专利名称：：甘蔗宿根矮化病病菌多克隆抗体的制备方法
技术领域：
：本发明涉及多克隆抗体制备
技术领域：
，具体是关于甘蔗宿根矮化病病菌多克隆抗体的制备方法。
背景技术：
：甘蔗宿根矮化病USD)是甘蔗生产上最重要的一种细菌性病害，病原菌Lxx极细小，寄生于甘蔗木质部导管内。由于该病没有明显的外部和内部症状，且易与干單造成的症状相混，加上其主要通过带菌种茎和砍收工具传播，从而导致无意识的传播，造成病害蔓延，对甘蔗生产危害极大。该病通常造成甘蔗减产12—37%,在干單的情况下减产高达60y。，宿根性减弱，即使是无病的健康种苗在生产上使用5年后也是100%感病。由于该病原菌难分离培养，使RSD诊断很困难。传统上该病通常釆用剖茎检视和相差显微镜观察病原菌的诊断方法。但前者的准确性极差，后者的操作繁杂，检测的灵敏度也不高。随着免疫学技术在生物医学及动植物病原菌的检测上的广泛应用，将该技术用于甘蔗RSD的诊断已成为可能。该法具有可检测样品数多，操作简单,准确性高等特点，但受到需要特异性抗体的限制。目前，还尚未见有该抗体制备的报道，因此，迫切需要制备该病原菌的抗体，以满足在甘蔗科研及生产上对RSD病原诊断的需要。
发明内容本发明的目的在于提供一种甘蔗宿根矮化病病菌多克隆抗体的制备方法。该制备方法简单、成本低廉，用本方法制备的甘蔗多克隆抗体具有特异性高，纯度及效价高，可长期保存的优点，该抗体可以应用于甘蔗宿根矮化病病菌的检测。本发明的目的可通过下述技术方案来实现一种甘蔗宿根矮化病病菌多克隆抗体的制备方法，包括如下步骤(1)病原菌的分离培养，获取抗原；(2)取(l)的抗原与等量的弗氏完全佐剂混合，乳化，取混合液皮下多点免疫健康家兔；(3)2~3周后，取(1)的抗原与等量的弗氏不完全佐剂混合，乳化，取混合液对(2)的免疫家兔按(2)的相同剂量及方式进行再免疫，此步骤中，重复多次免疫，每次间隔为1~3周，测定效价达到要求后，心脏釆血，分离抗血清；(4)抗血清纯化、得到目标多克隆抗体；其中，步骤(1)的病原菌为甘蔗宿根矮化病病菌。步骤(1)中的病原菌的分离培养步骤为(1.1)蔗汁的获得砍取感病品种的成熟蔗茎，将其表面清洗干净；选取近基部的若干节提取带菌的蔗汁，将蔗汁盛于离心管中；(1.2)蔗汁的过滤及低速离心用滤纸过滤蔗汁，将获得的蔗汁分装至离心管里，低速离心后，将上清液转到新的离心管中，重复上述离心步骤一次；(1.3)病原菌的培养在无菌条件下，菌液经细菌过滤器过滤后用PBS缓冲液进行梯度稀释，再将各个梯度浓度的菌液点滴在SC培养基上，用封口膜对培养皿进行封口，倒置于263(TC恒温箱中进行培养；(1.4)病原菌的继代纯化在无菌条件下，挑取上述长出的单菌落到SC培养基上进行纯化培养；(1.5)扩大培养病原菌制备抗原在无菌条件下，挑取经纯化后的单菌落到SC液体培养基培养，待培养基变混浊时，收集菌液，高速离心，弃上清，用PBS缓冲液悬浮沉淀，获得抗原。步骤(4)中的抗血清纯化、获得目标多克隆抗体步骤为(4.l)取适量抗血清，加入等体积生理盐水后，再逐滴加入饱和硫酸铵溶液若干亳升，边加边搅拌，充分混合后，静置30minlh;(4.2)离心弃去沉淀，以除去杂蛋白，在上清液中再加饱和硫酸铵溶液，充分混匀后静置30minlh;(4.3)离心，弃上清，以生理盐水溶解沉淀后，再用饱和硫酸铵溶液进行沉淀；(4.4)离心，弃上清，按照(4.2)(4.3)步骤重复若干次，用生理盐水溶解沉淀，装入透析袋透析除盐；(4.5)最后以BaCl2检查透析液中的3042一或以纳氏试剂检查冊4+,直至无S042-或NH/出现为止;(4.6)离心去沉淀，上清液即为纯化的多克隆抗体IgG。本发明的突出的实质性特点和显著的进步在于本发明首次提出了甘蔗宿根矮化病病菌多克隆抗体的制备方法，在本发明中，甘蔗宿根矮化病病菌分离自甘蔗蔗汁，因而是蔗汁环境样品中甘蔗宿根矮化病病菌的代表菌群类型，基于此得到的多克隆抗体可特异性识别蔗汁中的甘蔗宿根矮化病病菌。此外，该制备方法还有简单、成本低廉的优点。用本发明制备的甘蔗多克隆抗体具有特异性高，纯度及效价高(大于10000)，可长期保存的优点，将其用于甘蔗科研及生产领域中甘蔗宿根矮化病病菌的免疫检测中，将具有精确性、灵敏度高等优势，应用前景广阔。具体实施例方式通过以下实施例对本发明作进一步的详细说明。实施例一一种甘蔗宿根矮化病病菌多克隆抗体的制备方法，按如下步骤进行(i)病原菌的分离培养，获取抗原；(i.i)蔗汁的获得于11一12月份，晴朗天气，砍取感病品种的成熟蔗茎,6去除表面杂质后，用洗洁剂将其表面清洗干净，晾干，用70%酒精擦拭表面进行消毒；把蔗茎切成510cm长后，纵向剖开，用钳子直接钳取蔗汁，蔗汁盛于50ml的离心管中。U.2)蔗汁的过滤及低速离心用滤纸过滤蔗汁，将过滤后的蔗汁转到新的离心管里，低速(2000rpm)离心5分钟，将上清液转到新的离心管中，重复上述离心步骤一次。(i.3)病原菌的培养在无菌条件下，菌液经0.45pm细菌过滤器过滤后用0.01M的PBS缓冲液进行梯度稀释，再将各个梯度浓度的菌液点滴到SC培养基，待菌液完全被培养基吸干后，用封口膜对培养皿进行封口，倒置于26~3(TC恒温箱中进行培养约20~35天，出现无色、圆形、点状大小，边缘整齐中间隆起的菌落，菌落直径约为0.1-0.5mm。(i.4)病原菌的继代纯化在无菌条件下，挑取上述长出的单菌落到SC培养基上进行纯化培养。(i.5)扩大培养病原菌制备抗原在无菌条件下，挑取经继代纯化后的单菌落，转入SC液体培养基，振荡培养约1020天。待培养基变混浊时，收集菌液，高速离心(12000rpin)10分钟，弃上清，用PBS缓冲液悬浮沉淀，获得抗原。(2)取抗原与等量的弗氏完全佐剂混合，乳化；取(1)的悬浮菌液(抗原)与等体积的弗氏完全佐剂(sigma公司，货号F5881)混合均匀，乳化后，选择健康家兔，取混合液按照lmL/kg体重以皮下多点注射的方式进行免疫。(3)2周后，取(1)的悬浮菌液(抗原)与等体积的弗氏不完全佐剂(sigma公司，货号F5506)混合均匀，乳化后，取混合液对(2)的免疫家兔按照lmL/kg体重以皮下多点注射的方式进行再免疫；在此步骤中，重复进行多次免疫，每次免疫间隔为2周，第5次免疫10天后，耳缘静脉釆集1-2mL血液，静置分离出血清后测定效价，具体步7a)酶标板的包被将菌液以PBS(0.01M,pH7.2~7.4)稀释至1:100、1:500、1:1000、1:3000，取100pL加入酶标板孔。37°C孵育4h6h进行包被。b)洗板孵育完毕后甩掉板孔中液体，以250pL/孔的PBS—T(PBS含0.05%Tween—20)洗涤3次，每次静置10~20s,完毕后用吸水纸拍干。c)封闭向酶标板孔中加入碳酸盐缓冲液(O.02M，pH9.0)150)iL/孔，37°C孵育lh。完毕后，甩掉孔中液体，按照步骤(b)进行洗板。d)加样将血清以PBS按照1:500、1:1000、1:3000、1:5000进行稀释后，以50nL/孔的量加入酶标板。e)反应37。C孵育lh后，进行洗板。f)加酶标二抗每孔加入用PBS3000倍稀释的酶标二抗lOOjaL,37°C反应30min后进行洗板。g)显色每孔加入显色液(sigma公司，货号T0440)IOO)liL，37。C显色反应15min。h)测定每孔加终止液(0.5M盐酸)50|liL终止反应，用酶标仪于450nm/630nm波长处测定OD值。表1是其中一次的测定数据。表1抗血清效价(OD值)测定数据示例<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>i)测定血清效价合格(血清稀释比例大于1:10000，OD值高于l.O)后，心脏采血，收集并分离血清。(4)抗血清纯化，获取目标多克隆抗体(4.1)取步骤(3)获得的血清20mL，加生理盐水20mL,再逐滴加入饱和硫酸铵溶液lGmL，边加边搅拌，充分混合后，静置30min。(4.2)3000rpm离心20min，弃去沉淀，以除去纤维蛋白。在上清液中再加饱和硫酸铵溶液30mL,充分混勾后静置30min。(4.3)3000rpm离心20min,弃上清，于沉淀中加20ml生理盐水，使之溶解，再加饱和硫酸铵溶液10mL,充分混匀后静置30min。(4.4)3000rpm离心20min，弃上清。重复步骤(4.3)2~3次后，用10mL生理盐水溶解沉淀，装入透析袋，在去离子水中透析过夜。然后于生理盐水中4'C透析24h，中间换液数次。(4.5)以1。/。BaCl2检查透析液中的S042—或以纳氏试剂检查NH4+(取3一4mL透析液，加试剂1~2滴,出现砖红色即认为有NH/存在)，直至无S042—或冊4+出现为止。(4.6)离心去沉淀，上清液即为纯化的多克隆抗体IgG。斑点酶标免疫试验(DB—EIA)压板取10~15张吸水纸，剪成与硝化纤维膜一样大小(硝化纤维膜的长度与宽度略小于压板的长宽度)，硝化纤维膜用蒸镏水浸泡23min,将硝化纤维膜附到一块带孔的压板上(注意膜与板上的孔对齐)，然后与吸水纸一起用压板压好,上紧螺丝。上样用微量移液器吸取100~130nL蔗汁样品点于板孔中，每孔点一个样。晾干将点好样的板，置于室温、通风的地方，待孔中的样液全部被硝化纤维膜和吸水纸吸干(l~2h)，用螺丝刀解开压板，取出硝化纤维膜。干燥将晾干后的硝化纤维膜，置于8(TC的恒温鼓风干燥箱中lh。封闭将硝化纤维膜置于3。/。的脱脂奶粉水溶液中，在摇床上摇动30min。洗膜取出硝化纤维膜，用蒸镏水冲洗3次。加入RSD兔抗体(一抗)将RSD兔抗体溶于PBST中，将冲洗干净的硝化纤维膜置于加入RSD兔抗体的PBST溶液中，并在摇床上温育l~2h。洗膜取出硝化纤维膜，用蒸镏水冲洗3次。加入羊抗兔碱性磷酸酶标记抗体(二抗)将碱性磷酸酶标记抗体溶于PBST中，将冲洗干净的硝化纤维膜置于加入碱性磷酸酶标记抗体的PBST溶液中，并在摇床上温育l2h。洗膜取出硝化纤维膜，用蒸镏水冲洗3次。加入底物显色将固蓝BB盐加入到底物工作液中，将硝化纤维膜在加入固蓝BB盐的底物工作液中温育，并在摇床上摇动l2h(置于黑暗处)。洗膜取出硝化纤维膜，用蒸镏水冲洗3次。漂白将冲洗后的硝化纤维膜在10%双氧水中漂白20min。晾干、拍照、记录结果(兰褐色为阳性)。实施例二一种甘蔗宿根矮化病病菌多克隆抗体的制备方法，其步骤与实施例一相同，主要区别在于步骤(l)中的(l.3)病原菌的培养步骤和(1.4)病原菌的继代纯化步骤中所用到的SC培养基为改良的SC培养基cornmealagar(15—18)g/L+Bacto—agar(3_5)g/L+Bacto—peptone(6—9)g/L+Bovineheminchloride15mg/L+MgSO4*7H2O(0.l—O.2)g/L+K2HP0413ml(0.1M储存液)/L十KH2P0487ml(O.IM储存液)/L;Glucose(0.5—2)g/L+Cysteine(1—2)g/L+Bovineserumalbumin2g/L，PH6.5—8.0;步骤(l)中的(1.5)扩大培养病原菌制备抗原步骤中所用到的液体SC培养基为改良的液体SC培养基Bacto—peptone(6—9)g/L+Bovineheminchloride15mg/L+MgS04*7H20(0.1—0.2)g/L+K2HPO413ml(0.1M储存液)/1>KH2P0487ml(0.1M储存液)/L;Glucose(0.5—2)g/L+Cysteine(l—2)g/L+Bovineserumalbumin2g/L,PH6.5—8.0。采用上述改良的sc培养基和改良的液体SC培养基进行病原菌的分离培养，能更快获取抗原。其它步骤和检测方法与实施例l相同。权利要求1.一种甘蔗宿根矮化病病菌多克隆抗体的制备方法，包括如下步骤(1)病原菌的分离培养，获取抗原；(2)取抗原与等量的弗氏完全佐剂混合，乳化，取混合液皮下多点免疫健康家兔；(3)2～3周后，取(1)的抗原与等量的弗氏不完全佐剂混合，乳化，取混合液对(2)的免疫家兔按(2)的相同剂量及方式进行再免疫，重复多次免疫，每次间隔1～3周，测定效价达到要求后，心脏采血，分离抗血清；(4)将(2)的抗血清纯化、获得目标多克隆抗体；其特征在于步骤(1)的病原菌为甘蔗宿根矮化病病菌。2.如权利要求1所述的甘蔗宿根矮化病病菌多克隆抗体的制备方法，其特征在于步骤(1)中的病原菌的分离培养步骤(1.1)蔗汁的获得砍取感病品种的成熟蔗茎，将其表面清洗干净，选取近基部的若干节提取带菌的蔗汁，将蔗汁盛于离心管中；(1.2)蔗汁的过滤及低速离心用滤纸过滤蔗汁，将获得的蔗汁分装至离心管里，低速离心后，将上清液转到新的离心管中，重复上述离心步骤一次；(1.3)病原菌的培养在无菌条件下，菌液经细菌过滤器过滤后用PBS缓冲液进行梯度稀释，再将各个梯度浓度的菌液点滴在SC培养基上，用封口膜对培养皿进行封口，倒置于263(TC恒温箱中进行培养；(1.4)病原菌的继代纯化在无菌条件下，挑取上述长出的单菌落到SC培养基上进行纯化培养；(1.5)扩大培养病原菌制备抗原在无菌条件下，挑取经纯化后的单菌落到SC液体培养基振荡培养，待培养基变混浊时，收集菌液，高速离心，弃上清，用PBS缓冲液悬浮沉淀，获得抗原。3.如权利要求2所述的甘蔗宿根矮化病病菌多克隆抗体的制备方法，其特征在于所述的SC培养基为改良的SC培养基cornmealagar(15—18)g/L+Bacto—agar(3—5)g/L+Bacto—peptone(6—9)g/L+Bovineheminchloride15mg/L+MgSCWH20(0.1—0.2)g/L+K2HP0413ml(0.IM储存液)/L+K跳87ml(0.1M储存液)/L;Glucose(0.5—2)g/L+Cysteine(1—2)g/L+Bovineserumalbumin2g/L;PH6.5—8.0;所述的SC液体培养基为改良的SC液体培养基Bacto~peptone(6—9)g/L+Bovineheminchloride15mg/L+MgS04*7H20(0.1—0.2)g/L+K2HP0413ml(0.lM储存液)/L+KH2P0487ml(0.1M储存液)/L;Glucose(0.5—2)g/L+Cysteine(1—2)g/L+Bovineserumalbumin2g/L;PH6.5—8.0。4.如权利要求1或2或3所述的甘蔗宿根矮化病病菌多克隆抗体的制备方法，其特征在于步骤(4)的抗血清纯化、获得目标多克隆抗体步骤如下(4.l)取适量抗血清，加入等体积生理盐水后，再逐滴加入饱和硫酸铵溶液若干亳升，边加边搅拌，充分混合后，静置30minlh;(4.2)离心弃去沉淀，以除去杂蛋白，在上清液中再加饱和硫酸铵溶液，充分混匀后静置30minlh;(4.3)离心，弃上清，以生理盐水溶解沉淀后，再用饱和硫酸铵溶液进行沉淀；(4.4)离心，弃上清，按照(4.2)(4.3)步骤重复若千次，用生理盐水溶解沉淀，装入透析袋透析除盐；(4.5)最后以BaCl2检查透析液中的S042—或以纳氏试剂检查NH/，直至无S0/一或冊4+出现为止；(4.6)离心去沉淀，上清液即为纯化的多克隆抗体IgG。全文摘要本发明涉及甘蔗宿根矮化病的防治
技术领域：
，提出甘蔗宿根矮化病病菌多克隆抗体的制备方法，其步骤包括(1)病原菌的分离培养，获取抗原；(2)取抗原与等量的弗氏完全佐剂混合，乳化，免疫家兔；(3)取抗原与等量的弗氏不完全佐剂混合，乳化，再免疫家兔，重复免疫多次，测定效价达到要求后，心脏采血，分离抗血清；(4)抗血清纯化、获得目标多克隆抗体。在本发明中，甘蔗宿根矮化病病菌分离自甘蔗蔗汁，基于此得到的多克隆抗体可特异性识别蔗汁中的甘蔗宿根矮化病病菌。用本发明制备的甘蔗宿根矮化病病菌多克隆抗体，具有特异性高，纯度及效价高，可长期保存的优点，这对今后在甘蔗科研及生产上用免疫学方法检测病原菌进行甘蔗宿根矮化病(RSD)诊断具有重要的现实意义。文档编号C07K16/12GK101560256SQ20091003984公开日2009年10月21日申请日期2009年5月27日优先权日2009年5月27日发明者万宇平,何方洋,余厚美,睿刘,杨湛端,沈万宽,潘永保,邓海华,陈健文,齐永文申请人:广州甘蔗糖业研究所