专利名称：控制多肽修饰反应的方法
控制多肽修饰反应的方法发明领域本发明涉及控制多肽修饰反应的方法，特别(但并非排他的)是控制人因子 VII(FVII)活化以产生人因子VII (a) (FVII (a))的方法。本发明也涉及通过所述多肽修饰 反应可获得的多肽以及涉及包含所述多肽的药物组合物。
背景技术：
血液凝固是由各种血液成分(或因子)复杂的相互作用组成的过程，该过程最终 引起纤维蛋白凝块。一般来说，参与被称为凝血“级联”的血液成分是无酶活性蛋白(酶 原)，这些蛋白通过活化剂(本身是活化凝血因子)的作用转化为蛋白水解酶。已经过上述 转化作用的凝血因子一般称为“活性因子”，并且其通过在凝血因子的名称添加字母“a”来 命名(例如因子VII (a))。FVII (也称作单链FVII、未活化FVII或酶原)是单多肽链，其在Argl52和Ilel53 间的肽键被蛋白酶切割之后即转化为活化型-FVII (a)。所述反应可通过FVII (a)自体蛋白 酶解或通过其它酶例如FXa或罗素蝰蛇毒(Russel viper venom)催化。自体活化具有的 好处就是不需要添加酶或在反应后物理移除酶。能够小心控制FVII的活化是很重要的，因为一旦活化比例达到大于99% (即一旦 优选底物Arg 152已被耗尽)，则重链降解产物(AA^O和AA315)的含量会显著增加。因此 避免过度活化产物是至关重要的。同时，高比例的活化(例如高于94%)是理想的，这留下 相当狭窄的区间(例如94-99% )，在该区间内可获得低降解产物含量及高活性两者。一定量的酶活化会在该酶纯化期间同时发生。此外，由于起始材料组合物(主要 是FVII (a))效价变异以及所引起柱负荷的差异，纯化过程期间的活化水平将不可避免地 变化。纯化期间意外的保存时间也会引起活化水平变化。纯化期间，FVII (a)分子会经历 浓度、PH及停留时间方面的各种条件，所述条件会导致部分活化。纯化之后，业已发现活化 的比例随纯化技术及条件的变化而有很大变化(例如16%至74% )。纯化后活化比例的差 异，产生有关纯化后进行标准化活化程序的重要问题。FVII的活化比例可通过已知程序计算；但是目前没有实时测量技术，而且已知程 序的持续时间通常为大约30分钟。因此，如果在取样测量时活化比例接近99%，那么当得 到结果时将超过该值。这将会导致高水平的不想要的重链降解产物。US 4, 286, 056 (Baxter Travenol Lab)描述了用以产生活化的凝血酶原复合 物浓缩物的方法，所述方法包括通过测定起始材料的活化状态，然后根据对起始材料活 化进展的分析改变至少一种活化条件以达到预设的活化水平，从而控制活化程度。WO 2007/013993 (Maxygen Holdings Ltd)描述了一种用于在溶液中将FVII 活化为 FVII (a)的 方法，所述方法包括添加胺类化合物、Ca2+，调整溶液的终浓度至大约7. 2到8. 6，将所得到 的活化混合物在大约2°C到大约25°C之间保温足以将至少90%的scFVII转化为FVII (a) 的一段时间。US 4, 456, 591 (Baxter Travenol Lab)描述了向有凝血因子缺陷(例如凝血 因子不足或有凝血因子抑制剂)的患者给予有效止血量的组合物的方法，其中唯一有效的 活化止血剂为因子VII (a)。
因此非常需要提供一种用于确定最适反应时间以提供所需水平的修饰酶的改良 方法。本发明也提供较纯的蛋白酶产物。较纯的蛋白酶产物导致患者体内抗蛋白酶(抗 体)形成的可能性较小。此外，蛋白酶活化率的严格控制最终导致生产工厂里废料减少，因为当更大数目 的批料符合规定要求(就纯度和质量平均度而言)时将会丢弃更少生产批料。发明概述根据本发明的第一方面，提供一种控制多肽修饰反应的方法，所述方法包括计算 至少一种方法变量以及应用所述变量于数学模型中以便计算进一步方法变量值的步骤。根据本发明的第二方面，提供一种进行多肽修饰反应的方法，所述方法包括以下 步骤(a)测量多肽的起始浓度；(b)测量经修饰多肽的起始比例；(c)通过将步骤(a)和(b)的每一步骤中计算的值与经修饰多肽所需比例值相互 关联，计算多肽修饰反应时间；及(d)以步骤(C)计算的时间进行多肽修饰反应。根据本发明的第三方面，提供一种根据上文定义的方法可得到的多肽。附图简述
图1图解说明本发明的总体构思。对于变化的输入值，该方法确保输出值是基本 可预测及恒定的。图2说明严密调节蛋白酶活化程度的重要性。当活化程度(％)从99. 5%增加到 100%时，降解产物(蛋白酶)百分比呈指数增加。图3说明如果批料中存在越多的酶(即蛋白酶)，那么蛋白酶的活化就会越快发 生。以百分比表示的克分子分数(xb)可利用Henderson-Hasselkich图找到。可计算任何 PH下酶的活化分数。存在非线性关系。图4显示获得的FVII (a)的浓度具有浓度依赖性。FVII活化比率在高浓度 FVII (a)下比在低浓度FVII (a)下的大。图5显示获得的FVII (a)的浓度具有pH依赖性。在较高pH(6. 8)下FVII活化比 率比较高；在较低pH(6. 2)下FVII活化比率比较低；而在pH6. 5下FVII活化比率居中。发明详述根据本发明的第一方面，提供一种控制多肽修饰反应的方法，所述方法包括计算 至少一种方法变量以及应用所述变量于数学模型以计算进一步的方法变量值的步骤。因此本发明提供结合物理或数学模型和方法分析技术(process analytical technology, PAT)工具以便计算基本方法变量的好处。所述PAT工具具有可以线上、线内 和/或近线方式而准确控制所述修饰反应的优点。因此，这种技术的使用为使用者提供直 接所需值以至该反应可以最佳方式进行以达到最佳结果。在一个实施方案中，至少一种方 法变量可选自修饰程度、试剂浓度测量结果、PH测量结果、温度测量结果。在一个实施方案 中，进一步方法变量可以是反应时间。在一个实施方案中，所述方法包括控制多肽聚乙二醇化的程度。因此根据本发明的进一步的方面，提供控制多肽聚乙二醇化程度的方法，所述方法包括以下步骤应用所需 聚乙二醇化的程度、酶浓度、PEG浓度、多肽浓度以及温度于数学模型中，然后计算反应时 间。在一个实施方案中，所述方法包括控制因子IX(FIX)多肽的聚乙二醇化程度。在 该实施方案中，聚乙二醇化程度根据以下方法变量计算反应时间、酶浓度、PEG浓度、FIX 浓度以及温度(通常是22°C)。人们会意识到，技术人员能通过向数学模型(可来源于 Eulers,Runge-Kutta,Newton-Raphson或DASPK方法)输入方法变量值，计算用于达到FIX 所需聚乙二醇化程度的最适反应时间。这种数学方法可方便地用来提供多肽修饰反应的准 确控制。根据本发明的第二方面，提供一种进行多肽修饰反应的方法，所述方法包括以下 步骤(a)测量多肽的起始浓度；(b)测量经修饰多肽的起始比例；(c)通过将步骤(a)和(b)的每一步骤中计算的值与经修饰多肽所需比例值相互 关联，计算多肽修饰反应时间；以及(d)以步骤(C)计算的时间进行多肽修饰反应。在一个实施方案中，修饰反应包括酶切或通过向多肽添加化学剂的修饰(例如聚 乙二醇化)。在其中修饰包括酶切的一个实施方案中，业已意外地发现，可以使起始的浓度和 切割比例与所需切割比例相互联系，以便计算精确反应时间。这种相互联系的结果非常准 确(常常在大约0.5%切割比例之内)且可重复的。这种方法也提供了在反应前仅需计算 两个测量结果(即起始浓度和起始切割比例)的显著优点。此外，所述反应可以所计算的 时间进行，无需监测反应状态(或甚至测量最终切割比例，除非质量控制目的所需)。本文所用的术语“蛋白”、“多肽”及“肽”意指由通过肽键连接的至少5个组成氨 基酸组成的化合物。组成氨基酸可以来自由遗传密码编码的氨基酸，它们也可以是非遗传 密码编码的天然氨基酸以及合成氨基酸。非遗传密码编码的天然氨基酸是例如羟脯氨酸、 y-羧基谷氨酸、鸟氨酸、磷酸丝氨酸、D-丙氨酸以及D-谷氨酸。合成氨基酸包括化学合成制 造的氨基酸，即遗传密码编码的氨基酸的D-异构体诸如D-丙氨酸及D-亮氨酸、Aib (a-氨 基异丁酸)、Abu(a_氨基丁酸)、Tle (叔丁基甘氨酸)、β -丙氨酸、3_氨甲基苯甲酸以及邻 氨基苯甲酸。在一个实施方案中，所述多肽是酶，诸如凝血因子或止血相关蛋白(例如丝氨 酸蛋白酶)。这些多肽的实例包括因子I(纤维蛋白原)、因子II(凝血酶原)、组织因 子、因子V(凝血因子V)、因子VI、因子VII、因子VIII、因子ΙΧ(克里斯马斯因子)、因子 X(Stuart-Prower因子)、因子XI (血浆凝血激酶前体)、因子XII (哈格曼因子)、因子 XIII (血纤蛋白稳定因子)、血管假性血友病因子、前激肽释放酶、高分子量激肽原(HMWK)、 纤连蛋白、抗凝血酶III、肝素辅因子II、蛋白C、蛋白S、蛋白Ζ、蛋白Z相关蛋白酶抑制剂 (ZPI)、纤维蛋白溶酶原、α 2-抗纤溶酶、组织纤溶酶原激活物(tPA)、尿激酶、纤溶酶原激 活物抑制剂-1 (PAIl)、纤溶酶原激活物抑制剂-2 (PAI2)以及癌前凝血剂。在另外一个实施方案中，所述多肽是自体活化的多肽。在另外一个实施方案中，所述酶是凝血因子(例如丝氨酸蛋白酶凝血因子)。适当的丝氨酸蛋白酶凝血因子的实例 包括分类在EC 3. 4. 21之下的那些因子，例如因子II、因子VII、因子IX、因子X、因子XI、 因子XII、前激肽释放酶、蛋白C以及纤维蛋白溶酶原(这些无活性酶原的活化形式分别是 FIIa、FVIIa、FI)(a、FXa、FXIa、FXIIa、激肽释放酶、活化的蛋白C(aPC)以及纤维蛋白溶酶)。在其中的修饰反应包括酶切的一个实施方案中，凝血因子是因子VII或其类似物 或衍生物。在其中的修饰反应包括聚乙二醇化的一个实施方案中，凝血因子是因子IX或其 类似物或衍生物。在本发明的一个方面，本发明提供活化丝氨酸蛋白酶凝血因子的方法，其包括以 下步骤(a)测量丝氨酸蛋白酶凝血因子的起始浓度；(b)测量活化的丝氨酸蛋白酶凝血因子的起始比例；(c)通过将步骤(a)和(b)的每一步骤中测量的值与活化丝氨酸蛋白酶凝血因子 所需比例值相互关联，计算丝氨酸蛋白酶凝血因子活化反应的时间；及(d)以步骤(C)计算的时间进行丝氨酸蛋白酶凝血因子活化反应；(e)在步骤(C)计算的反应时间后终止反应。根据本发明的再一方面，本发明提供将因子VII活化为因子VII (a)或其类似物或 衍生物的方法，其包括以下步骤(a)测量因子VII起始浓度；(b)测量活化的因子VII的起始比例；(c)通过将步骤(a)和(b)的每一步骤中计算的值与活化因子VII所需比例值相 互关联，计算因子VII活化反应的时间；及(d)以步骤(c)计算的时间进行因子VII活化反应。在另一任选步骤(e)中，在步骤(C)计算的反应时间后终止反应。在本发明又一方面，本发明提供防止活化丝氨酸蛋白酶产物降解的方法，其包括 以下步骤(a)测量丝氨酸蛋白酶凝血因子的起始浓度；(b)测量活化的丝氨酸蛋白酶凝血因子的起始比例；(c)通过将步骤(a)和(b)的每一步骤中的测量值与活化丝氨酸蛋白酶凝血因子 所需比例值相互关联，计算丝氨酸蛋白酶凝血因子活化反应的时间；及(d)以步骤(C)计算的时间进行丝氨酸蛋白酶凝血因子活化反应；(e)在步骤(C)计算的反应时间后终止反应。本发明的一个实施方案中，步骤(C)中描述的相互关联程序是根据公式(I)计算的
权利要求
1.一种活化丝氨酸蛋白酶凝血因子的方法，该方法包括以下步骤(a)测量丝氨酸蛋白酶凝血因子的起始浓度；(b)测量活化的丝氨酸蛋白酶凝血因子的起始比例；(c)通过将步骤(a)和(b)的每一步骤中的测量值与活化丝氨酸蛋白酶凝血因子的所 需比例值相互关联，计算丝氨酸蛋白酶凝血因子的活化反应时间；及(d)以步骤(c)计算的时间进行丝氨酸蛋白酶凝血因子活化反应；(e)在步骤(c)计算的反应时间后终止反应。
2.权利要求1的方法，其中步骤(c)中的反应时间T根据公式(I)计算In/aktQ-{akt-\)\丈—一 m\akt {aktO-l)J~ k(T)-xb-F0 (I)其中“akt”意指已切割多肽的所需比例，“aktO”意指步骤(b)测量的已切割多肽起始 比例，“F0”意指步骤(a)测量的多肽起始浓度(g/1)，k(T)意指作为温度T的函数的指定 反应的反应常数(L/g/min)，xb意指克分子分数。
3.权利要求2的方法，其中k(T)是多项式或样条。
4.权利要求1-2中任何一项的方法，其中步骤(c)描述的相互关联程序根据公式(II) 计算一 ArJaktQjakt-I)^ 玄 一 一 in\akt{aktO-l) J“k.xb.FQ (II)其中akt、aktO、k、xb及FO如权利要求2中所定义，而k为反应常数。
5.权利要求4的方法，其中k= 0.四。
6.权利要求1-4中任何一项的方法，其中xb= 1。
7.一种防止活化的丝氨酸蛋白酶凝血因子降解的方法，所述方法包括以下步骤(a)测量丝氨酸蛋白酶凝血因子的起始浓度；(b)测量活化的丝氨酸蛋白酶凝血因子的起始比例；(c)通过将步骤(a)和(b)的每一步骤中的测量值与活化的丝氨酸蛋白酶凝血因子的 所需比例值相互关联，计算丝氨酸蛋白酶凝血因子的活化反应时间；及(d)以步骤(c)计算的时间进行丝氨酸蛋白酶凝血因子活化反应；(e)在步骤(c)计算的反应时间后终止反应。
8.权利要求1-7中任何一项的方法，其中所述的丝氨酸蛋白酶是因子VII、因子VII类 似物或其衍生物、或因子IX。
9.权利要求8的方法，其中所述的因子VII类似物为V158D/E^6V/iC98Q-FVII(a)。
10.权利要求1-9中任何一项的方法，其中所需切割比例为90-99%，诸如94-99%、 95-97 %、96-98%、97-99%。
11.根据权利要求1-10中任何一项的方法，其中切割反应另外包括钙离子(例如氯化 钙)的添加。
12.权利要求1-11中任何一项定义的方法，其中活化反应在pH6. 0-8.0、例如 6. 25-6. 75 (例如 6. 5 士 0. 05)下进行。
13.权利要求1-12中任何一项定义的方法，其中反应的终止包括将pH值降低到大约 6. 0之下，例如5. 5-6. 0 (例如5. 8)。
14.可根据以上任何一项权利要求中定义的方法获得的丝氨酸蛋白酶。
15.一种组合物，其包含可根据以上任何一项权利要求中定义的方法获得的活化因子 VIKa)类似物或其衍生物。
全文摘要
本发明涉及控制多肽修饰反应的方法，特别(但并非排他的)是，控制人因子VII(FVII)活化而产生因子VII(a)(FVII(a))的方法。本发明也涉及通过所述多肽修饰反应可获得的多肽以及涉及包含所述多肽的药物组合物。
文档编号C07K14/745GK102046653SQ200980121180
公开日2011年5月4日 申请日期2009年5月29日 优先权日2008年5月30日
发明者J·克拉鲁普, L·塞杰加尔德 申请人:诺沃-诺迪斯克保健股份有限公司