超滤脱盐，超滤膜截留分子量为IOOKD，浓縮到蛋白含量12%。(5)巴氏消毒从超滤器中泵出蛋白浓縮液，加无热原注射用水稀释到蛋白含量2%，加入55mM甘氨酸和25X麦芽糖作为巴氏消毒的保护剂。蛋白溶液于60土0.5'C保温IO小时，灭活血浆蛋白制品中的病毒。(6)冻干分装巴氏灭活的al-AT蛋白液真空冻干，含水量控制在3%以下，冻干粉按照500mg蛋白/瓶无菌分装，转入待检品库。(7)干热消毒/全检包装冻干品置80。C保温库放置60小时灭活制品病毒，转入成品库全检包装。成品检测结果如下表l:表l<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>(1)FIV沉淀预处理称取Cohn法组分沉淀FIV3kg，加入50L30mM的醋酸钠缓冲溶液，于2~8'C搅拌过夜，加入3kg硅藻土，在28'C搅拌1小时，进样板框滤器加压过滤，温度控制在4'C，滤液中加入珍珠岩l.5kg，2-8'C搅拌3h，以1MHC1调溶液pH6.2，进样板框滤器加压过滤，温度控制在4'C，取上清液为层析上柱液。(2)DEAE-S印haroseFastFlow阴离子交换层析取出DEAF-SepharoseFastFlow凝胶，室温放置以达到温度平衡，取6L凝胶装柱，以30mM，pH6.0的醋酸钠缓冲溶液平衡洗柱，平衡液用量12倍柱体积。将上柱液IOL上样于平衡好的DEAE-SepharoseFastFlow柱(9.5xll0cm)，用30mM，pH6.0的醋酸钠缓冲溶液洗柱，洗柱液用量10倍柱体积，流速2.0L/h，以pH6.0,20mM的柠檬酸一柠檬酸钠缓冲液洗脱，流速4.5L/h，洗脱温度控制在2-8'C。同时于紫外光280nm波长下自动监测，记录层析图谱，选择性收集含有al-AT为主要成分的组分。(3)S印hacrylS-200凝胶过滤层析取SephaerylS-200凝胶5L，于室温放置2h达到温度平衡后装柱，以30Mm，pH7.2的醋酸钠缓冲溶液平衡洗柱，平衡液用量10倍柱体积，以lMNaOH溶液将层析后收集的al-AT组分调至pH7.2，上样于平衡好的Sephacryl5-200柱(7.5x90cm)，用相同的缓冲液以1.5L/h的流速洗脱，洗脱温度控制在2-8°C。同时于紫外光280nm波长下自动监测，记录层析图谱，选择性地收集al-AT的组分。(4)超滤脱盐浓縮经层析纯化的al-AT溶液泵入超滤机，用无热原注射用水550L超滤脱盐，超滤膜截留分子量为100KD,浓縮到蛋白含量12%。(5)巴氏消毒从超滤器中泵出蛋白浓縮液，加无热原注射用水稀释到蛋白含量2%,加入55mM甘氨酸和32%麦芽糖作为巴氏消毒的保护剂。蛋白溶液于60士0.5'C保温IO小时，灭活血浆蛋白制品中的病毒。(6)冻干分装巴氏灭活的al-AT蛋白液真空冻干，含水量控制在3%以下，冻干粉按照500mg蛋白/瓶无菌分装，转入待检品库。(7)干热消毒/全检包装冻干品置8(TC保温库放置72小时灭活制品病毒，转入成品库全检包装。权利要求1.一种从人血浆组分FIV沉淀中分离纯化α1-抗胰蛋白酶的方法，其特征在于包括以下步骤(A)血浆沉淀预处理取FIV沉淀加溶解液稀释到蛋白含量2％～5％，pH8.0～8.5，离子强度0.09-0.12，温度控制在2～8℃搅拌过夜，按照0.5％～15％的比例(W/V)加入硅酸盐助剂在2-8℃搅拌1h，固液分离，取上清液，按照0.5％-15％的比例(W/V)再次加入硅酸盐助剂在2-8℃搅拌3h，固液分离，取上清液进样层析柱；(B)阴离子凝胶层析取凝胶，室温放置达到温度平衡后装柱，以缓冲液洗脱平衡，pH6.0～6.5，平衡量为柱体积的8～12倍，将上清液上样于平衡好的层析柱，用缓冲液洗脱，pH6.0～6.5，温度控制在2～8℃，洗柱8～10倍柱体积，于紫外光280nm波长下自动监测，记录层析图谱，选择性地收集以含有a1-AT为主要成分的组分；(C)凝胶过滤层析取凝胶，室温放置达到温度平衡后装柱，以缓冲液平衡，将层析后收集的a1-AT的组分调至pH7.0-7.5，上样于平衡好的Sephacryl5-200柱，用相同的缓冲液洗脱，同时于紫外光280nm波长下自动监测，记录层析图谱，选择性地收集a1-AT的组分；(D)超滤脱盐浓缩；(E)巴氏病毒灭活将浓缩蛋白液加无热原注射用水稀释，加入保护剂，于60±0.5℃保温8～12小时，灭活血浆蛋白制品中的病毒；(F)冻干分装巴氏灭活的a1-AT蛋白液经除菌过滤，转入冻干机真空冻干；(G)干热消毒分装的冻干粉针放置于保温库中保温，灭活病毒，转入成品库全检包装。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于:所述步骤A的溶解液为为8~18mM的磷酸盐缓冲液或30~35mM的醋酸盐缓冲液；溶解液中添加的助剂为硅藻土、珍珠岩，添加剂的用量为每100毫升溶解液添加0.5克-15克。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述步骤A中的固液分离采用高速离心分离或板框加压过滤，分离温度控制在4'C，固液分离后上清液调节到pH5.5-6.5。4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤B中离子交换层析填料为DEAF-SepharoseFastFlow凝胶，洗脱液为8~18mM的磷酸盐缓冲液或30~35mM的醋酸盐缓冲液或12~25mM的柠檬酸盐缓冲液，流速控制在2.0~4.5L/h。5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤C中凝胶过滤层析填料为SephacrylS-200凝胶，洗脱液为8~18mM的磷酸盐缓冲液或30~35mM的醋酸盐缓冲液或12~25mM的柠檬酸盐缓冲液，pH7.0-7.5，洗脱量为柱体积的8-12倍，流速控制在每小时1.5~3.5倍柱体积，洗脱温度控制在2-8°C。6.根据权利要求l所述的方法，其特征在于:所述步骤D是将经层析纯化的al-AT溶液泵入超滤机，用无热原注射用水超滤脱盐，超滤膜截留分子量为IOOKD。7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤E稀释到蛋白含量控制在1.5%-2.5%，pH6.4-6.8。8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤E中巴氏消毒的保护剂为甘氨酸和麦芽糖混合保护剂，甘氨酸含量控制在45-55mM，麦芽糖含量控制在25%-35%。9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤F中所述除菌过滤采用的除菌膜孔径0.22111!1，真空冻干含水量控制在3%以下。10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤G中冻干制品的保温温度为80°C，保温时间为60~72小时。全文摘要本发明公开了一种人血浆组分FIV沉淀中分离纯化α1-抗胰蛋白酶的方法，其特征在于包括以下步骤(A)血浆沉淀预处理；(B)阴离子凝胶层析；(C)凝胶过滤层析；(D)超滤脱盐浓缩；(E)巴氏病毒灭活；(F)冻干分装；(G)干热消毒。本发明是以人血白蛋白生产过程中产生的弃料FIV组分沉淀为原料，采用层析技术分离纯化一种蛋白酶抑制剂即α1-抗胰蛋白酶(α1-antitrypsin，α1-AT)，建立α1-AT浓缩制剂的生产工艺。本方法制备的产品纯度好、收率高，操作简单易行，同时占用设备少、劳动强度小、能耗低，以白蛋白生产的废弃物料作原料，生产成本低。文档编号C07K14/81GK101274956SQ20081002737公开日2008年10月1日申请日期2008年4月11日优先权日2008年4月11日发明者吕应年,朱光祖申请人:三九集团湛江开发区双林药业有限公司