新型细胞凋亡检测试剂及相关试剂盒的制作方法

专利名称：新型细胞凋亡检测试剂及相关试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域，更确切地说基于现代生物化学技术和现代蛋白质化学技术制 备新型细胞凋亡检测试剂，并形成相应的细胞凋亡检测试剂盒，其制备及应用特点。
背景技术：
一、人膜联蛋白V (AnnexinV)的背景知识
人膜联蛋白是一种钙离子依赖性膜磷脂结合蛋白质。它分布广泛，在多种组织细胞(如 心肌细胞、血管内皮、骨骼肌、肝细胞等)中有表达。人膜联蛋白V是人体内存在的一种蛋 白质，共由319个氨基酸残基组成，分子量约为36kDalton,等电点4.71 [Rand J H. "Amexin opathies" a new class of diseases [J]. Nature, 1999, 340 (13):1035-1036.]。它含有一个半胱氨酸残
基，位于第四个重复序列中。在四级结构中，此半胱氨酸残基被埋藏在分子:内部，只有在变
性条件下，它才暴露在表面，允许人膜联蛋白v形成同源二聚体。人膜联蛋白v只含有一个
潜在的糖基化位点，但它是一个非糖基化蛋白。人膜联蛋白V最早由胎盘分离出来[YueYF，
Jiang H, Shi L, et al. Study on the mechanism of intrauterine infection of hepatitis B virus[J]. Chin J
Obstet Gynecol, 2004， 39(4): 224,6.]。从上世纪80年代开始，人们对人膜联蛋白V的功能和结
构进行了研究[Fadok VA, Savill JS, Haslett C, et al. Differnt populations of maciphages use either
the vitrotin receptor or the phosphatidylaerine rceptor to rcognize and rmove apoptotic cells[J]. J
Immoral, 1992 ,149: 4029; De ]VIeyer S. Influence of the administration of human annexin V on in
vitro binding of small hepatitis B surface antigen to human and to rat hepatocyte.[J] Viral Hepat,
2000，7 (2): 104; Patel S K， MaN, Monks T J， et al. Changes in gene expression during Chemical
induced nephrocarcinogenicity in the Eker rat [J]. Mol Car cinog， 2003, 38 (3):141-154.]。人膜联蛋
白V的cDNA已经被确定。[Liu JY.Yang Liu F,et al. Preparation of recombinat protein of
extracellular ligand binding domains of mouse VEGF receptor 2 a nd its application[J].China
Journal of Modern Medicine,2003,12 (24):2L]。人膜联蛋白V的两个结构域位于其N端的尾部
和C端的核心区。C端结构域是高度保守的，同人膜联蛋白家族中的其他成员一样，都是由
4个含有约70个氨基酸残基组成的重复序列构成。而N端序列的同源性却小于5%[ Hawkins
TE,Christien J,Merrifield,et al. Calcium signaling and annexins[J]. Cell Biophys， 2000， 33:275-
296.]。另外，在其N端含有两个苏氨酸残基，但是在标准的磷酸化条件下，不能被磷酸化。
人膜联蛋白V不含有信号肽和可能跨越磷脂双分子层的疏水序列，但它能被分泌到胞外，其
机制目前仍不十分清楚。天然来源的人膜联蛋白V含量低，无法批量提供。目前人膜联蛋白V的制备一般是通过基因工程技术在大肠杆菌中对人膜联蛋白v基因进行直接表达，进一步
地，再对其表达产物形成的包涵体进行变复性处理，以及后期一系列的纯化步骤，最终制备
人膜联蛋白v蛋白质[陈大明，谢虹，祁本忠，张颖梅，贾兵，杨红伟，罗志福，张锦荣，金 小海，王凡，马大龙。细胞凋亡检测蛋白AnnexinV的制备纯化和初步评价。原子能科学技 术，38， Siipl， 182-187]。纯化工艺相对复杂，并且存在包涵体变复性处理，对其分子结构 有一定影响，对后期蛋白的得率也有较大影响。目前，人膜联蛋白V经过FITC或者PI标记 后，用于体外细胞凋亡的检测分析，同时，放射性标记人膜联蛋白V的核医学显像还用于体 内生物活体的细胞凋亡检测分析。放射性人膜联蛋白V的核医学显像剂主要包括99Tcm和碘 (123' 124' 125' 1311)以及1SF标记的人膜联蛋白V[Blankeneberg FG, Katsikis PD, TaitJF， et al. In vivo dictation during programmed cell death[J]. Proc Natl Acad Sci USA, 1998,95,6349-6354]。
二、细胞凋亡的检测技术
细胞凋亡是指细胞在一定的生理或病理条件下，受内在遗传机制的控制自动结束生命的 过程[Schmechel DE, Saunders AM, Strittoatter WS, Crain BJ, Hulette CM， Joo SH， et al. Increased amyloid beta-peptide deposition in cerebral cortex as a consequence of apolipoprotein E genotype in late-onset Alzheimer's disease[J]. Proc Natl Acad Sci USA,1993,90:9649—9653.]。细胞 凋亡是一种积极排除生物体内的过剩细胞和有害细胞的机制，在个体形态形成、形态改变等 发生过程中，在成体的恒常性的维持以及生物体的防御等方面发挥作用。该现象是以细胞核 浓縮、染色体DNA被以核小体为单位切成梯状片段、细胞縮小，最终形成细胞凋亡小体等 形态变化为特征。不引起周围细胞的溶解。细胞凋亡是在细胞群中散.发，阶段性进行的，并 且依存于ATP的供给和RNA、蛋白质的合成，是主动排除机制，不仅在个体发育时和卵细胞 退縮等生理状态下可观察到，而且在自身免疫性疾病、神经变质性疾病、缺血性疾病等很多 疾病及病理状态下也可观察到[Sorbi S, Nacmias B, Forleo P, Piacentini S, Latorraca S, Amaducci L. Epistatic effect of APP717 mutation and apolipoprotein genotype in familial Alzheimer's disease[J]. Ann Neurol 1995,38:124-127.]。细胞凋亡的细胞内信息传导途径可大致 分为二个阶段，即诱导阶段和实行阶段。近来研究表明，细胞凋亡发生的关键环节不在细胞 核，而在细胞质。在凋亡细胞被诱导产生特征性形态改变和DNA降解之前，线粒体膜功能 发生改变，内膜跨膜电位消失和线粒体内蛋白酶活化物的释放，激发各种凋亡相关的代谢变 化。诱导细胞凋亡的因素有内源性的和外源性的因素。内源性的因素包括细胞凋亡诱发机制 (如Fas配体、肿瘤坏死因子等)的激活和抑制机制(生长因子、激素、受体因子等增殖性 因子)的失活[St George- Hyslop PM, McLachlan D, Tsuda T, Rogaev E, Karlinsky H, Lippa CF,et al. Alzheimer's disease and possible gene interactions [J]. Science 1994,263:537.]。夕卜源性的因素 包括放射线、热休克等物理性因素，药物、毒物等化学性因素以及病毒、细菌等生物学因素。 近年来还发现活性氧以及一氧化氮在神经系统疾病、心血管疾病、免疫性疾病及老化等方面
的作用都不同程度地与细胞凋亡有关。细胞凋亡的检测方法目前有如下几种方式1、形态学
观察。(1) HE染色结合、光镜观察。凋亡细胞呈圆形，胞核深染，胞质浓縮，染色质成团块 状，细胞表面有"出芽"现象。(2) 丫啶橙(AO)染色、荧光显微镜观察。活细胞核呈黄绿 色荧光，胞质呈红色荧光。凋亡细胞核染色质呈黄绿色，浓聚在核膜内侧，可见细胞膜呈泡 状月彭出及凋亡小体[Suzuki N， Cheung T, Cai X-D, et al. An increased percentage of long amyloid proteinprecursor(「APP717)mutants[J]. Science 1994,264:1336—1340.]。 (3)台盼蓝染色。如果 细胞膜不完整、破裂，台盼蓝染料进入细胞，细胞变蓝，即为坏死。如果细胞膜完整，细胞 不为台盼蓝染色，则为正常细胞或凋亡细胞。此方法对反映细胞膜的完整性，区别坏死细胞 有一定的帮助。(4)透射电镜观察。可见凋亡细胞表面微绒毛消失，核染色质固缩、边集， 常呈新月形，核膜皱褶，胞质紧实，细胞器集中，胞膜起泡或出"芽"及凋亡小体和凋亡小 体被临近巨噬细胞吞噬现象。2、 DNA凝胶电泳。当细胞发生凋亡或坏死，其细胞DNA均发 生断裂，细胞内小分子量DNA片断增加，高分子量DNA减少，胞质内出现DNA片断。但 凋亡细胞DNA断裂点均有规律的发生在核小体之间，出现180—200bpDNA片段，而坏死细 胞的DNA断裂点为无特征的杂乱片段。利用此特征可以确定群体细胞的死亡，并可与坏死 细胞区别。正常活细胞DNA电泳出现阶梯状(Ladder)条带；坏死细胞DNA电泳类似血抹 片时的连续性条带。3、酶联免疫吸附法(ELISA)进行核小体测定。凋亡细胞的DNA断裂 使细胞质内出现核小体。核小体由组蛋白及其伴随的DNA片段组成，可由ELISA法检测 [Teller JK, Russo C, DeBisk LM, Angelini G, Zaccheo D, Dagna-Bricarelli F, et al. Presence of soluble amyloid peptide precedes amyloid plaque formation in Down's Syndrome[J]. Nature Med 1996,2:93-95.]。该法敏感性高。同时，不需要特殊仪器，适合基层工作，但是不能精确测定 凋亡细胞发生的绝对量。4、流式细胞仪定量分析。该方法也是一种常用的检测方法。检测原 理是当细胞发生凋亡时，其细胞膜的通透性也增加，但是其程度介于正常细胞与坏死细胞之 间。利用这一特点，被检测细胞悬液用荧光素染色，利用流式细胞仪测量细胞悬液中细胞荧 光强度来区分正常细胞、坏死细胞和凋亡细胞[Martin SJ， Reutelingsperger CP, McGahon AJ, Rader JA, van Schie RC, LaFace DM， Green DR. Early redistribution of plasma membrane phosphatidylserine is a general feature of apoptosis regardless of the initiating stimulus: inhibition by overexpression ofBcl-2 and Abl[J]. J Exp Med 1995,182:1545-1556.]。利用Hoechs-PI染色法， 正常细胞对染料有抗拒性，荧光染色很浅，凋亡细胞主要摄取Hoecha染料，呈现强蓝色荧光，
5而坏死细胞主要摄取碘化丙啶(PI)而呈强的红色荧光。检测细胞膜成分变化的人膜联蛋白 V(AnnexinV)联合PI法的基本原理是:在细胞凋亡早期位于细胞膜内侧的磷脂酰丝氨酸(PS) 迁移至细胞膜外测[Koopman G, Reutelingsperger CP, Kuijten GA， Keehnen RM， Pals ST, van Oers MH. Aimexin V for flow cytometric detection of phosphatidylserine expression on B cells undergoing apoptosis[J]. Blood 1994,84:1415—1420.]。人膜联蛋白V是一种钙依赖性的磷脂结 合蛋白，它与PS具有高度的结合力。因此，人膜联蛋白V可以作为探针检测暴露在细胞外 测的磷脂酰丝氨酸。将人膜联蛋白V标记上荧光素(如荧光素异硫氰酸酯FITC)，同时结合 使用PI(因坏死细胞PS亦暴露于细胞膜外测，且对PI高染)，进行凋亡细胞双染法后用流式 细胞仪，即可检测凋亡细胞。对于正常活细胞，人膜联蛋白V、 PI均低染；对于凋亡细胞， 人膜联蛋白V高染、PI低染；而对于坏死细胞，人膜联蛋白V、 PI均高染。当细胞发生凋亡 时，膜上的PS外露早于DNA断裂发生，因此人膜联蛋白V联合PI染色法检测早期细胞凋 亡更为灵敏。人膜联蛋白V联合PI染色不需要固定细胞，可避免其他方法因固定造成的细胞 碎片过多或因固定出现DNA片段丢失[Mochizuki T， Kuge Y, Zhao S, Tsukamoto E, Hosokawa M, Strauss HW, BIankenberg FG, Tait JF, Tamaki N. Detection of apoptotic tumor response in vivo after a single dose of chemotherapy with 99mTc-a獄xin V[J]. J Nucl Med 2003,44:92—97.]。因此， 人膜联蛋白V联合PI染色法更省时，结果更为可靠，是目前最为理想的检测细胞凋亡的方法。
三、荧光标记技术
荧光标记技术是指利用一些能发射荧光的物质共价结合或物理吸附在所要研究分子的某 个基团上，利用它的荧光特性来提供被研究对象的信息。有机物质分子在吸收光能后，分子 从激发态的最低振动能级向基态跃迁时的发射光称为荧光。可以利用荧光染料与被研究对象 (蛋白质、核酸等)吸附或共价结合后其荧光特性发生改变，从而反映出有关研究对象性能 的信息。荧光标记技术起源于20世纪40年代时用荧光标记抗体来检测相应的抗原。随着现 代医学、分子生物学和各种先进荧光检测仪器及技术的应用，荧光标记作为一种非放射性的 标记技术己应用于生命科学的各个研究领域，并取得了迅速的发展。荧光标记具有非放射性、 操作简便、高稳定性、高灵敏度和高选择性等特点，且荧光标记染料种类多、方法灵活，可 应用于多种生物大分子及药物的标记[Evans KC， Berger EP, Cho C-G， Weisgraber KH， Lansbury PT. Apolipoprotein E is a kinetic but not a thermodynamic inhibitor of amyloid formation: implications for the pathogenesis and treatment of Alzheimer's disease[J]. Proc Natl Acad Sci USA 1995,92:763—767; Hyman BT, West HL, Rebeck GW, Lai F, M纖DMA.Neur叩athological changes in Down's Syndrome hippocampal formation: effect of age and apolipoprotein E
6genotype[J]. Arch Neurol 1995,52:373—378.]。
常用的荧光标记染料有以下几类1、荧光素类染料。荧光素类染料的光稳定性好，荧光
量子产率高，其活性基团易与被标记分子中的-NH2， -OH， -SH等结合，常应用于对蛋白质、 核酸等物质的分析。荧光素类标记试剂包括标准荧光素及其衍生物，如荧光素异硫氰酸酯 (FITC)、羟基荧光素(FAM)、四氯荧光素(TET)等。其中FITC是应用最为广泛的一种 荧光素衍生物，广泛用于杂交探针、Edman蛋白质测序法及抗体的标记。FAM、 TET主要用 于DNA自动测序和核酸探针等。但荧光素类衍生物的缺点是光淬灭率高、pH敏感性强和 发射波谱宽[Ignatius MJ, Gebicke-Haerter PJ, Skene JHP, Schilling JW,Weisgraber KH, Mahley RW, et al. Expression of apolipoprotein E during nerve degeneration and regeneration[J]. Proc Natl AcadSciUSA，1986,83: 1125-1129.]。 2、罗丹明类染料。罗丹明类染料(rhodamine dye)是生 物技术中常用的蛋白质分析染料之一，主要包括R101、四乙基罗丹明(RB200)和羧基四甲 基罗丹明(TAMRA)等。在标记反应中活性基团大多与-NH2结合。与荧光素类衍生物相比， 罗丹明类具有更强的光稳定性、更高的荧光产量和更低的pH敏感性。3、菁染料。菁染料是 一种比较特殊的染料，在光照下不稳定。但它的摩尔消光系数高、光谱范围广且光量子产率 高。利用它的这些特性，已经将其应用于生物大分子荧光标记。菁染料与双链核酸结合时(包 括DNA和RNA)，其荧光强度会增加。当专门用于DNA标记时，必须先加入RNA酶进行 处理。菁染料也可以与寡核苷酸探针同时使用，以显示和定量分析细胞中的特定核酸序列。 目前研究比较活跃的菁染料主要有两大类， 一类是噻唑橙(thiazole orange， TO)、嗯唑橙 (oxazole orange, YO)系列及其二聚体染料；另一类是多甲川系列菁染料。菁染料主要用于 标记核酸。4、其他荧光染料。二苯乙烯、萘酰亚胺、香豆素类、吖啶类、芘类等都可用于蛋 白质标记。菲啶类、吲哚、哌洛宁、色素酶A3等可用于标记核酸[Kowall NC, McKee AC， Yankner BA, Beal MF. In vivo neurotoxicity of beta amyloid 「 (1~40) and the 「 (25—35) fragment[J]. Neurobiol Aging 1992,13:537-542.]。此外，以硼酸盐为基质的发光材料因具有合 成温度低、易制备和亮度高等特点，也被认为是有价值的发光基质。如某些稀土硼酸盐以及 以掺杂稀土离子的硼酸盐。
荧光标记技术在蛋白质和核酸分析研究中应用广泛，这种标记方法在其它物质的检测中 同样具有重要的作用。例如还原末端的多糖及寡糖的荧光标记；利用分子荧光特性能直接 测定药品与人血清中某些特定物质的含量；荧光标记还可以用于表征生物活性分子的自由基 等等[LaDu M， Falduto M, Manelli A, Reardon C, Getz G, Frail D.Isoform-specific binding of apolipoprotein E to amyloid[J]. J Biol Chem 1994,269:23403—23406.]。
蛋白质荧光衍生化是将蛋白质中氨基酸的一些功能性基团共价连接上荧光物质。其中最常用的衍生化位点就是氨基。氨基上的氢原子在碱性条件下可被取代，因反应较温和，被广 泛采用。能与氨基起反应的荧光衍生化试剂主要包括芳香邻二醛类如邻苯二甲醛(OPA);酰
氯类如丹磺酰氯(Dns-CL);氯甲酸酯类如芴甲氧羰基氯(FNOC-CL);氰酸酯类如荧光素异 硫氰酸酯(FITC);碳酸脂类如6-氨喹啉基-N-琥珀酰亚胺碳酸脂；酸酐类如N-9-芴甲氧基 碳酰-氨基酸基-N-羧酸酐。氨基酸羧基也可以作为衍生化位点，但是因为需要的反应体系要 求较高，因此在应用上远没有氨基衍生化应用的广泛。能与羧基起反应的荧光试剂主要包括 香豆素类如4-溴甲基-7-甲氧基香豆素(Br-Mmc);重氮甲烷类如l-芘重氮甲烷；苯胺类如9， 10-二氨基菲和芳香卤代垸类如9-氯甲基蒽。其他可以衍生化的位点还有羰基，衍生化试剂有 肼类试剂如丹磺酰肼，邻苯二胺类如邻苯二胺；巯基荧光衍生化，衍生化试剂有N-[P-苯-l,3 -氧氮杂茂]-苯马来酰亚胺(BIPM) [Neve RL, Dawes LR， Yankner BA, Benewitz LL， Rodriguez W,Higgins GA. Genetics and biology of the Alzheimer's amyloid precursor[.T]. Prog Brain Res 1990,86:257-267.]。

发明内容
本发明着眼研制一种高效、灵敏、经济的新型细胞凋亡检测试剂。首先，应用融合蛋白 表达技术制备了偶联谷胱甘肽硫转移酶(GST)的人膜联蛋白V重组融合蛋白(命名为 GPPAN-V)。重组蛋白质的一级结构如图1所示。对GPPAN-V蛋白质进行了 SDS-PAGE电 泳鉴定。如图2所示。鉴定结果表明，制备的GPPAN-V重组蛋白质纯度较高，并且溶解性 良好。电泳鉴定还表明，GPPAN-V结构均一性良好。氨基酸组成实验表明，氨基酸组成与预 期一致。对GPPAN-V的多种研究表明，人膜联蛋白V偶联GST后，其生物学活性仍旧保持 不变，能够正常展示其生物学功能。对GPPAN-V重组蛋白质进行FITC的化学偶联结合实验， 制备出FITC荧光标记的GPPAN-V重组蛋白质FITC-GPPAN-V。对FITC-GPPAN-V进行纯化， 纯化图谱如图3所示。对纯化后的FITC-GPPAN-V进行电泳鉴定，电泳鉴定图如图4所示， 电泳鉴定结果表明FITC-GPPAN-V的化学结构稳定，均一性较好。FITC化学标记的GPPAN-V 重组蛋白质目测显示绿色荧光，在荧光显微镜下检测进一步验证了以上观测结果。随后，将 自行制备的FITC标记的GPPAN-V重组蛋白质作为新型细胞凋亡检测试剂应用于对细胞凋亡 的检测分析中，同时以市场上己有的、以FITC标记的人膜联蛋白V作为主要检测试剂的商 品化试剂盒作为对照。经不同方法标记的凋亡细胞经流式细胞仪检测，分别分成未标记细胞 组、单标PI细胞组、单标FITC-GPPAN-V细胞组、双标FITC-GPPAN-V和PI细胞组、双标 市场上购买的商品化试剂盒FITC标记的人膜联蛋白V和PI细胞组。其中，单标PI细胞组 检测的是凋亡晚期的细胞，单标人膜联蛋白V-FITC检测到的是凋亡早期的细胞，而双标人膜
8联蛋白V-FITC和PI能将凋亡早期和晚期的细胞区分丌。检测实验结果如图5所示，图5为 以商品化FITC-人膜联蛋白V试剂盒为对照，使用新型标记蛋白质FITC-GPPAN-V对凋亡细 胞检测的结果。实验结果表明，FITC荧光标记的GPPAN-V新型重组蛋白质同样能够用于细 胞凋亡的检测分析，使用该试剂的实验组同样展示出细胞早期凋亡的现象，其效果与目前商 品化的FITC标记人膜联蛋白V的试剂盒检测效果相问。实验结果也进一步验证了连接有标 签蛋白GST的GPPAN-V重组蛋白质中的人膜联蛋白V结构能够正确折叠，从而展示出人膜 联蛋白V的生物学功能。所以我们研制的FITC-GPPAN-V可以作为一个新的有效的用于细胞 凋亡检测的工具。由T GPPAN-V重组蛋白质的制备要比制备单独的高纯度的人膜联蚩白V 蛋白容易得多，这意味着试剂盒的成本可以降低，从而形成一种新颖有效的有前途的新型细 胞凋亡检测试剂盒，更好地应用于科学研究、检测分析，甚至实际临床应用中。 以FITC-GPPAN-V为主要成份的细胞凋亡检测试剂盒有如下特点
1、 有效性。细胞凋亡作为一个现代生命科学，尤其是细胞生物学及相关医疗诊断、治疗 方面的一个热点，被广泛研究和关注，大量相关科学研究需要进行细胞凋亡的检测以获得重 要的科学研究数据与结果。FITC-、GPPAN-V与其他商品化试剂，如PI,可以形成-个简单实 用的检测试剂盒，能够高效、灵敏地进行这一检测过程。
2、 经济性。也是它的实用性。目前，市场上的细胞凋亡检测试剂盒价格昂贵， 一方面原 因是主要的检测试剂"FITC标记的人膜联蛋白V"生产成本高。人膜联蛋白V的纯化工艺相 对于GPPAN-V要复杂得多，它通常包括舞杂的包涵体变复性处理步骤，这进一步影响了其 产量得率，也对人膜联蛋白V蛋白质本身的稳定性有负面影响，这限制了其应用。GPPAN-V 重组蛋白质的制备相比于目前人膜联蛋白V的制备，要简单得多，表达产物以可溶形式存在， 无需进行复杂的包涵体处理步骤，而且，后期纯化只需要简单的一步亲和层析即可完成制备 过程。同时，基于现代基因工程技术，重组工程菌可以高密度发酵，非常适合工业化大规模 生产，这又进一步降低了成本。同时，我们的研究证实，GPPAN-V可以被有效地进行FITC 荧光标记，从而制备出FITC-GPPAN-V，应用于检测。所以，以FITC-GPPAN-V为主要成分 的检测试剂盒生产成本大大降低，有利于其推广使用。这也使得我们研制的GPPAN-V重组 蛋白质在实用性方面优于目前市场上已有的细胞凋亡检测试剂盒。
3、 新颖性。首次将GST偶联的人膜联蛋白V (GPPAN-V),应用于细胞凋亡的检测，并 形成配套的细胞凋亡检测试剂盒。研究表明，该检测方法具有灵敏、高效、方便的特点。


附图l.GPPAN-V重组融合蛋白质的一级结构示意图。其中，"一"下划线区域表示GST编码
9框；下划线区域表示Precission Protease蛋白酶作用位点；"......"下划线区域表示
人膜联蛋AV编码框。
附图2. 12%SDS-PAGE电泳检测菌体全蛋白及GPPAN-V重组蛋白质纯化。其中，Lane 1， 菌体全蛋白；Lane 2，菌体破碎液沉淀；Lane 3,菌体破碎液上清；Lane 4-7，纯化后的 GPPAN-V重组蛋白质；Lane 8，蛋白质分子量参照物。
附图3. SephadexG-25葡聚糖凝胶柱层析制备FITC-GPPAN-V荧光标记蛋白质。其中，峰1 为含有FITC-GPPAN-V荧光标记蛋白的组分；峰2为未标记FITC的GPPAN-V重组蛋白 质组份；最后经过很长时间有一个不很明显的峰3，为没有结合任何蛋白的FITC。
附图4. 12% SDS-PAGE电泳鉴定制备的FITC-GPPAN-V荧光标记蛋白质。其中，Lanel、 2， 标记之前的GPPAN-V重组蛋白质；Lane 3、 4, FITC荧光标记后的洗脱峰1; Lane 5，菌 体全蛋白。
附图5.应用流式细胞仪技术进行细胞凋亡检测分析实验结果图。其中，图5-l，未标记细胞 组；图5-2 ，单标PI细胞组；图5-3,单标FITC-GPPAN-V细胞组；图5-4，双标FITC-GPPAN-V 和PI细胞组；图5-5，试剂盒中的FITC标记的人膜联蛋白V (AnxV-FITC)和PI双标细胞组。
参考文献
Rand J H. "Annexin opathies" a new class of diseases [J]. Nature, 1999, 340 (13):1035-1036.
Yue YF， Jiang H， Shi L， et al. Study on the mechanism of intrauterine infection of hepatitis B virus. Chin J Obstet Gynecol, 2004, 39(4): 224-226. Fadok VA， Savill JS, Haslett C, et al. Differnt populations of macrphages use either the vitrotin
receptor or the phosphatidylaerine rceptor to rcognize and rmove apoptotic cells[J]. J Immoral,
1992,149:4029.
De Meyer S. Influence of the administration of human annexin V on in vitro binding of small
hepatitis B surface antigen to human and to rat hepatocyte[J]. Viral Hepat， 2000, 7(2): 104. Patel SK, Ma N, Monks TJ， et al. Changes in gene expression during Chemical induced
nephrocarcinogenicity in the Eker rat[J]. Mol Carcinog， 2003, 38(3): 141-154. Liu JY.Yang Liu F， et al. Preparation of recombinat protein of extracellular ligand binding
domains of mouse VEGF receptor 2 and its application[J]. China Journal of Modem Medicine,
2003,12(24): 21.
Hawkins TE, Christien J， Merrifield, et al. Calcium signaling and annexins[J]. Cell Biophys, 2000,
1033:275-296.
陈大明，谢虹，祁木忠，张颖梅，贾兵，杨红伟，罗志福，张锦荣，金小海，王凡，马大龙. 细胞凋亡检测蛋白AnnexinV的制备纯化和初歩评价,原子能科学技术，2004， 38， Supl， 182-187.
Blankeneberg FG， Katsikis PD， TaiUF， et al. In vivo dictation during programmed cell death[J].
Proc Natl Acad Sci USA， 1998, 95, 6349-6354. Schmechd DE， Saunders AM, Strittmatter WS, et al. Increased amyloid beta-peptide deposition in
cerebral cortex as a consequence of apolipoprotein E genotype in late-onset Alzheimer's
disease[J]. Proc Natl Acad Sci USA， 1993, 90: 9649—9653. Sorbi S, Nacmias B, Forleo P， et al. Epistatic effect of APP717 mutation and apolipoprotein
genotype in familial Alzheimer's disease[J]. AnnNeurol， 1995， 38: 124~127. St. George-Hyslop PM, McLachlan D, Tsuda T， et ，1. Alzheimer's disease and possible gene
interactions[J], Science, 1994, 263: 537. Suzuki N， Cheung T, Cai X-D, et al. An increased percentage of long amyloid 「 protein precursor
(「 APP717) mutants[J]. Science, 1994, 264: 1336—1340. Teller JK, Russo C, DeBisk LM, et al. Presence of soluble amyloid peptide precedes amyloid
plaque formation in Down,s Syndrome[J]. Nature Med, 1996， 2: 93—95. Martin SJ, Reutelingsperger CP， McGahon AJ, et al. Early redistribution of plasma mem-brane
phosphatidylseririe is a general feature of apoptosis regardless of the initiating stimulus:
inhibition by overexpression of Bcl-2 and Abl[J]. J Exp Med, 1995， 182: 1545—1556. Koopman G， Reutelingsperger CP， Kuijten GA， et al. Annexin V for flow cytometric detection of
phosphatidylserine expression on B cells undergoing apoptosis[J]. Blood, 1994, 84: 1415—1420. Mochizuki T, Kuge Y, Zhao S, et al. Detection of apoptotic tumor response in vivo after a single
dose of chemotherapy with 99mTc-訓exin V[J]. J Nucl Med, 2003， 44: 92—97. Evans KC， Berger EP， Cho C-G, et al. Apolipoprotein E is a kinetic but not a thermodynamic
inhibitor of amyloid formation: implications for the pathogenesis and treatment of Alzheimer's
disease[J]. Proc Natl Acad Sci USA,1995， 92: 763—767. Hyman BT, West HL, Rebeck GW, et al. Neuropathological changes in Down's Syndrome
hippocampal formation: effect of age and apolipoprotein E genotype[J]. Arch Neurol 1995, 52:
373—378.
Ignatius MJ， Gebicke-Haerter PJ, Skene JHP, et al. Expression of apolipoprotein E during nervedegeneration and regeneration[J]. Proc Natl Acad Sci USA, 1986, 83: 1125—1129. Kowall NC， McKee AC, Yankner BA, Beal MF. In vivo neurotoxicity of beta amyloid 「 [1~40] and
the 「 (25—35) fragment[J]. Neurobiol Aging, 1992, 13: 537—542. Ladu M, Falduto M, Manelli A， et al.Isoform-spec迅c binding of apolipoprotein E to amyloid[J]. J
Biol Chem,1994, 269: 23403-23406. Neve RL, Dawes LR, Yankner BA, et al. Genetics and biology of the Alzheimer's amyloid
precu丽[J]. Prog Brain Res, 1990, 86: 257—267.
具体实施例方式
实施例1. GPPAN-V重组蛋白质的制备 实验材料与试剂GPPAN-V基因工程菌株由本实验室备存；Tryptone、 Yeast Extract为Oxoid 公司产品；各种层析介质均为瑞典Pharmacm公司产品；其他所需分析纯级试剂为北京化工 厂产品；部分色谱级试剂为美国Sigma公司产品；
实验设备台式低温离心机(5417R)为德国Eppendorf公司产品；电泳仪、凝胶成像系统为 美国Bio-Rad公司产品；高速冷冻离心机为美国Bedonan公司产品；恒温空气摇床 (OSFT-HS-R-32)为葡萄牙Teq公司产品；奥立龙520A酸度计为美国Orion公司产品；JY98-超声波细胞粉碎机为宁波新芝科器研究所产品；大型蛋白纯化系统(FPLC， UPC-900)为瑞 典Pharmacia公司产品蛋白质冷冻干燥机为德国Christ公司产品；Elix/RiOs纯水系统为美 国Millipore公司产品。
实验方法
1、 GPPAN-V重组蛋白质基因的表达
挑取鉴定为阳性的单克隆菌落至3mL (含amp 50ug/mL)的LB液体培养基中，37°C 220rpm振荡培养12个小时。将过夜培养的3mL菌液按1:10的比例接种于400mL (含amp 50ug/mL)的TM表达培养基中，37°C 220rpm振荡培养大约3小时，扩增至OD600约为0.4-0.8。 降低温度至3(TC， IPTG浓度为O.lmM，低温表达16小时，表达GPPAN-V重组蛋白质。取 表达菌液lmL， 6000rpm离心10分钟，倒去上清液，收获菌体沉淀，进行SDS-PAGE电泳， 鉴定表达情况。其余表达菌液则用于后续的目标蛋白纯化。
2、 GPPAN-V重组蛋白质的纯化
将扩大培养表达的400mL菌体加入16mL磷酸缓冲液重悬混匀，将重悬的菌体于冰上进 行超声破碎，功率800W,工作时间5秒，间隙时间15秒。将菌体破碎后得到的悬液进行离 心，20000rpm离心20分钟后，立即转移上清至另一离心管，将转移后的上清20000rpm重 复离心20分钟，转移上清并置于冰上。利用GST亲和柱纯化GPPAN-V重组蛋白质。首先， 将谷胱甘肽琼脂糖介质颠倒混匀，取2mL介质加入层析柱，然后加入10mL 20%的乙醇让其 自然沉降，待乙醇流尽后加入lOmL磷酸缓冲液清洗柱子，等到磷酸缓冲液与层析介质平面 持平时盖好层析柱盖子，待用。在室温下，用IO个柱体积的磷酸缓冲液进行柱平衡，洗至紫 外检测值到基线不变为止。将离心完的上清液加入GST亲和柱，室温结合15-30分钟，可适当搅拌，以4mL/分钟的流速上样。用10个柱体积的磷酸缓冲液洗涤柱子，至紫外检测值不 变为止。收集上样峰待分析。配制10mM的还原型谷胱甘肽溶液，即洗脱液3mL。加到GST 亲和柱上，充分结合10分钟，其间可轻微搅拌。然后，用洗脱缓冲液洗脱，流速2mL/分钟， 分部收集洗脱下来的重组蛋白质，同时记录收集峰值，继而用磷酸缓冲液洗，直至无蛋白溶 液流出为至。最后，对GST亲和柱进行再生和保存。用0.04MNaOH溶液洗3次，每次10mL， 再用lOmL磷酸缓冲液平衡至中性，20。/。乙醇保存于4。C。
3、 SDS-PAGE检测
首先配制12%分离胶和4%浓縮胶。分离胶配制ddH20 3.35mL; 1.5M Tris-HCl (pH 8.8) 2.5mL; 10%SDS100uL: 20% Acryl/0.8% Bis Jt液4.0mL; TEMED 5uL; 10%APS 50uL;浓 缩胶配制ddH20 6.1mL; 0,5M Tris-HCl (pH 6.8)2.5mL; 10%SDS 100uL: 20°/。Acryl/0.8%Bis C液1.3mL; 10%APS 50uL; TEMED 10uL。然后对样品进行处理将lmL/管的样品6000rpm 转离心5分钟，收获菌体。完全倒干菌液后，加入20nL去离子双蒸水，充分混匀。等体积 加2X样品缓冲液(0.5M Tris-HCl(pH 6.8) 4mL; ddH20 20mL; Glycerol 4.0mL; e -巯基乙醇 0.4mL;溴酚兰20mg), 20pL/管，充分混匀。沸水中变性10分钟，煮完后以4'C 12000rpm 离心10分钟，取15^xL上清液进行电泳。100V, 30分钟。打开凝胶胶板，做好标记后去下 胶，小心移入染色器皿中，加入100mL染色液(0.1%考马斯亮蓝11250:乙醇:冰醋酸==5:4:1， 过滤后用)，加盖振荡染色1.5小时。将染色液倒去，染色的凝胶用水漂洗数遍，沥干水后置 于染色皿中，再加入100mL脱色液(医用酒精:冰醋酸:水=45:5:50)，加盖，脱色至凝胶能清 晰显示出蛋白条带止。SDS-PAGE可以鉴定制备的GPPAN-V重组蛋白质的纯度和含量。
4、 考马斯亮蓝G250法测定GPPAN-V重组蛋白质浓度
在OD595nm、敏感度为1的条件下，取lmL的G250溶液于比色皿中，然后将比色皿放 到仪器中进行调零。取lmL的G250溶液和100uL的蛋白样品溶液于比色皿中混合，反应3 分钟，然后将比色皿放进仪器中进行测量、读数，做2-3管平行。根据考马斯亮兰G250标准 曲线公式计算出样品蛋白的浓度。蛋白浓度p (mg/mL)=对应浓度值乂稀释倍数。通过G250 分光光度法测定纯化的GPPAN-V重组蛋白质。将纯化后的GPPAN-V重组蛋白质进行脱盐及 冻干，保存。
实验结果
诱导表达后收集菌体，离心后超声破碎菌体，经亲和层析纯化。图1为GPPAN-V的一
14级结构示意图。图2所示为GPPAN-V重组基因工程菌的表达及纯化鉴定结果。其中，第一 泳道为菌体全蛋白，第二泳道为菌体破碎液沉淀，第三泳道为菌体破碎液上清。与图中第二 泳道相比，第三泳道中含有大部分的GPPAN-V重组蛋白质，表明大部分GPPAN-V重组蛋白 质以可溶性形式存在。第四至第七泳道为亲和层析纯化后的鉴定结果。由图中可见，在 61kDalton位置，为GPPAN-V重组蛋白质的条带。经过亲和层析柱纯化后，可以去除几乎全 部的菌体杂蛋白，得到了浓度较高、纯度较好的GPPAN-V重组蛋白质。
实施例2. FITC-GPPAN-V荧光标记蛋白的制备
实验材料与试剂FITC、 DTT、 e-巯基乙醇为德国Mark公司产品；Tris、 SDS、甘氨酸、丙 烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺为美国Sigma公司产品；GST亲和介质为GE Healthcare公司产品； 其他所需分析纯级试剂为北京化工厂产品；部分色谱级试剂为美国Sigma公司产品。
实验设备高速冷冻离心机为美国Beckman公司产品；奥立龙520A酸度计为美国Orion公 司产品；电泳仪为美国Bio-Rad公司产品；大型蛋白纯化系统(FPLC, UPC-900)为瑞典 Pharmacia公司产品；荧光显微镜为德国Christ公司产品；Elix/RiOs纯水系统为美国Millipore 公司产品。
实验方法
1 、 GPPAN-V重组蛋白的准备用0 4°C的pH 8.0磷酸缓冲液将目标蛋白溶液稀释至浓度为 10mg/mL左右，放于冰槽中。
2、 荧光色素准备按每毫克蛋白加入FITC荧光素0.01mg计算，称取所需的FITC荧光素， 用3%碳酸钠水溶液溶解。
3、 结合反应避光，逐滴将FITC溶液加入到目标蛋白溶液中，边加边搅拌，充分搅匀，在 0 4"C持续搅拌18 24小时，进行结合反应。
4、 透析结合完毕后，将标记好的目标蛋白溶液进行离心处理，2500。m， 20分钟，除去其 中少量的沉淀物，上情液装入MD34型透析袋(MWCO3500)中，置于烧杯中，4'C条件下，用 pH8.0磷酸缓冲液透析72小时，每8小时更换一次缓冲液。
5、 过柱取透析完毕的标记物，通过SephadexG-25葡聚糖凝胶柱(26mmX200mm)，分离 游离荧光素，根据分子量大小不同的蛋白质，其洗脱体积不同，标记好的FITC-GPPAN-V最 先被洗脱下来，其次是未标记的GPPAN-V融合蛋白，最后为未标记上蛋白质的荧光分子。
15根据紫外检测值变化，分别收集各个洗脱峰。洗脱液0.01mol/L磷酸缓冲液(pH7.2);过滤量: 12mL;收集量20mL,稀释1.7倍左右。 7、保存冻干保存，置-20'C备用。
实验结果
经SephadexG-25葡聚糖凝胶柱层析，去除未标记的蛋白及未和蛋白质结合的FITC。经 SephadexG-25葡聚糖凝胶过滤后可以得到三个洗脱峰，如图3所示，其屮，峰1，为结合FITC 的GPPAN-V重组融合蛋白质(FITC-GPPAN-V)，显示绿色荧光；峰2，很小，为未标记FITC 的GPPAN-V重组蛋白质，最后经过很长时间有一个不很明显的峰3，为没有结合任何蛋白的 FITC。电泳检测洗脱峰1中的成分，如图4所示。由电泳结果可知，峰1中含有FITC-GPPAN-V 标记重组蛋白质。
实施例3.应用新型荧光标记蛋白FITC-GPPAN-V检测细胞凋亡
实验材料与试剂人膜联蛋白V-FITC试剂盒为北京众康志恒生物技术有限公司产品；PMSF， DTT, (3-巯基乙醇为德国Mark公司产品；细胞培养基为美国Invi加gen公司产品；甘油、 NaH2P04、 Na2HP04、 NaCl、 HC1、 EGTA为国产分析纯产品。
实验设备流式细胞仪为美国Cole-parmer公司产品；台式低温离心机(5417R)为德国 Eppendorf公司产品；高速冷冻离心机为芙国Beckman公司产品；Elbc/RiOs纯水系统为美国 Millipore公司产品。
实验方法
1、 诱导细胞凋亡用过氧化氢处理Hela细胞，过夜培养12小时待用。
2、 检测细胞凋亡待测细胞的浓度为5X'105-5X106+/mL。取lmL细胞悬浮液，1000rpm, 4"C离心10分钟，弃上清。加入lmL预冷的磷酸缓冲液，轻轻震荡使细胞悬浮，1000rpm, 4 'C离心10分钟，弃上清(对于贴壁细胞，先用胰酶消化，再用磷酸缓冲液洗涤)。重复以上 步骤两次。将细胞重悬于200uL含25mM Ca离子的碳酸缓冲液。加入10uL FITC-GPPAN-V 或者商品化试剂盒中FITC-人膜联蛋白V，以及10uL PI，轻轻混匀，避光室温反应15分钟 或4"C反应30分钟。加入300uL结合缓冲液，在1小时内上机检测。
3、 检测结果分析流式细胞术可以将实验样本中正常、坏死、凋亡细胞区分开。以FITC和PI荧光作双参数点图，细胞分为四个区左上，PI单标，代表机械损伤细胞；左下，代表活 细胞；右上，人膜联蛋白V和PI共标，代表为凋亡晚期或坏死细胞；右下，人膜联蛋白V 单标，代表早期凋亡细胞。分别观察四群细胞比例，检测凋亡现象。
实验结果
将不同方法标记的凋亡细胞经流式细胞仪检测，分别分成未标记细胞组、单标PI细胞组、
单标FITC-GPPAN-V细胞组、双标FITC-GPPAN-V禾口 PI细胞组、双标试剂盒人膜联蛋白 V-FITC和PI细胞组。其中，单标PI检测的是凋亡晚期的细胞，单标人膜联蛋白V-FITC检 测到的是凋亡早期的细胞，而双标人膜联蛋白V-FITC和PI能将凋亡早期和晚期的细胞区分 开。实验结果如图5所示。流式细胞术可以将实验样本中正常、坏死、凋亡细胞区分开。 以FITC和PI荧光作双参数点图，检测结果可以将细胞分为四个区左上，表示PI单标 结果，代表机械损伤细胞；左下，不被标记，代表活细胞；右上，人膜联蛋白V和PI共标， 代表为凋亡晚期或坏死细胞；右下，人膜联蛋白V单标，代表早期凋亡细胞。据图5所示现
象分析，图5-1中未标记任何物质细胞，不能检测到凋亡细胞，只在左下区域检测到活细胞；
图5-2中单标PI可以在左上和左下都检测检测到细胞 ，表示除了有活细胞外还有大量的凋亡 晚期的细胞；图5-3中单标FITC-GPPAN-V能在左下和右下检测到细胞，表示除了有活细胞 外还检测到有大量的凋亡早期的细胞，说明FITC-GPPAN-V能检测到凋亡早期的细胞；图5-4 为双标FTIC-GPPAN-V和PI，可以看到能在左上、左下和右下检测到细胞，说明在检测到活 细胞外，还可以检测到凋亡不同时期的细胞，并且FITC-GPPAN-V和PI能把细胞区分为凋亡 早期和晚期两种形态图5-5为阳性对照，双标商品化试剂盒人膜联蛋白V-FITC和PI，可以 在左上、左下和右下检测到不同状态的细胞。比较图5-4和图5-5可以看到，FITC-GPPAN-V 能够明显地标记早期的细胞凋亡，并且和试剂盒人膜联蛋白V-FITC具有相同的效果。
以上试验表明，FITC-GPPAN-V能够检测出早期细胞凋亡现象，并且其效果和商品化试 剂盒中人膜联蛋白V-FITC具有相同的效果，说明连接有标签蛋白GST的GPPAN-V并没有 影响人膜联蛋白V的正确折叠，能够展示出人膜联蛋白V的生物学功能。FITC-GPPAN-V可 以作为一种新型的检测早期细胞凋亡的工具，由于GPPAN-V的制备要比人膜联蛋白V蛋白 质的制备更容易，成本更低，对于应用于细胞学方面的检测是一个很好的选择。序列表
<120> —种新型细胞凋亡检测试剂及试剂盒的研制
<130>
<160> 1
<170>
<210> 1 <211> 561 <212> PRT
<400> 1
Met Ser Pro He Leu Gly Tyr Trp Lys lie Lys Gly Leu Val Gin Pro Thr Arg Leu Leu 15 10 15
Leu Glu Tyr Leu Glu Leu Lys Tyr Glu Glu His Leu Tyr Glu Arg Asp Glu Gly Asp Lys 21 25 30 35
Trp Arg Asn Lys Lys Phe Glu Leu Gly Leu Glu Phe Pro Asn Leu Pro Tyr Tyr lie Asp 41 45 50 55
Gly Asp Val Lys Leu Thr Gin Ser Met Ala lie lie Arg Tyr lie Ala Asp Lys His Asn 61 65 70 75
Met Leu Gly Gly Cys Pro Lys Glu Arg Ala Glu lie Ser Met Leu Glu Gly Ala Val Leu 81 85 90 95
Asp lie Arg Tyr Gly Val Ser Arg lie Ala Tyr Ser Lys Asp Phe Glu Thr Leu Lys Val 101 105 110 115Asp Phe Leu Ser Lys Leu Pro Glu Met Leu Lys Met Phe Glu Asp Arg Leu Cys His Lys 121 125 130 135
Thr Tyr Leu Asn Gly Asp His Val Thr His Pro Asp Phe Met Leu Tyr Asp Ala Leu Asp 141 145 150 155
Val Val Leu Tyr Met Asp Pro Met Cys Leu Asp Ala Phe Pro Lys Leu Val Cys Phe Lys 161 165 170 175
Lys Arg lie Glu Ala lie Pro Gin lie Asp Lys Tyr Leu Lys Ser Ser Lys Tyr He Ala 181 185 190 195
Trp Pro Leu Gin Gly Trp Gin Ala Thr Phe Gly Gly Gly Asp His Pro Pro Lys Ser Asp 201 205 210 215
Leu Glu Val Leu Phe Gin Gly Pro Leu Gly Ser Leu Glu Val Leu Phe Gin Gly Pro Leu 221 225 230 235
Gly Ser Ala Gin Val Leu Arg Gly Thr Val Thr Asp Phe Pro Gly Phe Asp Glu Arg Ala 241 245 250 255
Asp Ala Glu Thr Leu Arg Lys Ala Met Lys Gly Leu Gly Thr Asp Glu Glu Ser lie Leu 261 265 270 275
Thr Leu Leu Thr Ser Arg Ser Asn Ala Gin Arg Gin Glu lie Ser Ala Ala Phe Lys Thr 281 285 2卯 295
Leu Phe Gly Arg Asp Leu Leu Asp Asp Leu Lys Ser Glu Leu Thr Gly Lys Phe Glu Lys 301 305 310 315
19Leu lie Val Ala Leu Met Lys Pro Ser Arg Leu Tyr Asp Ala Tyr Glu Leu Lys His Ala 321 325 330 335
Leu Lys Gly Ala Gly Thr Asn Glu Lys Val Leu Thr Glu lie lie Ala Ser Arg Thr Pro 341 345 350 355
Glu Glu Leu Arg Ala lie Lys Gin Val Tyr Glu Glu Glu Tyr Gly Ser Ser Leu Glu Asp 361 365 370 375
Asp Val Val Gly Asp Thr Ser Gly Tyr Tyr Gin Arg Met Leu Val Val Leu Leu Gin Ala 381 385 390 395
Asn Arg Asp Pro Asp Ala Gly He Asp Glu Ala Gin Val Glu Gin Asp Ala Gin Ala Leu 401 405 410 415
Phe Gin Ala Gly Glu Leu Lys Trp Gly Thr Asp Glu Glu Lys Phe lie Thr lie Phe Gly 421 425 430 435
Thr Arg Ser Val Ser His Leu Arg Lys Val Phe Asp Lys Tyr Met Thr lie Ser Gly Phe 441 445 450 455
Gin lie Glu Glu Thr lie Asp Arg Glu Thr Ser Gly Asn Leu Glu Gin Leu Leu Leu Ala 461 465 470 475
Val Val Lys Ser lie Arg Ser lie Pro Ala Tyr Leu Ala Glu Thr Leu Tyr Tyr Ala Met 481 485 4卯 495
Lys Gly Ala Gly Thr Asp Asp His Thr Leu lie Arg Val Met Val Ser Arg Ser Glu lie 501 505 510 515
20Asp Leu Phe Asn lie Arg Lys Glu Phe Arg Lys Asn Phe Ala Thr Ser Leu Tyr Ser Met 521 525 530 535
lie Lys Gly Asp Thr Ser Gly Asp Tyr Lys Lys Ala Leu Leu Leu Leu Cys Gly Glu Asp 541 545 550 555
Asp 56权利要求
1.一种可用于细胞凋亡检测分析的新型重组蛋白质GPPAN-V，其详细的蛋白质一级结构如下所示MSPILGYWKIKGLVQPTRLLLEYLEEKYEEHLYERDEGDKWRNKKFELGLEFPNLPYYIDGDVKLTQSMAIIRYIADKHNMLGGCPKERAEISMLEGAVLDIRYGVSRIAYSKDFETLKVDFLSKLPEMLKMFEDRLCHKTYLNGDHVTHPDFMLYDALDVVLYMDPMCLDAFPKLVCFKKRIEAIPQIDKYLKSSKYIAWPLQGWQATFGGGDHPPKSDLEVLFQGPLGSLEVLFQGPLGSAQVLRGTVTDFPGFDERADAETLRKAMKGLGTDEESILTLLTSRSNAQRQEISAAFKTLFGRDLLDDLKSELTGKFEKLIVALMKPSRLYDAYELKHALKGAGTNEKVLTEIIASRTPEELRAIKQVYEEEYGSSLEDDVVGDTSGYYQRMLVVLLQANRDPDAGIDEAQVEQDAQALFQAGELKWGTDEEKFITIFGTRSVSHLRKVFDKYMTISGFQIEETIDRETSGNLEQLLLAVVKSIRSIPAYLAETLYYAMKGAGTDDHTLIRVMVSRSEIDLFNIRKEFRKNFATSLYSMIKGDTSGDYKKALLLLCGEDD
2. 根据权利要求l， 一种用于体外细胞凋亡检测的新型试剂FITC (荧光素异硫氰酸酯)标 记的重组蛋白质FITC-GPPAN-V。
3. 根据权利要求2，以FITC-GPPAN-V为主要试剂而构成的用于细胞凋亡检测分析的试剂盒。
4. 根据权利要求3， 一般情况下，权利要求3中的这种新型试剂盒应包括如下内容 FITC-GPPAN-V，碘化丙啶(PI)，以及相应的缓冲液。
5. 根据权利要求1 ，基于GPPAN-V重组蛋白质而形成的其他细胞凋亡检测分析产品或试剂品o
6. 根据权利要求1， 2， 3， 4， 5，指应用于细胞生物学研究以及临床检测分析等科学研究与 实际应用中。
全文摘要
本发明涉及新型细胞凋亡检测试剂及相关试剂盒的研制。基于现代生物工程技术，将谷胱甘肽硫转移酶(GST)与人膜联蛋白V(annexin V)偶联起来形成一种新型重组融合蛋白GPPAN-V(其蛋白质一级结构示意图如附图1所示)。含有GPPAN-V重组基因表达载体的大肠杆菌宿主菌诱导后的高效表达产物GPPAN-V重组融合蛋白质以可溶形式存在，通过亲和层析纯化即可制备出具有较高纯度的GPPAN-V重组融合蛋白质。GPPAN-V重组融合蛋白质与荧光素异硫氰酸酯(FITC)进行化学偶联后形成可用于细胞凋亡检测的新型细胞凋亡检测试剂FITC-GPPAN-V。以FITC-GPPAN-V为核心形成的新型细胞凋亡检测试剂盒，具有经济、灵敏、高效的优点。
文档编号C07K19/00GK101665537SQ200910148569
公开日2010年3月10日 申请日期2009年6月29日 优先权日2009年6月29日
发明者健 井 申请人:健 井