一种稳定性同位素¹⁵N标记八肽GFL的制备方法

专利名称：一种稳定性同位素¹⁵N标记八肽GFL的制备方法
技术领域：
本发明涉及稳定性同位素标记化合物，尤其涉及一种稳定性同位素"N标记八 肽GFL的制备方法。
背景技术：
随着后基因组计划的到来，蛋白质组研究成为生命科学的最前沿。在用核磁共 振(NMR)研究蛋白质结构以及定量蛋白质组学方面，稳定同位素(2H、 13C、 15N) 标记的多肽和蛋白质都大有用武之地，此类化合物已成为蛋白质组学领域不可或缺 的重要工具。
目前，标记多肽作为定量蛋白质组中的"化学标签"广泛应用于生物示踪与生 物检测等领域。然而，有关于15N稳定性同位素标记八肽GFL的制备工艺还未见 相关报道。

发明内容
本发明的目的就是为了克服上述现有技术存在的缺陷而提供一种工艺合理、产 品纯度高的稳定性同位素15N标记八肽GFL的制备方法。 本发明的目的可以通过以下技术方案来实现
一种稳定性同位素15N标记八肽GFL (拟生长因子)的制备方法，其特征在于， 该方法采用Fmoc(9-芴甲氧羰酰基)固相肽合成法，以Wang-树脂为载体，以Fmoc 保护的氨基酸为原料，该原料中至少有一个氨基酸为稳定性同位素"N标记的，以 HBTU (2- (lH-苯并三唑)-N， N， N，， N，-四甲基脲六氟磷酸盐)/HOBt (l-羟基 苯并三唑)/DIEA (N， N-二异丙基乙胺)为縮合试剂，逐一接入氨基酸，氨基酸 接完后经剪切、纯化制得稳定性同位素15N标记八肽GFL。
所述的方法具体包括以下步骤 (1) Fmoc-Ile-Wang树脂的制备1) 将1.5mmol/g取代量的Wang-树脂放入干燥的多肽合成管中；
2) 用二氯甲烷溶胀10 60min，用水泵抽干溶剂二氯甲垸，换用DMF洗涤5 次，每次用量2 5ml;
3 )取2~10叫HBTU，加2~10eq Fmoc-Ile-OH，少量DMF溶解，加5~15eq DIEA， 混匀；
4) 将上述溶液加入树脂中，反应l-2小时；
5) DMF 5mlx5min洗涤；
6) 用2 10eq苯甲酸酐或醋酸酐加leq吡啶封闭树脂上未反应的羟基，DMF 作反应溶剂，反应l小时；
7) 用DMF、 DCM (二氯甲垸)、甲醇或正己垸5mlx5min洗涤，真空干燥， 得到Fmoc-Ile-Wang树脂；
(2)稳定性同位素15N标记八肽GFL的制备 采用固相多肽合成的方法，从Fmoc-Ile-Wang树脂出发，用多肽合成管制备， 具体如下
1) 将0.1mmolFmoc-Ile-Wang树脂放入干燥的反应器中；
2) 用二氯甲垸溶胀10 60min， DMF洗涤5mlx5min;
3) 30。/。哌啶-DMF溶液脱Fmoc， 5minx2次，溶液体积为溶胀后树脂体积的 2-3倍；
4) DMF洗涤5mlx5min;
5) 取2 5eq HBTU， 2~5叫HOBt， 2~5叫Fmoc-Arg (Pbf)隱OH，少量DMF 溶解，加4 10eqDIEA，混匀;
6) 将上述溶液加入树脂中，反应1 2小时；
7) 合成完毕，DMF洗涤5mlx5min， 30。/。哌啶-DMF溶液脱Fmoc， 5minx2次， 溶液体积为溶胀后树脂体积的2-3倍；
8) 用DMF、 DCM、甲醇或正己烷洗涤5mlx5min;
9) 取2 5eq HBTU， 2~5eq HOBt， 2 5叫Fmoc画Arg (Pbf)誦OH，少量DMF 溶解，加4 10eqDIEA，混匀;
10) 将上述溶液加入树脂中，反应1 2小时；
11) 合成完毕，DMF洗涤5mlx5min;
12) 30M哌啶-DMF溶液脱Fmoc， 5minx2次，溶液体积为溶胀后树脂体积的2-3倍；
13) 用DMF、 DCM、甲醇或正己烷洗涤5mlx5min;
14) 取2~5eq HBTU， 2 5eq HOBt， 2~5叫Fmoc-Leu國OH，少量DMF溶解， 加4 10eqDIEA，混匀；
15) 将上述溶液加入树脂中，反应1 2小时；
16) 合成完毕，DMF洗涤5mlx5min;
17) 30。/。哌啶-DMF溶液脱Fmoc， 5minx2次，溶液体积为溶胀后树脂体积的 2-3倍；
18) 用DMF或DCM或甲醇或正己烷洗涤5mlx5min;
19) 取2 5叫HBTU， 2 5叫HOBt， 2~5叫Fmoc-Phe-OH，少量DMF溶解， 加4 10eqD正A，混匀；
20) 将上述溶液加入树脂中，反应1 2小时；
21) 合成完毕，DMF洗涤5mlx5min;
22) 30y。哌啶-DMF溶液脱Fmoc， 5minx2次，溶液体积为溶胀后树脂体积的 2-3倍；
23) 用DMF、 DCM、甲醇或正己烷洗涤5mlx5min;
24) 取2 5eqHBTU， 2~5叫HOBt， 2~5叫Fmoc-Gly-OH，少量DMF溶解， 加4 10eqDIEA，混匀；
25) 将上述溶液加入树脂中，反应1 2小时；
26) 合成完毕，DMF洗涤5mlx5min;
27) 30n/。哌啶-DMF溶液脱Fmoc， 5minx2次，溶液体积为溶胀后树脂体积的 2陽3倍；
28) 用DMF、 DCM、甲醇或正己烷洗涤5mlx5min;
29) 取2 5eqHBTU， 2 5叫HOBt， 2~5eq Fmoc-Gly-OH，少量DMF溶解， 加4 10eqD正A，混匀；
30) 将上述溶液加入树脂中，反应1 2小时；
31) 合成完毕，DMF洗涤5mlx5min;
32) 30。/。哌啶-DMF溶液脱Fmoc， 5minx2次，溶液体积为溶胀后树脂体积的 2-3倍;
33) 用DMF、 DCM、甲醇或正己烷洗涤5mlx5min;34) 取2 5eqHBTU， 2 5叫HOBt， 2~5eq Fmoc-Tyr (tbu) -OH，少量DMF 溶解，加4 10eqDIEA，混匀；
35) 将上述溶液加入树脂中，反应1 2小时；
36) 合成完毕，DMF洗涤5mlx5min;
37) 30y。哌啶-DMF溶液脱Fmoc， 5minx2次，溶液体积为溶胀后树脂体积的 2-3倍；
38) 用DMF、 DCM、甲醇或正己烷洗涤5mlx5min;
39) 用甲醇收縮树脂，加入少许甲醇，反应5min，重复2 5次；
40) 用正己烷洗涤2 5次后，真空干燥；
41) 剪切、纯化将干燥后的树脂置于离心管中，加入剪切液静置反应1~5 小时，反应完过滤，向滤液中加入5 10倍滤液体积的冷乙醚，沉淀产生，离心， 收集沉淀，烘干得到稳定性同位素15N标记八肽GFL;
上述步骤(1) 3)的Fmoc-Ile國OH、步骤(2) 5)的Fmoc-Arg (Pbf) -OH、 步骤(2) 9)的Fmoc-Arg (Pbf) -OH、步骤(2) 14)的Fmoc-Leu-OH、步骤(2) 19)的Fmoc-Phe-OH、步骤(2)24)的Fmoc-Gly-OH、步骤(2)29)的Fmoc-Gly-OH、 步骤(2) 34)的Fmoc-Tyr (tbu) -OH中至少有一个为稳定性同位素"N标记的氨 基酸。
所述的步骤(2) 1)中的O.lmmolFmoc-Ile-Wang树脂根据取代量A计算称量， 所述的取代量A的测定如下
(1) 称量干燥的Fmoc-Ile-Wang树脂，获得树脂质量，以mg计；
(2) 按3mL/1.5mgFmoc-Ile-Wang树脂加入20Q/。体积比的哌啶-DMF，间歇 摇动2-3h;
(3) 以20。/。体积比的哌啶-DMF作参比溶液，测量290nm的吸光度N;
(4) 以下列公式计算取代量
A-取代量(mmol/g) = (Nxl0) / (质量xl.75)。
所述的步骤(2) 41)的剪切液为混合均匀的三氟醋酸，三异丙基硅垸和水， 所述的三氟醋酸的体积比为50~80%，所述的三异丙基硅烷的体积为2~10%。
与现有技术相比，本发明工艺合理，操作简单，节约成本，解决了现有合成反 应中丰度稀释、纯度不高、工艺繁琐、原料消耗大等问题，获得的稳定性同位素 15N标记八肽GFL纯度高(可达99%以上)、丰度高(可达97%以上)，同时，本发明还具有生产周期短、工艺稳定等优点。


图1为本发明多肽合成管示意图。
具体实施例方式
下面对照附图及具体实施例对本发明作进一步说明。 实施例1
一种稳定性同位素15N标记八肽GFL Tyr-Gly*-Gly*-Phe*-Leu*-Arg-Arg-Ile的
制备方法，该方法包括以下步骤
一、 Fmoc-Ile-Wang树脂制备
(1) 放Wang-树脂(1.5mmol/g的取代量)在干燥的多肽合成管中；
(2) 用二氯甲垸溶胀60min,用水泵抽干溶剂二氯甲垸，换用DMF洗涤5 次，每次用量5ml;
(3) 取4eq (即Wang树脂摩尔量的4倍，下同)HBTU，加4eqFmoc-Ile-OH， 少量DMF溶解，力卩8eq DIEA，混匀；
(4) 将上述溶液加入树脂中，反应2小时；
(5) DMF 5mlx5min洗涤；
(6) 用5eq苯甲酸酑加leq吡啶封闭树脂上未反应的羟基，DMF作反应溶 剂，反应l小时；
(7) 用DMF洗涤5mlx5min，真空干燥树脂，得到Fmoc-Ile-Wang树脂。 Fmoc-Ile-Wang树脂上载量的测定
(1) 称一份干燥的Fmoc-Ile-Wang树脂1.5mg;
(2) 力口3mL20M体积比的哌啶(溶于DMF)，间歇摇动3h;
(3) 以20%体积比的哌啶(溶于DMF)作参比溶液，测量290nm的吸光度
N;
以下列公式计算取代量
A=Loading(mmol/g)= (N吸光度xlO)/(质量xl.75)K0.1764x10)/( 1.5x1.75) =0.672mmol/g
二、 八肽GFLTyr-Gly承-Gly气Phe、Leu承-Arg匿Arg隱Ile的制备
10采用固相多肽合成的方法，从Fmoc-Ile-Wang树脂出发，用多肽合成管(如图 l所示)制备，具体如下
(1) 放0.1mmolFmoc-Ile-Wang树脂(根据取代量A计算即150mg)在干燥 的反应器中；
(2) 用二氯甲烷溶胀30min， DMF洗涤5mlx5min;
(3) 30y。哌啶-DMF溶液脱Fmoc， 5minx2次，溶液体积为溶胀后树脂体积的
2倍；
(4) DMF洗涤5mlx5min;
(5) 取4eqHBTU， 4eqHOBt, 4叫Fmoc-Arg (Pbf) -OH，少量DMF溶解， 加10eqDIEA，混匀；
(6) 将上述溶液加入树脂中，反应l小时；
(7) 合成完毕，DMF洗涤5mlx5min，重复(3) 脱Fmoc;
(8) 用DMF或DCM或甲醇或正己垸洗涤5x5min;
(9) 取4eqHBTU， 4eqHOBt， 4eqFmoc-Arg (Pbf) -OH，少量DMF溶解， 加4eqD正A，混匀；
(10) 将上述溶液加入树脂中，反应l小时；
(11) 合成完毕，DMF洗涤5mlx5min;
(12) 30y。哌啶-DMF溶液脱Fmoc， 5minx2次，溶液体积为溶胀后树脂体积 的2-3倍；
(13) 用DMF洗涤5x5min;
(14) 取4eqHBTU， 4叫HOBt, 4eq 15N-Fmoc-Leu-OH，少量DMF溶解，力口 10eqD正A，混匀；
(15) 将上述溶液加入树脂中，反应l小时；
(16) 合成完毕，DMF洗涤5mlx5min;
(17) 30。/。哌啶-DMF溶液脱Fmoc， 5minx2次，溶液体积为溶胀后树脂体积 的2倍；
(18) 用DMF或DCM或甲醇或正己烷洗涤5x5min;
(19) 取4eqHBTU， 4eqHOBt， 4eq 15N-Fmoc-Phe-OH，少量DMF溶解，加 lOeqDIEA，混匀；
(20) 将上述溶液加入树脂中，反应l小时；(21) 合成完毕，DMF洗涤5mlx5min;
(22) 30n/。哌啶-DMF溶液脱Fmoc， 5minx2次，溶液体积为溶胀后树脂体积 的2倍；
(23) 用DMF洗涤5x5min;
(24) 取4eqHBTU, 4eqHOBt， 4eq 15N-Fmoc-Gly-OH，少量DMF溶解，加 10eqDIEA，混匀；
(25) 将上述溶液加入树脂中，反应1 2小时；
(26) 合成完毕，DMF洗涤5mlx5min;
(27) 30M哌啶-DMF溶液脱Fmoc， 5minx2次，溶液体积为溶胀后树脂体积 的2倍；
(28) 用DMF洗涤5x5min;
(29) 取4eqHBTU， 4eqHOBt， 4eq 15N-Fmoc-Gly-OH，少量DMF溶解，力口 10eqDIEA，混匀；
(30) 将上述溶液加入树脂中，反应l小时；
(31) 合成完毕，DMF洗涤5mlx5min;
(32) 30y。哌啶-DMF溶液脱Fmoc， 5minx2次，溶液体积为溶胀后树脂体积
的2倍；
(33) 用DMF洗涤5x5min;
(34) 取4eqHBTU， 4eqHOBt， 4eqFmoc-Tyr (tbu) -OH，少量DMF溶解， 加10eqDIEA，混匀；
(35) 将上述溶液加入树脂中，反应l小时；
(36) 合成完毕，DMF洗涤5mlx5min;
(37) 30n/。哌啶-DMF溶液脱Fmoc， 5minx2次，溶液体积为溶胀后树脂体积 的2倍；
(38) 用DMF洗涤5x5min;
(39) 用甲醇收縮树脂，加入少许甲醇，反应5min，重复5次；
(40) 用正己烷洗涤5次后，真空干燥；
(41) 剪切将"N-八肽从WANG树脂上剪切下；配置剪切溶液将三氟醋 酸，三异丙基硅垸，水按照80: 2: 18的比例混合均匀；将干燥完树脂置于离心管 中，加入事先配好的剪切液静置反应5小时，反应完过滤，向滤液中加入10倍滤液体积的冷乙醚，沉淀产生，离心，收集沉淀，烘干得到230mg"N八肽GFL，纯 度达99.3%，丰度达97.5%。
实施例2
一种稳定性同位素15N标记八肽GFL Tyr-Gly*-Gly*-Phe*-Leu*-Arg-Arg-Ile的 制备方法，该方法包括以下步骤
一、 Fmoc-Ile-Wang树脂制备
(1) 放Wang-树脂(1.5mmol/g的取代量)在干燥的多肽合成管中；
(2) 用二氯甲垸溶胀30min，用水泵抽干溶剂二氯甲烷，换用DMF洗涤5 次，每次用量2 5ml;
(3) 取10eqHBTU，加lOeqFmoc陽Ile-OH，少量DMF溶解，加10eqDIEA，
混匀；
(4) 将上述溶液加入树脂中，反应l小时； (5 ) DMF洗涤5mlx 5min洗涤；
(6) 用10eq醋酸酐加leq吡啶封闭树脂上未反应的羟基；DMF作反应溶剂； 反应1小时；
(7) 用DCM洗涤5mlx5min;真空干燥树脂，得到Fmoc-Ile-Wang树脂。 Fmoc-Ile-Wang树脂上载量的测定
(1) 称一份干燥的Fmoc-Ile-Wang树脂1.5mg;
(2) 力口3mL20y。体积比的哌啶(溶于DMF)，间歇摇动2h;
(3) 以20%体积比的哌啶(溶于DMF)作参比溶液，测量290nm的吸光度
N;
以下列公式计算取代量
A=Loading (mmol/g) = (N吸光度x10) / (质量xl.75) = (0.3x10) / (2.7x1.75) =0.635mmol/g
二、 八肽GFLTyr-Gly*-Gly*-Phe*-Leu*-Arg-Arg-Ile的制备
釆用固相多肽合成的方法，从Fmoc-Ile-Wang树脂出发，用多肽合成管(参见 图l所示)制备，具体如下
(1)放0.1mmolFmoc-Ile-Wang树脂(根据取代量A计算即157mg)在干燥 的反应器中；(2) 用二氯甲烷溶胀60min， DMF洗涤5mlx5min;
(3) 30。/。哌啶-DMF溶液脱Fmoc， 5minx2次，溶液体积为溶胀后树脂体积的
3倍；
(4) DMF洗涤5mlx5min;
(5) 取5eqHBTU， 5eqHOBt， 5eqFmoc-Arg (Pbf) -OH，少量DMF溶解， 加8eqDIEA，混匀;
(6) 将上述溶液加入树脂中，反应2小时；
(7) 合成完毕，DMF洗涤5mlx5min，重复(3) 脱Fmoc;
(8) DCM洗涤5x5min;
(9) 取5eqHBTU， 5eqHOBt， 5eqFmoc-Arg (Pbf) -OH，少量DMF溶解， 加8eqDIEA，混匀；
(10) 将上述溶液加入树脂中，反应2小时；
(11) 合成完毕，DMF洗涤5mlx5min;
(12) 30。/。哌啶-DMF溶液脱Fmoc， 5minx2次，溶液体积为溶胀后树脂体积 的3倍；
(13) 用DCM洗涤5x5min;
(14) 取5叫HBTU， 5eqHOBt， 5eq 15N-Fmoc-Leu-OH，少量DMF溶解，加 8eqDIEA，混匀；
(15) 将上述溶液加入树脂中，反应2小时；
(16) 合成完毕，DMF洗涤5mlx5min;
(17) 30y。哌啶-DMF溶液脱Fmoc， 5minx2次，溶液体积为溶胀后树脂体积 的3倍；
(18) 用DCM洗涤5x5min;
(19) 取5eqHBTU， 5eqHOBt， 5eq 15N-Fmoc-Phe-OH，少量DMF溶解，加 8叫DIEA，混匀；
(20) 将上述溶液加入树脂中，反应2小时；
(21) 合成完毕，DMF洗涤5mlx5min;
(22) 30n/。哌啶-DMF溶液脱Fmoc， 5minx2次，溶液体积为溶胀后树脂体积 的3倍；
(23) 用DCM洗涤5x5min
14(24) 取5eqHBTU， 5eqH0Bt， 5eq 15N-Fmoc-Gly-OH，少量DMF溶解，加 8eqDIEA，混匀；
(25) 将上述溶液加入树脂中，反应2小时；
(26) 合成完毕，DMF洗涤5mlx5min;
(27) 30y。哌啶-DMF溶液脱Fmoc， 5minx2次，溶液体积为溶胀后树脂体积 的3倍；
(28) 用DCM洗涤5x5min;
(29) 取5eqHBTU， 5eq HOBt， 5eq 15N-Fmoc-Gly-OH，少量DMF溶解，加 8叫DIEA，混匀；
(30) 将上述溶液加入树脂中，反应2小时；
(31) 合成完毕，DMF洗涤5mlx5min;
(32) 3(P/。哌啶-DMF溶液脱Fmoc， 5minx2次，溶液体积为溶胀后树脂体积 的3倍；
(33) 用DCM洗涤5x5min;
(34) 取2eqHBTU， 2eqHOBt， 2eqFmoc-Tyr (tbu) -OH，少量DMF溶解， 加4eqDIEA，混匀；
(35) 将上述溶液加入树脂中，反应2小时；
(36) 合成完毕，DMF洗涤5mlx5min;
(37) 30。/。哌啶-DMF溶液脱Fmoc， 5minx2次，溶液体积为溶胀后树脂体积 的3倍；
(38) 用DCM洗涤5x5min;
(39) 用甲醇收縮树脂，加入少许甲醇，反应5min，重复3次；
(40) 用正己烷洗涤3次后，真空干燥；
(41) 剪切将"N-八肽从WANG树脂上剪切下；配置剪切溶液将三氟醋 酸，三异丙基硅垸，水按照60:10:30比例混合均匀；将干燥完树脂置于离心管中， 加入事先配好的剪切液静置反应3小时，反应完过滤，向滤液中加入8倍滤液体积 的冷乙醚，沉淀产生，离心，收集沉淀，烘干得到256mg15N八肽GFL，纯度达 99.5%，丰度达97.8%。
实施例3一种稳定性同位素15N标记八肽GFL Tyr-Gly*-Gly*-Phe*-Leu*-Arg-Arg-Ile的
制备方法，该方法包括以下步骤
一、 Fmoc-Ile-Wang树脂制备
(1) 放Wang-树脂(1.5mmol/g的取代量)在干燥的多肽合成管中；
(2) 用二氯甲烷溶胀10min，用水泵抽干溶剂二氯甲垸，换用DMF洗涤2 次，每次用量2ml;
(3) 取8eq HBTU，力卩8叫Fmoc-Ile-OH，少量DMF溶解，力B 5eq DIEA，混
匀；
(4) 将上述溶液加入树脂中，反应l小时；
(5) DMF洗涤5mlx5min洗涤；
(6) 用8eq苯甲酸酐加l叫吡啶封闭树脂上未反应的羟基；DMF作反应溶 剂；反应l小时；
(7) 用甲醇洗涤5mlx5min;真空干燥树脂，得到Fmoc-Ile-Wang树脂。 Fmoc-Ile-Wang树脂上载量的测定
(1) 称一份干燥的Fmoc-Ile-Wang树脂1.5mg;
(2) 力口3mL20。/o体积比的哌啶(溶于DMF)，间歇摇动2-3h;
(3) 以20%体积比的哌啶(溶于DMF)作参比溶液，测量290nm的吸光度
N;
以下列公式计算取代量
A=Loading(mmol/g)= (N吸光度xlO)/(质量xl.75)K0.1801x10)/( 1.5x1.75) =0.686mmol/g
二、 八肽GFLTyr-Gly*-Gly*-Phe*-Leu*-Arg-Arg-Ile的制备 采用固相多肽合成的方法，从Fmoc-Ile-Wang树脂出发，用多肽合成管(参见
图l所示)制备，具体如下
(1) 放O.lmmolFmoc-Ile-Wang树脂(根据取代量A计算即146mg)在干燥 的反应器中；
(2) 用二氯甲烷溶胀10min， DMF洗涤5mlx5min;
(3) 30。/。哌啶-DMF溶液脱Fmoc， 5minx2次，溶液体积为溶胀后树脂体积的
3倍；
(4) DMF洗涤5mlx5min;(5) 取2eqHBTU, 2eqHOBt， 2eqFmoc-Arg (Pbf) -OH，少量DMF溶解， 加4eqDIEA，混匀;
(6) 将上述溶液加入树脂中，反应2小时；
(7) 合成完毕，DMF洗涤5mlx5min，重复(3) 脱Fmoc;
(8) 甲醇洗涤5x5min;
(9) 取2eqHBTU， 2eqHOBt， 2eqFmoc-Arg (Pbf) -OH，少量DMF溶解， 加4叫DIEA，混匀；
(10) 将上述溶液加入树脂中，反应2小时；
(11) 合成完毕，DMF洗涤5mlx5min;
(12) 30。/。哌啶-DMF溶液脱Fmoc， 5minx2次，溶液体积为溶胀后树脂体积 的3倍；
(13) 用甲醇洗涤5x5min;
(14) 取2eqHBTU， 2叫HOBt， 2eq 15N-Fmoc-Leu-OH，少量DMF溶解，加 4叫DIEA，混匀；
(15) 将上述溶液加入树脂中，反应2小时；
(16) 合成完毕，DMF洗涤5mlx5min;
(17) 30。/。哌啶-DMF溶液脱Fmoc， 5minx2次，溶液体积为溶胀后树脂体积 的3倍；
(18) 用DCM洗涤5x5min;
(19) 取2eqHBTU， 2eqHOBt， 2eq 15N-Fmoc-Phe-OH，少量DMF溶解，加 4叫DIEA，混勻；
(20) 将上述溶液加入树脂中，反应2小时；
(21) 合成完毕，DMF洗涤5mlx5min;
(22) 30。/。哌啶-DMF溶液脱Fmoc， 5minx2次，溶液体积为溶胀后树脂体积 的3倍；
(23) 用DCM洗涤5x5min;
(24) 取5eqHBTU， 5叫HOBt， 5eq 15N-Fmoc-Gly-OH，少量DMF溶解，加 8叫DIEA，混匀；
(25) 将上述溶液加入树脂中，反应2小时；
(26) 合成完毕，DMF洗涤5mlx5min;
17(27) 30y。哌啶-DMF溶液脱Fmoc， 5minx2次，溶液体积为溶胀后树脂体积 的3倍；
(28) 用甲醇洗涤5x5min;
(29) 取2eqHBTU， 2eqHOBt， 2eq 15N-Fmoc-Gly-OH，少量DMF溶解，加 4eqDIEA，混匀；
(30) 将上述溶液加入树脂中，反应2小时；
(31) 合成完毕，DMF洗涤5mlx5min;
(32) 30。/。哌啶-DMF溶液脱Fmoc， 5minx2次，溶液体积为溶胀后树脂体积 的3倍；
(33) 用DCM洗涤5x5min;
(34) 取5eqHBTU， 5eqHOBt， 5eqFmoc-Tyr (tbu) -OH，少量DMF溶解， 加8叫DIEA，混匀；
(35) 将上述溶液加入树脂中，反应2小时；
(36) 合成完毕，DMF洗涤5mlx5min;
(37) 30M哌啶-DMF溶液脱Fmoc， 5minx2次，溶液体积为溶胀后树脂体积 的3倍；
(38) 用DCM洗涤5x5min;
(39) 用甲醇收縮树脂，加入少许甲醇，反应5min，重复2次；
(40) 用正己烷洗涤3次后，真空干燥；
(41) 剪切将"N-八肽从WANG树脂上剪切下；配置剪切溶液将三氟醋
酸，三异丙基硅烷，水按照70:8:22比例混合均匀；将干燥完树脂置于离心管中， 加入事先配好的剪切液静置反应3小时，反应完过滤，向滤液中加入8倍滤液体积 的冷乙醚，沉淀产生，离心，收集沉淀，烘干得到260mg15N八肽GFL，纯度达 99.8%，丰度达98.3%。
实施例4
一种稳定性同4立素15N标记八肽GFL Tyr、Gly、Gly、Phe、Leu气Arg^Arg、Ile承的 制备方法，该方法包括以下步骤
一、Fmoc-Ile-Wang树脂制备 (1)放Wang-树脂(1.5mmol/g的取代量)在干燥的多肽合成管中；(2) 用二氯甲垸溶胀60min，用水泵抽干溶剂二氯甲烷，换用DMF洗涤5 次，每次用量5ml;
(3) 取4叫HBTU,力n 4eq15N-Fmoc-Ile-OH，少量DMF溶解，加8eqDIEA，
混匀；
(4) 将上述溶液加入树脂中，反应2小时；
(5) DMF 5mlx5min洗涤；
(6) 用5eq苯甲酸酐加leq吡啶封闭树脂上未反应的羟基，DMF作反应溶 剂，反应l小时；
(7) 用DMF洗涤5mlx5min，真空千燥树脂，得到15N-Fmoc-Ile-Wang树脂。 Fmoc-Ile-Wang树脂上载量的测定
(1) 称一份干燥的Fmoc-Ile-Wang树脂1.5mg;
(2) 力口3mL20。/。体积比的哌啶(溶于DMF)，间歇摇动3h;
(3) 以20%体积比的哌啶(溶于DMF)作参比溶液，测量290nm的吸光度
N;
以下列公式计算取代量
A=Loading(mmol/g)= (N吸光度xl0)/(质量xl.75X0.1764xl0)/(1.5x1.75) =0.672mmol/g
二、八肽GFLTyr、Gly、Gly、Phe、Leu、Arg、Arg、Ile承的制备 采用固相多肽合成的方法，从"N-Fmoc-Ile-Wang树脂出发，用多肽合成管(如 图l所示)制备，具体如下
(1) 放0.1 mmol15N-Fmoc-Ile-Wang树脂(根据取代量A计算即150mg)在 干燥的反应器中；
(2) 用二氯甲烷溶胀30min， DMF洗涤5mlx5min;
(3) 30n/。哌啶-DMF溶液脱Fmoc， 5minx2次，溶液体积为溶胀后树脂体积的
2倍；
(4) DMF洗涤5mlx5min;
(5) 取4eqHBTU， 4叫HOBt， 4叫15N-Fmoc-Arg (Pbf) -OH，少量DMF溶 解，力口 10eqDIEA，混匀；
(6) 将上述溶液加入树脂中，反应l小时；
(7) 合成完毕，DMF洗涤5mlx5min，重复(3) 脱Fmoc;(8) 用DMF或DCM或甲醇或正己烷洗涤5x5min;
(9) 取4eqHBTU， 4eqHOBt， 4eq 15N-Fmoc-Arg (Pbf) -OH，少量DMF溶 解，加4叫D正A，混匀；
(10) 将上述溶液加入树脂中，反应l小时；
(11) 合成完毕，DMF洗涤5mlx5min;
(12) 30。/。哌啶-DMF溶液脱Fmoc， 5minx2次，溶液体积为溶胀后树脂体积 的2-3倍；
(13) 用DMF洗涤5x5min;
(14) 取4eqHBTU， 4eqHOBt， 4eq 15N-Fmoc-Leu-OH，少量DMF溶解，力口 10eqDIEA，混匀；
(15) 将上述溶液加入树脂中，反应l小时；
(16) 合成完毕，DMF洗涤5mlx5min;
(17) 30W哌啶-DMF溶液脱Fmoc， 5minx2次，溶液体积为溶胀后树脂体积 的2倍；
(18) 用DMF或DCM或甲醇或正己垸洗涤5x5min;
(19) 取4eqHBTU， 4eqHOBt， 4eq 15N-Fmoc-Phe-OH，少量DMF溶解，加 10eqDIEA，混匀；
(20) 将上述溶液加入树脂中，反应l小时；
(21) 合成完毕，DMF洗涤5mlx5min;
(22) 30。/。哌啶-DMF溶液脱Fmoc， 5minx2次，溶液体积为溶胀后树脂体积 的2倍；
(23) 用DMF洗涤5x5min;
(24) 取4eqHBTU， 4eqHOBt， 4eq 15N-Fmoc-Gly-OH，少量DMF溶解，力口 10eqDIEA，混匀；
(25) 将上述溶液加入树脂中，反应1 2小时；
(26) 合成完毕，DMF洗涤5mlx5min;
(27) 30。/。哌啶-DMF溶液脱Fmoc， 5minx2次，溶液体积为溶胀后树脂体积 的2倍；
(28) 用DMF洗涤5x5min;
(29) 取4叫HBTU， 4叫HOBt， 4eq 15N-Fmoc-Gly-OH，少量DMF溶解，力口10eqDIEA，混匀；
(30) 将上述溶液加入树脂中，反应l小时；
(31) 合成完毕，DMF洗涤5mlx5min;
(32) 30。/。哌啶-DMF溶液脱Fmoc， 5minx2次，溶液体积为溶胀后树脂体积 的2倍；
(33) 用DMF洗涤5x5min;
(34) 取4eqHBTU， 4eqHOBt， 4eq 15N-Fmoc-Tyr (tbu) -OH，少量DMF溶 解，加10eqDIEA，混匀；
(35) 将上述溶液加入树脂中，反应l小时；
(36) 合成完毕，DMF洗涤5mlx5min;
(37) 30。/。哌啶-DMF溶液脱Fmoc， 5minx2次，溶液体积为溶胀后树脂体积 的2倍；
(38) 用DMF洗涤5x5min;
(39) 用甲醇收縮树脂，加入少许甲醇，反应5min，重复5次；
(40) 用正己垸洗涤5次后，真空干燥；
(41) 剪切将"N-八肽从WANG树脂上剪切下；配置剪切溶液将三氟醋 酸，三异丙基硅垸，水按照80: 2: 18的比例混合均匀；将干燥完树脂置于离心管
中，加入事先配好的剪切液静置反应5小时，反应完过滤，向滤液中加入10倍滤 液体积的冷乙醚，沉淀产生，离心，收集沉淀，烘干得到230mg"N八肽GFL。
实施例5
一种稳定性同位素15N标记八肽GFLTyr-Gly-Gly-Phe-Leu*-Arg-Arg-Ile的制备 方法，该方法包括以下步骤
一、Fmoc-Ile-Wang树脂制备
(1) 放Wang-树脂(1.5mmol/g的取代量)在干燥的多肽合成管中；
(2) 用二氯甲垸溶胀30min，用水泵抽干溶剂二氯甲垸，换用DMF洗涤5 次，每次用量2 5ml;
(3) 取10eqHBTU，加10叫Fmoc-Ile國OH，少量DMF溶解，加10eqDIEA，
混匀；
(4) 将上述溶液加入树脂中，反应l小时；(5) DMF洗涤5mlx5min洗涤；
(6) 用10eq醋酸酐加leq吡啶封闭树脂上未反应的羟基；DMF作反应溶剂; 反应1小时；
(7) 用DCM洗涤5mlx5min;真空干燥树脂，得到Fmoc-Ile-Wang树脂。 Fmoc-Ile-Wang树脂上载量的测定
(1) 称一份干燥的Fmoc-Ile-Wang树脂1.5mg;
(2) 力口3mL20。/。体积比的哌啶(溶于DMF)，间歇摇动2h;
(3) 以20%体积比的哌啶(溶于DMF)作参比溶液，测量2卯nm的吸光度
N;
以下列公式计算取代量
A=Loading (mmol/g) = (N吸光度x10) / (质量xl.75) = (0.3x10) / (2.7x1.75) =0.635mmol/g
二、八肽GFLTyr-Gly-Gly-Phe-Leu*-Arg-Arg-Ile的制备
采用固相多肽合成的方法，从Fmoc-Ile-Wang树脂出发，用多肽合成管(参见 图l所示)制备，具体如下
(1) 放0.1mmolFmoc-Ile-Wang树脂(根据取代量A计算即157mg)在干燥 的反应器中；
(2) 用二氯甲烷溶胀60min， DMF洗涤5mlx5min;
(3) 30y。哌啶-DMF溶液脱Fmoc， 5minx2次，溶液体积为溶胀后树脂体积的
3倍；
(4) DMF洗涤5mlx5min;
(5) 取5eqHBTU， 5eqHOBt， 5eqFmoc-Arg (Pbf) -OH，少量DMF溶解， 加8eqDIEA，混匀；
(6) 将上述溶液加入树脂中，反应2小时；
(7) 合成完毕，DMF洗涤5mlx5min，重复(3) 脱Fmoc;
(8) DCM洗涤5x5min;
(9) 取5叫HBTU， 5叫HOBt， 5eqFmoc-Arg (Pbf) -OH，少量DMF溶解， 加8eqDIEA，混匀;
(10) 将上述溶液加入树脂中，反应2小时；
(11) 合成完毕，DMF洗涤5mlx5min;(12) 30"/。哌啶-DMF溶液脱Fmoc, 5minx2次，溶液体积为溶胀后树脂体积 的3倍；
(13) 用DCM洗涤5x5min;
(14) 取5eqHBTU， 5eqH0Bt， 5eq 15N-Fmoc-Leu-OH，少量DMF溶解，加 8eqDIEA，混匀；
(15) 将上述溶液加入树脂中，反应2小时；
(16) 合成完毕，DMF洗涤5mlx5min;
(17) 30n/。哌啶-DMF溶液脱Fmoc， 5minx2次，溶液体积为溶胀后树脂体积 的3倍；
(18) 用DCM洗涤5x5min;
(19) 取5eqHBTU， 5eqHOBt， 5eq Fmoc-Phe-OH，少量DMF溶解，加8eq DIEA，混匀；
(20) 将上述溶液加入树脂中，反应2小时；
(21) 合成完毕，DMF洗涤5mlx5min;
(22) 30。/。哌啶-DMF溶液脱Fmoc， 5minx2次，溶液体积为溶胀后树脂体积 的3倍；
(23) 用DCM洗涤5x5min
(24) 取5eqHBTU， 5eqHOBt， 5eqFmoc-Gly-OH，少量DMF溶解，加8eq DIEA，混匀；
(25) 将上述溶液加入树脂中，反应2小时；
(26) 合成完毕，DMF ^先涤5mlx5min;
(27) 30。/。哌啶-DMF溶液脱Fmoc， 5minx2次，溶液体积为溶胀后树脂体积 的3倍；
(28) 用DCM洗涤5x5min;
(29) 取5eqHBTU， 5eqHOBt， 5eq Fmoc-Gly-OH，少量DMF溶解，加8eq DIEA，混匀；
(30) 将上述溶液加入树脂中，反应2小时；
(31) 合成完毕，DMF洗涤5mlx5min;
(32) 30。/。哌咬-DMF溶液脱Fmoc， 5minx2次，溶液体积为溶胀后树脂体积 的3倍；
23(33) 用DCM洗涤5x5min;
(34) 取2eqHBTU， 2eqHOBt， 2叫Fmoc-Tyr (tbu) -OH，少量DMF溶解， 加4eqDIEA，混匀；
(35) 将上述溶液加入树脂中，反应2小时；
(36) 合成完毕，DMF洗涤5mlx5min;
(37) 30y。哌啶-DMF溶液脱Fmoc， 5minx2次，溶液体积为溶胀后树脂体积 的3倍；
(38) 用DCM洗涤5x5min;
(39) 用甲醇收縮树脂，加入少许甲醇，反应5min,重复3次；
(40) 用正己烷洗涤3次后，真空干燥；
(41) 剪切将"N-八肽从WANG树脂上剪切下；配置剪切溶液将三氟醋
酸，三异丙基硅烷，水按照60:10:30比例混合均匀；将干燥完树脂置于离心管中， 加入事先配好的剪切液静置反应3小时，反应完过滤，向滤液中加入8倍滤液体积 的冷乙醚，沉淀产生，离心，收集沉淀，烘干得到256mg"N八肽GFL。
权利要求
1. 一种稳定性同位素15N标记八肽GFL的制备方法，其特征在于，该方法采用Fmoc固相肽合成法，以Wang-树脂为载体，以Fmoc保护的氨基酸为原料，该原料中至少有一个氨基酸为稳定性同位素15N标记的，以HBTU/HOBt/DIEA为缩合试剂，逐一接入氨基酸，氨基酸接完后经剪切、纯化制得稳定性同位素15N标记八肽GFL。
2. 根据权利要求1所述的稳定性同位素"N标记八肽GFL的制备方法，其特 征在于，所述的方法具体包括以下步骤(1) Fmoc-Ile-Wang树脂的制备1) 将1.5mmol/g取代量的Wang-树脂放入干燥的多肽合成管中；2) 用二氯甲烷溶胀10 60min，用水泵抽干溶剂二氯甲垸，换用DMF洗涤5 次，每次用量2 5ml;3)取2~10eq HBTU，加2~10eq Fmoc-Ile-OH，少量DMF溶解，加5~15eq DIEA， 混匀；4) 将上述溶液加入树脂中，反应l-2小时；5) DMF 5mlx5min洗涤；6) 用2 10eq苯甲酸酐或醋酸酐加leq吡啶封闭树脂上未反应的羟基，DMF 作反应溶剂，反应l小时；7) 用DMF、DCM、甲醇或正己烷5mlx5min洗涤，真空干燥，得到Fmoc-Ile-Wang树脂；(2) 稳定性同位素15N标记八肽GFL的制备 采用固相多肽合成的方法，从Fmoc-Ile-Wang树脂出发，用多肽合成管制备，具体如下1) 将0.1mmolFmoc-Ile-Wang树脂放入干燥的反应器中；2) 用二氯甲烷溶胀10 60min， DMF洗涤5mlx5min;3) 30M哌啶-DMF溶液脱Fmoc， 5minx2次，溶液体积为溶胀后树脂体积的 2國3倍；4) DMF洗涤5mlx5min;5) 取2 5eq HBTU， 2~5eq HOBt， 2~5eq Fmoc-Arg (Pbf) -OH，少量DMF 溶解，加4 10eqDIEA，混匀；6) 将上述溶液加入树脂中，反应1 2小时；7) 合成完毕，DMF洗涤5mlx5min， 30。/。哌啶-DMF溶液脱Fmoc， 5minx2次， 溶液体积为溶胀后树脂体积的2-3倍；8) 用DMF、 DCM、甲醇或正己烷洗涤5mlx5min;9) 取2 5eq HBTU， 2 5叫HOBt， 2 5eq Fmoc-Arg (Pbf)國OH，少量DMF 溶解，加4 10eqDIEA，混匀;10) 将上述溶液加入树脂中，反应1 2小时；11) 合成完毕，DMF洗涤5mlx5min;12) 30。/。哌啶-DMF溶液脱Fmoc， 5minx2次，溶液体积为溶胀后树脂体积的 2隱3倍；13) 用DMF、 DCM、甲醇或正己烷洗涤5mlx5min;14) 取2 5eqHBTU， 2~5叫HOBt， 2~5叫Fmoc-Leu-OH，少量DMF溶解， 加卜10eqDIEA，混匀；15) 将上述溶液加入树脂中，反应1 2小时；16) 合成完毕，DMF洗涤5mlx5min;17) 30M哌咬-DMF溶液脱Fmoc， 5minx2次，溶液体积为溶胀后树脂体积的 2-3倍;18) 用DMF或DCM或甲醇或正己垸洗涤5mlx5min;19) 取2 5叫HBTU， 2 5eqHOBt， 2~5eq Fmoc-Phe-OH，少量DMF溶解， 加4 10叫DIEA，混匀；20) 将上述溶液加入树脂中，反应1 2小时；21) 合成完毕，DMF洗涤5mlx5min;22) 30。/。哌啶-DMF溶液脱Fmoc， 5minx2次，溶液体积为溶胀后树脂体积的 2-3倍;23) 用DMF、 DCM、甲醇或正己垸洗漆5mlx5min;24) 取2 5叫HBTU， 2 5eq HOBt， 2 5叫Fmoc-Gly-OH，少量DMF溶解， 加4 10eqDIEA，混匀；25) 将上述溶液加入树脂中，反应1 2小时；26) 合成完毕，DMF洗涤5mlx5min;27) 30y。哌啶-DMF溶液脱Fmoc， 5minx2次，溶液体积为溶胀后树脂体积的 2-3倍；28) 用DMF、 DCM、甲醇或正己烷洗涤5mlx5min;29) 取2 5eqHBTU， 2~5eq HOBt， 2~5eq Fmoc-Gly-OH，少量DMF溶解， 加4 10eqDIEA，混匀；30) 将上述溶液加入树脂中，反应1 2小时；31) 合成完毕，DMF洗涤5mlx5min;32) 30。/。哌啶-DMF溶液脱Fmoc， 5minx2次，溶液体积为溶胀后树脂体积的 2-3倍；33) 用DMF、 DCM、甲醇或正己烷洗涤5mlx5min;34) 取2 5eqHBTU， 2~5叫HOBt， 2~5eq Fmoc-Tyr (tbu) -OH，少量DMF 溶解，加4 10eqDIEA，混匀；35) 将上述溶液加入树脂中，反应1 2小时；36) 合成完毕，DMF洗涤5mlx5min;37) 30y。哌啶-DMF溶液脱Fmoc， 5minx2次，溶液体积为溶胀后树脂体积的 2陽3倍；38) 用DMF、 DCM、甲醇或正己烷洗涤5mlx5min;39) 用甲醇收縮树脂，加入少许甲醇，反应5min，重复2 5次；40) 用正己烷洗涤2 5次后，真空干燥；41) 剪切、纯化将干燥后的树脂置于离心管中，加入剪切液静置反应1~5 小时，反应完过滤，向滤液中加入5 10倍滤液体积的冷乙醚，沉淀产生，离心， 收集沉淀，烘干得到稳定性同位素15N标记八肽GFL;上述步骤(1) 3)的Fmoc-Ile-OH、步骤(2) 5)的Fmoc-Arg (Pbf) -OH、 步骤(2) 9)的Fmoc-Arg (Pbf) -OH、步骤(2) 14)的Fmoc-Leu-OH、步骤(2) 19)的Fmoc-Phe-OH、步骤(2)24)的Fmoc-Gly-OH、步骤(2)29)的Fmoc-Gly-OH、 步骤(2) 34)的Fmoc-Tyr (tbu) -OH中至少有一个为稳定性同位素15N标记的氨 基酸。
3.根据权利要求2所述的稳定性同位素"N标记八肽GFL的制备方法，其特 征在于，所述的步骤(2) 1)中的0.1mmolFmoc-Ile-Wang树脂根据取代量A计算称量，所述的取代量A的测定如下(1) 称量干燥的Fmoc-Ile-Wang树脂，获得树脂质量，以mg计；(2) 按3mL/1.5mgFmoc-Ile-Wang树脂加入20。/。体积比的哌啶-DMF，间歇 摇动2-3h;(3) 以20。/。体积比的哌啶-DMF作参比溶液，测量290nm的吸光度N;(4) 以下列公式计算取代量八=取代量(mmol/g) = (NxlO) / (质量xl.75)。
4.根据权利要求2所述的稳定性同位素15N标记八肽GFL的制备方法，其特 征在于，所述的步骤(2) 41)的剪切液为混合均匀的三氟醋酸，三异丙基硅烷和 水，所述的三氟醋酸的体积比为50~80%，所述的三异丙基硅垸的体积为2 10%。
全文摘要
本发明涉及一种稳定性同位素¹⁵N标记八肽GFL的制备方法，该方法采用Fmoc固相肽合成法，以Wang-树脂为载体，以Fmoc保护的氨基酸为原料，该原料中至少有一个氨基酸为稳定性同位素¹⁵N标记的，以HBTU/HOBt/DIEA为缩合试剂，逐一接入氨基酸，氨基酸接完后经剪切、纯化制得稳定性同位素¹⁵N标记八肽GFL。与现有技术相比，本发明工艺合理，操作简单，节约成本，解决了现有合成反应中丰度稀释、纯度不高、工艺繁琐、原料消耗大等问题，获得的稳定性同位素¹⁵N标记八肽GFL纯度高(可达99％以上)、丰度高(可达97％以上)，同时，本发明还具有生产周期短、工艺稳定等优点。
文档编号C07K7/06GK101475629SQ20091004542
公开日2009年7月8日 申请日期2009年1月15日 优先权日2009年1月15日
发明者宋明鸣, 廖晓全, 亮 张, 李良君, 杜晓宁 申请人:上海化工研究院