人重组chemerin蛋白、重组载体、转化体及其制备方法

专利名称：人重组chemerin蛋白、重组载体、转化体及其制备方法
技术领域：
本发明属于基因工程技术领域，具体涉及人重组chemerin蛋白、重组载体和转化体及 其制备方法。
背景资料
chemerin是一种最近被新发现的趋化功能蛋白，为ChemR23配体，最早是从卵巢癌晚 期病人腹腔积水分离纯化出来(Val6rie Wittamer, Jean-Denis Franssen, Marisa Vulcano, et al.， J.Exp. Med. 198 (2003) 977—985.)。人Chemerin基因(GB: NM_002889)长度为734bp， CDS长度为492bp， CDS中前面60bp编码一长度为20氨基酸的信号肽，最后21bp编码 一6氨基酸的C端多肽。其前体蛋白质是由163个氨基酸残基组成，N端的信号肽不包含 在分泌出来的Chemerin前体蛋白内，而Chemerin前体蛋白被血清中的丝氨酸蛋白酶酶切 长度为6氨基酸的C端多肽之后，成为具有生物活性的chemerin。
通过与ChemR23结合作用，chemerin对树突状细胞和巨噬细胞迁移具有强大的趋化作 用(Val6rie Wittamer, Jean-Denis Franssen, Marisa Vulcano, et al" J. Exp. Med. 198 (2003) 977-985.)。有研究表明chemerin对血中NK细胞具有募集作用(Silvia Parolini, Amerigo Santoro, Emanuela Marcenaro, et al" Blood 109 (2007) 3625-3632.)。因此，chemerin作为一 种重要的免疫调控生理因子，被广泛认为是一个新药研究开发的热点。最近研究资料显示， chemerin还是一个非常重要的脂肪因子，肥胖人群的chemerin血清水平明显高于对照组人 群，参与肥胖或糖尿病的发病调控(Takahashi， M. et al" FEBS Lett. 582 (5) (2008)， 573-578)， 可作为肥胖或糖尿病的临床检测指标之一。
但chemerin在生物体内含量很少，且难以纯化。目前尚无有具有生物活性的人重组 chemerin蛋白报道或上市。

发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种人重组chemerin蛋白。
为此， 一方面，本发明公开了一种人重组chemerin蛋白，为如下(a)或(b)的蛋白质
(a) 其氨基酸序列如SEQIDNO.l所述的蛋白质；
(b) 在(a)中的氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有淋巴细胞趋化作用活性的由(a)衍生的蛋白质。
一方面，本发明公开了一种多核苷酸分子，其特征在于该多核苷酸分子编码本发明所述
人重组chemerin蛋白。
在一实施例里，所述多核苷酸分子的碱基序列如SEQ ID N0.2。
一方面，本发明公开了一种包含本发明所述多核苷酸分子的重组表达载体。
在实施方式中，所述重组表达载体可为原核表达载体或真核表达载体，其中优选原核
表达载体，最优选pET28a质粒。
一方面，本发明公开了一种包含本发明所述重组表达载体的转化体。 在一实施方式中，所述转化体为大肠杆菌。
另一方面，本发明公开了一种本发明所述人重组chemerin蛋白的制备方法，包括如下
步骤
a) 人重组Chemerin蛋白表达载体的构建；
b) 人重组Chemerin蛋白转化体的制备；
c) 人重组Chemerin蛋白的表达；
d) 人重组Chemerin蛋白的纯化。
在一实施方式中，所述人重组Chemerin蛋白表达载体为包含编码本发明所示蛋白的 DNA的表达载体，其中所述重组表达载体可为原核表达载体或真核表达载体，优选原核表 达载体，最优选pET28a质粒。
在一实施方式中，所述人重组Chemerin蛋白转化体是包含人重组Chemerin蛋白表达 载体的大肠杆菌。人重组Chemerin蛋白表达载体优选为包含编码SEQ ID NO.l所述人重 组chemerin蛋白DNA的表达载体。
在一实施方式中，在步骤c)后和步骤d)前，还包括人重组Chemerin蛋白的变性及复性 步骤所述大肠杆菌破菌并收集包涵体，所述包涵体溶解至盐酸胍变性溶液中变性，然后 采用复性液复性人重组Chemerin蛋白，其中复性液为Tris-HC1缓冲液并含有谷胱甘肽氧 化还原系统，pH值在8. 0以上，其优选配方为0. lMTris-HCl， ImM GSH， 0. ImM GSSG。
发明人发现采用此缓冲液体系可保证复性出来的人重组Chemerin蛋白在pH调整至7. 0 以下时仍然保持可溶形式，而在其它一些复性液体系下，复性之后的蛋白质在pH调整至 7.0以下时，人重组Chemerin蛋白不可逆的沉淀。
在一实施方式中，所述人重组Chemerin蛋白的纯化步骤，包括 (1)阴离子交换柱纯化
人重组Chemerin样品上阴离子交换柱，洗脱缓冲液A洗脱，收集蛋白洗脱液；
其中，洗脱缓冲液A为Tris-HCl缓冲液，pH6.5-8.0，优选为20mM Tris-HCl， ImM EDTA,25mMNaCl，pH7.0。
(2)阳离子交换柱纯化
(1)所得的蛋白洗脱液调节pH至4.5，上阳离子交换柱，洗脱缓冲液B， 1.0ml/min洗脱， 收集电导〉60mS/cm的洗脱峰。
其中，洗脱缓冲液B为醋酸盐缓冲液，pH3.0-5.0，优选50mMNaAc-HAc, lmMEDTA， pH4.5。
本领域技术人员均了解，真核蛋白新生的多肽链大多数是没有功能的，必须加工修饰 才能转变为有活性的蛋白质，如磷酸化、糖基化等修饰并切除新生肽链非功能所需片段， 为有功能的蛋白质。原核表达系统工艺成熟、成本低廉，但原核表达系统缺少这些加工修 饰功能，常导致原核表达系统中合成的真核蛋白或因折叠方式不正确，或因折叠效率低下， 结果使得蛋白活性低或无活性。
本发明首次公开了人重组chemerin蛋白、重组载体和转化体及其制备方法。本发明所 提供的人重组chemerin蛋白为直接具有活性的形式。本发明所述制备人重组chemerin蛋 白的方法，工艺简单、成本低廉，不需要酶切等额外的步骤，所生产的重组chemerin蛋 白产品纯度达到98%以上，内毒素含量低，活性高。这为chemerin蛋白在新药研发和检测 试剂的应用提供了丰富的、高质量的原料。


图l.PCR电泳图。
图2. pET28a重组质粒的示意图。
图3.人重组Chemerin蛋白SDS-PAGE电泳图。
图4.人重组Chemerin蛋白毛细管蛋白电泳图。
图5.人重组Chemerin蛋白对于小鼠腹腔巨噬细胞的趋化作用。
具体实施例方式
下文将进一步详细讨论本发明的多个方面。
通过从酵母、如细菌的微生物或人或动物细胞系中分泌，可产生重组分子形式的本发 明的人重组chemerin蛋白。任选从宿主细胞中分泌多肽。
许多表达系统是已知的和可用的，包括细菌(例如大肠杆菌和枯草芽袍杆菌)，酵母(例 如酿酒酵母、乳克鲁维酵母和巴斯德毕赤酵母)，丝状真菌(例如曲霉)，植物细胞，动物细胞和昆虫细胞。
本发明包括编码本发明的人重组chemerin蛋白的DNA以及含有这些DNA的载体、 转化体。
本发明中，转化体(transformant)，即带有异源DNA分子的受体细胞。
本发明还包括通过合成和重组技术生产本发明的人重组chemerin蛋白的方法。通过本 领域已知的方法可以分离和纯化多核苷酸(DNA或RNA)、载体、宿主细胞和生物体。
用于本发明的载体可以是如噬菌体、质粒、粘粒、微型染色体、病毒或逆转录病毒载 体。可用于克隆和/或表达本发明的多核苷酸的载体是能在需复制和/或表达多核苷酸的 宿主细胞中复制和/或表达多核苷酸的载体。 一般说来，多核苷酸和/或载体可用于任何 真核或原核细胞，包括哺乳动物细胞(如人(如HeLa)、猴(如Cos)、兔(如兔网织红 细胞)、大鼠、仓鼠(如CH0、 NS0和幼仓鼠肾细胞)或小鼠细胞(如L细胞))、植物细 胞、酵母细胞、昆虫细胞或细菌细胞(如大肠杆菌)。有关适用于多种类型宿主细胞的适 当载体的例子可参见例如F. Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology . Greene Publishing Associates and Wiley_Interscience (1992)禾口 Sambrook et al. (1989)。可以使用含有这些多核苷酸的宿主细胞来大量表达可用于例如药物、诊断试 剂、疫苗和治疗剂的蛋白质。
已开发出多种方法用于经由互补的粘性末端使DNA与载体可操作相连。例如，可在欲 插入载体DNA内的DNA区段添加互补的同聚体序列片段。然后通过互补同聚体尾之间的 氢键连接载体和DNA区段以形成重组DNA分子。
含有一或多种限制性位点的合成接头提供了另一种连接DNA区段与载体的方法。用噬 菌体T4 DNA聚合酶或大肠杆菌DNA聚合酶I处理通过内切核酸酶限制性消化产生的 DNA区段，所述的两种聚合酶用其3'，5'-核酸外切活性除去突出的Y-单链末端，并用 其聚合活性补平3'-凹端。因此，这些活性的联合产生了平端DNA区段。然后在能催化 平端DNA分子连接的酶，如噬菌体T4 DNA连接酶的存在下将平端区段与大摩尔过量的 接头分子一起保温。因此，反应产物是末端携有聚合接头序列的DNA区段。然后用适当 的限制性酶裂解这些DNA区段，并连接至已用酶裂解的表达载体中，所述酶能产生与所 述DNA区段相容的末端。从多个商家可以买到含有多个限制性内切核酸酶位点的合成接 头。
多核苷酸插入物应该可操作地连接于同表达多核苷酸的宿主细胞相容的适当启动子 上。启动子可以是强启动子和/或诱导型启动子。列举的一些启动子的例子包括噬菌体久 PL启动子、大肠杆菌lac、 trP 、 phoA、 tac启动子、SV40早期和晚期启动子以及逆转 录病毒LTR启动子。其它适当启动子是本领域技术人员已知的。表达重组载体进一步含有转录起始、终止位点，并在转录区含有用于翻译的核糖体结合位点。重组载体表达的转 录物的编码部分可包括位于起点处的翻译起始密码子和适当地位于被翻译多肽的末端的 终止密码子(UAA , UGA或UAG)。
如上所述，表达载体可包括至少一个选择标记。所述标记包括对真核细胞培养物而言 的二氢叶酸还原酶、G418 、谷氨酰胺合酶或新霉素抗性；以及用于大肠杆菌和其它细菌 培养的四环素、卡那霉素或氨卞青霉素抗性基因。适当宿主的代表性例子包括但不限于 细菌细胞，如大肠杆菌、链霉菌和鼠伤寒沙门氏菌细胞；真菌细胞，如酵母细胞(如酿酒 酵母或巴斯德毕赤酵母)；昆虫细胞，如果蝇S2和夜蛾SF9细胞；动物细胞，如CH0， COS, NS0 ， 293和Bowes黑素瘤细胞；和植物细胞。上述宿主细胞的适当培养基和培养条件 是本领域巳知的。
本发明还包括含有本发明的核苷酸序列的宿主细胞，所述核苷酸序列经本领域已知的 技术与一或多种异源控制区(如启动子和/或增强子)可操作相连。可以选择能调节插入 的基因序列的表达，或能按照所需的特殊方式修饰和加工基因产物的宿主菌株。在某些诱 导物的存在下，某些启动子启动的表达会升高；因此，可以控制经基因改造的多肽的表达。 另外，不同宿主细胞具有特征性的和特殊的翻译、翻译后加工和修饰(如磷酸化、裂解) 蛋白质的机制。可以选择适当的细胞系以确保对表达的外源蛋白质进行合乎需要的修饰和 加工。
通过磷酸钙转染、DEAE-葡聚糖介导的转染、阳离子脂质介导的转染、电穿孔、转导、 感染或其它方法，即可将本发明的核酸和核酸重组载体导入宿主细胞。所述方法描述于多 个标准的实验室手册中，如Davisetal.， BasicMethods In Molecular Biology ( 1986 )。
编码本发明的人重组chemerin蛋白的多核苷酸可以与含有选择标记的载体连接以在 宿主中增殖。 一般说来，可在沉淀物，如磷酸钙沉淀物或其与带电脂质的复合物中导入质 粒载体。如果载体是病毒，可使用适当的包装细胞系在体外对其进行包装，再转导至宿主 细胞。
通过众所周知的技术可以鉴定出被成功转化的细胞，即含有本发明的DNA重组载体的 细胞。例如，可培养导入表达重组载体所得的细胞以产生所需多肽。收集并裂解细胞，使 用如Southern ( 1975 ) J. Mol. Biol. 95， 503或Berent et al (1985) Biotech. 3, 208 所述的方法，检测其DNA内容物中DNA的存在。或者，使用抗体检测上清液中蛋白质的存 在。
通过众所周知的方法从重组细胞培养物中回收和纯化本发明的人重组chemerin蛋白 较为有利，所述方法包括硫酸按或乙醇沉淀、酸提取、阴离子或阳离子交换层析、磷酸纤 维素层析、疏水作用层析、亲和层析、羟基磷灰石层析、疏水电荷作用层析和凝集素层析。在一些实施方案中，可使用高效液相层析(HPLC)进行纯化。 '
在一些实施方案中，可使用上述的一种或多种层析方法纯化本发明的人重组chemerin 蛋白。在其它实施方案中，可使用下述的一种或多种层析柱纯化本发明的人重组chemerin 蛋白，所述层析柱有 Q s印harose FF柱、SP sepharose FF柱、Q s印harose High Performance柱、Blue sepharose FF柱、Blue柱、Phenyl Sepharose FF柱、DEAE Sephaxose FF或Methyl柱。
另外，可使用国际公开号W000/44772 (全文列入本文作为参考)中描述的方法纯化本 发明的人重组chemerin蛋白。本领域技术人员可以容易地改动其中所述的方法以用于纯 化本发明的人重组chemerin蛋白。可以从包括例如细菌、酵母、高等植物、昆虫和哺乳 动物细胞的原核或真核宿主经重组技术产生的产物中回收本发明的人重组chemerin蛋白。
无需进一步描述，可以相信本领域技术人员可使用上文的描述和下文性的实施例来制 备和利用本发明中检测到的改变并且实践所要求的方法。因此，下述工作实施例具体描述 了本发明的某些实施方案，不能将其看成是对其余内容的限制。
实施例l.人重组Chemerin蛋白表达载体的构建
从人类肝脏cDNA中用引物5，-CATGCCATGGAGCTCACGGAAGCCCAGCG-3' ( SEQ IDN0.4)和反向引物5，-CCGGAATTCTTAGGAGAAGGCGAACTGTCCAG-3， ( SEQ ID N0.5)(由上海生工合成)PCR出人Chemerin基因。引物中加下划线的部分是Ncol和 EcoRI的酶切位点。PCR条件为(95。C5分钟94。C20秒钟，63。C30秒钟，72°C 30秒 钟，30循环；72。C10分钟)。PCR产物凝胶电泳，回收约500bp的DNA片段(见图1)， 然后被包装进入pTA2载体并测序(Invitrogene)。序列与SEQ ID N0.2 —致的菌落抽提质 粒，以Ncol和EcoRI双酶切并将酶切下来的片段包装进入Ncol和EcoRI双酶切的pET28a 质粒。将pET28a质粒以化学转染或电转染的方法包装进感受态的BL21。以卡拉霉素平板 挑选阳性克隆，并将阳性克隆抽提质粒，以Ncol和EcoRI双酶切验证正确包装的质粒。
实施例2.人重组Chemerin蛋白的表达
实施例1制备的工程菌株在LB培养基(1% NaCl; 1% Tryptone; 0.5% Yeast Extract; pH7.0)中培养至OD600-0.6左右时，加入IPTG进行诱导(我们使用的是ImM浓度，然 而，更高或者更低的浓度也是适用的)。诱导在37-42。C下摇床培养进行4小时。诱导结束 后离心收集菌体，并以lxPBS (137mMNaCl; 2.7mMKCl; 4.3mMNa2HP04; 1.4mMKH2P04; pH7.4)进行洗涤。实施例3.人重组Chemerin蛋白的变性及复性
实施例2中离心收集的菌体以超声的方式进行破菌并收集包涵体(新芝JY92-2D)， 500W，适量超声。以3秒超声3秒休息为一个循环，共300个循环。超声缓冲液lxPBS; 1 mM EDTA; 0.1 mM PMSF; pH7.4。更强烈或者更温和的超声条件都是适用的。包涵体以 "PBS洗涤后，以10倍体积的变性缓冲液溶解(6M盐酸胍；lmM EDTA; 50mM NaCl; 50mM Tris-HCl; pH8.0)。包涵体充分溶解后再将变性液滴加至复性液中(O.IM Tris-HCl; lmMGSH;0.1mMGSSG;pH9.5)，复性时需严谨控制蛋白浓度，最佳浓度为10-100ug/mL， 然而，更高或者更低的浓度也是适用的。
发明人研究表明，复性液为Tris-HCl缓冲液并含有谷胱甘肽氧化还原系统，pH值在9. 0 以上，可保证复性出来的蛋白在pH调整至8.0以下时仍然保持可溶形式，而在其它一些 复性液体系下，复性之后的蛋白质在pH调整至8. 0以下时，蛋白不可逆的沉淀。(见表1.) _表l.复性液对人重组Chemerin蛋白可溶性的影响_
先复性于(50mM NaH2PO4pH10.7，
lmM EDTA， 50mMNaCl)，然后 等体积稀释至 (20mM Tris-HCl pH 8.0, lmM EDTA)
复性液
O.IM Tris-HCl; lmMGSH;O.lmM GSSG; pH9.5
25mM脇P(X pHlO. 7， lmMEDTA， 25mM NaCl
20mM Tris-HCl pH 8.0, lmM EDTA
pH<8.0时，人重组 Chemerin蛋白的可 溶性
+
注"+ "表示可溶；"—"表示不溶<
实施例4.人重组Chemerin蛋白的纯化
实施例3所制备的人重组Chemerin蛋白复性液在15000RPM离心30分钟后，取上清 以醋酸调节pH至7.5后，进行离子交换柱纯化。步骤如下 (1)阴离子交换柱DEAE/Q柱过柱纯化
a) 以Wash Buffer 1 (20mM Tris-HCl, lmM EDTA, 25mM NaCl ， pH7.5)平衡柱床将 A\B泵放入Wash Buffer 1中，流速各50%，以Wash buffer 1清洗整个管路及柱子 4-5个柱床体积，直至电导、UV值平衡。b) 上样将A泵放入人重组Chemerin样品内，调节进样为A泵100。/。， B泵0%。
c) 上样过程中收集Flow Through,作为S柱上样的人重组Chemerin样品。
d) Flow Through以醋酸调节pH至4.5 。
(2) 阳离子交换柱CM/S柱过柱纯化
a) 以Wash Buffer 2 (50mM NaAc-HAc， ImM EDTA, pH4.5 )平衡柱床将A\B泵放入 Wash Buffer 2中，流速各50%，以Wash buffer 2清洗整个管路及柱子4~5个柱床 体积，直至电导、UV值平衡。
b) 上样将A泵放入样品内，B泵放入Wash Buffer 2+1M NaCl (50mM NaAc-HAc, ImM EDTA, 1M NaCl, pH4.5)内，调节进样为A泵100%, B泵0%。
c) 上样结束后以Wash Buffer 2平衡柱床，冲洗并平衡柱子2~3个柱床体积，直至电 导、UV值平衡。
d) 洗脱条件B泵20。/。-100。/。， l%/min， 1.0 ml/min洗脱，出峰时收集洗脱峰。在我 们的方法中，收集电导〉60mS/cm的洗脱峰。
(3) 纯化后蛋白的处理
a) 纯化后的人重组Chemerin蛋白以聚乙二醇20000浓縮，再以pH7.4的1><PBS透析。
b) 透析后的蛋白浓度可达lmg/mL以上，纯度可达98%以上。蛋白可直接以液氮速冻 后置于-80。C低温冰箱保存。
实施例5. SDS-PAGE电泳和毛细管电泳检测
按照常规SDS-PAGE电泳操作，进行SDS-PAGE电泳。
结果见图3:第l道分子量标记。第2道经IPTG诱导后的工程菌株超声之后的上 清。第3道经IPTG诱导后的工程菌株超声之后的包涵体沉淀。第4道阳离子交换柱
洗脱下来的纯化的人重组Chemerin蛋白。第5道纯化的人重组Chemerin蛋白以聚乙二 醇20000浓縮之后再以PBS透析之后的蛋白。蛋白纯度经BandScan软件分析其纯度可达 98%以上。
实施例4制备的人重组Chemerin蛋白进行毛细管电泳检测，条件为Electrophoresis system ACS200, China装备UV检测212nm。毛细管长度53厘米，有效长度44厘米。电 泳缓冲液50mM甲酸缓冲液，pH3.5。电压25kV，电流110uA。结果见图4，表明实施 例4制备的人重组Chemerin蛋白其纯度高。
实施例6.人重组Chemerin蛋白内毒素检测
采用鲎试剂(厦门鲎试剂实验厂有限公司)，检测了实施例4制备的三批人重组Chemerin蛋白的内毒素含量，分别为0.641 E.U.Aig， 0.603 E.U,/ug和0.685 E.U./ug。
实施例7.人重组Chemerin蛋白活性检测
实施例4制备的人重组Chemerin蛋白对于小鼠腹腔巨噬细胞的趋化作用，趋化作用以 最大趋化作用的百分比显示。在Transwell (Costar 3422， 8微米孔径，膜直径6.5毫米) 上室加入4x105个重悬于含10%FBS的RPMI 1640培养基内的小鼠腹腔巨噬细胞，体积为 200uL。下室加入600uL含10%FBS的RPMI 1640培养基，并含不同浓度的人重组Chemerin 蛋白。趋化结束后将趋化膜取下，擦去上表面黏附的细胞，下表面黏附的细胞即为被趋化 的细胞。在显微镜下计数5个随即视野。每个浓度测试了三个复孔。
结果显示，人重组Chemerin蛋白对于小鼠腹腔巨噬细胞显示了较强的趋化作用。ED50 经计算为l-2ng/mL。
实例8人重组Chemerin第六位氨基酸由Ala改为Gly
将实施例1中所述的PCR目的基因片段自起始密码子ATG之后第十四位碱基以定点突 变的方法改成G，艮卩(ATGGAGCTCACGGAAGCC)改为(ATGGAGCTCACGGAAGCC)， 其它步骤同实施例1一4，表达并纯化后的蛋白质序列(SEQIDNO.3)第六位由Ala变为 Gly ，艮卩(Met Glu Leu Thr Glu Ala Gin Arg Arg Gly Leu)成为(Met Glu Leu Thr Glu Gly Gin ArgArgGlyLeu)。对这一纯化后的蛋白质采用了实施例7中所述方法，在变异后的人重组 Chemerin蛋白浓度为l,10,100ng/mL时，其趋化活性(按照被区划成功穿越Transwell膜孔 的细胞来计算)分别相当于对照的2倍，3倍及3.6倍，与实施例4制备的人重组Chemerin 蛋白相比无显著变化。
本发明的范围不受所述具体实施方案的限制，所述实施方案只作为阐明本发明各个方 面的单个例子，本发明范围内还包括功能等同的方法和组分。实际上，除了本文所述的内 容外，本领域技术人员参照上文的描述和附图可以容易地掌握对本发明的多种改进。所述 改进也落入所附权利要求书的范围之内。上文提及的参考文献皆全文列入本文作为参考。序列表
〈110〉再生医药有限公司
<120>人重组chemerin蛋白、重组载体和转化体及其制备方法 <130>序列表
<160> 5
〈170〉 Patentln version 3. 3
<210〉 1
〈211〉 138
〈212〉 PRT
〈213> Homo sapiens
<220>
<221> MUTAGEN <222> (l)..(l)
〈400> 1
Met Glu Leu Thr Glu Ala Gin Arg Arg Gly Leu Gin Val Ala Leu Glu 15 10 15
Glu Phe His Lys His Pro Pro Val Gin Trp Ala Phe Gin Glu Thr Ser 20 25 30
Val Glu Ser Ala Val Asp Thr Pro Phe Pro Ala Gly lie Phe Val Arg 35 40 45
Leu Glu Phe Lys Leu Gin Gin Thr Ser Cys Arg Lys Arg Asp Trp Lys 50 55 60
Lys Pro Glu Cys Lys Val Arg Pro Asn Gly Arg Lys Arg Lys Cys Leu 65 70 75 80
Ala Cys lie Lys Leu Gly Ser Glu Asp Lys Val Leu Gly Arg Leu Val 85 90 95His Cys Pro lie Glu Thr Gin Val Leu Arg Glu Ala Glu Glu His Gin 100 105 110
Glu Thr Gin Cys Leu Arg Val Gin Arg Ala Gly Glu Asp Pro His Ser 115 120 125
Phe Tyr Phe Pro Gly Gin Phe Ala Phe Ser 130 135
〈210〉 2 〈211〉 425 <212> DNA
<213> Aritfical Sequence 〈400〉 2
ccalggagct cacgg肌gcc csgcgccggg gcctgcgiggt ggccctggag gaMttcacs 60 agcacccgcc cgtgcagtgg gccttccagg agaccagtgt ggagagcgcc gtggacacgc 120 ccttcccagc tgg组3ttt gtgaggctgg组tt iagct gcagcagaca兆ctgccgga 180 agagggactg gaagaaaccc gagtgcaaag tcaggcccaa tgggaggaaa cggaaatgcc 240 tggcctgcat caaactgggc tctgaggaca aagttctggg ccggttggtc cactgcccca 300 tagagaccca agttctgcgg gaggctgagg agcaccagga gacccagtgc ctcagggtgc 360 agcgggctgg tgaggacccc cacagcttct acttccctgg acagttcgcc ttctcctaag 420 aattc 425
〈210> 3
<211〉 138
<212> PRT
<213〉 Homo sapiens
<220>
〈221〉 MUTAGEN <222〉 (1). . (1)<220>
<221> MUTAGEN <222> (6),. (6)
<400〉 3
Met Glu Leu Thr Glu Gly Gin Arg Arg Gly Leu Gin Val Ala Leu Glu 15 10 15
Glu Phe His Lys His Pro Pro Val Gin Trp Ala Phe Gin Glu Thr Ser 20 25 30
Val Glu Ser Ala Val Asp Thr Pro Phe Pro Ala Gly lie Phe Val Arg 35 40 45
Leu Glu Phe Lys Leu Gin Gin Thr Ser Cys Arg Lys Arg Asp Trp Lys
50 55 60
Lys Pro Glu Cys Lys Val Arg Pro Asn Gly Arg Lys Arg Lys Cys Leu 65 70 75 80
Ala Cys lie Lys Leu Gly Ser Glu Asp Lys Val Leu Gly Arg Leu Val 85 90 95
His Cys Pro lie Glu Thr Gin Val Leu Arg Glu Ala Glu Glu His Gin 100 105 110
Glu Thr Gin Cys Leu Arg Val Gin Arg Ala Gly Glu Asp Pro His Ser 115 120 125
Phe Tyr Phe Pro Gly Gin Phe Ala Phe Ser 130 135
〈210〉 4 〈211〉 29 <212> DNA<213〉 Aritfical Sequence 〈400〉 4
catgccatgg agctcacgga agcccagcg 29
<210> 5 <211> 32 <212〉 DNA
<213〉 Aritfical Sequence <400> 5
ccggaattct taggagaagg cgaactgtcc ag 3权利要求
1.一种人重组chemerin蛋白，为如下(a)或(b)的蛋白(a)其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所述的蛋白；(b)在(a)中的氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有淋巴细胞趋化作用活性的由(a)衍生的蛋白。
2. —种编码权利要求1所述的人重组chemerin蛋白的多核苷酸分子。
3. —种包含权利要求2所述多核苷酸分子的重组表达载体。
4. 一种包含权利要求3所述重组表达载体的转化体。
5. —种权利要求l所述人重组chemerin蛋白的制备方法，包括如下步骤a) 人重组Chemerin蛋白表达载体的构建；b) 人重组Chemerin蛋白的表达；c) 人重组Chemerin蛋白的纯化。
6. 如权利要求5所述的制备方法，其特征在于所述人重组Chemerin蛋白表达载体为包 含编码权利要求1所述人重组chemerin蛋白DNA的表达载体。
7. 如权利要求5所述的制备方法，其特征在于所述表达载体可为原核表达载体或真核 表达载体。
8. 如权利要求5所述的制备方法，其特征在于所述表达载体可为pET28a质粒。
9. 如权利要求10所述的制备方法，其特征在于所述人重组Chemerin蛋白转化体是包 含编码权利要求1所述的人重组chemerin蛋白表达载体的大肠杆菌。
10. 如权利要求9所述的制备方法，其特征在于所述人重组Chemerin蛋白表达载体为 包含编码SEQ IDNO.l所述人重组chemerin蛋白DNA的表达载体。
11. 如权利要求9所述的制备方法，其特征在于在步骤c)后和步骤d)前，还包括人重 组Chemerin蛋白的变性及复性步骤所述大肠杆菌破菌并收集包涵体，所述包涵体溶解至 盐酸胍变性溶液中变性，然后采用复性液复性人重组Chemerin蛋白，其中复性液为 Tris-HCl缓冲液并含有谷胱甘肽氧化还原系统，pH 〉8.0。
12. 如权利要求11所述的制备方法，其特征在于所述复性液配方为0. lMTris-HCl， ImM GSH， 0. ImM GSSG， pH9.5。
13. 如权利要求5所述的制备方法，其特征在于所述人重组Chemerin蛋白的纯化步骤， 包括a.).阴离子交换柱纯化人重组Chemerin样品上阴离子交换柱，洗脱缓冲液A洗脱，收集蛋白洗脱液，其中，洗脱缓冲液A为Tris-HCl缓冲液，pH6.5-8.0; b).阳离子交换柱纯化蛋白洗脱液调节pH至4.5，上阳离子交换柱，洗脱缓冲液B1.0ml/min洗脱，收集 电导〉60mS/cm的洗脱峰，其中，洗脱缓冲液B为醋酸盐缓冲液，pH3.0-5.0。
14. 如权利要求13所述的制备方法，其特征在于所述阴离子交换柱为DEAE/Q柱。
15. 如权利要求13所述的制备方法，其特征在于所述洗脱缓冲液A为20mM Tris-HCl, lmM EDTA, 25mM NaCl, pH7.0。
16. 如权利要求13所述的制备方法，其特征在于所述阳离子交换柱为CM/S柱。
17. 如权利要求13所述的制备方法，其特征在于所述洗脱缓冲液B为50mM NaAc-HAc， ImMEDTA, pH4.5。
全文摘要
本发明属于基因工程技术领域，具体涉及人重组chemerin蛋白、重组载体和转化体及其制备方法。本发明首次公开了人重组chemerin蛋白、重组载体和转化体及其制备方法。本发明所提供的人重组chemerin蛋白为直接具有淋巴细胞趋化活性的形式。本发明所述制备人重组chemerin蛋白的方法，工艺简单、成本低廉，不需要酶切等额外的步骤，所生产的重组chemerin蛋白产品纯度达到98％以上，内毒素含量低，活性高。这为chemerin蛋白在新药研发和检测试剂的应用提供了丰富的、高质量的原料。
文档编号C07K14/435GK101619100SQ200810130458
公开日2010年1月6日 申请日期2008年7月4日 优先权日2008年7月4日
发明者砥 向, 伟 韩 申请人:再生医药有限公司