药物融合物和缀合物的制作方法

专利名称：药物融合物和缀合物的制作方法
药物融合物和缀合物本发明涉及血清半寿期得到改进的药物融合物和缀合物。这些融合物和缀合物包 含免疫球蛋白(抗体)单一可变结构域(single variable domain)及GLP和/或毒蜥外 泌肽分子。本发明还涉及包含这类药物融合物和缀合物的用途、剂型、组合物和装置。
背景技术：
具有可用于治疗和/或诊断目的活性的许多药物的价值有限，因为当给药后它们 快速从体内清除。例如，在治疗上具有有益活性的许多多肽通过肾快速从循环中清除。因 此，必需给予大的剂量才能获得所需要的治疗效果。存在对具有改进的药代动力学性质的 治疗药和诊断药的需求。在机体或全身循环中，半寿期短的这类药物之一是肠降血糖素激素例如胰高血糖 素样肽1或YY肽以及毒蜥外泌肽，例如毒蜥外泌肽-4。胰高血糖素样肽(GLP)-I是一种肠降血糖素激素，具有有效的葡萄糖依赖性促胰 岛素作用和胰高血糖素抑制作用、对胰β细胞的营养作用以及对胃肠分泌和蠕动的抑制 作用，它把降低血浆葡萄糖和减少血糖波动结合在一起。此外，GLP-I通过其提高饱感的 能力而减少食物摄取，因此限制体重增加，并且甚至可引起体重减轻。总之，这些作用赋 予GLP-I独特的特征，鉴于十分需要抗糖尿病药，特别是因为其抗高血糖作用的葡萄糖依 赖性，这可使任何严重低血糖的风险降到最低。然而，其药代动力学/药效动力学特征如 此，以致天然GLP-I并非是治疗有益的。因此，虽然GLP-I当连续给予时是最有效的，但 是一次皮下注射的持续作用短暂。GLP-I非常容易遭受体内酶的降解，而且与二肽基肽酶 IV(DPP-IV)的切割可能关系最大，因为这种切割快速发生，并产生非促胰岛素代谢物。因此 根据对影响GLP-I代谢稳定性和药代动力学/药效动力学特征的因素的理解，利用GLP-I 的治疗潜力的策略已成为深入研究的焦点。已进行了广泛的研究工作以期按减缓GLP-I降解同时又保持生物活性的方式抑 制所述肽酶或修饰GLP-I。W005/027978公开了作用特征延长的GLP-I衍生物。W002/46227 公开了包含多肽(例如白蛋白)与GLP-I或类似物(这些类似物的公开内容通过引用 作为可以用于本发明的GLP-I类似物的实例而结合到本文中)融合的异源融合蛋白。 W005/003^6、W003/060071、W003/059934 公开了氨基融合蛋白(amino fusion protein), 其中GLP-I与白蛋白融合以期延长该激素的半寿期。然而，尽管作了这些努力，但仍未生产出长效的活性GLP-1。因此，特别在糖尿病和肥胖症领域，存在对改进的GLP-I肽或同样具有特别适于 治疗糖尿病和肥胖症的促胰岛素作用的其它肽(例如毒蜥外泌肽-4)的巨大需求。因此需 要修饰GLP-1、毒蜥外泌肽-4和其它促胰岛素肽使其体内作用时间延长同时又保持低毒性 和治疗益处。发明概述本发明提供一种组合物，其为融合物或缀合物并且包含以下成分或由以下成分 组成(a)促胰岛素药物或分子、或者肠降血糖素药物或分子，例如可以是毒蜥外泌肽-4 或GLP-I (例如GLP-1 (7-37)A8G突变体)，作为与(b)的融合物或缀合物存在，(b)DOM7h-14(Vk)结构域抗体(dAb)，其与血清白蛋白特异性结合(D0M几-14的氨基酸序列见图 1(h) =SEQ ID NO 8)。还可任选存在将促胰岛素药物或肠降血糖素药物(例如毒蜥外泌肽-4和/或 GLP-1)与dAb (例如与DOM^1-HdAb)连接的氨基酸接头或化学接头。接头可以是例如螺旋 接头，例如图l(k)所示的螺旋接头序列=SEQ ID NO 11，或者可以是gly-ser接头，例如具 有

图1(1)所示的氨基酸序列SEQ ID NO 12。在某些实施方案中，本发明的融合物(或缀合物)可包含其它的分子，例如其它的 肽或多肽。促胰岛素药物或肠降血糖素药物(例如毒蜥外泌肽和/或GLP-1)可作为dAb的 N端或C端的融合物(或缀合物)而存在。在某些实施方案中，本发明提供包含选自以下融合物分子或者由选自以下融合物 分子组成的多肽(a)2xGLP-l(7-37)A8G D0M7h_14 dAb融合物(DATO114，氨基酸序列见图 1 (a) :SEQ ID NO 1)，(b)毒蜥外泌肽4(G4S接头)3D0M^i-14 dAb融合物(DAT0115，氨基酸序列见图 1(b) =SEQ ID NO 2)，(c)毒蜥外泌肽4-D0M7h-14 dAb融合物(DAT0116，氨基酸序列见图1 (c) =SEQ ID NO 3),(d)毒蜥外泌肽4、螺旋接头、D0M7h-14 dAb融合物(DAT0117，氨基酸序列见图 1(d) =SEQ ID NO 4)，(e) GLP-I (7-37) A8G(G4S 接头)3D0M7h-14 dAb 融合物(DAT0118，氨基酸序列见图 1(e) =SEQ ID NO 5)，(f) GLP-I (7-37) A8G D0M7h_14 dAb 融合物(DAT0119，氨基酸序列见图 1 (f) :SEQ ID NO 6)，(g)GLP-I (7-37) A8G、螺旋接头、D0M7h_14 dAb 融合物(DAT0120，氨基酸序列见图 1(g) =SEQ ID NO 7)。本发明还提供包含上述氨基酸序列或由上述氨基酸序列组成的缀合物分子，即具 有由SEQ ID NO 1-7所示的氨基酸序列的缀合物分子。Dom 7h_14是与血清白蛋白结合的人免疫球蛋白单一可变结构域或dAb (Vk)，其 氨基酸序列见图 1(h) =SEQ ID NO 8。Dom7h_14 dAb 的 CDR 区在图 1(h) :SEQ ID NO 8 所示 氨基酸序列中用下划线表示。本文使用的“融合物”是指包含结合血清白蛋白的DOM^1-H dAb作为第一部分和 促胰岛素药物或肠降血糖素药物作为第二部分的融合蛋白。结合血清白蛋白的dAb和所述 药物或药剂作为单条连续多肽链的离散组成部分(部分)存在。第一部分(dAb)和第二部 分(肠降血糖素药物或促胰岛素药物)可以通过肽键彼此直接结合或者通过合适的氨基酸 或者肽或多肽接头连接。适当时，可存在额外部分，例如肽或多肽(例如第三、第四肽)和 /或接头序列。第一部分可位于相对于第二部分的N端位置、C端位置或内部。在某些实施 方案中，融合蛋白含有一个以上(例如1个-约20个)dAb部分。本文使用的“缀合物”是指包含结合血清白蛋白的、促胰岛素药物或肠降血糖素药物与之共价或非共价结合的dAb的组合物。促胰岛素药物或肠降血糖素药物可直接与dAb 共价结合，或者通过合适的接头部分间接结合。药物或药剂可以在任何合适的位置上与dAb 结合，例如氨基端、羧基端或通过合适的氨基酸侧链(例如赖氨酸的ε氨基或半胱氨酸的 巯基)。或者，药物或药剂可直接与dAb非共价结合(例如静电相互作用、疏水相互作用) 或间接结合(例如通过互补结合配偶体(例如生物素和抗生物素蛋白)的非共价结合，其 中一个配偶体与药物或药剂共价结合，而互补结合配偶体与dAb共价结合)。本发明还提供本发明的任何缀合物或融合物的(基本上)纯的单体例如DAT0114、 DAT0115、DAT0116、DAT0117、DAT0118、DAT0119 和 DAT120 的单体。在一个实施方案中，它是 至少98%、99%、99. 5%纯或100%纯的单体。本发明还提供编码本文所述融合物的核酸，例如编码DAT0114、DAT0115、DAT0116、 DAT0117、DAT0118、DAT0119 和 DAT120 的核酸，以及例如其中在图 2(SEQ ID NO 13-23)中 所示的核酸序列。本文还提供包含这些核酸的宿主细胞。本发明另提供用于产生本发明的融合物的方法，所述方法包括在适于表达所述重 组核酸的条件下维持包含编码本发明的融合物的重组核酸和/或构建体的宿主细胞，从而 产生融合物。本发明还提供包含本发明的融合物或缀合物的组合物(例如药物组合物)。本发明还提供用于治疗患有疾病或病症的个体的方法，例如本文所述疾病或病 症，例如代谢疾病，例如高血糖症、葡萄糖耐量减低(impaired glucose tolerance), β细 胞缺乏症、糖尿病(例如I型或II型糖尿病或妊娠糖尿病)或肥胖症或以过食为特征的疾 病，例如它可用于例如普-威综合征O^ader-Willi syndrome)抑制食欲，并且所述方法包 括给予所述个体治疗有效量的本发明的融合物或缀合物。其它代谢紊乱包括但不限于胰岛素抵抗、胰岛素缺乏、高胰岛素血症、高血糖症、 血脂异常(dyslipidemia)、高脂血症、高酮血症、高血压、冠状动脉疾病、动脉粥样硬化、肾 衰竭、神经病(例如自主神经病、副交感神经病和多神经病)、视网膜病、白内障、代谢紊乱 (例如胰岛素和/或葡萄糖代谢紊乱)、内分泌障碍、肥胖症、体重减轻、肝脏疾病(例如肝 病、肝硬化和肝移植相关疾病)以及与这些疾病或病症有关的病况。另外，可用本发明的化合物预防或治疗的糖尿病相关病症包括但不限于高血糖 症、肥胖症、糖尿病性视网膜病、单神经病、多神经病、动脉粥样硬化、溃疡、心脏病、中风、贫 血症、坏疽(例如脚手坏疽)、阳萎、感染、白内障、肾功能低下、自主神经系统机能障碍、白 细胞功能减低、腕管综合征、杜普伊特伦挛缩(Dupuytren' s contracture)和糖尿病酮症 酸中毒。本发明还提供用于治疗或预防与血液葡萄糖升高有关的疾病的方法，所述方法包 括给予患者或受治疗者至少一剂本发明的融合物或缀合物和/或药物组合物。本发明还涉及使用本发明的缀合物或融合物调节患者对胰岛素响应性的方法，以 及增加细胞摄取葡萄糖的方法，及调节细胞对胰岛素的敏感性的方法。本发明还提供刺激 胰岛素合成和释放，提高脂肪、肌肉或肝组织对胰岛素摄取的敏感性，刺激葡萄糖摄取，减 慢消化过程，或者阻断患者中胰高血糖素分泌的方法，所述方法包括给予所述患者本发明 的融合物或缀合物，例如包括给予至少一剂本发明的药物缀合物或融合物和/或药物组合 物。7
本发明的融合物或缀合物和/或药物组合物可以单独给予或者与其它分子或部 分组合给予，其它分子或部分例如调节患者的胰岛素敏感性、体重、心脏病、高血压、神经 病、细胞代谢和/或葡萄糖、胰岛素或其它激素水平的多肽、治疗性蛋白和/或分子(例如 胰岛素和/或其它蛋白质(包括抗体))、肽或小分子。在具体的实施方案中，本发明的缀合 物或融合物与胰岛素(或胰岛素衍生物、类似物、融合蛋白或促分泌素)组合给予。本发明还提供本发明的缀合物或融合物在制备用于治疗疾病或病症的药物中的 用途，例如上述任意一种疾病，例如代谢紊乱，例如高血糖症、糖尿病(1型或2型糖尿病或 妊娠糖尿病)或肥胖症。本发明还涉及本文所述的融合物或缀合物用于治疗、诊断或预防中的用途。可进一步设计或格式化(formatted)本发明的融合物或缀合物(例如融合物的 dAb组分)以具有较大的流体动力学尺寸来进一步延长半寿期，例如通过连接PEG基团、血 清白蛋白、运铁蛋白、运铁蛋白受体或其至少运铁蛋白结合的部分、抗体Fc区，或者通过与 抗体结构域缀合。例如，可将结合血清白蛋白的dAb设计成抗体的较大的抗原结合片段(例 如设计成 Fab、Fab，、F(ab)2、F(ab，)2、IgG、scFv)。在本申请公开的本发明的其它实施方案中，在本发明的融合物中可以取代使用 "dAb",预期技术人员可以取代使用包含dAb的⑶R(例如Dom7h-14的OTR)的结构域，其 与血清白蛋白结合(例如⑶R嫁接在亲和体(affibody)、SpA支架、LDL受体A类结构域或 EGF结构域等合适蛋白质支架或骨架上)。因此，本公开内容从整体来看可解释为提供这类 结构域代替dAb的公开内容。在某些实施方案中，本发明提供包含促胰岛素药物或肠降血糖素药物和双特异性 配体或多特异性配体的本发明的融合物或缀合物，其包含结合血清白蛋白的本发明的第一 dAb (例如Dom7h-14)，以及具有与第一 dAb相同或不同的结合特异性的第二 dAb和任选在 多特异性配体的情况下具有更多的dAb。第二 dAb (或更多的dAb)可任选结合不同的靶标， 例如FgFr lc，或CD5靶标。因此，在一个方面，本发明提供本发明的融合物或缀合物用于通过胃肠外给药的 递送，例如通过皮下、肌内或静脉内注射、吸入、经鼻递送、跨黏膜递送、口服递送、递送到患 者的胃肠道、直肠递送或经眼递送。在一个方面，本发明提供本发明的融合物或缀合物在制 备通过下列方式递送的药物中的用途皮下注射、吸入递送、静脉内递送、经鼻递送、跨黏膜 递送、口服递送、递送到患者的胃肠道、直肠递送或经眼递送。在一个方面，本发明提供通过下列方式递送药物至患者的方法皮下注射、经肺递 送、静脉内递送、经鼻递送、跨黏膜递送、口服递送、递送到患者的胃肠道、直肠递送或经眼 递送，其中所述方法包括给予患者药学上有效量的本发明的融合物或缀合物。在一个方面，本发明提供包含本发明的融合物或缀合物的口服剂型、注射剂型、可 吸入剂型、喷雾剂型或眼用剂型。剂型可以是片剂、丸剂、胶囊剂、液体制剂或糖浆剂。在一 个方面，组合物可以口服给予，例如饮料，例如以治疗肥胖症的减肥饮料销售。在一个方面， 本发明提供用于直肠递送给患者的剂型，例如可以提供作为栓剂的剂型。例如，用于胃肠外给予GLP-I化合物的组合物可按照W003/002136 (通过引用结合 到本文)中所述方法制备。例如，用于经鼻给予某些肽的组合物可按照欧洲专利号272097 (属于Novo8Nordisk A/S)或WO 93/18785 (均通过引用结合到本文)中所述方法制备。术语“受治疗者”或“个体”在本文定义为动物，例如哺乳动物，包括但不限于灵长 类(例如人)、牛、绵羊、山羊、马、狗、猫、兔、豚鼠、大鼠、小鼠或其它牛科动物、绵羊类、马科 动物、犬科动物、猫科动物、啮齿动物或鼠科动物种类。本发明还提供用于给予受治疗者(例如患者)本发明的组合物(例如本发明的 缀合物或融合物)的药盒，所述药盒包括组合物(例如本发明的缀合物或融合物)、递药 装置和任选使用说明书。组合物(例如缀合物或融合物)可以剂型(例如冻干剂型)提 供。在某些实施方案中，递药装置选自注射器、吸入器、鼻内或眼内给药装置(例如喷雾器 (mister)、眼鼻点滴器)和无针注射装置。可将本发明的组合物(例如缀合物或融合物)冻干以贮存，并在临用前用合适的 载体复溶。可以采用任何合适的冻干方法(例如喷雾干燥、烘烤干燥(cake drying))和/ 或复溶技术。本领域技术人员应当了解的是，冻干和复溶可能导致抗体活性不同程度的损 失，需要调节使用水平来弥补。在具体的实施方案中，本发明提供包含本文所述冻干(冷冻 干燥)组合物(例如药物缀合物、药物融合物)的组合物。优选当再水化时，冻干(冷冻干 燥)组合物(例如药物缀合物、药物融合物)的活性(例如血清白蛋白的结合活性)损失 不超过约20%、或不超过约25%、或不超过约30%、或不超过约35%、或不超过约40%、或 不超过约45%、或不超过约50%。所述活性是在组合物(例如药物缀合物、药物融合物) 冻干之前，产生所述组合物的作用所需要的量。例如，要达到和维持所需血清浓度长达所需 的一段时间所需要的缀合物或融合物的量。在冻干前，可以采用任何合适的方法测定组合 物(例如药物缀合物、药物融合物)的活性，并且在再水化后采用相同方法测定活性损失的 量，来确定活性。本发明还提供包含本发明的融合物或缀合物的缓释剂型，这类缓释剂型可包含本 发明的融合物或缀合物以及例如透明质酸、微球或脂质体和其它药学上或药理上可接受的 载体、赋形剂和/或稀释剂。这类缓释剂型可为例如栓剂的形式。在一个方面，本发明提供包含本发明的融合物或缀合物和药学上或生理学上可接 受的载体、赋形剂或稀释剂的药物组合物。附图简述图 1 图示氨基酸序列(a) DATOl 14 (SEQ ID NO 1)，(b) DATOl 15 (SEQ ID NO 2)， (c) DATOl 16 (SEQ ID NO 3)，(d) DATOl 17 (SEQ ID NO 4)，(e) DATOl 18 (SEQ ID NO 5)，(f) DATO119(SEQ ID NO 6)(g)DATO120(SEQ ID NO 7)(h)Dom7h_14(SEQ ID NO 8) (dAb) (CDR 用下划线表示)，(i)GLP-I 7-37A⑶G(SEQ ID NO 9)，(j)毒蜥外泌肽 _4(SEQ ID NO 10)， (k)螺旋接头(SEQ ID NO 11) (l)Gly-ser 接头(SEQ ID NO 12)。图2图示核酸序列(a) DAT0114 (哺乳动物构建体)(SEQ ID NO 13)，(b) DAT0115 (哺乳动物构建体)(SEQ ID NO 14)，(c) DAT0115 (优化的大肠杆菌(E. coli)构建 体)(SEQ ID NO 15)，(d) DAT0116 (哺乳动物构建体)(SEQ ID NO 16)，(e) DATOl 16 (优化 的大肠杆菌构建体)(SEQ ID NO 17)，(f) DAT0117 (哺乳动物构建体)(SEQ ID NO 18)，(g) DAT0117 (优化的大肠杆菌构建体)(SEQ ID NO 19)，(h) DAT0118 (哺乳动物构建体)(SEQ ID NO 20)，(i) DATOl 19 (哺乳动物构建体)(SEQID NO 21)，(j) DAT0120 (哺乳动物构建体) (SEQ ID NO 22)， (k)Dom7h_14(SEQ ID NO 23)。
图3 (a)图示小鼠肥胖症模型中给予DAT0115后体重呈剂量依赖性的减轻，(b) 图示小鼠肥胖症模型中给予DAT0115的每日摄食量。图 4 图示 DAT0115 的 DSC 实线-DAT0115 迹线，虚线-与非-2-态(non-2-state) 模型拟合。图5 图示溶菌酶的DSC 实线-溶菌酶迹线，虚线-与非-2-态模型拟合(迹线重 叠，因此无法观察到虚线迹线)。图 6 图示 DATOl 15 的 SEC MALLS0图 7 图示 DATOl 17 的 SEC MALLS0图 8 图示 DATO120 的 SEC MALLS0发明详述在本说明书中参照实施方案，以能够清楚明了地表达说明书的方式对本发明进行 了描述。预期并且应当理解的是，在不偏离本发明的情况下，可对实施方案进行各种合并或 分离。除非另有说明，否则本文使用的所有科技术语都具有本领域(例如细胞培养、分 子遗传学、核酸化学、杂交技术和生物化学)普通技术人员通常理解的含义。采用分子、遗 传和生化方法(一般参见 Sambrook 等，Molecular Cloning :A Laboratory Manual，第 2 版 (1989)Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N. Y.禾口Ausubel 等， Short Protocols in Molecular Biology (1999),第 4 版，John Wiley & Sons, Inc.均通 过引用结合到本文中)和化学方法的标准技术。本文使用的术语“促胰岛素药物”是指能够刺激激素胰岛素的合成或表达或者激 素胰岛素的活性，或者引起对激素胰岛素的合成或表达或者激素胰岛素的活性的刺激的化 合物。已知促胰岛素药物的实例包括但不限于例如葡萄糖、GIP、GLP、毒蜥外泌肽(例如毒 蜥外泌肽-4和毒蜥外泌肽-3)、PYY和0ΧΜ。本文使用的术语“肠降血糖素”是指当葡萄糖水平正常时，或者尤其当其升高时， 引起胰岛素的释放量增加的胃肠激素类型。举例来讲，它们包括GLP-1、GIP、0ΧΜ、PYY、VIP 和PP(胰多肽)。本文使用的术语“类似物”当涉及多肽时是指修饰肽，其中肽的一个或多个氨基酸 残基被其它氨基酸残基取代和/或其中一个或多个氨基酸残基从肽中缺失和/或其中所述 肽的一个或多个氨基酸残基缺失和/或其中一个或多个氨基酸残基添加到肽中。氨基酸残 基的这类添加或缺失可发生在肽的N端和/或肽的C端，或者它们可以在肽内。一个简单 体系用来描述GLP-I的类似物例如GLP-I A8G(7-37氨基酸)表示这样的GLP-I类似物 其中天然存在的位置8上的丙氨酸被甘氨酸残基取代。按照IUPAC-IUB命名法所采用的标 准氨基酸单字母缩写词描述肽类似物及其衍生物的化学式。本文使用的“片段”当提及多肽时，是指多肽具有与完整天然存在的多肽的氨基酸 序列的部分相同并非完全相同的氨基酸序列。片段可以是“独立的(free-standing) ”或包 含在较大的多肽内，它们在单一较大的多肽中作为一个连续区段构成一个部分或区域。举 例来说，天然存在的GLP-I的片段可以包括天然存在的氨基酸1-36中的氨基酸7-36。此 外，多肽的片段还可以是天然存在的部分序列的变体。例如，包含天然存在的GLP-I的氨基 酸7-30的GLP-I片段还可以是在其部分序列中具有氨基酸取代的变体。10
本发明合适的促胰岛素药物的实例包括GLP-1、GLP-I衍生物、GLP-I类似物或 GLP-I类似物的衍生物。此外，它们包括毒蜥外泌肽_4、毒蜥外泌肽-4类似物和毒蜥外泌 肽-4衍生物或片段及毒蜥外泌肽_3、毒蜥外泌肽-3衍生物和毒蜥外泌肽-3类似物。本文使用的术语“GLP-1 ” 是指 GLP-I (7-37)、GLP-I (7-36)、GLP-I (7-35)、 GLP-I (7-38)、GLP-I (7-39)、GLP-1 (7-40)、GLP-1 (7-41) ,GLP-I 类似物、GLP-1 肽、GLP-1 衍 生物或突变体或片段或GLP-I类似物的衍生物。这类肽、突变体、类似物和衍生物是促胰岛 素药物。例如GLP-I可以是GLP-I (7-37)A8G突变体，其氨基酸序列见图l(i) :SEQ ID NO 9。更多的GLP-1类似物参见国际专利申请号90/11296 (The General Hospital Corporation)，其涉及包含GLP-1 (7-36)及其功能衍生物的肽片段，具有的促胰岛素活性 超过GLP-I (1-36)或GLP-I (1-37)的促胰岛素活性，并且涉及其作为促胰岛素药物的用途 (通过引用结合到本文中，特别是通过药物的实例用于本发明)。国际专利申请号 WO 91/11457 (Buckley 等)公开了活性 GLP-1 肽 7-；34、7-35、7_36 和7-37的类似物，其还可用作本发明的GLP-I药物(通过引用结合到本文中，特别是通过 药物或药剂的实例用于本发明)。本文使用的术语“毒蜥外泌肽-4肽”是指毒蜥外泌肽-4 (1-39)、毒蜥外泌肽_4类 似物、毒蜥外泌肽-4肽的片段、毒蜥外泌肽-4衍生物或毒蜥外泌肽-4类似物的衍生物。 这类肽、片段、类似物和衍生物是促胰岛素药物。毒蜥外泌肽-4(1-39)的氨基酸序列见图 l(j) :SEQ ID NO 10。可用于本发明的更多的毒蜥外泌肽类似物参见PCT专利公布号WO 99/25728 (Beeley 等)、WO 99/25727 (Beeley 等)、WO 98/05351 (Young 等)、WO 99/40788 (Young 等)、WO 99/07404 (Beeley 等)和 WO 99/43708 (Knudsen 等)(均通过弓 | 用结合到本文中，特别是通过药物的实例用于本发明)。本文使用的“肽”是指约2-约50个氨基酸通过肽键连接在一起。本文使用的“多肽”是指至少约50个氨基酸通过肽键连接在一起。多肽一般包含 三级结构并折叠成为功能结构域。本文使用的“展示系统”是指其中根据所需特征(例如物理、化学或功能特征)易 于选择一批多肽或肽的系统。展示系统可以是合适的多肽库或肽库(例如在溶液中、固定 在合适的支持体上)。展示系统也可以是采用细胞表达系统(例如在转化、感染、转染或转 导细胞中表达核酸文库，并且在细胞表面展示编码多肽)或非细胞表达系统(例如乳液区 室化与展示)的系统。示例性的展示系统将核酸的编码功能与由所述核酸编码的多肽或肽 的物理、化学和/或功能特性联系起来。当采用这类展示系统时，可以选出具有所需要的 物理、化学和/或功能特性的多肽或肽，并且可容易地分离或回收编码选定多肽或肽的核 酸。将核酸的编码功能与多肽或肽的物理、化学和/或功能特性联系起来的多个展示系统 是本领域已知的，例如噬菌体展示(bacteriophage display/phage display，例如噬菌粒 展示)、核糖体展示、乳液区室化与展示、酵母展示、嘌罗霉素展示、细菌展示、质粒上展示、 共价展示等。(参见例如EP 0436597 (Dyax)、美国专利号6，172，197 (McCafferty等)、美国 专利号 6，489，103 (Griffiths 等))。11
本文使用的“功能(性)，，是指具有生物活性(例如特异性结合活性)的多肽或 肽。例如，术语“功能性多肽”包括通过抗体的抗原结合部位结合靶抗原的抗体或其抗原结 合片段。本文使用的“靶配体”是指被多肽或肽特异性或选择性结合的配体。例如，当多肽 为抗体或其抗原结合片段时，靶配体可以是任何所需要的抗原或表位。与靶抗原的结合取 决于具有功能性的多肽或肽。本文使用的抗体是指IgG, IgM, IgA, IgD或IgE或片段(例如Fab、F(ab，)2、Fv、 二硫键连接的Fv、SCFv、致密构象多特异性抗体、二硫键连接的scFv、双链抗体)，不论是来 源于任何物种天然产生的抗体，还是由重组DNA技术产生；不论是从血清、B细胞、杂交瘤、 转染瘤、酵母分离，还是从细菌分离。本文使用的“抗体形式(antibody format) ”是指任何合适的多肽结构，其中可 掺入一个或多个抗体可变结构域，从而赋予该结构对抗原的结合特异性。多种合适的抗体 形式是本领域已知的，例如嵌合抗体、人源化抗体、人抗体、单链抗体、双特异性抗体、抗体 重链、抗体轻链、抗体重链和/或轻链的同二聚体和异二聚体、前述任一种的抗原结合片段 (例如Fv片段(例如单链Fv(ScFv)、二硫键结合的Fv)、Fab片段、Fab'片段、F(ab' )2片 段)、单一抗体可变结构域(例如dAb、VH、VHH、Vl)以及前述任一种的修饰形式(例如通过 聚乙二醇共价连接的修饰或其它合适的多聚体或人源化Vhh)。表述“免疫球蛋白单一可变结构域”是指独立于其它V区或结构域而特异性结合 抗原或表位的抗体可变结构域(VH、VHH、VJ。免疫球蛋白单一可变结构域存在形式之一可以 具有其它可变区或可变结构域(例如同多聚体或杂多聚体)，其中所述其它区或结构域不 是单一免疫球蛋白可变结构域结合抗原所必需的(即免疫球蛋白单一可变结构域独立于 其它可变区结合抗原)。“结构域抗体”或“dAb”与本文使用的术语“免疫球蛋白单一可变 结构域”相同。“单一免疫球蛋白可变结构域”与本文使用的术语“免疫球蛋白单一可变结 构域”相同。“单一抗体可变结构域”与本文使用的术语“免疫球蛋白单一可变结构域”相 同。在一个实施方案中，免疫球蛋白单一可变结构域是人抗体可变结构域，但是还包括得自 其它物种的单一抗体可变结构域，例如啮齿动物(例如参见WO 00Λ9004，其内容通过整体 引用结合到本文中)、大斑猫鲨和驼类(Camelid) Vhh dAb。驼类Vra是免疫球蛋白单一可变 结构域多肽，得自包括骆驼、美洲驼、羊驼、单峰驼和栗色羊驼在内的物种，其产生天然缺乏 轻链的重链抗体。Vhh可以是人源化的。“结构域”是折叠的蛋白质结构，具有独立于蛋白质其余部分的三级结构。结构域 一般负责蛋白质的分立的功能性质，在许多情况下可以添加、剔除或转移到其它蛋白质上 而又不丧失蛋白质和/或结构域的其余部分的功能。“单一抗体可变结构域”是折叠的多肽 结构域，包含特有的抗体可变结构域序列。因此它包括整个抗体可变结构域和修饰可变结 构域，例如，其中一个或多个环被不是抗体可变结构域所特有的序列置换，或者被截短或包 含N端突出端或C端突出端的抗体可变结构域，以及可变结构域的折叠片段，其至少保持结 合活性和全长结构域的特异性。术语“文库”是指异源多肽或核酸的混合物。文库由多个成员组成，每个成员都具 有单一的多肽序列或核酸序列。就此而言，“文库”与“库”是同义的。文库成员之间的序列 差异负责文库中存在的多样性。文库可呈多肽或核酸的简单混合物的形式，或者可以呈用12核酸文库转化的生物体或细胞的形式，例如细菌、病毒、动物或植物细胞等。在一个实施方 案中，每个生物体或细胞只含有一个或有限数目的文库成员。在一个实施方案中，核酸被掺 入表达载体，以供由核酸编码的多肽的表达。因此，在一个方面，文库可以呈一群宿主生物 体的形式，每个生物体含有一个或多个拷贝的表达载体，所述载体含有文库的核酸形式的 一个成员，可被表达产生其相应的多肽成员。因此，宿主生物体群具有编码大量不同多肽库 的潜力。本文使用的术语“剂量”是指全部一次(单位剂量)或者在规定时间间隔内分两次 或更多次给予受治疗者的融合物或缀合物的量。例如，剂量可以是指在一天( 小时)(日 剂量)、2天、1周、2周、3周或者一个月或更多个月的进程中给予受治疗者的融合物或缀合 物的量(例如通过一次给药，或者通过两次或更多次给药)。剂量之间的间隔可以是任何需 要的时间量。表述“半寿期”是指例如由于天然机制引起的体内降解和/或清除或螯合所致，融 合物或缀合物的血清或血浆浓度降至50%的时间。本发明的融合物或缀合物在体内是稳 定的，且其半寿期通过与抵抗降解和/或清除或螯合的血清白蛋白分子(例如人血清白蛋 白(HSA))结合而延长。这些血清白蛋白分子是天然存在的蛋白质，其本身在体内的半寿期 长。对延长半寿期的分子非特异性的类似分子相比，如果某一分子的功能活性在体内持续 时间更长，则该分子的半寿期延长。例如，将包含对人血清白蛋白(HSA)有特异性的dAb和 肠降血糖素药物或促胰岛素药物(例如GLP-I或毒蜥外泌肽)的本发明的融合物或缀合物 与其中不存在对HSA的特异性(也就是不结合HSA但结合其它分子)的相同配体进行比较。 例如，它可能结合细胞上的第三靶标。本发明的融合物或缀合物的半寿期通常增加10%、 20%、30%、40%、50% 以上。半寿期延长&、31、乜、51、1(^、2(^、3(^、4(^、5(^是可能的。或 者，半寿期延长高达 30x、40x、50x、60x、70x、80x、90x、100x、150x 是可能的。本文使用的“流体动力学尺寸”是指基于分子通过水溶液扩散的分子(例如蛋白 质分子、配体)的表观尺寸。可对蛋白质通过溶液的扩散或运动进行处理来推导蛋白质的 表观尺寸，其中尺寸用蛋白质颗粒的“斯托克斯半径(Stokes radius)”或“液体动力学半 径”给出。蛋白质的“流体动力学尺寸”取决于质量和形状(构象)两者，使得具有相同分 子量的两种蛋白质可能根据蛋白质的总体构象而具有不同的流体动力学尺寸。两个序列之间“同源性”或“同一性”或“相似性”(有关术语在本文中互换使用) 的计算如下进行。对序列进行比对用于最佳比较目的(例如可以在第一和第二氨基酸或核 酸序列的一个或两个中引入空位用于最佳比对，出于比较目的可以忽略非同源序列)。在一 个实施方案中，出于比较目的比对的参比序列的长度是该参比序列长度的至少30%、或至 少40%、或至少50%、或至少60%、或至少70%、80%、90%、100%。然后对在相应氨基酸 位置或核苷酸位置上的氨基酸残基或核苷酸进行比较。如果第一序列中某一位置由第二序 列相应位置的相同氨基酸残基或核苷酸占据，则所述分子在该位置上是相同的(本文使用 的氨基酸或核酸“同源性”等同于氨基酸或核酸“同一性”)。考虑两个序列最佳比对需要引 入的空位的数目和各个空位的长度，两个序列之间的百分比同一性是所述序列共有的相同 位置数的函数。应用算法BLAST2SeqUences，采用默认参数，来准备并确定本文定义的氨基 酸和核苷酸序列比对和同源性、相似性或同一性(Tatusova，T.A.等，FEMSMicrobiol Lett, 174 :187-188(1999))。
核酸、宿主细胞本发明涉及编码本文所述的本发明的融合物(例如由SEQ ID NO 13_23编码的融 合物)的分离和/或重组核酸。本文所称的“分离(的)”核酸是与其原有环境中(例如在细胞中或在核酸的混合 物中，例如文库)的其它物质(例如其它核酸，例如基因组DNA、cDNA和/或RNA)分离的核 酸。分离核酸可以作为载体的组成部分(例如质粒)而被分离。
本文所称的“重组”核酸是通过重组DNA方法产生的核酸，包括依靠人工重组的方 法，例如采用限制性内切酶、同源重组、病毒等方法，例如克隆至载体或染色体中；以及采用 聚合酶链式反应(PCR)制备的核酸。本发明还涉及包含(一个或多个)重组核酸或表达构建体的重组宿主细胞，例如 哺乳动物或微生物，所述重组核酸或表达构建体包含编码本文所述的本发明的融合物的核 酸。本文还提供制备本文所述的本发明的融合物的方法，所述方法包括在适于表达融合物 多肽的条件下维持本发明的重组宿主细胞，例如哺乳动物或微生物。如有需要，所述方法可 另包括分离或回收融合物的步骤。例如，可以采用适于选定的宿主细胞的任何方法(例如转化、转染、电穿孔、感 染)，将编码本发明的融合物多肽的核酸分子(即一个或多个核酸分子)，或者包含这类核 酸分子的表达构建体(即一个或多个构建体)导入合适的宿主细胞中产生重组宿主细胞， 使得核酸分子与一个或多个表达控制元件有效连接(例如在载体中、在通过细胞内加工所 产生的构建体中、整合到宿主细胞基因组)。可以将所得到的重组宿主细胞维持在适于表达 的条件(例如在诱导物存在下、在合适的动物中、在补充了适当盐分、生长因子、抗生素、营 养补充剂等的合适培养基中)下，从而产生编码的肽或多肽。如有需要，可以分离或回收编 码的肽或多肽(例如从动物、宿主细胞、培养基、乳汁分离或回收)。该方法包括在转基因动 物的宿主细胞中表达(参见例如WO 92/03918，GenPharm International)。本文所述的本发明的融合物多肽还可以在合适的体外表达系统中产生，例如通过 化学合成或通过任何其它合适的方法。如本文所描述和举例说明的一样，本发明的融合物或缀合物一般以高亲和力结合 血清白蛋白。例如，本发明的融合物或缀合物可以约5微摩尔-约ΙΟΟρΜ，例如约1微摩尔-约 ΙΟΟρΜ，例如400-800nm，例如约600nm的亲和力(KD ；KD = Koff (kd) /Kon(ka)[通过表面等离 子共振测定)结合人血清白蛋白。本发明的融合物或缀合物可以在大肠杆菌中或在毕赤酵母(Pichia)菌种(例如 巴斯德毕赤酵母(P.pastoris))中表达。在一个实施方案中，当在大肠杆菌或毕赤酵母菌 种(例如巴斯德毕赤酵母)、或在哺乳动物细胞培养物中(例如CH0，或HEK 293细胞)表 达时，以至少约0. 5mg/L的量分泌融合物。虽然当本文所述的融合物或缀合物在大肠杆菌 或毕赤酵母菌种或哺乳动物细胞中表达时是可分泌的，但是它们可采用任何合适的方法制 备，例如合成化学方法或不使用大肠杆菌或毕赤酵母菌种的生物生产方法。在某些实施方案中，本发明的融合物和缀合物当给予有效量时，在动物模型中是 有效的，例如WO 2006/059106中披露的动物模型(例如公布的WO 2006/059106第104-105 页)或本文实施例中描述的动物模型。有效量一般为约0. OOOlmg/kg-约10mg/kg(例如约140. OOlmg/kg-约 10mg/kg、例如约 0. OOlmg/kg-约 lmg/kg、例如约 0. Olmg/kg-约 lmg/kg、例 如约0. Olmg/kg-约0. lmg/kg)。疾病模型是本领域技术人员公认的，用于预测在人体中的 治疗功效。一般来讲，本发明的融合物和缀合物可以纯的形式与药学上或生理学上合适的 载体一起使用。这些载体通常可包括任何包括盐水和/或缓冲介质在内的水溶液或含 醇/水溶液、乳液或悬浮液。胃肠外溶媒可包括氯化钠溶液、林格氏葡萄糖(Ringer' s dextrose)、葡萄糖和氯化钠及乳酸盐化林格氏液。如果需要将多肽复合物保持在悬浮液 中，则可从羧甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、明胶和藻酸盐等增稠剂选择合适的生理学上可 接受的辅助剂。静脉用溶媒包括液体及营养补充物和电解质补充物，例如林格氏葡萄糖型补 充物。还可存在防腐剂和其它添加剂，例如抗微生物剂、抗氧化剂、螯合剂和惰性气体 (Mack(1982)Remington' s Pharmaceutical Sciences，第 16 版)。可以使用多种合适的 剂型，包括缓释剂型。本发明的药物组合物的给药途径可以是本领域普通技术人员通常已知的任何给 药途径。对于疗法，可以根据标准技术，给予任何患者本发明的药物融合物或缀合物。可以通过任何合适的方式给药，包括胃肠外、静脉内、肌内、腹膜内、口服、经皮、经 由肺途径，或者适当时，用导管直接输注。剂量和给药频率将取决于患者的年龄、性别和健 康状况、同时给予的其它药物、禁忌症和临床工作人员要考虑的其它参数。根据适应情况， 给药可以是局部性的或是全身性的。在一个实施方案中，本发明提供用于递送至肺部的经肺剂型，其包含(a)本发明 的缀合物和融合物，和(b)药学上可接受的缓冲剂，且其中所述组合物包含液滴，且组合 物中存在约40%以上(例如50%以上)的液滴，其大小范围为小于约6微米，例如约1微 米-约6微米，例如小于约5微米，例如约1-约5微米。例如这些组合物尤其适于通过直 接性局部经肺递送而给予受治疗者。例如，这些组合物可以直接给予肺部，例如通过吸入 法，例如通过使用喷雾器装置。经肺递送的这些组合物可包含生理学上可接受的缓冲液， 其PH范围介于约4-约8之间，例如约7-约7. 5，且粘度约等于含有1. 2% (w/v)蔗糖的约 2% -约10% PEG 1000的50mM磷酸缓冲液的溶液粘度。可将本发明的融合物或缀合物冻干以贮存，并且在临用前用合适的载体复溶。已 经证实该技术对于常规免疫球蛋白是有效的，可以采用现有技术已知的冻干和复溶技术。 本领域技术人员应当了解的是，冻干和复溶可能导致抗体活性不同程度的损失(例如对于 常规免疫球蛋白，比起IgG抗体，IgM抗体的活性损失往往较大)，必需调节升高使用水平予 以弥补。对于预防运用，例如当给予患有前驱糖尿病或胰岛素抵抗的个体时，还可以相似 或略为较低的剂量给予含有本发明的融合物或缀合物的组合物来预防、抑制或延迟疾病的 发生(例如保持缓解或静止，或防止急性期)。临床技术人员将能够确定治疗、抑制或防止 疾病的适当的给药间隔。当给予本发明的融合物或缀合物治疗、抑制或防止疾病时，可以给 予多达每天四次、每周两次、每周一次、每两周一次、一月一次或每两月一次，剂量为例如约 0. 000lmg/kg-约 10mg/kg(例如约 0. OOlmg/kg-约 10mg/kg、例如约 0. OOlmg/kg-约 Img/ kg、例如约 0. 01mg/kg-约 lmg/kg、例如约 0. 01mg/kg-约 0. lmg/kg)。15
与治疗前的这类症状相比，或者与未用这类组合物或其它适当对照治疗的个体 (人或模型动物)的这类症状相比，如果一种或多种症状减轻(例如达至少10%或临床评 价量表中的至少一分)，则使用本文所述组合物进行的治疗或疗法被视为“有效”。症状显 然将随所靶定的疾病或病症的确切性质而改变，但是普通临床工作人员或技术人员仍可测定。同样，与未用组合物治疗的相似个体(人或动物模型)的这类症状相比，如果一种 或多种症状的发生或严重程度延迟、减轻或消除，则使用本文所述组合物进行的预防是“有 效的”。本发明的融合物和缀合物可以作为单独给予的组合物使用，或者可与其它治疗剂 或活性剂(例如其它多肽或肽或小分子)联用。这些其它的药剂可包括各种药物，例如二 甲双胍、胰岛素、格列酮类(例如罗格列酮(rosaglitazone))、免疫抑制剂、免疫刺激剂。本发明的融合物和缀合物与一种或多种其它治疗剂/活性剂一起给予和/或配制 在一起。当本发明的融合物或缀合物与其它治疗剂一起给予时，融合物或缀合物可在其它 治疗剂给药之前、同时、一起或之后给予。本发明的融合物或缀合物和其它治疗剂一般以提 供重叠的治疗效果的方式给予。半寿期延长促胰岛素药物或肠降血糖素药物(例如GLP-I或毒蜥外泌肽配体)的半寿期 对于体内应用是有益的。本发明通过提供体内半寿期延长的促胰岛素药物或肠降血糖素药 物(例如GLP和毒蜥外泌肽)并且这些分子的功能活性因此在机体内有较长的持续时间， 从而解决了这个问题。如本文所述，与单独的促胰岛素药物或肠降血糖素药物相比，本发明的组合物 (即包含本文所述的融合物或缀合物)可显著地延长体内血清或血浆半寿期和/或增加 AUC和/或延长平均驻留时间(MRT)。另外，促胰岛素药物或肠降血糖素药物的活性在本发 明的组合物(例如缀合物或融合物)中一般来说基本上不改变。然而，本发明组合物的活 性与单独的促胰岛素药物或肠降血糖素药物相比的某些改变是可接受的，并且一般通过改 进本发明的缀合物或融合物的药代动力学性质而得到弥补。例如，本发明的药物缀合物或 融合物以比单独的药物低的亲和力结合药物靶，但是由于药物组合物的药代动力学性质得 到改进(例如延长的体内血清半寿期、较大的AUC)，因此与单独的药物相比时，具有大致相 等或较好的功效。另外，由于本发明的缀合物或融合物的半寿期延长，与单独的促胰岛素药 物或肠降血糖素药物相比，它们可以较低频率给药，例如将它们以一月一次或一周一次给 予患者，并且与仅给予促胰岛素药物或肠降血糖素药物相比，它们还在血液中保持较恒定 的促胰岛素药物或肠降血糖素药物水平，从而达到所需要的治疗或预防效果。药代动力学分析和配体半寿期测定方法为本领域技术人员所熟知。有关详 情可参见 Kenneth, A 等Chemical Stability of Pharmaceuticals :A Handbook for Pharmacists 禾口 Peters 等，Pharmacokinetc analysis :A Practical Approach(1996)。还 可参照"Pharmacokinetics，，，M Gibaldi 禾口 D Perron, Marcel Dekker 出版，第 2 版，前版本 修订版(1982)，其中披露了药代动力学参数，例如t α和ti3半寿期及曲线下面积(AUC)。半寿期(tl/2a和tl/2i3)及AUC和MRT可以从配体的血浆或血清浓度相对于时 间的曲线确定。可以运用WinNonlin分析包(可获自Pharsight Corp.，Mountain View,CN 102046207 A说明书13/25页 CA94040，USA)，例如制作曲线模型。在第一期(α期)，配体主要在患者体内进行分布，其 中一些排除。第二期(β期)是末期，此时配体已经完成分布，并且血清浓度随配体从患者 体内清除而下降。ta半寿期是第一期的半寿期，ti3半寿期是第二期的半寿期。此外，还 可应用本领域众所周知的非区室拟合模型来测定半寿期。在一个实施方案中，本发明提供清除半寿期(例如在人体内)的范围约12小时以 上、例如约12小时-约21天、例如约M小时-约21天、例如约2-8天、例如约3-4天的本 发明的融合物或缀合物。还可将本发明的融合物或缀合物进一步设计或格式化成具有较大的流体动力学 尺寸，例如通过与PEG基团、血清白蛋白、运铁蛋白、运铁蛋白受体或至少其运铁蛋白结合 部分、抗体Fc区连接，或者通过与抗体结构域缀合。流体动力学尺寸可采用本领域众所周知的方法测定。例如，凝胶过滤层析法可以 用来测定配体的流体动力学尺寸。用于测定配体的流体动力学尺寸的合适的凝胶过滤基质 (例如交联琼脂糖基质)是众所周知且易获得的。本发明的组合物，即包含本文所述的融合物和缀合物的组合物，提供若干进一步 的优势。结构域抗体组分是非常稳定的，较抗体和抗体的其它抗原结合片段小，通过在大肠 杆菌或酵母(例如巴斯德毕赤酵母)中表达可以高收率产生，且结合血清白蛋白的抗体的 抗原结合片段可容易地从来源于人的文库或从任何理想的物种中选择。因此，与一般在哺 乳动物细胞(例如人、人源化或嵌合抗体)中产生的治疗剂相比，包含结合血清白蛋白的 dAb的本发明的组合物可更容易地产生，并且可以使用无免疫原性的dAb (例如人dAb可用 于治疗或诊断人的疾病)。当促胰岛素药物或肠降血糖素药物是含有dAb结合血清白蛋白的药物组合物的 组成部分时，促胰岛素药物或肠降血糖素药物的免疫原性可降低。因此，本发明提供融合 物或缀合物组合物，其可具有较少免疫原性(与例如单独的促胰岛素药物或肠降血糖素相 比)或在含有结合血清白蛋白的dAb的药物组合物的情况下可基本上无免疫原性。因此， 可以随时间推移重复给予受治疗者这类组合物，同时由受治疗者免疫系统产生的抗药抗体 所致的功效损失最小。另外，与单独的促胰岛素药物或肠降血糖素相比，本文所述缀合物或融合物组合 物的安全特性可能提高，副作用降低。例如，由于dAb的血清白蛋白结合活性所致，本发明 的融合物和缀合物在血管循环中的停留时间延长。另外，本发明的融合物和缀合物在全身 给药(例如血管内给药)后，基本上不能够穿越血脑屏障并在中枢神经系统中蓄积。因此， 与单独的促胰岛素药物或肠降血糖素药物相比，给予本发明的融合物或缀合物具有较大安 全性且副作用降低。同样，与单独的所述药物相比，融合物或缀合物对特定器官(例如肾或 肝)的毒性降低。实施例实施例1 :GLP-1 (A8G)或毒蜥外泌肽_4和D0M^-14 AlbudAb的遗传融合物的表 达将在位置8的丙氨酸被甘氨酸置换的毒蜥外泌肽-4或GLP-I (7-37) ([Gly8] GLP-1)作为与D0M^!-14(—种结合血清白蛋白的结构域抗体(dAb) (albudab)，其氨基酸序 列见下文)的融合物克隆至PTT-5载体(可获自CNRC，Canada)中。在每种情况下，GLP-I或17毒蜥外泌肽-4位于构建体的5’端，dAb位于3’端。用图I(A-G)中所示氨基酸序列制备了 总共 7 个构建体(DAT0114、DAT0115、DAT0116、DAT0117、DAT0118、DAT0119、DAT0120)。不存 在接头、或者存在gly-ser接头(G4S)或螺旋接头(Arai,R.，H』eda等(2001)。“ Design of the linkers which effectively separate domains of a bifunctional fusion protein(设计有效分离双功能融合蛋白的结构域的接头)."Protein Eng 14(8) 529-32. 456)或有由在GLP-I或毒蜥外泌肽_4和dAb之间的第二 GLP-I部分组成的接头。所 包括的接头作为间隔基，将GLP-I或毒蜥外泌肽-4在空间上与dAb分隔开以防止在GLP-I 或毒蜥外泌肽-4与GLP-I受体之间的结合出现位阻现象。构建体的序列见图1 (A-G)。采用碱性裂解在大肠杆菌中制备无内毒素的DNA(使用无内毒素的质粒Giga试剂 盒，可获自Qiagen CA)，并用来转染HEK293E细胞(可获自CNRC，Canada)。使用每培养瓶 333 μ 1 293fectin (Invotrogen)和 250 μ g DNA,以 1. 75xl06 个细胞 /ml，转染至 250ml/ 培 养瓶的HEK293E细胞中，并且于30°C表达5天。离心收获上清液后，通过亲和纯化法在蛋白 质L上进行纯化。蛋白质成批与装填在柱中的树脂结合，用10柱体积的PBS洗涤。蛋白质 用50ml 0. IM甘氨酸(pH 2)洗脱，用Tris (pH 8)中和。用SDS-PAGE凝胶鉴定预期大小的 蛋白质，大小见下表1。表1 :DAT0114、DAT0115、DAT0116、DAT0117、DAT0118、DAT0119、DAT0120 构建体的分子量融合蛋白预期分子量DATOl1418256DATOl1516896DATOl1615950DAT011719798DAT011815936DAT011915318DATO12018895实施例2 表示结合血清白蛋白的GLP-I和毒蜥外泌肽_4 AlbudAb融合物通过表面等离子共振(Biacore AB，可获自GE Healthcare)对GLP-1和毒蜥外泌 肽-4 AlbudAb融合物进行了分析，获得有关亲和力的信息。使用用血清白蛋白包被的CM5 Biacore芯片(羧甲基化葡聚糖基质)进行了分析。将约1000共振单位(resonance unit, RU)的每种待测血清白蛋白(人、大鼠和小鼠血清白蛋白)在乙酸缓冲液(PH 5.5)中固 定。Biocore AB的流动吸收池1是未包被、封闭的阴性对照，流动吸收池2用人血清白蛋白18(HSA) (815RU)包被，流动吸收池3用大鼠血清白蛋白(RSA) (826RU)包被，流动吸收池4用 小鼠血清白蛋白(MSA) (938RU)包被。使各种受测融合物分子在如上述实施例中所述的哺 乳动物组织培养物中表达。通过稀释至BIACORE HBS-EP 缓冲液(0. OlM HEPES(pH 7. 4)、0· 15M NaCl、3mM EDTA、0.005(%表面活性剂P20)并且流经BIACORE芯片来制备各种浓度的融合物分子(以 16ηΜ-2μΜ 的范围)。将结合速率和解离速率曲线拟合至KD区域中由dAb的浓度所产生的迹线，由 BIACORE迹线计算亲和力(KD)。将亲和力(KD)概括于下表2中表2 与人、大鼠和小鼠血清白蛋白结合的GLP-I和毒蜥外泌肽_4AlbudAb
权利要求
1.一种融合物或缀合物组合物，其包含以下成分或由以下成分组成(a)促胰岛素药 物或肠降血糖素药物，其作为与(b)的融合物或缀合物存在，(b)DOM 7h-14结构域抗体 (dAb)，其结合血清白蛋白并且其氨基酸序列如图1(h) (SEQ ID NO 8)中所示。
2.权利要求1的融合物或缀合物，其中所述药物是毒蜥外泌肽-4或GLP-I分子。
3.权利要求1或2的融合物或缀合物，其中所述药物选自(a)GLP-l(7-37)A8G突变型， 其氨基酸序列如图l(i) (SEQ ID NO 9)所示，或(b)毒蜥外泌肽_4分子，其氨基酸序列如 图 l(j) (SEQ ID NO 10)所示。
4.前述权利要求中任一项的融合物或缀合物，其包含连接所述药物和dAb的氨基酸接 头或化学接头。
5.权利要求4的融合物或缀合物，其中所述氨基酸接头是具有图l(k)(SEQ ID NO 11) 所示氨基酸序列的螺旋接头，或具有图1(1) (SEQID NO 12)所示氨基酸序列的gly-ser接 头。
6.前述权利要求中任一项的融合物，其中所述促胰岛素药物或肠降血糖素药物作为融 合物的组成部分存在于dAb的N端或C端。
7.权利要求6的融合物，所述融合物包含选自以下的氨基酸序列或由选自以下的氨基 酸序列组成(a)2xGLP-l A8G D0M7h_14 融合物(DAT0114) HGEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRHGEGTFTSDVSSYLEGQ AAKEFIAWLVKGRDIQMTQSPSSLSASVGDRVTTTCRASQWIGSQLS WYQQKPGKAPKLLIMWRSSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPED FATYYCAQGAALPRTFGQGTKVEIKR(SEQ ID NO 1)(b)毒蜥外泌肽4、(G4S)3接头、DOM^i-14融合物(DAT0115) HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPSGGGGGSGG GGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQffIGSQLSffYQQK PGKAPKLLIMWRSSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYY CAQGAALPRTFGQGTKVEIKR (SEQ ID NO 2)(c)毒蜥外泌肽4D0M^i-14融合物(DAT0116) HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPSGDIQMTQSP SSLSASV⑶RVTITCRASQWIGSQLSWYQQKPGKAPKLLIMWRSSLQ SGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCAQGAALPRTFGQGTK VEIKR(SEQ ID NO 3)(d)毒蜥外泌肽4、螺旋接头、DOM^i-14融合物(DAT0117) HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPSGKEAAAKE AAAKEAAAKELAAKEAAAKEAAAKEAAAKELAADIQMTQSPSSLS ASV⑶RVTITCRASQWIGSQLSWYQQKPGKAPKLLIMWRSSLQSGV PSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCAQGAALPRTFGQGTKVEI KR(SEQ ID NO 4)(e)GLP-I A8G、(G4S) 3 接头、D0M7h_14 融合物(DAT0118) HGEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRGGGGSGGGGSGGGGSD IQMTQSPSSLSASV⑶RVTITCRASQWIGSQLSWYQQKPGKAPKLLI MWRSSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCAQGAALPR TFGQGTKVEIKR(SEQ ID NO 5)(f)GLP-I A8G、PSS 接头、D0M7h-14 融合物(DAT0119) HGEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRGPSSDIQMTQSPSSLSAS V⑶RVTITCRASQWIGSQLSWYQQKPGKAPKLLIMWRSSLQSGVPSR FSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFSTYYCAQGAALPRTFGQGTKVEIKR (SEQ ID NO 6)(g)GLP-I A8G、螺旋接头、D0M7h-14 融合物(DAT0120) HGEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAffLVKGRGKEAAAKEAAAKEAA AKELAAKEAAAKEAAAKEAAAKELAADIQMTQSPSSLSASVGDRVT ITCRASQWIGSQLSWYQQKPGKAPKLLIMWRSSLQSGVPSRFSGSGS GTDFTLTISSLQPEDFATYYCAQGAALPRTFGQGTKVEIKR(SEQ ID NO 7)。
8.前述权利要求中任一项的融合物或缀合物，其中所述dAb进一步格式化以增加其流 体动力学大小，所述格式化的方法为将选自以下的分子与所述dAb连接PEG基团、血清白 蛋白、运铁蛋白、运铁蛋白受体或至少其运铁蛋白结合部分、抗体Fc区；或者将抗体结构域 缀合到所述dAb。
9.前述权利要求中任一项的融合物或缀合物，其包含进一步的肽或多肽部分。
10.前述权利要求中任一项的融合物或缀合物，其包含具有与Dom7h-14dAb相同或不 同的结合特异性的另外的dAb部分。
11.前述权利要求中任一项的融合物或缀合物，其在人体内的清除半寿期为12小时以 上，例如12-21天。
12.前述权利要求中任一项的融合物或缀合物，其与人血清白蛋白结合的KD范围为约 5微摩尔-约1微微摩尔。
13.一种药物组合物，所述药物组合物包含前述权利要求中任一项的融合物或缀合物 以及药学上或生理上可接受的载体、赋形剂或稀释剂。
14.权利要求13的药物组合物，所述药物组合物包含其它治疗剂/活性剂。
15.一种组合物，所述组合物包含(a)权利要求1-12中任一项的融合物或缀合物，和 (b)其它治疗剂/活性剂，其用于单独、序贯或同时给予受治疗者。
16.用于治疗或预防代谢疾病和紊乱的前述权利要求中任一项的组合物。
17.权利要求16的组合物，其中所述疾病和紊乱选自高血糖症、葡萄糖耐量减低、β 细胞缺乏症、糖尿病(I型或II型糖尿病或妊娠糖尿病)、肥胖症、以过食为特征的疾病。
18.权利要求1-15中任一项的组合物在制备治疗或预防代谢疾病和紊乱的药物中的 用途。
19.权利要求1-15中任一项的组合物在制备用于通过皮下、静脉内或肌内注射递送给受治疗者的药物中的用途。
20.权利要求1-15中任一项的组合物在制备用于胃肠外、口服、直肠、经黏膜、眼、肺或 胃肠道递送的药物中的用途。
21.一种用于治疗或预防代谢疾病的方法，所述方法包括给予患者治疗或预防有效量 的权利要求1-15中任一项的组合物。
22.—种口服剂型、注射剂型、吸入剂型或喷雾剂型，所述剂型包含权利要求1-15中任 一项的组合物。
23.一种缓释剂型，例如栓剂形式的缓释剂型，所述缓释剂型包含权利要求1-15中任 一项的组合物。
24.—种冻干剂型，所述冻干剂型包含权利要求1-15中任一项的组合物。
25.一种递药装置，所述递药装置装有权利要求1-15中任一项的组合物。
26.一种分离或重组核酸，所述核酸编码权利要求1-7中任一种融合物。
27.一种核酸，所述核酸编码权利要求7的融合物。
28.—种载体，所述载体包含权利要求沈或27的核酸。
29.一种宿主细胞，所述宿主细胞包含权利要求沈或27的核酸或者权利要求观的载体。
30.一种产生融合多肽的方法，所述多肽包含以下成分或由以下成分组成(a)促胰岛 素药物或肠降血糖素药物，作为与(b)的融合物存在，(b)DOM 7h-14结构域抗体(dAb)，其 结合血清白蛋白并且具有图1(h)所示氨基酸序列，所述方法包括在适于所述核酸或载体 表达的条件下培养权利要求四的宿主细胞，从而产生融合多肽。
31.一种治疗或预防患者例如病人的血液葡萄糖升高相关疾病或病症的方法，所述方 法包括给予所述患者治疗或预防有效量的权利要求1-15中任一项的组合物。
32.—种刺激患者例如病人的胰岛素产生和/或增加胰岛素敏感性的方法，所述方法 包括给予所述患者至少一剂权利要求1-15中任一项的组合物。b
全文摘要
本发明涉及血清半寿期改进的药物融合物。这样的融合物和缀合物包含多肽、免疫球蛋白(抗体)单一可变结构域及GLP和/或毒蜥外泌肽分子。本发明还涉及包含这类药物融合物和缀合物的用途、制剂、组合物和装置。
文档编号C07K16/46GK102046207SQ200980121191
公开日2011年5月4日 申请日期2009年3月27日 优先权日2008年3月31日
发明者C·赫林, L·J·霍尔特, L·耶斯佩斯 申请人:葛兰素集团有限公司