α-促黑素细胞激素的肽类似物的制作方法

专利名称：α-促黑素细胞激素的肽类似物的制作方法
技术领域：
本发明涉及肽类似物。具体地说，本发明涉及对黑皮质素1受体(MClR)具有选择 性的天然α-促黑素细胞激素(α-MSH)的肽类似物，其药物制剂以及这些类似物在治疗医 学和兽医学疾病中的应用。
背景技术：
神经肽是广泛分布于机体中的生物学活性小肽，具有从神经递质到生长因子的功 能。许多证据表明神经肽具有抗炎性能。在许多神经肽中，黑皮质素肽(黑皮质素)能结 合并刺激黑皮质素(MC)受体。黑皮质素的一个例子包括α-促黑素细胞激素(α-MSH)，主 要知道它能调节外周色素沉着，但也知道它有抗炎和免疫调节性能。已在几种器官中检测 到α -MSH神经肽，由神经元、垂体、肠、皮肤和免疫细胞产生。注射α -MSH诱导半抗原特异性耐受的接触过敏模型和抑制细菌内毒素_介导的 炎症业已证明α-MSH具有这种免疫调节性能。在许多动物疾病模型，例如炎性肠病、关节 炎和实验性心脏移植中α-MSH也显示具有治疗活性。大脑炎症、肾脏损伤和肝炎的其它 动物模型证明了该神经肽有抗炎作用。α -MSH能抑制促炎细胞因子，例如TNF-α、IL_6和 IL-I的产生，并抑制趋化因子而减少巨噬细胞和嗜中性白细胞迁移至炎性部位。一氧化氮 (NO)是各种形式炎症的共同介质。也显示α-MSH能抑制受内毒素刺激的巨噬细胞和嗜中 性白细胞合成NO。除了对细胞因子产生的作用外，α-MSH能下调单核细胞和树突状细胞的 I类MHC、⑶86和⑶40表达而影响抗原呈递和协同刺激。还知道α -MSH能增加单核细胞 中的白介素IO(IL-IO)形成，据信IL-10是免疫抑制作用的重要组分。虽然α -MSH免疫调节作用的分子机制尚未完全知晓，但α -MSH作用的潜在机制 是它能抑制细胞中核因子_ κ B的激活。抑制NF- κ B抑制了巨噬细胞产生促炎细胞因子和 合成一氧化氮。α -MSH通过结合属于含7个跨膜结构域的G-蛋白偶联受体组的特异性受 体而起作用。这些受体包括巨噬细胞的黑皮质素1和黑皮质素3受体(MCR-1和MCR-3)， α -MSH通过与之结合抑制NF- κ B。α -MSH的许多免疫调节作用也通过累积cAMP而介导。 α -MSH与黑皮质素受体结合提高了 cAMP水平，从而可抑制I κ B降解，因而抑制NF- κ B转 位和一氧化氮产生。与α -MSH结合并受其刺激的MCl受体参与各种抗炎和免疫调节应答。已鉴定到 五类黑皮质素受体，MC1-MC5。已发现MC-I受体存在于黑素细胞、黑色素瘤细胞、巨噬细胞、 嗜中性白细胞、神经胶质瘤细胞、星形细胞、单核细胞、内皮细胞上，存在于脑、睾丸和卵巢 的某些区域中。本领域对刺激MC-I受体并产生有效抗炎和免疫调节应答的化合物和方法 一直有兴趣。发明概述本文提供能选择性结合黑皮质素1受体(MClR)的基本纯的化合物或其药学上可 接受的盐，所述化合物包含具有序列His Xaa1 Arg Trp (SEQ ID NO :1)或D-Trp D-Arg Xaa2 D-His (SEQ ID NO 2)的核心四肽；其中 Xaa1 是 D-Cha, D-Phe 或 Cha, Xaa2 是 D-Cha, D-Phe或Phe。在一些实施方式中，其C-末端序列是D-Ser D-Ile D-Ile D-Ser D-Ser (SEQ ID NO 3)。本文还提供能选择性结合黑皮质素1受体(MCRl)的基本纯的化合物或其药学上 可接受的盐，所述化合物包含具有以下序列的多肽X&&2X&&5X&&7 X&&g X&&g X&&1QXss^ X&&13，其中X aa1 是 D-Val、D-Ala 或 D-Lys ；Xaa2 是 D_Prο、D-A1 a 或 D_Ly s ；Xaa3 是 D-Lys> D-Orn> D_Nle、D-Ala 或 D-Lys ；Xaa4 是 Gly 或 D-Ala ；Xaa5 是 D_Trp、Trp, D_3_ 苯并噻吩基-Ala、D_5_ 羟基-Trp, D_5_ 甲氧基-Trp, D-Phe 或 D-Ala ；XaadD-ArgJ-His 或 D-Ala;Xaa7 是 D-Cha、D-Phe、Phe、D_4-氟 _Phg、D_3-吡啶基-Ala、D-Thi、D-Trp、D_4_ 硝 基-Phe 或 D-Ala ；Xaa8 ^ D-His> His> D~Arg> Phe ^ D-Ala ；Xaa9 是 D_Glu、D-Asp, D-瓜氨酸、D-Ser 或 D-Ala ；Xaa10 是 D-Met、D-丁石智氛酸(buthionine)、D-Ile 或 D-Ala ；Xaa11 是 D-Ser> D-Ile 或 D-Ala ；
Xaa12 ^ D-Tyr > D-Ser D-Ala ；Xaa13 是 D-Ser 或 D-Ala ；其中除非当Xaai_3均是D-Ala时，不多于一个的Xaa1,是D-Ala和不多于一个的 Xaa1 ο 是L-氨基酸。在还有另一方面，本文提供包含具有以下序列多肽的基本纯的化合物或其药学上 可接受的盐D-Val D-Pro D-Lys Gly D-Trp D-Arg Phe D-His D-Ser D-Ile D-Ile D-Ser D-Ser(SEQ ID NO 4)；D-Val D-Pro D-Lys Gly D-Trp D-Arg D-Cha D-His D-Ser D-Ile D-Ile D-Ser D-Ser(SEQ ID NO 5)；Ser Tyr Ser Met Glu His Cha Arg Trp Gly Lys Pro Val (SEQ ID NO 6)；或D-Val D-Pro D-Lys Gly D-Trp D-Arg D-Phe D-His D-Glu D-Met D-Ser D-Tyr D-Ser(SEQ ID NO :7)。在一些实施方式中，本文提供的多肽经PEG化。在一些实施方式中，本文提供的化合物可偶联于生物学活性部分。 在一些实施方式中，本文提供的化合物选择性结合MC1R。在一些实施方式中，所述 化合物表现出以下特性的至少一种能选择性激活MC1R，在体外血浆中稳定和耐受蛋白酶 降解。在一方面，本文提供包含本文提供的任何一种基本纯的化合物和药学上可接受的 赋形剂的药物组合物。在另一方面，本文提供治疗有需要的对象的自身免疫疾病或病症的方法，包括给予所述对象包含药学上可接受的赋形剂和治疗有效量的本文提供的化合物的药物组合物。 在一些实施方式中，所述自身免疫疾病或病症选自多发性硬化症、I型糖尿病、再生障碍 性贫血、格雷夫斯病、腹部疾病、克罗恩病、红斑狼疮、关节炎、骨关节炎、自身免疫葡萄膜炎 和重症肌无力。在还有另一方面，本文提供治疗有需要的对象的炎症的方法，包括给予所述对象 包含药学上可接受的赋形剂和治疗有效量的本文提供的化合物的药物组合物。在一些实 施方式中，所述炎症与选自下组的疾病相关炎性肠病、类风湿性关节炎、过敏、动脉粥样硬 化、银屑病、胃炎和缺血性心脏病。 在一方面，本文提供降低或抑制有需要的对象的移植物排异的方法，包括给予所 述对象包含药学上可接受的赋形剂和治疗有效量的本文提供的化合物的药物组合物。在另一方面，本文提供治疗有需要的对象的黑色素瘤的方法，包括给予所述对象 包含药学上可接受的赋形剂和治疗有效量的本文提供的化合物的药物。在还有另一方面，本文提供治疗有需要的对象的黑色素瘤的方法，包括给予所述 对象包含药学上可接受的赋形剂和治疗有效量偶联物的药物，所述偶联物包含与抗肿瘤负 载物偶联的本文提供的化合物。该抗肿瘤负载物可以是放射性核素、辐照致敏剂、光敏剂、 化疗剂或毒素。在还有一方面，本文提供装有本文提供化合物的药物组合物和任选的使用说明书 的试剂盒。附图简述

图1显示天然α-MSH减轻了葡萄膜炎。图IA显示每日用天然a-MSH(100微克 /小鼠)静脉内注射治疗BIO. RIII小鼠的数据，临床评分为2-3。与未治疗对照相比葡萄 膜炎显著减轻(p<0.01)。图IB显示每日腹膜内注射天然α-MSHdOO微克/小鼠)或腹 膜内注射地塞米松(0. 2mg/kg或2. Omg/kg)治疗BIO. RIII小鼠的数据，临床评分为1_2(η =5)。治疗开始后，视网膜炎症减轻(ρ < 0. 05)。星号表示与对照相比有显著差异。图2说明RI α -MSH和天然α -MSH缓解了晚期葡萄膜炎。在BIO. RIII小鼠中诱 导EAU，小鼠于第12天达到疾病晚期(评分为3)，静脉内注射每日给予100微克/小鼠天 然α -MSH、RI α -MSH或PBS。图2A显示用天然α -MSH或逆(retro) -RI α -MSH治疗小鼠 的数据，与PBS对照小鼠相比，显示葡萄膜炎眼评分降低。图2Β显示EAU诱导后第16天， 各组中小鼠各眼的最高评分(η = 8)。星号表示各组之间有显著差异(ρ < 0. 05)。图3显示用α -MSH或RI α -MSH治疗的小鼠的视网膜图像和各眼评分。在Β10. RIII小鼠中诱导EAU，小鼠于第13天达到疾病晚期，此时开始每日用100微克/小鼠天然 α -MSH、RI α -MSH或PBS静脉内注射治疗。显示了治疗13天后提供各组眼评分中值的视 网膜眼底检查(Fimdoscopic)图像(η = 11)。PBS治疗小鼠的眼评分为3，显示在眼睛的数 个象限中有炎性病损和邻近视神经有血管炎(图3Α)。α -MSH和RI α -MSH治疗小鼠的眼 评分为1，显示葡萄膜炎消退，仅在视神经周围有炎症(图3Β和3C)。视网膜代表各组的眼 评分中值。治疗后第13天各组小鼠的各眼评分示于图中。星号表示各组之间有显著差异
(P < 0. 01)。图4显示RI α -MSH和天然α -MSH治疗EAU小鼠的组织病理学。给雌性Β10. RI11 小鼠注射IRBP+CFA诱导EAU。当小鼠达到眼评分为3时，每日静脉内注射100微克/小鼠的逆-倒位(retro-inverso) α -MSH、天然 α -MSH 或 PBS 治疗小鼠。RI α -MSH 或 α -MSH 治疗组小鼠的炎性应答缓解(P < 0. 05)。照片显示治疗开始后10天眼睛的苏木精和曙红 染色，代表了 PBS (图4Α)、α -MSH(图4Β)和RI α -MSH (图4C)治疗组小鼠的眼评分中值。 放大100Χ。 图5显示与混杂肽对照相比，每日腹膜内给予逆_倒位α -MSH对葡萄膜炎的影 响。诱生疾病后第11天开始每日腹膜内注射100微克RI α-MSH或对照混杂D氨基酸肽治 疗BIO. RIII小鼠。数据显示RI α -MSH(η = 4)和对照混杂肽(η = 5)治疗组小鼠的临床 平均眼评分。小鼠总共治疗13天。数据代表两次实验。星号表示各组之间有显著差异(P < 0. 04)。图6. RI α -MSH治疗视网膜炎症的效果。当临床评分为4时，每日腹膜内注射 RI α -MSH(3、10或100微克/小鼠)治疗B10RIII小鼠。每日注射对照混杂肽100微克/ 小鼠。该图描绘了随时间推移的临床评分。用100或10微克/小鼠开始治疗后观察到视 网膜炎症减轻。用较低剂量的RI α -MSH(3微克/小鼠)或PBS或对照混杂肽(η = 4)治 疗的小鼠，观察到有限的有益临床应答。星号表示各组之间有显著差异(P <0.05)。图7显示RI α -MSH对鼠黑色素瘤细胞产生cAMP的影响。用0. 01ng/ml-1000ng/ ml浓度的天然α -MSH、逆-倒位α -MSH或对照混杂肽处理B16-F1黑色素瘤细胞后检测细 胞中的cAMP。图7A显示天然α -MSH和RI α -MSH显著提高了 cAMP水平。检测cAMP所用 的对照包括100 μ M浓度的毛喉素。图7Β显示丙氨酸扫描数据。检验lyg/ml RIa-MSH 的丙氨酸取代肽是否能提高鼠B16-F1黑色素瘤细胞系的cAMP水平。数据代表两次实验。 序列表见表1。星号表示各组之间有显著差异(P < 0. 01)。图8显示MOG诱导的EAE的疾病进程。注射M0G35-55肽(200微克/小鼠)和 CFA乳液诱导C57BL/6小鼠产生EAE。在第0天和第2天注射百日咳毒素。第10天开始每 日腹膜内注射100微克/小鼠a-MSH、RI a-MSH或PBS进行治疗。图8A显示每日记录的 临床疾病评分。图8B显示诱导疾病后第20天各组的各疾病评分。图9显示RI a -MSH导致EAE疾病平均评分降低。注射M0G35-55肽(200微克/ 小鼠)和CFA诱导C57BL/6小鼠产生EAE。在第0天和第2天注射百日咳毒素。第10天开 始每日腹膜内注射100微克或30微克/小鼠的a -MSH或RI a -MSH、2mg/kg的地塞米松或 PBS进行治疗。每日记录临床疾病评分。图10显示用RI a -MSH治疗小鼠的脊髓组织学。注射M0G35-55肽(200微克/小 鼠)和CFA乳液诱导C57BL/6小鼠产生EAE。在第0天和第2天注射百日咳毒素。第10 天开始每日腹膜内注射100微克/小鼠的RI a -MSH进行治疗。收集疾病诱导后第24天的 脊髓。各组显示两只代表性小鼠的PBS治疗(图IOa和10c)和RI a -MSH治疗(图IOb和 IOd)。箭头显示炎症细胞浸润部位。图11显示EAE疾病阶段中，MOG肽免疫小鼠脾脏中的TNFa和IL-IOmRNA含 量。在第0天用200 μ g MOG肽免疫小鼠，第10-15天每日用PBS、a-MSH(100 μ g)或 RIa-MSH(IOOyg)治疗。治疗开始后第1 (图Ila和lib)、第4 (图Ilc和lid)和第7天 (图lie和Ilf)收集脾脏，用定量PCR分析TNF α和IL-IOmRNA表达。数据显示各治疗组 4只小鼠的平均值。根据肌动蛋白标准化RNA水平。图12显示对MOG 35-55肽的回忆应答。在第0天用200 μ g MOG肽免疫小鼠。第2-8天小鼠腹膜内注射PBS、IOOyga-MSH或IOOyg RI a-MSH(η = 5)。第9天收集脾脏 (图12a)和淋巴结(图12b)细胞，用25 μ g/ml MOG35-55肽或OVA肽体外刺激。培养第三 天用[3H]胸苷脉冲细胞。数据显示为平均值士SD。24小时后，收集用MOG肽刺激的脾脏 细胞培养上清液，用流式细胞术分析细胞因子TNF-α和IFNy (图12c)及MCP-1 (图12d) 的水平。数据显示为平均值士SD。原初小鼠未用MOG肽免疫。图13显示RI α -MSH治疗后，MOG免疫小鼠的血清和脾脏中的细胞因子概况。在 第0天用200 μ g MOG 35-55肽免疫小鼠。第2-8天给小鼠腹膜内注射PBS、100 μ g α -MSH 或IOOyg RI α-MSH(η = 5)。第9天收集脾脏和血清。图13a和13b显示实时PCR定量 测定的脾脏TNF-α和IL-10分别的mRNA水平。数据显示各治疗组4只小鼠的平均值。根 据β-肌动蛋白标准化RNA水平。用流式细胞术分析血清的细胞因子水平。图13c显示 TNF-α、MCP-U IL_6的血清水平，图13d显示IL-10和IL-12的血清水平。原初小鼠未用 MOG肽免疫。数据显示为平均值士SD。图14显示α -MSH和RI α -MSH对巨噬细胞标记的影响。在第1_7天，用MOG肽体 内免疫小鼠，每日用α-MSH或RI α-MSHdOO微克/小鼠)治疗。用流式细胞术分析脾脏 巨噬细胞的CD14、CD40和CD86表达水平。根据CDllb+(图14a)或F4/80+(图14b)巨噬细 胞群门控(分离)细胞。数据显示为门控(分离的)巨噬细胞群的平均阳性百分比(η = 5)。图15显示LPS-诱导了腹腔巨噬细胞(图15a)和脾脏(图15b)中mMClRmRNA水 平增加。给C57BL/6小鼠(η = 4)腹膜内注射LPS(1微克/小鼠)。在0. 5小时、1小时和 24小时收集腹腔巨噬细胞和脾脏。用实时PCR定量测定mMClR mRNA水平。根据18s标准 化RNA水平。图16显示MSH对体内LPS炎症模型的作用。给C57BL/6小鼠腹膜内注射1微克 LPS。30分钟后，腹膜内注射地塞米松(2mg/kg)和α -MSH(图16a-16c)或RI α -MSH类似 物891(图16d-16f)治疗小鼠。LPS攻击后2小时收集血清。通过流式细胞术，采用细胞计 数珠试验分析TNF- α (图16a 和16d)、MCP-I (图16b和16e)和IL-10 (图16c和16f)水 平。数据显示各细胞因子检测值和各组的平均值(η = 6)。图17显示RI-α-MSH和α-MSH在血浆和血清中的稳定性。图17Α显示37°C， RI-α -MSH和α -MSH在血浆和PBS中的稳定性。图17Β显示单次静脉内注射后，RI-α -MSH 和α-MSH肽的血清半衰期。图18显示MSH(图18Α)和RI-MSH(图18Β)与黑皮质素受体1、3、4和5的结合研
允结果。图19显示核心四肽HfRW和逆-倒位MSH的翻转。图20显示RI-MHS不同位置的非天然氨基酸残基取代。图21显示RI-MHS与其变体的代表性竞争结合MClR的试验。图22显示RI α-MSH类似物对Β16 Fl鼠黑色素瘤细胞cAMP水平的影响。图22A 类似物890,891和892 ；图22B 类似物893,894和895 ；图22C 类似物880,886和878 ；和 图22D 类似物872,878和869。发明详述^X
本发明方法的α-MSH和MClR蛋白及核酸不限于其具体来源或物种。因此，可以 是分离的或重组(产生)的蛋白质和核酸。α -促黑素细胞激素(α -MSH)是包含序列Ser Tyr Ser Met Glu His Phe Arg Trp Gly Lys Pro Val (SEQ ID NO 8) (SYSMEHFRffGKPV)的多肽。近年来检验到 α-MSH 具有抗 炎和免疫调节性能。α-MSH源自阿黑皮素原(POMC)的胞内蛋白水解切割。已在几种器官 中检测到α-MSH神经肽，系由神经元、垂体、肠、皮肤和免疫细胞所产生。已
“偶联物”包括粘附、连接、偶联、形成复合体或以其它方式彼此结合的两个或更多 个成员。这些成员可通过共价键、离子键、静电作用、氢键、范德华力或物理方式彼此连接。“生物学活性”分子包括能引发或调节生理学应答的分子或化合物。在一方面，生 物学活性化合物能刺激黑皮质素受体，优选MCl-受体。“调节”表示上调或下调一种或多种蛋白质和蛋白质亚单位的活性，例如其表达、 水平或活性高于或低于不存在该调节剂时观察到的活性。例如，术语“调节”可表示“抑制” 或“刺激”。“C-末端序列”包括通常(但不一定)指羧基末端的氨基酸链。书写肽序列的习 惯是将C-末端置于右侧，从N-末端向C-末端书写序列。C-末端序列可包含1-100个氨基 酸，优选2-15个氨基酸。甚至更优选3-10个氨基酸。C-末端可以羧基为末端，或者可用 本领熟知的方法修饰该末端而包含功能成员(例如，靶向基团、保留信号、脂质和锚定(基 团))。本发明提供“基本纯的化合物”。本文用术语“基本纯的化合物，，描述基本上不含 与其天然结合的其它蛋白质、脂质、碳水化合物、核酸和其它生物学材料的分子，例如多肽 (如结合MClR的多肽或其片段)。例如，基本纯的分子，如多肽可以是至少60干重％的感 兴趣分子。可采用常规方法，例如聚丙烯酰胺凝胶电泳(如，SDS-PAGE)、柱层析(如，高效 液相层析(HPLC))和氨基末端的氨基酸序列分析来测定多肽的纯度。在一个实施方式中，短语“选择性结合”表示当存在两种或多种受体(例如，黑皮 质素受体MC1、MC2、MC3、MC4、MC5受体)的混合物时，本发明制备或所用的化合物或多肽优 先结合一类受体胜过另一类受体。“氨基酸”或“氨基酸序列”包括寡肽、肽、多肽或蛋白质序列，或它们的任何片段、 部分或亚单位，及其天然或合成的分子。术语“多肽”和“蛋白质”包括通过肽键或修饰的 肽键(即肽等构物)彼此连接的氨基酸，包括除20种基因编码的氨基酸外的修饰氨基酸。 术语“多肽”还包括肽和多肽片段、基序等。氨基酸的大写单字母缩写指其天然L-异构体。 氨基酸的小写单字母缩写表示其D-异构体。术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”可互换使用，指任何长度的氨基酸聚合物。肽和多 肽可完全由合成的、非天然氨基酸类似物构成，或是部分天然肽的氨基酸和部分非天然氨 基酸的类似物构成的嵌合分子。在一方面，多肽用于本发明的组合物、细胞体系或方法中 (例如，含有表达至少一种本发明酶的质粒的宿主细胞)。此外，多肽指由共价连接于另一 功能基团(例如，增溶基团、靶向基团、PEG、非氨基酸基团或其它治疗剂)的氨基酸聚合物 构成的化合物。可用以下括号内的名称简写氨基酸脯氨酸(Pro)、缬氨酸(Val)、赖氨酸(Lys)、鸟氨酸(Orn)、正亮氨酸(Nle)、甘氨酸(Gly)、色氨酸(Trp)、丙氨酸(Ala)、苯丙氨酸 (Phe)、精氨酸(Arg)、组氨酸(His)、谷氨酸(Glu)、天冬氨酸(Asp)、丝氨酸(Ser)、甲硫 氨酸(Met)、异亮氨酸(lie)、酪氨酸(Tyr)、环己基丙氨酸(Cha)、4_氟-D-苯基甘氨酸 (4-氟-D-Phg)、2_ 噻吩基-D-丙氨酸(D-Thi)。本文所用的“治疗”指给予哺乳动物能引发个体产生预防性、治愈性或其它有益作 用的制剂。治疗也可导致减弱或缓解对象的疾病或疾病症状。除非另有表述，本文所用的单数形式“一个”、“一种”和“该”包括复数形式。例如， “一种”靶细胞包括一个或多个靶细胞。本发明的多肽组合物可含有非天然结构组分的任何组合。各个肽残基可通过 肽键、其它化学键或偶联剂，例如戊二醛、N-羟基琥珀酰亚胺酯、双功能马来酰亚胺、N， N’ - 二环己基碳二亚胺(DCC)或N，N’ - 二异丙基碳二亚胺(DIC)相连接。能替代传统酰 胺键(“肽键”)连接的连接基团包括，例如酮基亚甲基(如_C( = 0)-CH2-替代-C(= 0) -NH-)、氨基亚甲基(CH2-NH)、亚乙基、烯烃(CH = CH)、醚(CH2-O)、硫醚(CH2-S)、四唑、噻 唑、逆酰胺(retroamide)、硫代酰胺或酯(参见，例如Spatola(1983)刊于Chemistry and Biochemistry of Amino Acids, Peptides and ProteinsC 氨基酸、肽和蛋白质的化学禾口 生物活性)，第 7 卷，第 267-357 页，"Peptide Backbone Modifications” (肽骨架修饰) MD (Marcel Dekker)公司，纽约，通过引用纳入本文)。可通过天然加工，例如翻译后加工(如磷酸化、酰化等)，或通过化学修饰技术，修 饰用于实施本发明方法的多肽，而得到修饰的多肽。修饰可发生在多肽中的任何地方，包 括肽骨架、氨基酸侧链和氨基或羧基末端。应该知道，给定多肽的数个位点中可存在程度 相同或不同的同一类修饰。给定多肽也可含有多种类型的修饰。修饰包括乙酰化、酰化、 ADP-核糖基化、酰胺化、共价连接于核黄素、共价连接于血红素分子、共价连接于核苷酸或 核苷酸衍生物、共价连接于脂质或脂质衍生物、共价连接于磷脂酰肌醇、交联环化、形成二 硫键、脱甲基化、形成共价交联、形成半胱氨酸、形成焦谷氨酸盐、甲酰化、Y "羧化、糖基化、 GPI锚定形成、羟基化、碘化、甲基化、豆蔻酰化、氧化、PEG化、蛋白水解加工、磷酸化、异戊 烯化、硒化、硫酸化和转运-NA介导的蛋白质添加氨基酸，例如精氨酸化。参见，例如通过 弓I用纳入本文的 Creighton, Τ· Ε· , Proteins—Structure and Molecular Properties (蛋 白质"结构和分子特性)第2版.，WFC公司(W. H. Freeman and Company)，纽约(1993)； Posttranslational Covalent Modification ofProteins ( ^ SM Wllif jp^^ff tfP ), B. C. Johnson 编.，学术出版社(Academic Press)，纽约，第 1-12 页(1983)。化合物的其它实施方式 在一些实施方式中，本发明提供能选择性结合黑皮质素1受体(MCRl)的基本纯的 化合物或其药学上可接受的盐，所述化合物包括具有以下序列的多肽X&&2X&&5X&&7 X&&g X&&g X&&1QXss^ X&&13，其中Xaa1 是 D_Val、D-Ala 或 D-Lys ；Xaa2 M D-Pro > D-Ala D-Lys ；Xaa3 是 D-Lys> D-Orn> D_Nle、D-Ala 或 D-Lys ；Xaa4 是 Gly 或 D-Ala ；Xaa5 是 D_Trp、Trp, D_3_ 苯并噻吩基-Ala、D_5_ 羟基-Trp、D_5_ 甲氧基-Trp、D-Phe 或 D-Ala ；XaadD-ArgJ-His 或 D-Ala;Xaa7 是 D-Cha、D-Phe、Phe、D_4-氟 _Phg、D_3-吡啶基-Ala、D-Thi、D-Trp、D_4_ 硝 基-Phe 或 D-Ala ；Xaa8 ^ D_His、His、D-Arg> Phe D-Ala ；Xaa9 是 D_Glu、D-Asp, D-瓜氨酸、D-Ser 或 D-Ala ；Xaaltl 是 D-Met、D-丁硫氨酸、D-Ile 或 D-Ala ；Xaa11 是 D-Ser> D-Ile 或 D-Ala ；Xaa12 ^ D-Tyr > D-Ser D-Ala ；Xaa1^D-Ser 或 D-Ala0在一些实施方式中，本文提供能选择性结合MClR的肽类似物或其药学上可接受 ^ JIW^T"ji^lJ W^li -.Xaa1 Xaa2 Xaa3 Xaa4 Xaa5 Xaa6 Xaa7 Xaa8 Xaa9 Xaa10 Xaa11
Xaa12 Xaa13,其中 Xaa1 是 D-Val ；Xaa2 是 D-Pro ；Xaa3 是 D-Lys>D-Orn 或 D-Nle ；Xaa4 是 Gly ； Xaa5 是 D-Trp、Trp、D_3_ 苯并噻吩基-Ala、D_5_ 羟基-Trp、D_5_ 甲氧基-Trp 或 D-Phe ； Xaa6 是 D-Arg 或 D-His ；Xaa7 是 D-Cha、D-Phe、Phe、D_4-氟-Phg、D_3-吡啶基-Ala,D-Thi, D-Trp 或 D-4-硝基-Phe ；Xaa8 是 D-His, His、D-Arg, Phe 或 D-Ala ；Xaa9 是 D-Glu, D-Asp, D-瓜氨酸或 D-Ser ；Xaa10 是 D_Met、D_ 丁硫氨酸或 D-Ile ；Xaa11 是 D-Ser 或 D-Ile ；Xaa12 是 D-Tyr或D-Ser ；Xaa13是D-Ser ；其中不多于一个的Xaai_13是L-氨基酸。在其它实施方式中，本文提供的肽类似物或其药学上可接受的盐包含具有以下序 列白勺多月太！Xaa1 Xaa2 Xaa3 Xaa4 Xaa5 Xaa6 Xaa7 Xaa8 Xaa9 Xaa10 Xaa11 Xaa12 Xaa13，其中 Xaa1 是 D-Val ；Xaa2 是 D-Pro ；Xaa3 是 D-Lys>D-Orn 或 D-Nle ；Xaa4 是 Gly ；Xaa5 是 D-Trp 或 Trp ；Xaa6 是 D-Arg ；Xaa7 是 D-Cha、D-Phe、Phe 或 D-Thi ；Xaa8 是 D-His 或 His ；Xaa9 是 D-Glu 或 D-Ser ；Xaa10 是 D_Met、D- 丁硫氨酸或 D-Ile ；Xaa11 是 D-Ser 或 D-Ile ；Xaa12 是 D-Tyr 或 D-Ser ；Xaa13是D-Ser ；其中不多于一个的Xaai_13是L-氨基酸。本文提供的化合物包括α -促黑素细胞激素(α _MSH)的肽类似物。在一个替代实施方式中，所述肽类似物由D-氨基酸构成。在其它实施方式中，所 述肽包含D氨基酸、L氨基酸或D和L氨基酸的混合物。在其它实施方式中，所述肽由至少 40 %、50 %、60 %、70 %、80 %、90 %或100 %的D氨基酸构成。本发明的化合物也可掺入以下 非限制性例子的非标准氨基酸D-鸟氨酸、D-正亮氨酸、3-苯并噻吩基-D-丙氨酸、5-羟 基-D-Trp、5-甲氧基-D-Trp、4-氟-D-苯基甘氨酸(4-氟-D-Phg)、3_吡啶基-D-丙氨酸、 2-噻吩基-D-丙氨酸(D-Thi)、D_环己基丙氨酸(D-Cha)、4_硝基-D-Phe、D-瓜氨酸、α -甲 基-D-Met和D- 丁硫氨酸。在一些实施方式中，所述核心四肽由氨基酸序列His Phe Arg Trp或Trp Arg Phe His构成，优选D-氨基酸构型。在另一实施方式中，所述核心四肽由氨基酸序列His D-Cha Arg Trp或Trp Arg D-Cha His构成，优选D-氨基酸构型。在一些实施方式中，所述核心四 肽由4个D-氨基酸构成。在其它实施方式中，所述核心四肽含有至少一个非标准氨基酸。本文提供的化合物 可以是天然或重组的化合物。可用本领域已知的常规化学技 术制备本发明的化合物。出版的文献解释了固相合成方法，例如Solid Phase Peptide Synthesis :A Practical Approach (固相肽合成实用方法)(Ε. Atherton 等，1989)。也可用本领域已知的常规分子生物学技术制备本发明的化合物。除非另有表述，本申请的术语定义和技术说明见于多种熟知的参考文献中，例如=Sambrook, J等.,Molecular Cloning A Laboratory Manual (分子克隆实验室手册)，Cold Spring Harbor Laboratory Press(冷泉港出版社)(1989) ；Goeddel，D编· ,Gene Expression Technology,Methods in Enzymology (基因表汰技术,酶学方法)，185, Academic Press (学术出版社)，圣迭戈，加利 福尼亚州(1991) ；"Guide to Protein Purification (蛋白质纯化指南)”Deutshcer，M. P 编.,Methods in Enzymology (酶学方法)，Academic Press (学术出版社)，圣迭戈，加利福 尼亚州(1989) ；Innis 等·，PCR Protocols :A Guide to Methods and Applications (PCR 方案方法和应用指导)，学术出版社，圣迭戈，加利福尼亚州(1990) ；Freshney, R. I.， Culture of Animal Cells :A Manual of Basic Technique (动物细胞培养基础技术 手册)，第二版，Alan Liss, Inc (AL 公司)·纽约，纽约州(1987) ；Murray, Ε. J 编.，Gene Transfer and Expression Protocols (基因转移和表汰方案)，第 109-128 页，The Humana Press Inc.(休玛娜出版公司)，克利夫顿，新泽西州和Lewin，B.，Genes VI(基因VI)，牛 津大学出版社，纽约(1997)。所有引述的参考文献通过引用全部纳入本文。在一些实施方式中，本文提供的肽类似物能选择性结合或活化黑皮质素1受体 (MClR)。可采用任何合适的试验来检测MClR的结合或活化。例如，可采用体外诱导cAMP来 评估MClR活化。体外评估可表明体内活化。本发明的其它实施方式包括MCl-受体的任何选 择性多肽。可用合适的筛选试验鉴定选择性MCl-受体化合物。实施例4公开了 MC-I受体 结合试验的非限制性例子。在一些实施方式中，优选的MCl-受体包括智人(homo sapiens) 的黑皮质素1受体(GenBank登录号NP_002377)。本发明的其它实施方式涉及调节cAMP、一氧化氮(NO)、TNF-α、TNF-α mRNA、 IL-IOmRNA, IL-10、IFN y , IL_6、IL-12和/或MCP-I水平的化合物。在一些实施方式中， 所述化合物能提高cAMP水平。在其它实施方式中，所述化合物涉及降低或抑制一氧化氮 (NO) ,TNF-α、TNF-a mRNA、IL-10mRNA、IL-10、IFNy、IL-6、IL-12 和 / 或 MCP-I 的水平。可 通过筛选试验测定调节上述水平的化合物的身份。可用本领域已知的可接受试验检测上述 水平。实施例中公开了显示能理想地调节这些水平的化合物的鉴定试验的非限制性例子。在一些实施方式中，本发明化合物可通过其它作用机制调节免疫应答和炎症，而 不限于本文公开的机制。在一些实施方式中，本文提供血浆稳定性和对蛋白酶降解耐受性改善的肽。可用 任何合适的方法评估血浆稳定性和对蛋白酶降解的耐受性。实施例19公开了一个非限制 性例子。体外评估可表明体内的性能、改善的耐受性和较长的半衰期。本文提供可在体内、离体或体外实施的方法。PEG化的肽在一些实施方式中，修饰所述肽延长其半衰期。在一些实施方式中，PEG化所述 肽。在一些实施方式中，PEG化的肽指共价连接或偶联于一条或多条聚乙二醇(PEG)聚 合物链的肽。PEG聚合物链可包括经修饰、功能化或衍生的PEG链。在另一实施方式中， PEG聚合物链可含有至少一个或多个分支点。在一些优选的实施方式中，PEG聚合物链和 相应的PEG化肽为水溶性，可在溶液中高度流动，无毒性和无免疫原性，不难从体内清除， 其体内分布可改变。在一些优选的实施方式中，通过(改变)PEG链类型来调节PEG化肽的药代动力学性质。制备PEG化肽的策略和方法可采用本领域已知的方法(G. Pasuta和 F. M. Veronese(2007) "Polymer-drug conjugation, recent achievements and general strategies (聚合物-药物偶联，最近的成果和通用策略)"Progress in Polymer Science 32(8-9) :933-961，通过引用纳入本文)。本领域已知制备第一和第二代PEG化蛋白质的方法。PEG化的非限制性例子包括第一步适当功能化PEG聚合物的一个或两个末端(对 于线形PEG)。用相同的反应活性分子活化各末端的PEG称为“同质双功能化”，而如果提供 不同的官能团，称该PEG衍生物为“异质双功能化”或“异质功能化”。制备PEG聚合物的化 学活性或活化衍生物而使PEG连接于所需分子。根据要偶联于PEG的分子中可利用的反应 活性基团的类型选择PEG衍生化的合适官能团。反应活性氨基酸的非限制性例子包括赖氨 酸、半胱氨酸、组氨酸、精氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸。也可利用N-末 端氨基和C-末端羧酸。用于偶联的其它异质双功能PEG:这些异质双功能PEG在两种实体需要亲水性、屈 曲性和生物相容性间隔臂的连接中非常有用。异质双功能PEG的优选末端基团是马来酰亚 胺、乙烯基砜、吡啶基二硫化物、胺、羧酸和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)酯基团。在本发明的一些实施方式中，PEG化肽的分子量范围为0. 2kDa-100kDao在本发明 的一些优选实施方式中，PEG化肽的分子量范围为0.2kDa-40kDa。在本发明的一些优选实 施方式中，PEG化肽的分子量范围为0.2kDa-15kDa。在其它实施方式中，可商品化购得的 PEG的优选平均分子量(以Da计；通过尺寸排阻层析测定)可选自< lk、2k、3. 5k、5k、10k、 20k、30k、40k和以上，但根据所需的药代动力学可以是任何分子量。例如，可采用较低分子 量的异质双功能PEG作为接头和采用较低分子量的PEG来提高肽的溶解性。PEG还可以是 多臂、分叉或分支PEG。在一些实施方式中，将所述肽偶联于靶向分子或起着靶向分子的作用，其中所述 靶向分子优选结合于所需受体。在本发明的一些优选实施方式中，将所述肽偶联于细胞 毒制剂。术语“细胞毒制剂”指能抑制或阻止细胞的表达活性、细胞的功能和/或导致细 胞破坏的物质。该术语应包括放射性同位素化疗剂，和毒素，例如细菌、真菌、植物或动 物来源的小分子毒素或酶活性毒素，包括它们的片段和/或变体。细胞毒制剂的非限制 性例子包括美登素、多拉司他汀及其类似物，包括塔斯托定(tasidotin)和奥利斯它汀 (auristatin)0在本发明的其它实施方式中，细胞毒制剂的非限制性例子包括但不限于 美登素类(maytansinoids)、钇、铋、蓖麻毒蛋白、蓖麻毒蛋白A-链、皂草素、阿霉素、柔红霉 素、紫杉醇、溴化乙锭、丝裂霉素、依托泊苷、鬼白噻吩甙(tenoposide)、长春新碱、长春碱、 秋水仙素、二羟基炭疽杆菌素二酮、放线菌素、白喉毒素亚单位A、截短的假单胞菌外毒素 (PE)A, PE40、相思豆毒蛋白、相思豆毒蛋白A链、蒴莲根毒素A链、α -八叠球菌素、白树毒 素、米托洁林、局限曲菌素、酚霉素、依诺霉素、麻疯树逆境蛋白(curicin)、巴豆毒蛋白、刺 孢霉素、石碱草(sapaonaria officinalis)抑制剂、糖皮质激素和其它化疗剂、以及放射性 同位素，例如 At211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、P32 和 Lu 的放射性同位素。还可将 抗体偶联于能将前药转化为其活性形式的抗癌前药活化酶。可用本领域目前已知的任何方法将肽直接或间接连接于细胞毒性或靶向制剂。在 本发明的一些优选实施方式中，经一个或多个接头使所述肽连接于细胞毒制剂或靶向试剂而形成偶联物，只要包含的接头不会实质性阻碍该肽或所偶联制剂的功能、结合、毒性或摄 入。接头的非限制性例子包括离子键和共价键及任何其它足够稳定的结合键，从而使 该偶联物所靶向的细胞可内化所述靶向制剂。根据所需特性选择接头分子。接头选择要 考虑的包括减轻或降低偶联元件相靠近所导致的空间位阻，偶联物的其它性能，例如特异 性、毒性、溶解性的变化，偶联物的血清稳定性和/或胞内利用度和/或提高连接键的可屈 曲性。接头可以是任何类型的连接键，例子描述参见通过引用全文纳入本文的美国专利号 7，166，702 和 5，194，425。适合于化学连接的偶联物的接头和连接键包括但不限于游离的反应活性基 团，例如胺基与硫醇基之间的二硫键、硫醚键、位阻二硫键和共价键。可采用异质双功能 试剂产生这些键，在一个或两个多肽上产生反应活性硫醇基，然后使一个多肽的硫醇基 与另一个多肽的反应活性马来酰亚胺基或反应活性硫醇基或胺基反应。其它接头包括 可在更具酸性的细胞内腔室中被切割的酸可切割接头，例如双马来酰亚胺乙氧基丙烷 (bismaleimidoethoxy propane)，酸不稳定转铁蛋白偶联物与己二酸二酰胼接头；暴露于 紫外光或可见光时可被切割的交联接头和例如各种结构域，如人IgGl的恒定区CH1、CH2和 CH3(参见通过引用纳入本文的 Batra 等.，(1993)Mol. Immunol. 30 :379_386)。可共价偶联接头而将化学接头和肽接头插入所述肽和靶向制剂或细胞毒制剂中。 可用下述异质双功能试剂来实现此类共价偶联。异质双功能交联试剂本领域技术人员已知用于在氨基与硫醇基之间形成共价键和将硫醇基引入蛋 白质中的许多异质双功能交联剂(参见，例如描述此类试剂的制备和应用并提供此类试 剂的商品化来源的PIERCE CATALOG(皮尔斯公司目录)，Immuno Technology Catalog & Handbook(免疫技术目录和手册)，1992-1993 ；也参见 Cumber 等·，(1992)Bioconjugate Chem. 3' :397_401 ；Thorpe 等.，(1987)Cancer Res. 47 :5924_5931 ；Gordon 等.，(1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84 308-312 ；Walden 等·， (1986) J. Mol. Cell Immunol. 2 191-197 ；Carlsson 等·， (1978)Biochem. J. 173 723~737 ；Mahan 等·， (1987)Anal. Biochem. 162 163-170 ；Wawryznaczak 等· , (1992)Br. J. Cancer 66 :361_366 ；Fattom等·, (1992) Infection & Immun. 60 584-589)。引述的所有参考文献通过引用全文纳入本文。 可利用这些试剂在靶向剂、趋化因子与要靶向(输送)的物质之间形成共价键。这些试 剂包括但不限于N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP;二硫键接头)； 6-[3-(2-吡啶基二硫代)丙酰胺基]己酸磺基琥珀酰亚胺酯(磺基-LC-SPDP)；琥珀酰亚 胺基氧基羰基-α-甲基苄基硫代硫酸酯(SMBT，阻碍二硫键接头)；6-[3-(2_吡啶基二硫 代)丙酰胺基]己酸琥珀酰亚胺酯(LC-SPDP) ；4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧 酸磺基琥珀酰亚胺酯(磺基-SMCC) ；3-(2_吡啶基二硫代)丁酸琥珀酰亚胺酯(SPDBHi 阻二硫键接头)；2-(7_叠氮基-4-甲基香豆素-3-乙酰胺)乙基-1，3-二硫代丙酸磺基 琥珀酰亚胺酯(SAED) ；7-叠氮基-4-甲基香豆素-3-乙酸磺基琥珀酰亚胺酯(SAMCA)； 6-[α-甲基-α_(2-吡啶基二硫代)甲苯酰胺基]己酸琥珀酰亚胺酯(磺基-LC-SMPT)； 1，4_ 二-[3' -(2'-吡啶基二硫代)丙酰胺基]丁烷(DPDPB) ;4_琥珀酰亚胺基氧基羰 基-α-甲基-α-(2-吡啶基硫代)甲苯(SMPT，位阻焦硫酸酯接头)；6 [ α -甲基-α - (2_ 口比啶基二硫代)甲苯酰胺基]己酸磺基琥珀酰亚胺酯(磺基-LC-SMPT)；间-马来酰亚胺基苯 甲酰基-N-羟基琥珀酰亚胺酯(MBS)；间-马来酰亚胺苯甲酰基-N-羟基磺基琥珀酰亚胺酯 (磺基-MBS) ；N-琥珀酰亚胺(4-碘代乙酰基)氨基苯甲酸酯(SIAB;硫醚接头)；(4-碘代 乙酰基)氨基苯甲酸磺基琥珀酰亚胺酯(磺基-SIAB)；琥珀酰亚胺基_4-(对-马来酰亚 胺基苯基)丁酸酯(SMPB)；磺基琥珀酰亚胺基_4-(对-马来酰亚胺基苯基)丁酸酯(磺 基-SMPB)；叠氮基苯甲酰基酰胼(ABH)。其它异质双功能可切割交联接头包括N-琥珀酰亚胺基(4-碘代乙酰基)_氨 基苯甲酸酯；(4-碘代乙酰基)-氨基苯甲酸磺基琥珀酰亚胺酯；4-琥珀酰亚胺基-氧 基羰基-α -(2-吡啶基二硫代)_甲苯；磺基琥珀酰亚胺基_6-[ α -甲基-α -(吡啶基 二硫醇)_甲苯酰胺基]己酸酯；N-琥珀酰亚胺基-3-(_2-吡啶基二硫代)_丙酸酯； 6 [3 (- (-2-吡啶基二硫代)-丙酰胺基]己酸琥珀酰亚胺酯；6 [3 (- (-2-吡啶基二硫代)-丙 酰胺基]己酸磺基琥珀酰亚胺酯；3-(2_吡啶基二硫代)-丙酰胼、埃尔曼试剂、二氯三嗪酸 (dichlorotriazinic acid)、S-(2-硫代吡啶基)-L-半胱氨酸。其它示范性双功能连接化 合物公开于美国专利号 5，349，066,5, 618，528,4, 569，789,4, 952，394 和 5，137，877，它们 均通过引用全文纳入本文。酸可切割、光可切割和热敏感的接头也可采用酸可切割、光可切割和热敏感的接头，特别是在需要切割要靶向(输送) 的物质使之更易于接触反应的情况时。酸可切割的接头包括但不限于双马来酰亚胺基乙 氧基丙烷接头；和己二酸二酰胼接头(参见，例如通过引用纳入本文的Fattom等.，(1992) Infection & Immim. 60 :584_589)，和含有转铁蛋白充足部分能进入胞内转铁蛋白循环途 径的酸不稳定转铁蛋白偶联物(参见，例如通过引用纳入本文的WelhSner等.，(1991) J. Biol. Chem. 266 :4309_4314)。光可切割的接头是暴光时可被切割的接头(参见，例如Goldmacher等.，(1992) Bioconj. Chem. 3 104-107，这些接头通过引用纳入本文)，从而在暴光后可释放要靶向(输 送)的的物质。已知有暴光时可被切割的光可切割接头(参见，例如Hazum等.，(1981)刊 于P印t.，Proc. Eur. Pept. Symp.，第 16 届，Brunfeldt，K(编)，第 105-110 页，其描述了采用 硝基苄基作为半胱氨酸的光可切割保护基团；Yen等.，(1989)Makromol. Chem. 190 =69-82, 其描述了水溶性光可切割共聚物，包括羟丙基甲基丙烯酰胺共聚物、甘氨酸共聚物、荧光素 共聚物和甲基罗丹明共聚物；GoIdmacher等.，(1992) Bioconj. Chem. 3 104-107，其描述 了暴露于近紫外光(350nm)时可发生光解降解的交联接头和试剂；和Senter等.，(1985) Photochem. Photobiol. 42 :231_237，其描述了可产生光可切割连接键的硝基苄氧基羰基氯 交联剂)，从而在暴光后可释放要靶向(输送)的的物质。引述的所有参考文献通过引用 全文纳入本文。此类接头在采用光纤暴光治疗皮肤病或眼病中特别有用。给予所述偶联物 后，使眼睛或皮肤或其它身体部分暴光，导致释放偶联物中要靶向(输送)的物质。此类光 可切割的接头可与需要除去靶向试剂使之从动物体内快速清除的诊断方案联用。用于化学偶联的其它接头其它接头包括三苯甲基接头，特别是衍生的三苯甲基可产生在不同酸度或碱度下 释放治疗剂的一类偶联物。因此，若能预先选择使治疗剂释放的PH范围所赋予的灵活性， 就能够根据需要递送的治疗剂在组织之间(分配)的已知生理学差异来选择接头(参见，例如通过引用纳入本文的美国专利号5，612，474)。例如，肿瘤组织的酸度看来低于正常组织。肽接头接头分子可以是肽。偶联物中可采用肽接头。这种肽接头通常含有约2个-60个 氨基酸残基，例如约5-40个，或约10-30个氨基酸残基。长度的选择取决于例如所包含接 头的用途等因素。接头分子可以是可屈曲的间隔臂氨基酸序列，例如单链抗体研究中已知的那 些序列。此类已知的接头分子的例子包括但不限于GGGGS，(GGGGS) η、GKSSGSGSESKS、 GSTSGSGKSSEGKG, GSTSGSGKSSEGSGSTKG, GSTSGSGKSSEGKG, GSTSGSGKPGSGEGSTKG, EGKS SGSGSESKEF、SRSSG、SGSSC0也可采用具有以下序列的白喉毒素胰蛋白酶敏感性接头 AMGRSGGGCAGNRVGSSLSCGGLNLQAM。其它接头分子的描述参见，例如Huston 等.，Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 85 5879-5883,1988 ；Whitlow, M^., Protein Engin. 6 989-995,1993 ；Newton 等.， Biochemistry 35 545-553,1996 ；A.J. Cumber 等.，Bioconj. Chem. 3 397-401,1992； Ladurner 等.，J. Mol. Biol. 273 :330_337，1997 ；和美国专利号 4，894，443，所有出版物通过 引用纳入本文。其它接头包括但不限于酶底物，例如组织蛋白酶B底物、组织蛋白酶D底物、胰蛋 白酶底物、凝血酶底物、枯草杆菌蛋白酶底物、因子Xa底物、和肠激酶底物；能提高溶解性、 可屈曲性和/或胞内可切割性的接头包括例如(glymSer)n和(sermgly) η等接头，(参见， 例如通过引用纳入本文的PCT公布号WO 96/06641，其提供了偶联物所用的示例性接头)。 在一些实施方式中，可包含几种接头以利用各接头的所需特性。制备偶联物可用化学偶联、重组DNA技术或重组表达与化学偶联相结合，来制备含连接靶向 物质的偶联物。可以任何取向连接本发明肽与细胞毒制剂或靶向制剂，偶联物中可存在一 种以上的靶向制剂和/或要靶向(输送)的物质。在本发明的一些优选实施方式中，通过亲水性和生物相容性间隔臂聚合物，包括 烷基短链、聚唾液酸或透明质酸、多肽或PEG将细胞毒制剂连接于所述肽。在本发明的一些 优选实施方式中，细胞毒制剂通过可切割接头，例如二硫键或含有可被溶酶体蛋白酶(如 组织蛋白酶)切割序列的肽偶联。在本发明的一些优选实施方式中，这种间隔臂连接于所 述肽的N-或C-末端。MM制备这些制剂或组合物的方法包括使本发明化合物与运载体和任选的一种或多 种辅助成分相结合的步骤。一般通过使本发明的化合物均勻紧密地结合液体运载体，或精 细分级的固体运载体，或二者，然后如果需要的话使产物成形来制备这种制剂。可按照本领域已知的制备药物的任何方法制备药物制剂。此类制剂可含有甜味 剂、调味剂、着色剂和防腐剂。可将制剂与适合制造的药学上可接受的无毒赋形剂混合。此 类“赋形剂”通常指无毒性不会以有害方式与该组合物中其它组分相互作用的基本上惰性 的物质。药学上可接受的赋形剂包括但不限于液体，例如水、缓冲盐水、聚乙二醇、透明质 酸、甘油和乙醇。其中包括药学上可接受的盐，例如无机酸盐，如三氟乙酸盐、盐酸盐、氢溴酸盐、磷酸盐、硫酸盐等；和有机酸盐，例如乙酸盐、丙酸盐、丙二酸盐、苯甲酸盐等。以适合递送的药物或药物组合物形式给予所述治疗剂。制剂可包含一种或多种稀 释齐 、乳化齐 、防腐齐 、缓冲齐 、赋形剂等，可提供例如冻干粉末、喷雾齐 、乳膏、洗液、凝胶、 贴剂、植入物等剂型。可用本领域熟知的药学上可接受的运载体将口服给予的药物制剂配 制成相应的合适剂型。此类运载体能将药物配制成适合患者吞服的单位剂型，例如片剂、丸 剂、粉末、锭剂(dragee)、胶囊、液体、糖锭(lozenge)、凝胶、糖浆、糊剂、混悬液等。加入合 适的添加化合物后(如果需要的话)，可将口服应用的药物制品配制成固体赋形剂，任选研 磨所得的混合物和加工颗粒混合物，从而获得片剂或锭剂的芯。合适的固体赋形剂有碳水 化合物或蛋白质填充剂，包括，例如糖，包括乳糖、蔗糖、甘露糖醇或山梨醇；玉米、小麦、大 米、马铃薯或其它植物的淀粉；纤维素，例如甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素或羧甲基纤维 素钠；和树胶，包括阿拉伯胶和黄蓍胶；和蛋白质，例如明胶和胶原。可加入崩解剂或增溶 剂，例如交联聚乙烯吡咯烷酮、琼脂、海藻酸或其盐，例如海藻酸钠。水性悬浮液可含有活性药物(例如，本发明的嵌合多肽或肽模拟物)和与之混 合的适合制备水性悬浮液的赋形剂。此类赋形剂包括悬浮剂，例如羧甲基纤维素钠、甲基 纤维素、羟丙基甲基纤维素、海藻酸钠、聚乙烯吡咯烷酮、黄蓍胶和阿拉伯胶，和分散剂或 润湿剂，例如天然磷脂(如卵磷脂)、环氧乙烷与脂肪酸的缩合产物(例如，聚氧乙烯硬 脂酸酯)、环氧乙烷与长链脂肪醇(例如，十七烷乙烯氧基十六醇Ofeptadecaethylene oxycetanol))的缩合产物、环氧乙烷与脂肪酸和己糖醇衍生偏酯的缩合产物(例如，聚氧 乙烯失水山梨糖醇单油酸酯)、或环氧乙烷与脂肪酸和己糖醇衍生偏酯的缩合产物(例如， 聚氧乙烯失水山梨糖醇单油酸酯)。水性悬浮液还可包含一种或多种防腐剂，例如对羟基苯 甲酸乙酯或正丙酯；一种或多种着色剂；一种或多种调味剂和一种或多种甜味剂，例如蔗 糖、阿斯巴甜或糖精。可调节制剂的克分子渗透压浓度。可采用基于油的药物给予本发明的疏水性活性制剂。可通过将活性制剂(例 如，本发明的嵌合组合物)悬浮在植物油，例如花生油、橄榄油、芝麻油或椰油，或矿物油， 例如液体石蜡；或这些油的混合物中，配制基于油的悬浮液。参见，例如通过引用纳入本 文的美国专利号5，716，928描述了采用精油或精油组分提高口服给予的疏水性药学化合 物的生物利用度和降低个体间和个体内差异(也参见通过引用纳入本文的美国专利号 5，858，401)。这种油性悬浮液可含有增稠剂，例如蜂蜡、硬石蜡或鲸蜡醇。可加入甜味剂以 提供可口的口服制品，例如甘油、山梨醇或蔗糖。可加入抗氧化剂，例如抗坏血酸使这些制 剂防腐。可注射油性载体的例子参见通过引用纳入本文的Minto (1997) J. Pharmacol. Exp. Ther. 281 :93_102。本发明的药物制剂也可以是水包油乳液形式。油相可以是上述植物油或 矿物油，或这些油的混合物。合适的乳化剂包括天然树胶，例如阿拉伯胶和黄蓍胶，天然磷 脂，例如大豆卵磷脂，衍生自脂肪酸和己糖醇酐的酯或偏酯，例如失水山梨糖醇单油酸酯， 和这些偏酯与环氧乙烷的缩合产物，例如聚氧乙烯失水山梨糖醇单油酸酯。这种乳液也可 包含甜味剂和调味剂，例如配制糖浆和酏剂。此类制剂还可含湿润剂、防腐剂或着色剂。也考虑包含治疗剂的组合物或药物可以含有药学上可接受的运载体，将其用作 肽、蛋白质、多核苷酸等物质的稳定剂。可起作肽的稳定剂作用的合适运载体的例子包括 但不限于药物级的葡萄糖、蔗糖、乳糖、海藻糖、甘露糖醇、山梨糖醇、肌醇、葡聚糖等。其 它合适的运载体包括但不限于淀粉、纤维素、磷酸钠或钙、柠檬酸、酒石酸、甘氨酸、高分子量聚乙二醇(PEG)和它们的组合。还可采用荷电脂质和/或洗涤剂。合适的荷电脂质包 括但不限于磷脂酰胆碱(卵磷脂)等。洗涤剂通常是非离子型、阴离子型、阳离子型或 两性型表面活性剂。合适的表面活性剂的例子包括，例如Tergitol⑧和Triton 表面活 性剂(康涅狄格州丹伯里的联合碳化物化学和塑料公司(Union Carbide Chemicals and Plastics, Danbury, CT))；聚氧乙烯山梨聚糖，例如TWEEN 表面活性剂(特拉华州威尔明 顿的 ACI 公司(Atlas Chemical Industries, Wilmington, DE))；聚氧乙烯醚，例如 Bri j ； 药学上可接受的脂肪酸酯，例如硫酸月桂酯及其盐(SDS)等材料。药学上可接受的赋形 剂、运载体、稳定剂和其它辅助物质的详细讨论可参见通过引用纳入本文的Remington’ s Pharmaceutical Sciences (雷明顿药物科学)(Mack Pub. Co.(马克出版公司)，新泽西州， 1991)。适合胃肠外给予的本发明药物组合物组合包含一种或多种本发明化合物与一种 或多种药学上可接受的无菌等渗水性或非水性溶液、分散液、悬浮液或乳液，或可在使用前 重建成无菌可注射液或分散液的无菌粉末，它们可含有糖、醇、抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂、 赋予该制剂与接受者血液等渗的溶质、或悬浮剂或增稠剂。可用于本发明药物组合物中的合适水性和非水性运载体的例子包括水、乙醇、多 元醇(例如，甘油、丙二醇、聚乙二醇等)和它们的合适混合液；植物油，例如橄榄油；和可 注射的有机酯，例如油酸乙酯。例如，以分散液为例，可采用包衣物质，例如卵磷脂来维持所 需粒径和采用表面活性剂来维持合适的流动性。这些组合物也可含有辅佐剂，例如防腐剂、润湿剂、乳化剂和分散剂。可通过包含 各种抗细菌和抗真菌制剂，例如对羟基苯甲酸酯(paraben)、氯代丁醇、苯酚、抗坏血酸等， 来确保防止微生物对本发明化合物的作用。该组合物中还需要包含等渗剂，例如糖、氯化 钠、磷酸缓冲盐水等。此外，可通过包含能延迟吸收的制剂，例如单硬脂酸铝和明胶来延缓 注射药物的吸收。在一些情况中，为延长药物的作用，需要减缓皮下或肌肉内注射药物的吸收。可采 用水溶性差的晶体或无定形材料的液体悬浮液实现此目的。药物的吸收速度取决于其溶解 速度，进而取决于晶体大小和晶形。或者，可将药物溶解或悬浮于油性载体中实现胃肠外给 予药物的延迟吸收。在本发明方法中，也可将所述药物化合物作为微球递送以减缓体内释放。例如， 可通过皮内注射给予微球使药物缓慢地皮下释放；参见Rao (1995) J. Biomater Sci. Polym. Ed. 7 623-645 ；生物可降解和可注射的凝胶制剂，参见，例如Gao (1995)Pharm. Res. 12 857-863 (1995)；或口服给予的微球，参见，例如 Eyles (1997) J. Pharm. Pharmacol. 49 669-674。引述的所有参考文献通过引用全文纳入本文。通过在生物可降解聚合物，例如聚丙交酯-聚乙交酯中形成微囊基质来制备本发 明化合物的可注射贮存剂型。可根据药物与聚合物的比例和所用具体聚合物的性质来控制 药物释放的速度。其它生物可降解的聚合物的例子包括聚(原酸酯)和聚(酐)。也可将 药物包裹在与机体组织相容的脂质体或微乳剂中来制备可注射的贮存制剂。可给予所述多肽本身或与另一种治疗性化合物联合给予。具体地说，可与治疗哺 乳动物黑色素瘤、炎症或自身免疫疾病的治疗性化合物一起给予所述多肽。可将所述多肽 和其它治疗性化合物配制在同一或不同组合物中。可与其它治疗性化合物同时、依次或分别给予所述多肽。鍾可改变本发明药物组合物中活性成分的实际剂量水平，以获得具体患者、组合物 和给药方式所需的治疗反应而对患者无毒的有效活性成分用量。当将本发明化合物作为药 物给予人和动物时，可将它们本身给予或作为药物组合物给予，所述药物组合物含有，例如 与药学上可接受的运载体相组合的0. 1-99%、更优选10-30%活性成分。选择的剂量水平取决于各种因素，包括所用的本发明特定化合物的活性，给药途 径、给药时间、所用特定化合物的分泌和代谢速度、吸收速度和程度、治疗持续时间、与所用 特定化合物联用的其它药物、化合物和/或材料、所治疗患者的年龄、性别、体重、全身健康 状况、和既往医疗史等医学领域熟知的因素。具备本领域普通技术的医师或兽医不难确定所需药物组合物的有效量和开出处 方。例如，医师或兽医在药物组合物中采用本发明化合物的开始剂量可低于实现所需治疗 效果的水平，再逐渐增加剂量直至实现所需效果。本发明化合物的合适日剂量通常是产生治疗效果最低有效剂量的化合物用量。此 类有效剂量通常取决于上述各种因素。用于所示作用时，用于患者本发明化合物的口服、静 脉内、脑室内和皮下剂量的非限制性范围通常为约lmg-5mg/公斤体重/小时。在其它实施 方式中，该剂量的非限制性范围为约5mg-2. 5mg/公斤体重/小时。在进一步的实施方式中， 该剂量的非限制性范围为约5mg-lmg/公斤体重/小时。如果需要，可将所述活性化合物的有效日剂量分成2、3、4、5、6或更多份亚剂量， 任选以单位剂型在全天经过合适的时间间隔给予。在一个实施方式中，所述化合物以每日 一次剂量给予。在进一步的实施方式中，连续给予所述化合物，例如通过静脉内或其它途 径。在其它实施方式中，给予所述化合物的频率低于每日一次，例如每周一次或更少。虽然可以单独给予本发明化合物，但优选将该化合物作为药物制剂(组合物)给 予。接受这种治疗的对象是有需要的任何动物，包括灵长类，特别是人，和其它哺乳动 物，例如家兔、马、牛，如奶牛、猪、山羊和绵羊；和通常的禽类及宠物。可将本发明化合物给予或与药学上可接受的运载体混合给予，也可与抗微生物制 剂，例如青霉素、头孢菌素类、氨基糖苷类和糖肽类一起给予。因此，联合治疗包括依次、同 时和分别给予所述活性化合物，使后续给药时前次给予的化合物的疗效尚未完全消失。给予所述化合物的可能途径可通过任何合适的给药途径将这些化合物给予人和其它动物进行治疗。本文所用 的术语给药“途径”包括但不限于皮下注射、静脉内注射、眼内注射、真皮内注射、肌肉内注 射、腹膜内注射、气管内给药、脂肪内给药(intraadiposal administration)、关节内给药、 鞘内给药、硬膜外给药、吸入、鼻内给药、口服给药、舌下给药、口腔含化给药、直肠给药、阴 道给药、脑池内给药、透皮给药和局部给药、或经局部递送给药(例如通过导管或支架)。也 可给予缓释剂型或共同给予所述化合物。在本发明方法中，还可通过鼻内、眼内、眼周和阴道内途径给予所述药学化合 物，包括栓剂、吹入剂、粉末和气溶胶制剂(例如类固醇吸入剂，参见通过引用纳入本文 的 Rohatagi (1995)J. Clin. Pharmacol. 35 :1187-1193 ；Tjwa(1995)Ann. Allergy Asthma
20Immunol. 75 :107-111)。可通过混合药物与合适的无刺激赋形剂来制备栓剂，所述赋形剂在 平常温度下是固体，但在体温下是液体，因此会在体内融化而释放药物。此类材料是可可脂
和聚乙二醇。在本发明的方法中，可配制成涂布棒、溶液、悬浮液、乳液、凝胶、乳膏、软膏、糊剂、 凝胶剂、粉末和气溶胶，通过局部途径经皮递送所述药学化合物。在本发明的方法中，可胃肠外给予所述药学化合物，例如静脉内(IV)给药或体腔 (例如，滑液空间)或器官内腔中给药。这些制剂可包含溶解于药学上可接受的运载体中的 活性药物溶液。可采用的可接受载体和溶剂是水和林格液，一种等渗氯化钠(溶液)。此 外，可采用无菌的不挥发油作为溶剂或悬浮介质。为此目的，可采用任何温和的不挥发油， 包括合成单甘油酯或甘油二酯。本文所述的本发明方法可单独使用或与其它方法联用以治疗自身免疫疾病或本 文所述的其它疾病。联合方案所采用的具体联合治疗(疗法或过程)要考虑所需疗法和/或过程是否 与要实现的所需治疗效果相容。还应知道，所用疗法对同一疾病能否实现所需效果(例如， 本发明化合物可与用于治疗同一疾病的另一种药物同时给予)，或者它们可实现不同效果 (例如，控制任何不良作用)。通常给予以治疗或预防特定疾病或病症的本文所用的其它治 疗剂称为“适合于所治疗疾病或病症的”治疗剂。可同时、依次或分别给予所述治疗剂的各个组分来实现本文定义的本发明联合治疗。治疗应用为预防或治疗目的可给予本文所述的多核苷酸或调节性化合物(下文称为“治疗 剂”)。当预防性提供时，在出现任何症状前提供所述治疗剂。所述治疗剂的预防性给药的 作用是防止或减轻任何症状。当治疗性提供时，在发生疾病或病症症状时(或其后不久) 提供治疗剂。治疗性给予所述治疗剂的作用是减轻实际症状的任何恶化。所治疗的个体可以是任何哺乳动物。一方面，所述哺乳动物是人。另一方面，此人 患有自身免疫疾病或病症。在其它方面，所述自身免疫疾病或病症与以下疾病相关或选自 以下疾病多发性硬化症、I型糖尿病、再生障碍性贫血、格雷夫斯病、腹部疾病、克罗恩病、 红斑狼疮、关节炎、骨关节炎、自身免疫葡萄膜炎和重症肌无力。在其它方面，此人患有炎性疾病或病症。在另一方面，所述炎性疾病或病症与以下 疾病相关或选自以下疾病炎性肠病、类风湿性关节炎、过敏、动脉粥样硬化、银屑病、胃炎 和缺血性心脏病。在另一方面，所述炎症与脑死亡相关，优选脑组织中内源性循环α-MSH 或Ci-MSH的水平降低。在还有另一方面，用所述治疗剂治疗患有α-MSH或MCl-受体介导 病症或疾病的对象。在另一方面，本发明涉及治疗患有黑色素瘤的对象。在一方面，本发明减轻或缓解 对象中的黑色素瘤。在还有另一方面，在黑色素瘤检测或成像试验中采用本发明化合物。装有所述化合物的药盒本发明还提供实施本发明治疗方案的药盒。此类药盒单独或联合装有治疗有效量 的药学上可接受形式的肽和药学上可接受形式的其它药物，该肽具有MClR调节剂的特定 活性。优选的药物剂型包括肽与无菌盐水、葡萄糖溶液、缓冲液或其它药学上可接受的无菌液体的组合。或者，可冻干或干燥所述组合物。在此例中，药盒也可装有药学上可接受的溶 液(优选无菌)以形成注射溶液。在另一实施方式中，药盒还可装有针头或注射器，优选包 装成无菌形式以供注射所述组合物。在其它实施方式中，所述药盒还装有将该组合物给予 对象的用法说明材料。说明材料可以是书写的插页、音频记录、视频记录或指导给予对象该 组合物的任何其它手段。在一个实施方式中，所述药盒装有(i)含有肽的第一容器，所述肽 具有MClR-特异性调节活性；和(ii)用法说明材料。治疗方法的其它实施方式在一些实施方式中，本发明向有需要的对象提供能减轻或抑制其移植物排异的方 法，包括给予所述对象包含药学上可接受的赋形剂和有效量的至少一种本文提供的肽化合 物的药物组合物。在一些实施方式中，本发明提供减轻或抑制移植的组织、细胞或器官引发 对象产生免疫应答的方法。移植组织的非限制性例子是实验性心脏移植中的同种异体移植 物和胰岛细胞。&棚牛自躺繩#騎(EAE)痛删牛产生了 α-MSH的新型D-氨基酸肽类似物并在实验性自身免疫葡萄膜炎(EAU)和 实验性自身免疫脑脊髓炎(EAE)模型以及脂多糖(LPQ替代性炎症疾病模型中评估其免疫 调节作用。在EAU模型和MOG诱导的EAE小鼠模型中，用RI α-MSH类似物治疗降低了临 床疾病评分和疾病发生率。此外，治疗小鼠中，MOG免疫小鼠的脾脏和淋巴结中TNF-α和 IL-IOmRNA表达水平降低。在LPS诱导的全身炎症模型中，α-MSH和类似物治疗降低了血 清细胞因子水平。这些数据表明这些新型α-MSH类似物具有用于治疗炎症和自身免疫疾 病的潜能。材料和方法肽.α -MSH(SYSMEHFRffGKPV)购自宾夕法尼亚州金戈夫普鲁西亚的巴卡姆公司 (Bachem, King of Prussia, PA) 。 D- U^W. RI α -MSH MU^ (vpkgwrfhemsys)、RI α -MSH 的丙氨酸取代肽、(硬脂酰基)HfRW(820)、(Ph(CH2)3CO)HfRff (819)和RI α-MSH类似物 891 [vpkGwr(D-Cha)hsiiss]由健赞公司(Genzyme Corporation)用标准固相方法合成，通 过反相HPLC纯化。混杂的D氨基酸对照肽(ksrsmgvfpeyh)由健赞公司合成。无关的D氨 基酸对照肽(plyWdiWdles)由健赞公司合成。动物.5-6周龄雌性BIO. RIII_H2r小鼠购自缅因州巴港的杰克逊实验室(Jackson Laboratories, Bar Harbor, ME)。6-8周龄雌性或雄性C57BL/6小鼠购自缅因州巴港的杰克逊实验室。动物研究的 所有方案得到健赞股份有限公司的公共动物照料和使用委员会(Institutional Animal Care and use Committee) (IACUC)批准。EAU诱导.在两个部位(肩胛骨之间和骨盆区)给雌性B10. RIII分别皮下注射 总共200μ g马萨诸塞州费奇伯格新英格兰肽公司(New England Peptide ；Fitchburg, ΜΑ)的光感受器间结合蛋白肽(interphotoreceptor binding protein peptide) (IRBP) 161-180，该肽用含结核分枝杆菌(mycobacterium tuberculosis) H37Ra (密歇根州 底特律迪菲科公司(Difco，Detroit, MI))的ang/ml完全弗氏佐剂(CFA ；密苏里州圣路易 斯西格玛公司(Sigma, St. Louis, MO))配制。眼评分.用1或2滴托吡卡胺(波多黎各胡玛考的阿尔康公司(Alcon ；Humacao,Puerto Rico))和暗室中静置约5分钟扩张小鼠眼睛的(瞳孔)。用手捉住小鼠， 用带78号屈光镜的间接眼底镜观察双眼视网膜。采用0-5之间的渐进评分系统给眼睛的 炎症评分。评分O 正常视网膜。评分1 邻近视神经有血管炎症。评分2 :< 5个炎性病损 局限于眼睛的一个象限。评分3:在眼睛的一个以上象限中有>5个炎性病损。评分4:炎 性病损汇合。评分5:视网膜剥脱。收集小鼠的完整眼睛置于PBS中。将眼睛包埋在OCT介 质中冷冻固定。通过乳头-视神经平面切割成5-μπι的切片，用苏木精和曙红染色。与黑皮质素受体的结合研究.检测了 α -MSH、RI α -MSH和混杂肽与黑皮质素受 体:1、3、4和5的结合概况。采用竞争性结合试验与(Nle4, D-Phe7) α -MSH(巴卡姆公司) 进行结合研究。由法国巴黎的克莱普实验室(Cer印laboratories)用编码样品进行结合分 析。所述肽结合后，还用HEK293细胞系膜制品进行与125I-NDP-MSH竞争结合黑皮质 素受体1、3、4和5的研究。25°C，将与125I-(Nle4, D-Phe7) - α-MSH混合的诸肽在V-底96 孔板的结合缓冲液(25mM HEPES pH7,1. 5mM CaCl2, ImM MgSO4, IOOmM NaCl,0. 2% BSA)中 与含I-IOfmol受体的HEK293转染细胞系(马萨诸塞州波士顿的帕金埃尔默公司(Perkin Elmer,Boston MA))的膜制品混合 1 小时。用 3μΜ 的(Nle4,D-Phe7)-NDP-MSH(巴卡姆公 司)作为阳性对照。使混合液通过96-孔GFC过滤器(马萨诸塞州比尔里卡米利波尔公司 (Millipore, Billerica, MA))过滤，用不含BSA的结合缓冲液洗涤3次，干燥并计数。cAMP检测.将弗吉尼亚州马纳萨斯美国模式培养物保藏所(American Type Culture Collection,Manassas, VA)的B 16-F1 (黑色素瘤细胞系)细胞以切104/孔接种平 底96孔板，用补加了 2mM谷氨酰胺、抗生素(100U/ml青霉素和100U/ml链霉素)和10%热 灭活胎牛血清(纽约州格兰德岛市英杰公司(Invitrogen，Grand Island, NY))的DMEM(马 里兰州沃克斯维尔市坎布莱克斯公司(Cambrex，WalkerSVille，MD))培养过夜。然后用天 然 a-MSH(0. 01-1000ng/ml)、逆-倒位 a -MSH(0. 01-1000ng/ml)或混杂 D 氨基酸对照肽 (0. 01-1000ng/ml)处理细胞30分钟。裂解细胞，用新泽西州皮斯卡塔韦AB公司(Amersham Biosciences,Piscataway,NJ)的酶免疫测定试剂盒检测胞内cAMP水平。用密苏里州圣路 易斯西格玛公司的100 μ M毛喉素作为阳性对照。EAE诱导和评分.用含0. 6mg结核分枝杆菌(密歇根州底特律迪菲科公司)的完 全弗氏佐剂(CFA ；密苏里州圣路易斯西格玛公司)乳化的M0G35-55肽Q00微克/小鼠； 马萨诸塞州费奇伯格新英格兰肽公司)免疫雌性C57BL/6小鼠。每只小鼠皮下二点注射递 送0. 2ml体积的乳液。腹膜内给药途径采用400纳克/动物剂量的PBS配制的百日咳博德 特菌(Bordetella pertussis)毒素(PTX ；西格玛公司)，在第0天和第3天给予。每日监 测小鼠的EAE麻痹症状。采用0-5之间的渐进评分系统给小鼠的临床症状评分。评分0 无疾病；评分1 尾巴松弛；评分2 后肢虚弱；评分3 后肢瘫痪；评分4 前肢虚弱/部分瘫 痪；评分5 死亡。收集脊髓和脑包埋在石蜡中以供苏木精和曙红染色。增殖试验.在96孔板中以切105个细胞/孔培养C57BL/6小鼠脾细胞和淋巴结 细胞。取M0G35-55或OVA 257-264肽以25 μ g/ml的浓度加入各孔。收集MOG肽刺激后48 小时的上清液。培养3天后，用IyCi/孔的[3H]胸苷脉冲细胞8小时。通过cpm检测胸 苷掺入。细胞因子RNA分析-RT-QPCR.用加利福尼亚州卡尔斯巴德英杰公司(Invitrogen，Carlsbad, CA)的TRIzo 1提取组织的总RNA。采用STOR绿(荧光)掺入和加利福尼亚州福 斯特城应用生物系统公司(Applied Biosystems,Foster City, CA)的试剂，在ABI 7900仪 上逆转录IygS RNA，用定量PCR检测。对于靶细胞因子检测，在每次PCR中运作cDNA标准 品并按小鼠β -肌动蛋白标准化所得信使(RNA)的浓度。用于获得这些数据的引物如下小 TNF α JE[b] -ggcaggtctactttggagtcattgc-acattcgaggctccagtgaattcgg(1)。1
们采用的小鼠 IL-IO 正向tgctatgctgcctgctctta 和反向tcatttccgataaggcttgg(2)。小 鼠 β -肌动蛋白的序列是正向 gtgggccgctctaggcaccaa禾Π反向 ctctttgatgtcacgcacgattt c (3)。CBA分析.利用加利福尼亚州圣何塞BD生物科学公司(BDBiosciences，San Jose, CA)制造的细胞计数珠试验试剂盒(CBA)对小鼠血清或细胞上清液作炎性细胞因子概况的 流式细胞术分析。按照生产商的方案加工样品。mMClR RNA分析-RT-QPCR.用加利福尼亚州卡尔斯巴德英杰公司的TRIzol提取 组织的总RNA。用Taqman试剂盒和加利福尼亚州福斯特城应用生物系统公司的试剂，在 ABI 7900仪上逆转录Iyg总RNA，用定量PCR检测。对于mMClR检测，在每次PCR中运作 cDNA标准品，按真核18S内源性对照(VIC/MGB探针，应用生物系统公司部分#4319413E)标 准化所得信使(RNA)的浓度。mMClR的引物如下正向CTCTGCCTCGTCACTTTCTTTCTA和反向 AACATGTGGGCATACAGAATCG及探针CCATGCTGGCACTCA。这些引物的设计采用了加利福尼亚州 福斯特城应用生物系统公司的引物表达3. 0软件。LPS模型.用LPS(1微克/小鼠)腹膜内注射攻击雄性C57BL/6小鼠。30分钟后， 用地塞米松(ang/kg ；西格玛公司)、RI- α -MSH类似物891或RI- α -MSH治疗小鼠。LPS攻 击后2小时，给小鼠放血获取血清。用细胞计数珠试验试剂盒(BD生物科学公司)作流式 细胞术分析细胞因子。统计学分析.结果表示为平均值士SD。各实验重复至少两次。为分析结果，采用 单向ANOVA和Tukey多重比较检验。提供以下实施例是为了说明而非限制本发明。实施例1^mn ^^^mmm^ (EAU) 型中的免疫抑击时舌个牛自身免疫葡萄膜炎是一种可导致疼痛和视力丧失的眼睛炎性疾病。类固醇和免疫 抑制药物是目前葡萄膜炎的唯一治疗剂，常具有严重的眼睛和全身毒性。因此，需要安全的 替代治疗剂。EAU是一种影响美国两百三十万人葡萄膜炎的动物模型。用光感受器间类视黄 醇结合蛋白(IRBP)或其肽片段或视网膜S-抗原(S-Ag)加佐剂免疫接种可诱导易感啮 齿类动物品系产生该疾病。该疾病涉及眼睛视网膜中炎性细胞浸润和光感受器损坏，可 自然恢复且无自发性复发。在同系啮齿动物受者中可过继性转移致葡萄膜炎性T细胞 (uveitogenic T cell)，提示葡萄膜炎是器官特异性T细胞介导的自身免疫疾病，如同许多 其它类似的自身免疫疾病，例如多发性硬化症、1型糖尿病和类风湿性关节炎。眼睛的微环境是免疫赦免部位，其中维持免疫抑制的机制适当地阻止了局部发生 炎症。眼组织中神经元表达的几种神经肽有助于维持眼睛的免疫赦免。这些神经肽之一是 α -MSH，它在眼睛微环境中以30pg/ml的生理浓度持续表达。
在大鼠内毒素-诱导的葡萄膜炎期间全身性给予天然α -MSH，以剂量依赖性方式 抑制了眼房水中的浸润细胞数和IL-6、TNF-a、MCP_1、MIP_2及一氧化氮水平。在小鼠EAU 模型中，当视网膜炎症达到高峰时给予a-MSH抑制了该病的严重程度。a-MSH可通过T细 胞上的黑皮质素5受体(MCR-5)诱导T调节细胞而抑制EAU。评估了天然a -MSH在小鼠后色素层葡萄膜炎模型中的治疗效果。给BIO. RIII小 鼠注射IRBP 161-180和CFA诱导葡萄膜炎。免疫后约10天疾病发作。第13天眼评分达到 2-3，连续7天静脉内注射给予小鼠QOO微克/小鼠)天然a-MSH，或不治疗。由于预防性 治疗系靶向疾病引发阶段而非效应阶段的活动性炎症，故当观察到活动性视网膜炎症时开 始治疗。此外，该治疗方案着重于临床应用。与未治疗的小鼠相比，用a-MSH治疗的小鼠 在7天治疗期间显示临床平均眼评分降低(图la)。与未治疗组小鼠第15天达到最高眼平 均评分3. 67士0. 52相比，α -MSH治疗小鼠第13天显示的最高眼平均评分为2. 83士0. 39。实施例2
_9] 在BIO. RIII牛自身免,疮葡萄腊炎1草型Φ比较天然α-MSH与地,H米松葡萄膜炎目前的治疗方式包括皮质激素和免疫抑制剂。将天然α-MSH的效果 与已知的皮质激素治疗剂地塞米松相比。注射11 161-180和0 4诱导810.1 111小鼠 发生葡萄膜炎。疾病发作即小鼠的眼临床评分达到1时，每日腹膜内注射给予小鼠天然 α -MSH(100微克/小鼠)、0· 2mg/kg地塞米松或2. Omg/kg地塞米松。每日治疗小鼠21天。 与PBS对照小鼠相比，在治疗期间用天然α -MSH治疗的小鼠显示临床平均眼评分显著降低 (图1Β)。数据显示每日腹膜内注射给予天然α -MSH抑制葡萄膜炎的程度高于0. 2mg/kg 或2. Omg/kg剂量的地塞米松治疗。实施例3新型逆-倒位α -MSH类似物可特异性结合MCR-I合成了天然α -MSH的新型、稳定的D-氨基酸肽类似物(RI α -MSH)并在体外和实 验性自身免疫葡萄膜炎(EAU)模型中评估了其免疫调节性能。结合研究表明与天然a-MSH 不同，RI a -MSH能特异性结合抗-炎性a -MSH受体(MCR-I)，但不结合其它a -MSH受体 (MCR-3、4 或 5)。分析了 RI a-MSH类似物与黑皮质素受体(MCR)的结合。采用包括MCR 1、3、4和 5在内的一组MCR进行竞争性结合试验。如前所述，所述肽的结合与125I-NDP-MSH竞争。天 然a-MSH能结合MCR 1、3、4和5。然而，与天然a-MSH不同，发现RI a-MSH只结合调节炎 性应答的MCR-I (表1)。混杂D氨基酸对照肽不结合任何黑皮质素受体。开发的能特异性 结合MCR-I而不结合MCR-3和MCR-4的a -MSH类似物，可降低天然a -MSH通过结合这些 受体可能产生的副作用。表 权利要求
1.一种基本纯的化合物或其药学上可接受的盐，所述化合物能选择性结合黑皮质素1 受体(MClR)，所述化合物包含的核心四肽具有以下序列His Xaa1 Arg Trp (SEQ ID NO 1) 或 D-Trp D-Arg Xaa2 D-His(SEQ ID NO 2)； 其中) 是 D-Cha、D-Phe 或 Cha，禾口 Xaa2 ^ D-Cha> D-Phe Phe0
2.如权利要求1所述的化合物，其特征在于，所述化合物包含的C-末端多肽具有以下 序列D-kr D-Ile D-Ile D-Ser D-Ser (SEQ ID NO :3)。
3.—种基本纯的化合物或其药学上可接受的盐，所述化合物选择性结合黑皮质素1受 体(MClR)，所述化合物包含具有以下序列的多肽XBB^ XΒ3-2 X&&3 Xao^ XBB^ X&3-5 XBB^ XBBg XBBg XBB^q XBB^ XBB^ X3-3-^3'其中 Xagi1 是 D-Val、D-Ala 或 D-Lys ；Xaa2 是 D-Pro、D-Ala 或 D-Lys ；Xaa3 是 D-Lys> D-Orn> D_Nle、D-Ala 或 D-Lys ；Xaa4 是 Gly 或 D-Ala ；Xaa5 是 D-Trp, Trp, D-3-苯并噻吩基-Ala、D_5_ 羟基-Trp, D_5_ 甲氧基-Trp, D-Phe 或 D-Ala ；Xaa6 是 D-Arg> D-His 或 D-Ala ；Xaa7 是 D-Cha、D-Phe, Phe、D_4_ 氟-Phg、D-3-吡啶基-Ala、D-Thi、D-Trp、D_4_ 硝 基-Phe 或 D-Ala ；Xaa8 是 D-His、His、D-Arg> Phe 或 D-Ala ；Xaa9 是 D-Glu、D-Asp, D-瓜氨酸、D-Ser 或 D-Ala ；Xaa10 是 D-Met、D- 丁硫氨酸、D-Ile 或 D-Ala ；Xaa11 是 D-Ser、D-Ile 或 D-Ala ；Xaa12 是 D-Tyr > D-Ser 或 D-Ala ；Xaa13 是 D-Ser 或 D-Ala ；其中除非当Xaa1j均是D-Ala时，不多于一个的)(叫_13是D-Ala和不多于一个的)(叫_13 是L-氨基酸。
4.如权利要求3所述的化合物或其药学上可接受的盐，其特征在于，所述化合物包含 具有以下序列的多肽XBB^ XΒ3-2 X&&3 Xao^ XBB^ X&3-5 XBB^ XBBg XBBg XBB^q XBB^ XBB^ X3-3-^3' 其中 Xagi1 是 D-Val ； Xaa2 ^ D-Pro ；Xaa3 是 D-Lys、D-Orn 或 D-Nle ； Xaa4 ^ Gly ；Xaa5 是 D-Trp、Trp、D-3-苯并噻吩基-Ala、D_5-羟基-Trp、D_5_ 甲氧基-Trp 或 D-Phe ； Xaa6 是 D-Arg 或 D-His ；Xaa7 是 D-Cha、D-Phe, Phe、D_4_ 氟-Phg、D-3-吡啶基-Ala, D-Thi、D-Trp 或 D_4_ 硝 基-Phe ；Xaa8 是 D-His、His、D-Arg> Phe 或 D-Ala ； Xaa9 是 D-Glu、D-Asp、D-瓜氨酸或 Dler ； Xaa10 是 D-Met、D- 丁硫氨酸或 D-Ile ； Xaa11 是 D-Ser 或 D-Ile ； Xaa12 是 D-Tyr 或 Dler ；禾口 Xaa13 是 D-Ser ；其中不多于一个的^Caa1,是L-氨基酸。
5.如权利要求3所述的化合物或其药学上可接受的盐，其特征在于，所述化合物包含 具有以下序列的多肽XBB^ XΒ3-2 X&&3 Xao^ XBB^ X&3-5 XBB^ XBBg XBBg XBB^q XBB^ XBB^ X3-3-^3' 其中 Xagi1 是 D-Val ； Xaa2 ^ D-Pro ；Xaa3 是 D-Lys、D-Orn 或 D-Nle ； Xaa4 是 Gly ；Xaa5 是 D-Trp 或 Trp ； Xaa6 是 D-Arg ；Xaa7 是 D-Cha、D-Phe, Phe 或 D-Thi ；Xaa8 是 D-His 或 His ；Xaa9 是 D-Glu 或 D-Ser ；Xaa10 是 D-Met、D- 丁硫氨酸或 D-Ile ；Xaa11 是 D-Ser 或 D-Ile ；Xaa12 是 D-Tyr 或 Dler ；禾口Xaa13 是 D-Ser ；其中不多于一个的^Caa1,是L-氨基酸。
6.一种基本纯的化合物或其药学上可接受的盐，所述化合物包含具有以下序列的多肽D-Val D-Pro D-Lys Gly D-Trp D-Arg Phe D-His D-Ser D-Ile D-Ile D-Ser D-Ser(SEQ ID NO 4)；D-Val D-Pro D-Lys Gly D-Trp D-Arg D-Cha D-His D-Ser D-Ile D-Ile D-Ser D-Ser(SEQ ID NO 5)；Ser Tyr Ser Met Glu His Cha Arg Trp Gly Lys Pro Val(SEQ ID NO :6)；或 D-Val D-Pro D-Lys Gly D-Trp D-Arg D-Phe D-His D-Glu D-Met D-Ser D-Tyr D-Ser(SEQ ID NO :7)。
7.如权利要求1、3、4、5或6所述的化合物，其特征在于，所述多肽经PEG化。
8.如权利要求6所述的化合物，其特征在于，所述化合物能选择性结合MC1R。
9.如权利要求1、3、4、5或6所述的化合物，其特征在于，所述化合物显示出至少一种以 下特性选择性激活MClR的能力； 在体外血浆中的稳定性；或 对蛋白酶降解的耐受性。
10.一种药物组合物，其包含权利要求1、3、4、5或6所述的化合物和药学上可接受的赋 形剂。
11.如权利要求1、3、4、5或6所述的化合物，其特征在于，所述化合物偶联于生物学活 性部分。
12.—种治疗有需要的对象中自身免疫疾病或病症的方法，包括给予所述对象包含药 学上可接受的赋形剂和治疗有效量的权利要求1、3、4、5或6所述化合物的药物组合物。
13.如权利要求12所述的方法，其特征在于，所述自身免疫疾病或病症选自多发性硬 化症、I型糖尿病、再生障碍性贫血、格雷夫斯病、腹部疾病、克罗恩病、红斑狼疮、关节炎、骨 关节炎、自身免疫葡萄膜炎和重症肌无力。
14.一种治疗有需要的对象中炎症的方法，包括给予所述对象包含药学上可接受的赋 形剂和治疗有效量的权利要求1、3、4、5或6所述化合物的药物组合物。
15.如权利要求14所述的方法，其特征在于，所述炎症与选自下组的疾病相关炎性肠 病、类风湿性关节炎、过敏、动脉粥样硬化、银屑病、胃炎和缺血性心脏病。
16.一种降低或抑制有需要对象中移植物排异的方法，包括给予所述对象包含药学上 可接受的赋形剂和治疗有效量的权利要求1、3、4、5或6所述化合物的药物组合物。
17.一种治疗有需要的对象中黑色素瘤的方法，包括给予所述对象包含药学上可接受 的赋形剂和治疗有效量的权利要求1、3、4、5或6所述化合物的药物组合物。
18.一种治疗有需要的对象中黑色素瘤的方法，包括给予所述对象包含药学上可接受 的赋形剂和治疗有效量的偶联物的药物组合物，所述偶联物包含偶联于抗肿瘤负载物的权 利要求1、3、4、5或6所述化合物。
19.如权利要求18所述的方法，其特征在于，所述抗肿瘤负载物是放射性核素、辐射致 敏剂、光敏剂、化疗剂或毒素。
20.一种试剂盒，其装有权利要求10所述的药物组合物和任选的使用说明书。
全文摘要
本文提供对黑皮质素1受体(MC1R)具有选择性的天然α-促黑素细胞激素(α-MSH)的稳定的肽类似物。本文还提供这种α-MSH肽类似物的药物制剂以及用这些类似物治疗涉及MC1R的医学和兽医学疾病的方法。
文档编号C07K14/68GK102143970SQ200980120892
公开日2011年8月3日 申请日期2009年3月20日 优先权日2008年5月27日
发明者A·E·埃德林, C·Q·潘, J·E·斯蒂法诺, J·L·德祖里斯, M·A·佩里科内, T·E·威登 申请人:健赞股份有限公司