抗炎症药剂的制作方法

专利名称：抗炎症药剂的制作方法
抗炎症药剂发明领域本发明属于治疗或预防人类和动物炎症的领域，并涉及用于治疗或预防各种炎性 病症的药物组合物和方法。具体来说，本发明涉及用于预防或治疗炎性病症例如瓜氨酸相 关疾病、优选为炎性疾病的组合物和方法。本发明提供了用于炎性病症的治疗和预防针的 对含瓜氨酸表位的特异性结合分子。
背景技术：
炎性病症，不论其本质是慢性还是急性的，在医疗保健行业中都是重要的难题。简 单来说，慢性炎症被认为持续时间长(数周或数月)的炎症，其中活性炎症、组织破坏和愈 合的努力都在同时进行之中(《RcAbins疾病病理学基础》(RcAbins Pathological Basis of Disease),R. S. Cotran,V. Kumar 禾口 S. L. Robbins 主编，W. B. Saunders Co. ,p. 75,1989)。 尽管慢性炎症可以继发于急性炎症发作之后，但是它也能作为隐伏过程开始，随时间而发 展，例如作为引起迟发型超敏反应的持续性感染(例如结核病、梅毒、真菌感染)、长时间暴 露于内源(例如升高的血脂)或外源(例如二氧化硅、石棉、香烟焦油、外科缝合线)毒素、 或抗身体自身组织的自身免疫疾病(例如类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮、多发性硬化、 牛皮癣)的结果。炎性关节炎在发达国家，特别是随着老年个体数量的增加是一种严重的健康问 题。例如，一种形式的炎性关节炎——类风湿关节炎(RA)，是一种多系统、慢性、复发性、炎 性疾病，影响世界人口的1到2%。尽管可能影响许多器官，但RA基本上是严重形式的慢性滑膜炎，有时引起患病 关节的破坏和关节强直(((Robbins疾病病理学基础》(Robbins Pathological Basis of Disease), R. S. Cotran, V. Kumar 禾口 S. L. Robbins, W. B. Saunders Co. , p. 75,1989)。在病理 上，这种疾病的特征是滑膜显著增厚从而形成伸出到关节间隙中的绒毛状突起、滑膜细胞 内衬多层化(滑膜细胞增殖)、滑膜被白细胞浸润(巨噬细胞、淋巴细胞、浆细胞和淋巴滤 泡；被称为“炎性滑膜炎”)，以及纤维蛋白在滑膜内沉积并伴有细胞坏死。作为该过程的结 果而形成的组织被称为关节翳(parmus)，并且关节翳最终生长到填满关节间隙。关节翳通 过血管发生过程发展出大范围的新血管网，这对于滑膜炎的演化是至关重要的。从关节翳 组织的细胞释放出消化酶(基质金属蛋白酶(例如胶原酶、基质溶素))和炎性过程的其他 介导物(例如过氧化氢、超氧化物、溶酶体酶和花生四烯酸代谢产物)，导致软骨组织进行 性破坏。关节翳侵入关节软骨，导致软骨组织的侵蚀和断裂。最后，所涉及的关节出现软骨 下骨骼的侵蚀和纤维性关节强直，并最终出现骨性强直。一般相信，RA是一种自身免疫疾病，许多不同的关节源性刺激在免疫遗传易感性 宿主中激活免疫应答。外源性感染因子(Epstein-Barr病毒、风疹病毒、细胞肥大病毒、疱 疹病毒、人类嗜T-淋巴细胞病毒、支原体等)和内源性蛋白例如胶原蛋白、蛋白聚糖、改变 的免疫球蛋白和翻译后修饰的蛋白例如瓜氨酸化的蛋白两者，都已被暗示是引发不适当的 宿主免疫应答的致病因子。无论引发因子是什么，自体免疫在疾病的发展中都发挥作用。具 体来说，相关抗原被抗原呈递细胞(滑膜中的巨噬细胞或树突状细胞)摄入、加工并呈递给T淋巴细胞。T细胞启动细胞免疫应答，并刺激B淋巴细胞增殖和分化成浆细胞。最终结果 是产生针对宿主组织的过量的不适合的免疫应答(例如针对II型胶原蛋白的抗体、针对自 身IgG的Fc部分的抗体(被称为“类风湿因子”))，以及针对不同的瓜氨酸化表位的抗体 (抗CCP抗体)。这进一步放大了免疫应答并加速了软骨组织的破坏。一旦引发这种级联 反应，大量软骨破坏的介导物造成了类风湿关节炎的发展。已经证实，上面提到的抗CCP抗体对于RA高度特异。最近的证据显示，每个对这 些抗体血清型阳性的个体要么已经患有RA，要么将在将来发生这种疾病。抗CCP抗体的存 在(特别是当高滴度存在时)指示了侵蚀性疾病结果(Nijenhuis等，Clin. Chim. Acta, vol 350，17-34,2004)。此外，已经证实抗CCP抗体在炎症位点处局部产生。在来自RA患者的 滑膜材料中发现的抗CCP抗体相对于总IgG的比例，似乎明显高于同样患者的血清中的比 例(Masson-Bessiere 等，Clin Exp Immunol, vol 119,544-552,2000)(Reparon-Schuijt 等，Arthritis Rheum, vol 44，41-47，2001)。滑膜中产抗CCP抗体的浆细胞的存在，表明炎症位点处CCP特异性B细胞的抗原 驱动性成熟。抗CCP抗体一旦产生，与滑膜中的瓜氨酸化蛋白形成的免疫复合物可以引发 炎性过程的发展。这些以及其他数据支持了这样一种假说，即抗CCP抗体事实上导致了 RA的至少一部分疾病症状。抗CCP抗体在RA发病机理中的作用，得到了在患有RA的患 者中进行的B淋巴细胞消减实验的结果的支持(Cambridge等，Arthritis Rheum, vol48, 2146-2154,2003)。患有晚期类风湿关节炎的人具有比某些类型的癌症更高的死亡率，因此治疗方 案已经转向被设计用于降低不可逆关节损伤的侵占性的早期药物疗法。美国风湿病学 会(American College of Rheumatology)最近的推荐意见(Arthritis and Rheumatism 39(5) :713-722,1996)包括对于任何具有确定诊断和进行中的症状的患者早期启动改变 疾病的抗风湿病药物(DMARD)疗法。抗癌症药物已变成用于绝大多数患者的一线疗法，其 中化疗药物氨甲蝶呤是60到70%的风湿病学家所选的药物。疾病的严重性通常需要无 限期地每周使用这种药物进行治疗，并且在尽管使用氨甲蝶呤疗法但疾病仍然发展的患 者(超过50%的患者)中，经常使用二线化疗药物例如环孢菌素和硫唑嘌呤(单独或组合 地)。对于能够抑制炎性疾病、特别是其中涉及滑膜的疾病和瓜氨酸相关的炎性疾病的 发病机理，用于治疗或预防炎性疾病的化合物，仍存在需求。

发明内容
本发明提供了用于炎性疾病的治疗或预防的与pl5和/或P17上的瓜氨酸化表位 特异性反应的结合分子。本发明还提供了用于治疗或预防炎性疾病的方法，包含向需要的患者给药治疗有 效量的抗炎症组合物的步骤，所述组合物包含与P15和/或pl7上的瓜氨酸化表位特异性 反应的结合分子。本发明的组合物和方法包括与瓜氨酸残基反应的特异性结合分子的可药用制剂。 具体来说，结合分子与本文中所鉴定的被称为P15和pl7的两个多肽上的瓜氨酸化表位特 异性反应。
在参考了下面的详细描述、图和实施例后，本发明的这些以及其他方面将变得明 显。此外，在本文中陈述了各种不同的参考文献，它们对某些过程、装置或组合物进行了更 详细描述，因此在此以其全文引为参考。发明详述本发明提供了用于炎性疾病的治疗或预防的与pl5和/或pl7上的瓜氨酸化表位 特异性反应的结合分子。在本文中使用的术语“特异性结合分子”是指能够特异性结合的分子、优选为小分 子。就此而言，特异性结合打算是指分子能够与选定的靶分子结合，而它在同样条件下将不 结合另一种不相关的靶分子。例如，当结合分子与血清白蛋白结合并且更少或完全不与血 清中发现的另一种或优选任何其他蛋白结合时，所述结合分子被称为与血清白蛋白特异性纟口口。在本文中，术语“与瓜氨酸特异性反应”或“与瓜氨酸化表位反应”或“与瓜氨酸表 位反应”，是指抗体与结构例如含有瓜氨酸残基的肽或肽样分子反应，但是抗体更少或优选 完全不与含有精氨酸残基代替瓜氨酸残基的同样结构反应。术语肽或肽样分子应该被解释 为这样的结构，其能够将瓜氨酸残基呈递在与本文所述的特异性结合分子具有免疫反应性 的正确情形下，优选为其在人类或动物体内所表现出的相同情形下，优选为天然多肽的情 形下。“特异性结合分子”可以是能够特异性结合靶化合物的分子、优选为小分子，由 DNA、RNA、肽、蛋白结构域、完整蛋白或其组合或其部分构成。特异性结合分子的优选实例 是肽或抗体或其部分，例如单链可变区片段(scFv)、抗原结合区片段(Fab)、单结构域抗体 (sdab)也称为VHH抗体、纳米抗体(nanobody)(源自于骆驼的单结构域抗体)、或被称为 VNAR的源自于鲨鱼IgNAR的单结构域抗体片段或其其他活性组分、Anticalin或适体(DNA 或RNA)。在优选实施方案中，特异性结合分子是包含抗体或适体、例如采取DNA或RNA形式 的适体的抗原结合结构域的融合蛋白。在更优选实施方案中，特异性结合分子包含抗体或 其衍生物，例如抗体片段、纳米抗体、单结构域抗体或其活性部分。因此，本发明尤其涉及如 上所述的作为肽或抗体的特异性结合分子。术语“抗体”是指能够特异性结合通常被称为“抗原”的靶分子的蛋白或多肽。抗 体(也称为免疫球蛋白)是在脊椎动物的血液或其他体液中发现的Y球蛋白，并被免疫系 统用来识别和中和外来物体例如细菌和病毒。抗体典型地由基本结构单元构成，每个结构单元具有两条大的重链和两条小的轻 链，以形成例如具有一个单元的单体、具有两个单元的二聚体或具有五个单元的五聚体。抗 体由一种被称为B细胞的白细胞产生。存在几种不同类型的抗体重链，以及几种不同类型 的抗体，其根据它们所具有的重链分组成不同的同种型。在哺乳动物中已知有五种不同的 抗体同种型，它们执行不同功能，并帮助指导针对它们所遇到的每种不同类型的外来物体 的适合的免疫应答。某些动物物种例如骆驼(例如美洲驼)和鲨鱼可能具有异常的抗体结 构。尽管所有抗体的通用结构非常相似，但是位于蛋白顶端的小区域极端可变，使数 百万具有轻微差异的顶端结构的抗体得以存在。该区域被称为高变区。每个这些变体能够 与不同的被称为抗原的靶结合。抗体的这种巨大的多样性允许免疫系统识别同样广泛的抗原多样性。抗原被抗体所识别的独特部分被称为表位。这些表位与它们的抗体以高度特异 性的相互作用结合，这允许抗体只识别和结合它们在构成有机体的数百万种不同分子中的 独特抗原。抗原被抗体的识别使其带上标签，用于被免疫系统的其他部分攻击。抗体也可 以直接中和靶，例如与病原体引起感染所需的部分结合。抗体的大量和多样性群体，由一组编码不同抗原结合位点(或互补位)的基因区 段的随机组合产生，并继之通过该抗体基因区域中的随机突变产生进一步的多样性。抗体 基因也在被称为类别转换的过程中重新组织，该过程将重链的基础改变成另一种，产生保 留有抗原特异性可变区的不同的抗体同种型。这允许单个抗体被免疫系统的几个不同部分 以几种不同的同种型使用。本文中使用的术语“抗体”包括单链抗体、抗原结合区片段、重组产生的抗体、单克 隆抗体、单结构域抗体等。在抗体或其他特异性结合分子的情形下，术语“或其部分”是指抗体或特异性结合 分子，其构成抗体或特异性结合分子的特异性结合位点的部分，并可以被解释为是抗体或 特异性结合分子仍然能够与整个抗体或特异性结合分子所反应的相同表位进行反应的部 分。在本发明中可以使用所有种类的特异性结合分子及其衍生物，例如抗体、包含抗 体的特异性结合结构域的融合蛋白、适体、抗体片段、单结构域抗体片段、其他蛋白类结合 结构域例如anticalin，以及特异性结合瓜氨酸化表位的小分子。但是，人类抗体或其片段 是本发明的优选实施方案。优选使用具有IgGl重链和λ轻链的IgGl (例如IgGlX)抗 体。但是，其他人类抗体同种型也被本发明所涵盖，包括与κ或λ轻链组合的IgG2、IgG3、 IgG4、IgM、IgAU IgA2、IgAsec、IgD和IgE0此外，所有源自动物的各种不同同种型的抗体 也可用于本发明。抗体可以是全尺寸抗体或抗体的抗原结合片段，包括Fab、F(ab’)2、单链 Fv片段或单结构域VHH、VH或VL单结构域。“与瓜氨酸化表位反应的特异性结合分子”应该被解释为是在较大结构例如肽或 肽核酸或适体或肽模拟结构的情形下，与瓜氨酸残基特异性反应的特异性结合分子。瓜氨酸是在翻译过程中不掺入到蛋白质中的一种氨基酸，但是，它可以通过精氨 酸残基被肽酰精氨酸脱亚氨酶(PAD)的翻译后修饰所产生。瓜氨酸化是由肽酰精氨酸脱亚氨酶(PAD)催化的精氨酸残基向瓜氨酸残基的翻 译后转化。肽酰精氨酸脱亚氨酶(PAD;EC 3.5.3. 1 催化蛋白中精氨酸残基向瓜氨酸残 基的转化。对于瓜氨酸来说不存在tRNA，蛋白中瓜氨酸残基的存在完全是翻译后修饰的结 果。在哺乳动物(人类、小鼠和大鼠)中已经鉴定到5种PAD同种型(PAD1-PAD6 ;“PAD4” 和“PAD5”被用于同一个同种型)，各由不同基因编码(Vossenaar等，Bioessays 25， 1106-1118，2003)。所有这些酶的活性强烈地依赖于Ca2+的存在，并且不能将游离L-精氨 酸转变成游离L-瓜氨酸。游离L-精氨酸可以被真核生物中的氧化氮合酶(EC 1. 14. 13. 39) 或细菌中的精氨酸脱亚氨酶(EC 3. 5. 3. 6)转化成游离L-瓜氨酸。这些酶不是Ca2+依赖 性的。高度同源的PAD酶之间的最显著差异是它们的组织特异性表达。在表皮中， PADl (异名PAD I、I型PAD)在角质细胞分化的最后阶段中参与角蛋白丝的瓜氨酸化， 其对于角质化包膜的重新组织是重要的。表皮中的另一个瓜氨酸化位点是毛囊，其含有PAD3(异名为PAD III、III型PAD)及其天然底物毛透明蛋白(THH)。THH是毛囊的内根鞘 细胞和髓质层以及较低程度上其他特化表皮的主要结构蛋白。最近鉴定到的PAD同种型 PAD6(异名ePAD)被发现在小鼠卵母细胞的细胞质片层中，其在早期胚胎发生中发挥重要 作用。其人类直系同源物的表达被发现仅限于卵巢、睾丸和外周血白细胞(Chavanas等， Gene vol 330 ； 19-27, 2004)。最初，这种PAD同种型被命名为ePAD，但是根据其他PAD的 系统编号，这种同种型被重新命名为PAD6 (Vossenaar等，Bioessays vol 25 1106-1118， 2003)。最广泛表达的同种型PAD2(异名PAD II、II型PAD、PAD_H19)存在于许多不同组织， 例如骨骼肌、脑、脾、分泌腺和巨噬细胞中。尽管具有这种广泛的表达样式，但鉴定到的天然 底物只有髓鞘碱性蛋白(MBP)和波形蛋白。在多发性硬化(MS)中，患者发生针对MBP的自 身免疫应答。MBP是髓鞘的一种丰富蛋白，其瓜氨酸化发生在中枢神经系统的发育过程中。 在钙离子载体诱导的人类和小鼠巨噬细胞的凋亡过程中，观察到了波形蛋白的瓜氨酸化， 并且如上所述，已显示瓜氨酸化的波形蛋白是RA特异性抗Μ自身抗体的靶。与上面讨论 的都主要位于细胞的胞质中的PAD相反，PAD4同种型(异名PAD IV、IV型PAD、HL_60PAD、 PAD V、V型PAD、PADI4)定位于核中。在PAD4蛋白的N-末端区域中发现了 PAD4的核定位 信号。PAD4主要表达在外周血粒细胞和单核细胞中。PAD4在核中的底物是组蛋白核心蛋 白(H2A、H3和H4)和核仁磷酸蛋白/B23，一种在核糖体组装、核细胞质运输和中心体复制 中发挥作用的核仁蛋白。本发明的特异性结合分子针对pl5和/或pl7上的瓜氨酸化表位，这两种多肽的 特征为其分子量分别为15kDa和17kDa。已发现这种特异性结合分子特别适合于炎性疾病的治疗或预防。本文中使用的“炎性病症”或“炎性疾病”是指众多病症或疾病中的任一种，其特 征在于血管性变化浮肿和嗜中性细胞浸润(例如急性炎性反应)；组织被单核细胞浸润； 组织被炎性细胞、结缔组织细胞及其细胞产物破坏；以及尝试通过结缔组织替换进行修复 (例如慢性炎性反应)。这种病症的代表性实例包括与瓜氨酸相关的炎性疾病和自身免疫疾病。在本文 中，与瓜氨酸相关的炎性疾病被定义为其中瓜氨酸化在疾病的发病机理中发挥作用的疾 病。瓜氨酸化在疾病的发病机理中是否发挥作用，可以由本领域技术人员使用本技术领域 中可用的常规测试容易地确定。例如，这些疾病的特征可能是在受影响或患病的相关组织 中存在异常水平的瓜氨酸化蛋白。这可以通过在其中使用患病组织作为抗原的免疫测试例 如western印迹或ELISA来完成，并且抗原的瓜氨酸化可以使用本文所述的抗瓜氨酸化抗 体来检测。或者，本领域技术人员可以使用蛋白质组学应用例如质谱分析来比较来自患病患 者的患病和健康组织的瓜氨酸化水平和类型。疾病也可以通过针对含瓜氨酸的肽或蛋白的免疫应答的存在来定性。这可以是体 液或细胞免疫应答，例如由T-细胞或B-细胞介导的应答。用于检测抗瓜氨酸抗体的测试 在本技术领域中已被描述并可商购。因此，本发明涉及用于治疗或预防与瓜氨酸相关的炎性疾病的特异性结合分子。这样的疾病是例如炎性关节炎包括类风湿关节炎和骨关节炎、多发性硬化、牛皮 癣性关节炎、牛皮癣、阿茨海默氏病、自体免疫性肝炎、幼年特发性关节炎、脊柱关节病、唐氏综合征、多系统萎缩症、帕金森氏症和路易体痴呆症。因此，本发明涉及用于治疗或预防 疾病的特异性结合分子，所述疾病选自关节炎、类风湿关节炎、骨关节炎、多发性硬化、牛皮 癣性关节炎、牛皮癣、阿茨海默氏病、自体免疫性肝炎、幼年特发性关节炎、脊柱关节病、唐 氏综合征、多系统萎缩症、帕金森氏症和路易体痴呆症。具体来说，本发明涉及用于自身免疫疾病、更具体为类风湿关节炎或骨关节炎的 治疗或预防的特异性结合分子。多发性硬化或MS是CNS的慢性炎性病症，其特征为自体免疫介导的髓鞘的破坏。 髓鞘的细胞在轴突周围形成由比例约为31的脂类-蛋白复合物构成的多个双层结构。 两种主要蛋白MBP和蛋白脂质蛋白，占蛋白部分的85%。MBP是高度阳离子性蛋白，能够 与带负电荷的磷脂例如磷脂酰丝氨酸形成强的相互作用。在健康成年人的约18%的MBP 分子中，(19个中的)6个精氨酸被瓜氨酸化(Wood等，J Biol Chem，vol264，5121-5127， 1989，Wood 等，Ann Neurol，vol40，18-24，1996)。剩余的 MBP 分子不含瓜氨酸。在 MS 患者 中，MBP-cit6的比例增加到总MBP的45%。MBP_cit6的净正电荷减少引起MBP分子的部 分解折叠，并减弱了它们与磷脂的相互作用(Boggs等，J Neurosci Res, vol57，529-535， 1999，Pritzker 等，Biochemistry, vol39，5374-5381，2000)。尽管 MBP_cit6 与未瓜氨酸 化的MBP相比能够更快地形成脂类复合物，但形成的复合物不像未瓜氨酸化的MBP所形成 的复合物那样紧密堆积(Boggs 等，J Neurosci Res, vol57, 529-535,1999, Beniac 等，J Struct Biol, voll29，80-95，2000)。与未瓜氨酸化的MBP相比，MBP_cit6被组织蛋白酶 D降解的速度快4倍(Cao等，Biochemistry, vol38，6157-6163，1999)。在罕见的急性爆 发性MS (Marburg型)病例中，80%的MBP蛋白被严重瓜氨酸化(MBPcitl8) (Wood等，Ann Neurol, vol40,18-24，1996)。严重解折叠的MBP_citl8与正常MBP相比被组织蛋白酶D降 解的速度快45倍(Cao等，Biochemistry, vol38，6157-6163，1999)。使用抗癌药物紫杉醇 (taxol)的活性成分多西紫杉醇(paclitaxel)的临床试验正在进行之中(0’ Cormor等， Ann Neurol, vol46,470,1999)。低剂量的多西紫杉醇能够在体外抑制MBP被PAD2的瓜氨 酸化(Pritzker 等，Biochim Biophys Acta, voll388，154-160，1998)。用多西紫杉醇治 疗减弱了临床症状，并诱导受损髓鞘的髓鞘重新形成(Moscarello等，Mult Scler, vol8, 130138，2002)，强调了 PAD作为脱髓鞘疾病中的候选因子的可能的重要性(Moscarello等， JNeurochem, vol81，335-343，2002)。在牛皮癣中，角质细胞非常快地增殖，并在仅仅约4天内就从基底层转移到表面。 皮肤不能足够快地脱去这些细胞，因此它们积累成厚的、干燥的碎片或斑点。在正常的角质 细胞中，角蛋白Kl在终端分化过程中被PADl瓜氨酸化。该过程导致角蛋白丝变得更加紧 凑，这对于表皮的正常角质化过程是必需的。在牛皮癣过度增殖性斑中的角质细胞不含瓜 氨酸化的角蛋白 Kl (Ishida-Yamamoto 等，J Invest Dermatol，vol 1 14，701-705，2000)。 还不清楚是增加的细胞增殖阻止了被PAD充分地瓜氨酸化，还是PAD的失活允许角质细胞 过度增殖和积累。尽管机制还不了解，但牛皮癣表皮中异常的瓜氨酸化显然与PADl相关。在优选实施方案中，本发明的组合物所采用的形式选自水性溶液、凝胶、水凝胶、 薄膜、糊剂、霜剂、喷剂、软膏或包扎物。在其他实施方案中，上述方法被用于通过选自关节 内、腹膜内、表面、直肠、静脉内、口腔、眼部或肿瘤的切除边缘的途径给药本文所述的组合 物。
在某些实施方案中，可药用载体包含至少一种选自下列的载体助溶剂溶液、脂 质体、胶团、胶束、纳晶、纳粒、乳液、微粒、微球、纳球、纳胶囊、聚合物或聚合载体、表面活性 剂、悬浮剂、络合剂例如环糊精或吸附性分子例如白蛋白、表面活性粒子和螯合剂。在其他 实施方案中，多糖包含透明质酸及其衍生物、葡聚糖及其衍生物、纤维素及其衍生物(例如 甲基纤维素、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羧甲基纤维、醋酸邻苯二甲酸纤维素、醋 酸琥珀酸纤维素、醋酸丁酸纤维素、邻苯二甲酸羟丙基甲基纤维素)、壳聚糖及其衍生物、 β -葡聚糖、阿糖基木聚糖、卡拉胶、果胶、糖原、岩藻聚糖(fucoidan)、软骨素、皮肤素、乙 酰肝素、肝素、戊聚糖、角质素、藻酸盐、环糊精及其盐和衍生物，包括其酯和硫酸盐。另一方面，本发明的方法包含将本发明的组合物投送到靶位点、尤其是滑膜关节。在本发明的一个具体实施方案中，特异性结合分子与单克隆抗体MimAb2. 102、 RmmAbl. 102、RhmAb2. 103、RmmAbl. 103、RhmAb2. 104、RmmAbl. 104、RhmAb2. 105 禾口 RhmAb2. 107竞争与pl5和/或pl7的结合。单克隆抗体RhmAb2. 101、RhmAb2. 103 和 RhmAb2. 104、RmmAbL 101、RmmAbL 103 和 RmmAbl. 104的可变区的一级mRNA序列已经公开，并在表1中所示的登记号下保存在EMBL 数据库中。单克隆抗体RhmAb2. 102,RmmAbl. 102、RhmAb2. 105和RhmAb2. 107的可变区的一 级序列在本文中公开在 SEQ ID NO: 13、SEQ ID NO: 15、SEQ ID NO: 17、SEQ ID NO: 19、SEQ ID NO :39, SEQ ID NO :40, SEQ ID NO :41 和 SEQ ID NO :42 中。因此，本发明涉及包含 SEQ ID NO 13、SEQ ID NO 15,SEQ ID NO 17,SEQ ID N0: 19,SEQ ID NO 39,SEQ ID NO :40、SEQ ID NO :41 和 SEQ ID NO 42 的可变区重链或轻链的 多肽。本发明还涉及 SEQ ID NO 13,SEQ ID NO 15,SEQ ID NO 17,SEQ ID NO 19,SEQ ID NO 39, SEQ ID NO :40、SEQ ID NO :41 禾口 SEQ ID NO 42 的多肽的编码核酸。在另一个优选实施方案中，特异性结合分子是选自单克隆抗体RhmAb2. 102、 RmmAbl. 102、RhmAb2. 103、RmmAbl. 103、RhmAb2. 104、RmmAbl. 104、RhmAb2. 105 禾口 RhmAb2. 107 的抗体。在另一个优选实施方案中，特异性结合分子包含源自于抗体的VH和/或VL结 构域，所述抗体选自单克隆抗体 RhmAb2. 102、RmmAbl. 102、RhmAb2. 103、RmmAbl. 103、 RhmAb2. 104、RmmAbl. 104、RhmAb2. 105 和 RhmAb2. 107。本发明的特异性结合分子基本上可以通过两种方式产生。首先，它们可以源自于 本文提出的抗体及其序列。甚至可以通过定点突变、链改组、有性PCR(sexUal PCR)或通过 本领域技术人员已知的用于抗体衍生和最适化的其他手段，来增加抗体的反应性。或者， 特异性结合分子、特别是抗体，可以通过使用任何本文所述的特异反应性表位、特别是PAD4 处理的组蛋白2AJil(SEQ ID N0:21)和其他特定的反应性肽进行淘选来获得。
就此而言，术语“衍生”是指鉴定到特定抗体中造成VH和/或VL结构域的特异性 结合性质的必需残基，然后将这些必需残基转移到另一个肽的背景中。
本领域技术人员可以使用本文描述的序列克隆或产生cDNA或基因组序 列，例如在下面的实施例中所描述的。将这些序列克隆在适合的真核表达系统例如 pcDNA3 (InVitrogen)或其衍生物中，然后与含有适合的轻链和重链的载体相组合双重转染 哺乳动物细胞(例如CHO细胞)，将导致所列抗体RhmAb2. 101,2. 102,2. 103,2. 104,2. 105 和 / 或 2. 107 以及 RmmAbl. 101、1. 102、1. 103、1. 104 的表达和分泌。
通过使用抗体序列的特异性结合结构域并将它们表达在不同背景例如多肽、例如 融合蛋白中，本领域技术人员也可以制造本文所描述的特异性结合分子的类似物。这在本 技术领域中是众所周知的。重组的人类和小鼠单克隆抗瓜氨酸抗体按照实施例1和15中的描述获得。获得 的单克隆抗体具有人类 IgGl Fc 区(RhmAb2. 101、RhmAb2. 102、RhmAb2. 103、RhmAb2. 104、 RhmAb2. 105 和 RhmAb2. 107)和小鼠 IgG2a Fc 区(RmmAbl· 101、RmmAbl. 102、RmmAbl. 103 和 RmmAbl. 104)。人类和小鼠重组抗体对(RhmAb2. 101 与 RmmAbl. 102，RhmAb2. 102 与 RmmAbl. 102,RhmAb2. 103 与 RmmAbl. 103，以及 RhmAb2. 104 与 RmmAbl. 104)含有一致的 VH和 VL结构域，但是分别含有人类IgGl (SEQ ID NO 14)或小鼠IgG2a Fc结构域(SEQ ID NO 20)。在western印迹上对三对小鼠和人类单克隆抗体进行了分析，并发现每对抗体对它们 相应的抗原都具有相同的特异性。小鼠单克隆抗瓜氨酸肽抗体RmmAbl3. 101、RmmAb 13. 102和RmmAbl3. 103从商 业来源获得(ModiQuest Research BV Nijmegen,荷兰；目录号 MQ13. 101、MQ13. 102 和 MQ13. 103)。抗瓜氨酸抗体在实验模型中进行测试，在该模型中通过将抗胶原蛋白抗体注 入小鼠诱导了炎症。该模型被称为胶原蛋白抗体诱导的关节炎(CAIA) (Nandakumar和 Holmdahl, J Immunol Methods，vol304，126-136，2005)。抗胶原蛋白抗体从商业来源获得 (ModiQuest Research BV Ni jmegen，荷兰；目录号 MQ18. 101)。小鼠单克隆抗瓜氨酸抗体RmmAbl3. 101、RmmAb 13. 102和RmmAbl3. 103被证实增 加了胶原蛋白抗体诱导的关节炎的严重性，正如也被Kuhn等(J.Clin. Invest, volll6, 961-871,2006)和 Hill 等(J Exp Med, vol 205，967-979，2008)所描述的。这显示在图 Ia 和Ib中。此外，在人类患者中进行了几项研究表明，针对瓜氨酸化表位的抗体增加了 RA的 病理发生(Masson-Bessiere 等，J. Immunol, vol 166，4177-4184，2001 ；Vossenaar 禾口 van Venrooij,Arthritis Res Ther，vol6，107-111，2004)。这显示在图 Ia 和 b 中，其分别显示 了同一个实验的“平均关节炎分值”和“关节炎发生率”。但是，令人吃惊的是，人类单克隆抗体RhmAb2. 104和RhmAb2. 105在实验CAIA模 型中减轻了关节炎的临床征兆，而RhmAb2. 103、RhmAb2. 102和RhmAb2. 107在实验CAIA模 型中甚至消除了关节炎的临床征兆。RhmAb2. 103和RhmAb2. 102的表现相同，只有使用RhmAb2. 102获得的结果显示在 图Ic和Id中。使用RhmAb2. 105和RhmAb2. 107获得的结果显示在

图10中。人类单克隆抗体RhmAb2. 101在所使用剂量下对关节炎的临床征兆完全没有影 响。在该实验中，使用可商购抗体RhmAb2. 201作为无关的抗体对照(ModiQuest Research B. V.，目录号MQR2. 201)。该抗体不识别瓜氨酸化的表位。也使用等价的小鼠Fc IgG2a 单克隆抗体 RmmAbl. 101、RmmAbl. 102、RmmAbl. 103 和RmmAbl. 104进行了同样的实验，这些抗体含有与它们的人类对应物相同的VH和VL结 构域，并且也识别与它们的人类对应物相同的表位。获得了与它们的人类对应物相同的 结果。RmmAbl. 102、RmmAbl. 103 和 RmmAbl. 104 消除(RmmAbl. 102、RmmAbl. 103)或减轻 (RmmAbl. 104)关节炎的临床征兆，而RmmAbl. 101完全没有影响。
图Ie和If显示了独立的CAIA实验，在其中对RhmAb2. 102的临床剂量进行了评 估。提供最大抑制的最低剂量是0. 5mg Ab/小鼠，其对应于IP注射时^mg/kg。从这些实验可以得出结论，被选自RhmAb2. 102、RhmAb2. 103、RhmAb2. 104、 RmmAbl. 102、RmmAbl. 103、RmmAbl. 104、RhmAb2. 105 和 RhmAb2. 107 的单克隆抗体所识别的特异性表位，在炎性疾病的治疗或预防中发挥重要作用。为了进一步分析这些单克隆抗体所识别的抗原或多种抗原，测试了它们对实施 例3中所描述的使用肽酰精氨酸脱亚氨酶(PAD酶)脱亚氨的细胞提取物的反应性。将含 有裂解后脱亚氨的hPAD2或hPAD4转染的C0S-1裂解物的Wfestern印迹，与单克隆抗体 RhmAb2. 101、RhmAb2. 102、RhmAb2. 103 和 RhmAb2. 104 温育。观察到只有与 RhmAb2. 102、 RhmAb2. 103和RhmAb2. 104温育的条板，才显示出与分子量约为15和17千道尔顿的双重蛋 白的反应性。WO 2004/078098公开了对瓜氨酸化肽/11类MHC复合物特异的抗体，用于抑制T 细胞活化。这些抗体不结合单独的肽或II类MHC分子，而是只结合肽与II类MHC分子的 复合物。本文公开的抗体与W02004/078098中公开的抗体不同，因为正如本文中所公开， 它们识别单独的肽和蛋白。此外，抗体识别western印迹中可能不是肽与II类MHC分子 之间的复合物的多肽，因为MHC分子与瓜氨酸化肽之间的复合物在免疫印迹过程中使用 的SDS凝胶的还原性条件下永远不能残存。因此，本文公开的结合分子所识别的表位与WO 2004/078098中公开的抗体不同。此外，本文公开的抗体不与肽和II类MHC分子的复合物 特异性反应。上面描述的实验和考虑引导我们得出结论，在预防炎性疾病的临床征兆的能力和 与pl5和pl7上瓜氨酸化表位的反应性之间，存在明显的相关性。当在免疫沉淀实验中使用人类单克隆抗体RhmAb2. 101、RhmAb2. 102、RhmAb2. 103 和 RhmAb2. 104 以及小鼠单克隆抗体 RmmAbl. 101、RmmAbl. 102、RmmAbl. 103 和 RmmAbl. 104时获得了类似的数据，正如在实施例5中详细描述的。使用RhmAb2. 102、RmmAbl. 102、RhmAb2. 103 和 RmmAbl. 103 在人类 PAD2 和 PAD4 脱亚氨的C0S-1裂解物上进行的免疫沉淀显示出了明显的P15和P17蛋白条带。当使用 RhmAb2. 104和RmmAbl. 104进行免疫沉淀时，这些条带的显著性略微降低。因此，识别pl5和pl7蛋白的强度似乎与这些抗体的治疗性质很好地相关(图 la-d) ο抗体与pl5或pl7是否反应，可以通过如实施例4和5中所详述的进行免疫沉淀 或western印迹分析容易地确定。或者，可以使用如实施例6中所述的含有脱亚氨的C0S-1 裂解物的Western印迹或纯化的脱亚氨pl5和/或pl7蛋白，在^festern印迹或ELISA中 进行与 RhmAb2. 102、RhmAb2. 103 或 RhmAb2. 104 的竞争实验。正如在实施例7中详述的，通过基质辅助激光解吸/电离-飞行时间质谱 (MALDI-TOF MS)对蛋白pl5和pl7进行了进一步表征。因为非洲绿猴的基因组还没有完全 测序，因此我们筛选了所有其他哺乳动物基因组寻找与使用MALDI-TOF MS所发现的肽的同 源性。所发现的具有高度同源性的蛋白被证明是组蛋白。这显示在表3(实施例7)中。因此，本发明还涉及与组蛋白上的瓜氨酸化表位特异性反应的结合分子，用于炎 性疾病的治疗或预防。
通过PAD的酶学作用使组蛋白瓜氨酸化已被证实，因此可以在体外非常好地生 产瓜氨酸化组蛋白。然后可以将这些瓜氨酸化组蛋白在酶结合测定法中用作底物，以筛 选和选择其他与瓜氨酸化P15和pl7、即组蛋白上的表位反应的特异性结合分子，例如肽 和抗体。优选情况下，选择与抗体 RhmAb2. 102、RmmAbl. 102、RhmAb2. 103、RmmAbl. 103、 RhmAb2. 104,RmmAbl. 104 和 RhmAb2. 105 和 RhmAb2. 107 竞争与 pl5 和 / 或 pl7 结合的特异 性结合分子。在本文件及其权利要求书中，动词“包含”及其各个变化形式以其非限制性的意义 使用，意味着包括了该词之后的条目，但是并不排除没有具体提到的条目。此外，由单数形 式指称的要素不排除存在一个以上要素的可能性，除非上下文明确要求存在一个并且只有 一个要素。因此，单数形式的指称通常意味着“至少一个”。为了进一步分析哪种或哪些脱亚氨组蛋白参与RhmAb2. 102和RhmAb2. 104的治疗 作用，使用人类肽酰精氨酸脱亚氨酶(PAD，EC3. 5. 3. 15) (huPAD2或huPAD4)对可商购的组 蛋白(H1、H2A、H2B、H3和H4)进行了脱亚氨。将脱亚氨以及未脱亚氨的组蛋白包被在96孔 ELISA板上，并与连续稀释的RhmAb2. 101、RhmAb2. 102和RhmAb2. 104温育。结果显示在表 6和图2中。从图2中显示的结果可以明显看出，huPAD4脱亚氨的组蛋白2A(H2A/p4)被治疗 性抗体RhmAb2. 102和RhmAb2. 104最好地识别，但是不被RhmAb2. 101识别(图2a、2b和 2c)。此外，如果与RhmAb2. 104相比，RhmAb2. 102对H2A/p4具有较高亲和性(图沘和 2c)。这些数据与这些抗体在实验CAIA模型中对关节炎的临床征兆的影响关联性良好，其 中RhmAb2. 102消除、RhmAb2. 104减轻了关节炎的临床征兆，而RhmAb2. 101对其没有影响 (图 Ic 和 Id)。因此，我们显示，H2A/p4上的脱亚氨表位或其结构模拟物在RA炎性级联反应中发 挥关键作用。对于H3/p2、H4/p2和H4/p4上的脱亚氨表位也同样如此，因为RhmAb2. 102与 RhmAb2. 104和RhmAb2. 101相比，显示出对这些组蛋白的更高的亲和性(图2a、2b和2c)。模拟物是例如具有可接受水平的等效活性的分子，所述等效活性在这种情况下包 括以与RhmAb2. 104和RhmAb2. 101相比更高的亲和性被RhmAb2. 102识别。因此，本发明涉及如上所述的特异性结合分子，其与人类PAD4脱亚氨化的人类组 蛋白2A或组蛋白4或人类PAD2脱亚氨化的人类组蛋白H4或组蛋白H3上的瓜氨酸化表位 反应。为了进一步精确定位H2A上被RhmAb2. 102和RhmAb2. 104识别的精确瓜氨酸化 表位，合成了含有所有13种可能的组蛋白2A脱亚氨位点的生物素标记的肽(表4)。将这 些肽包被在96孔中性链亲和素-ELISA板上，并与连续稀释的RhmAb2. 101、RhmAb2. 102和 RhmAb2. 104温育。结果显示在图3中。
权利要求
1.与pl5和/或pl7上的瓜氨酸化表位特异性反应的结合分子，其用于炎性疾病的预 防或治疗。
2.权利要求1的结合分子，其与人类PAD4脱亚氨化的人类组蛋白2A或组蛋白4、或人 类PAD2脱亚氨化的人类组蛋白H4或组蛋白H3上的瓜氨酸化表位特异性反应。
3.权利要求1或2的结合分子，其与选自SEQID N0:21、SEQ ID NO :24、SEQ ID NO 26、SEQ ID NO :37和SEQ ID NO 38的肽特异性反应。
4.权利要求1-3的结合分子，其用于治疗或预防与瓜氨酸相关的炎性疾病。
5.权利要求1-4的结合分子，其用于预防或治疗选自下列的疾病自身免疫疾病、关节 炎、类风湿关节炎、骨关节炎、多发性硬化、牛皮癣性关节炎、牛皮癣、阿茨海默氏病、自体免 疫性肝炎、幼年特发性关节炎、脊柱关节病、唐氏综合征、多系统萎缩症、帕金森氏症和路易 体痴呆症、克罗恩病和格林巴利综合征。
6.权利要求1-5的结合分子，其用于预防或治疗自身免疫疾病，例如类风湿关节炎。
7.权利要求1-6的结合分子，其是抗体或肽。
8.权利要求7的结合分子，其是选自单克隆抗体RhmAb2.102、RmmAbl. 102、 RhmAb2. 103、RmmAbl. 103、RhmAb2. 104、RmmAbl. 104、RhmAb2. 105 和 RhmAb2. 107 的抗体。
9.权利要求1-7的结合分子，其与选自RhmAb2.102、RmmAbl. 102、RhmAb2. 103、 RmmAbl. 103、RhmAb2. 104、RmmAbl. 104、RhmAb2. 105 和 RhmAb2. 107 的单克隆抗体竞争与选 自pl5、pl7的分子，人类PAD4脱亚氨化的人类组蛋白2A上的瓜氨酸化表位，人类PAD4脱 亚氨化的人类组蛋白4、人类PAD2脱亚氨化的人类组蛋白H4、人类PAD2脱亚氨化的人类组 蛋白H3上的瓜氨酸化表位，选自表7的名单的蛋白和SEQ ID NO :21、SEQ ID NO 24、SEQ ID NO 26、SEQ ID NO 37 和 SEQ ID NO 38 的肽结合。
10.权利要求1-7的结合分子，其包含源自于抗体的特异性结合结构域，所述抗体选自 单克隆抗体 RhmAb2. 102、RmmAbl. 102、RhmAb2. 103、RmmAbl. 103、RhmAb2. 104、RmmAbl. 104、 RhmAb2. 105 和 RhmAb2. 107。
11.权利要求10的结合分子，其是抗体或多肽。
12.权利要求11的结合分子，其是重组肽或单链抗体。
13.权利要求10-12的结合分子，其包含单链可变区片段(scFv)、抗原结合区片段 (Fab)、单结构域抗体(sdab)或VHH抗体或纳米抗体(nanobody)，例如源自于骆驼的单结构 域抗体或源自于鲨鱼IgNAR的单结构域抗体片段(VNAR)、Anticalin或适体。
14.一种用于预防或治疗炎性疾病的方法，包括向需要的患者给药治疗有效量的抗炎 症组合物，所述组合物包含结合分子，所述结合分子与选自Pl5、pl7分子上的瓜氨酸化表 位，人类PAD4脱亚氨化的人类组蛋白2A上的瓜氨酸化表位，人类PAD4脱亚氨化的人类组 蛋白4、人类PAD2脱亚氨化的人类组蛋白H4、人类PAD2脱亚氨化的人类组蛋白H3上的瓜 氨酸化表位，以及 SEQ ID NO :21、SEQ ID NO :24、SEQ ID NO 26、SEQ ID NO 37 和 SEQ ID NO 38的肽特异性反应。
15.权利要求14的方法，其中结合分子与选自RhmAb2.102、RmmAbl. 102、RhmAb2. 103、 RmmAbl. 103、RhmAb2. 104、RmmAbl. 104、RhmAb2. 105 和 RhmAb2. 107 的单克隆抗体竞争与选 自pl5、pl7的分子，人类PAD4脱亚氨化的人类组蛋白2A上的瓜氨酸化表位，人类PAD4脱 亚氨化的人类组蛋白4、人类PAD2脱亚氨化的人类组蛋白H4、人类PAD2脱亚氨化的人类组蛋白H3上的瓜氨酸化表位，选自表7的名单的蛋白和SEQ ID NO :21、SEQ ID NO 24、SEQ ID NO 26、SEQ ID NO 37 和 SEQ ID NO 38 的肽结合。
16.一种多肽，其包含SEQ ID NO 13,SEQ ID NO 15,SEQ ID N0:17、EQ ID NO :19、SEQ ID NO :39、SEQ ID NO :40、SEQ ID NO 41 和 SEQ ID NO 42 所示的可变重链或可变轻链。
17.编码权利要求16的多肽的核酸。
18.—种通过引发体内免疫应答来预防或治疗炎性疾病的方法，其中产生了与选自下 列的表位反应的特异性结合分子pl5、pl7上的瓜氨酸化表位，人类PAD4脱亚氨化的人类 组蛋白2A、人类PAD4脱亚氨化的人类组蛋白4、人类PAD2脱亚氨化的人类组蛋白H4、人类 PAD2脱亚氨化的人类组蛋白H3上的瓜氨酸化表位，以及SEQ ID NO :21、SEQ ID NO :24、SEQ ID NO 26、SEQ ID NO :37 和 SEQ ID NO 38 的月太。
19.权利要求18的方法，其中向需要的患者给药组合物，所述组合物包含选自下列的 活性成分pl5，pl7上的瓜氨酸化表位，人类PAD4脱亚氨化的人类组蛋白2A、人类PAD4脱 亚氨化的人类组蛋白4、人类PAD2脱亚氨化的人类组蛋白H4、人类PAD2脱亚氨化的人类组 蛋白 H3 上的瓜氨酸化表位，以及 SEQ ID N0:21、SEQ ID NO 24, SEQ ID N026、SEQ ID NO: 37 和 SEQ ID NO :38 的肽。
20.权利要求18或19的方法，其中炎性疾病选自自身免疫疾病、关节炎、类风湿关节 炎、骨关节炎、多发性硬化、牛皮癣性关节炎、牛皮癣、阿茨海默氏病、自体免疫性肝炎、幼年 特发性关节炎、脊柱关节病、唐氏综合征、多系统萎缩症、帕金森氏症和路易体痴呆症。
21.权利要求20的方法，其中炎性疾病是自身免疫疾病，例如类风湿关节炎。
22.权利要求18-21的方法，其中特异性结合分子是抗体。
23.一种用于炎性疾病的治疗或预防的组合物，其能够在体内引起针对选自下列的瓜 氨酸化表位的特异性免疫应答pl5和/或pl7上的瓜氨酸化表位，人类PAD4脱亚氨化的 人类组蛋白2A、人类PAD4脱亚氨化的人类组蛋白4、人类PAD2脱亚氨化的人类组蛋白H4、 人类PAD2脱亚氨化的人类组蛋白H3上的瓜氨酸化表位，以及SEQ ID NO :21、SEQ ID NO 24、SEQ ID NO 26、SEQ ID NO 37 和 SEQ ID NO 38 的月太。
24.权利要求23的组合物，其包含选自下列的活性成分pl5，pl7上的瓜氨酸化表位， 人类PAD4脱亚氨化的人类组蛋白2A、人类PAD4脱亚氨化的人类组蛋白4、人类PAD2脱亚氨 化的人类组蛋白H4、人类PAD2脱亚氨化的人类组蛋白H3上的瓜氨酸化表位，以及SEQ ID NO :21、SEQ ID NO :24、SEQ ID NO 26、SEQ ID NO 37 和 SEQ ID NO 38 的月太。
25.权利要求23或对的组合物，其中炎性疾病选自自身免疫疾病、关节炎、类风湿关节 炎、骨关节炎、多发性硬化、牛皮癣性关节炎、牛皮癣、阿茨海默氏病、自体免疫性肝炎、幼年 特发性关节炎、脊柱关节病、唐氏综合征、多系统萎缩症、帕金森氏症和路易体痴呆症。
26.权利要求25的组合物，其中炎性疾病是自身免疫疾病，例如类风湿关节炎。
27.权利要求23-26的组合物，其中特异性结合分子是抗体。
28.与pl5和/或pl7上的瓜氨酸化表位特异性反应的结合分子，其用于预防或治疗关 节损伤。
29.权利要求观的结合分子，与炎症抑制剂联合给药。
全文摘要
本发明属于治疗或预防人类和动物炎症的领域，并涉及用于治疗或预防各种炎性病症的药物组合物和方法。具体来说，本发明涉及用于预防或治疗炎性病症例如瓜氨酸相关的炎性疾病的组合物和方法。本发明提供了用于炎性病症的治疗和预防的针对含瓜氨酸表位的特异性结合分子。
文档编号C07K16/18GK102056944SQ200980121091
公开日2011年5月11日 申请日期2009年6月4日 优先权日2008年6月4日
发明者约瑟夫·玛利亚·亨德里克·拉茨, 雷纳多·杰勒杜斯·希尔瓦诺·齐尔里维 申请人:莫蒂克斯特私人有限公司