专利名称：免疫球蛋白纯化的制作方法
免疫球蛋白纯化本发明属于多肽纯化领域。其报道了通过从杂质中，尤其是从聚集形式的免疫球蛋白中以及从免疫球蛋白片段中，分离溶液中的免疫球蛋白来提供单体形式的免疫球蛋白的方法。
背景技术：
在当今的医学业界，蛋白质且特别是免疫球蛋白发挥了重要的作用。对于人类应用，每一治疗蛋白质都必须符合独特的标准。为了确保用于人类的生物药剂的安全性，必须特别地将可能造成伤害的核酸、病毒和宿主细胞蛋白质除去。为了符合质量管理规格标准 (regulatory specif ication)，必须在发酵工艺后进行一步或多步的纯化。此外，纯度、生产率和产量在确定合适的纯化方法中起着重要的作用。已经充分建立了不同的方法并广泛地用于蛋白质纯化，例如用微生物蛋白质的亲和层析(例如，A蛋白或G蛋白亲和层析)、离子交换层析(例如，阳离子交换的(磺丙基或羧甲基树脂)、阴离子交换的(氨乙基树脂)和混合模式的离子交换)、亲硫吸附(例如，用 β -巯基乙醇和其他SH配体)、疏水相互作用或芳族吸附层析(例如，用苯基琼脂糖凝胶、 亲杂氮芳基树脂(aza-arenophilic resin)或间氨基苯硼酸)、金属螯合亲和层析(例如， 用镍(II)-和铜(II)-亲和材料)、大小排阻层析和电泳方法(例如凝胶电泳、毛细管电泳) (参见例如 Vijayalakshmi, Μ. A.，Appl. Biochem. Biotech. 75 (1988) 93—102)。Necina, R，等人(Biotechnol. Bioeng. 60 (1998) 689-698)报道了通过显示出高电荷密度的离子交换介质，直接从细胞培养上清液中捕获人单克隆抗体。在WO 89/05157 中，报道了通过直接将细胞培养基进行阳离子交换处理来纯化产物免疫球蛋白的方法。 Danielsson, A.，等人，J. Immunol. Meth. 115 (1998)，79-88 描述了从小鼠腹水中一步纯化单克隆IgG抗体。Mhatre, R.，等人，J. Chrom. A 707 (1995) 225-231，开发了通过阳离子交换层析和PH梯度洗脱来纯化抗体Fab片段。WO 94/00561报道了人单克隆抗猕猴抗体和产生该抗体的细胞系。在WO 2004/024866中报道了通过离子交换层析纯化多肽的方法，其中使用梯度洗涤将目的多肽从一种或多种污染物中分离。khwarz，Α.，等人，Laborpraxis 21 (1997) 62-66，报道了用CM-HyperD柱纯化单克隆抗体。WO 2004/076485报道了通过A蛋白和离子交换层析的抗体纯化方法。在EP 0 530 447中，报道了通过组合3步层析步骤来纯化IgG单克隆抗体的方法。在US 4，983，722中报道了从抗体制备物中去除A蛋白。重组单克隆抗体工艺通常使用阴离子交换层析以结合痕量水平的杂质和潜在的污染物例如DNA、宿主细胞蛋白质和病毒，同时允许抗体流通(flow through) (Knudsen, H. L.，等人，J. Chrom. A 907 (2001) 145-154)。WO 95/16037报道了通过A蛋白和阳离子交换层析进行的从杂种杂交瘤中纯化抗 EGF-R/抗⑶3双特异性单克隆抗体。在EP 1 084 136中报道了通过使用离子交换层析从其多聚体中分离抗体单体。US 5，429，746涉及应用疏水相互作用层析组合层析来纯化抗体分子蛋白质。在US 4，604，208中报道了用于过滤流体，特别是受到带电粒子污染的肠胃外液体或生物液体的阴离子修饰的微孔膜。WO 03/040166报道了设计用于去除在含蛋白质的流体中的痕量杂质的膜和设备。回收多肽的方法报道于US 6，716,598中。在US 2006/0194953中，报道了用于从通过A蛋白亲和层析纯化的抗体中选择性去除泄露的(Ieaked)A蛋白质的方法。在 WO 99/6四36中报道了通过使用离子交换层析从聚集体中分离蛋白质单体。Lynch，P.和 Londo, T.，Gen. Eng. News 11(1997) 17，报道了用于从亲和纯化的治疗级抗体中去除聚集物的系统。Jiskoot, W.等人，J. Immunol. Meth. 124 (1989) 143-156报道了意图用于在人中治疗性应用的鼠单克隆抗体的两步纯化。发明概述本发明包含免疫球蛋白纯化领域方面。已经发现，下述阴离子交换层析步骤必须在从例如PH7. 8至PH8. 8的窄pH值范围中进行，所述步骤是其中可以从以流通模式的阴离子交换材料中获得单体形式的免疫球蛋白。令人惊奇地，较小的偏离该PH值范围，例如，至 PH7.0或pH9.0，都将消除该效果。用根据本发明的方法可以从聚集形式的免疫球蛋白和从免疫球蛋白片段中一步分离单体形式的免疫球蛋白。一个方面是用于获得单体形式的免疫球蛋白的方法，其中该方法包括以下步骤将包含单体形式和聚合形式的免疫球蛋白和/或免疫球蛋白片段的缓冲水溶液应用于阴离子交换层析材料，由此，从流通液或阴离子交换层析材料的上清液中回收去除了免疫球蛋白聚集物和免疫球蛋白片段的免疫球蛋白，其中缓冲水溶液具有从PH7. 8至pH8. 8的pH值，并由此获得单体形式的免疫球蛋白。在一个实施方案中，缓冲水溶液具有从PH8. O至pH8. 5的pH 值。在另一实施方案中，阴离子交换层析材料是膜阴离子交换层析材料。在另一个实施方案中，该阴离子交换层析材料是强阴离子交换层析材料。在另一个实施方案中，该强阴离子交换层析材料是Q-sepharose ,即与式 r-o-ch2chohch2och2chohch2n+ (CH3)3 的季铵基团共价结合的交联的琼脂糖基质(R)。仍在另一实施方案中，该方法包括作为第一步骤的额外的A蛋白层析步骤或额外的HCIC层析步骤或额外的离子交换层析步骤。发明详述术语“离子交换材料”或其语法等同形式表示携带共价结合的带电取代基的固定基质。对于整体电中性，无共价结合的反荷离子通过离子相互作用与带电取代基结合。“离子交换材料”具有将其非共价结合的反荷离子交换成类似的带电结合配偶体或者环境溶液的离子的能力。取决于其可交换的反荷离子的电荷，将“离子交换材料”称为“阳离子交换材料”或称为“阴离子交换材料”。取决于带电基团(取代基)的性质，例如在阳离子交换材料的情况下，将“离子交换材料”称为磺酸或磺丙基树脂( 或者称为羧甲基树脂(CM)。 取决于带电基团/取代基的化学性质，可以将“离子交换材料”另外地分类为强或弱离子交换材料，取决于共价结合的带电取代基的强度。例如，强阳离子交换材料具有磺酸基团，优选地磺丙基基团，作为带电取代基，弱阳离子交换材料具有羧酸基团，优选地羧甲基基团， 作为带电取代基。强阴离子交换材料具有季铵基团，并且弱阴离子交换材料具有二乙氨乙基基团作为带电取代基。术语“膜”表示微孔膜或大孔膜二者。膜自身由聚合材料组成，所述聚合材料例如， 如聚乙烯、聚丙烯、乙烯乙酸乙烯酯共聚物、聚四氟乙烯、聚碳酸酯、聚氯乙烯、聚酰胺(尼龙，例如Zetapore 、N66Po si dyne )、聚酯、醋酸纤维素、再生纤维素、纤维素复合物、聚砜、聚醚砜、聚芳砜、聚苯砜、聚丙烯腈、聚偏二氟乙烯、非织造的和织造的织物(例如Tyvek )、纤维质材料或无机材料例如沸石(zeolithe)、SiO2, A1203、TiO2或羟基磷灰石。离子交换材料可以在不同的名称下从多个公司得到，例如阳离子交换树脂 Bio-Rex (例如 70 型)、Chelex (例如 ιοο 型)、Macro-Prep (例如 cm 型、 High S、25S)、AG (例如 50W 型、MP)都可以从 BioRad Laboratories 得到、WCX 2 可以从Ciphergen得到、Dowex MAC-3可以从Dow化学公司得到、Cellulose CM (例如 23 型、52 型)、hyper-D、partisphere 可以从 Whatman pic.得到、Amberlite IRC(例如 76 型、747 型、748 型)、Amberlite GT 73、Toyopearl (例如 SP 型、cm 型、650M 型)都可以从 Tosoh Bioscience GmbH 得到、CM 1500 和 CM 3000 可以从 BioChrom Labs 得到、SP-S印harose 、CM-Sepharose 可以从 GE Healthcare 得到、Poros 树脂可以从 PerSeptive Biosystems 得到、Asahipak ES (例如 502C 型)、CXpak P、IEC CM(例如 825 型、2825 型、5025 型、LG 型)、IEC SP (例如 420N 型、825 型)、IEC QA (例如 LG 型、825 型) 可以从Shoko America有限公司得到、50W阳离子交换树脂可以从Eichrom Technologies 有限公司得到，并且例如阴离子交换树脂样Dowex ι可以从Dow化学公司得到、AG (例如 ι 型、2 型、4 型)、Bio-Rex 5、deae Bio-Gel ι、Macro-Prep deae 都可以从BioRad Laboratories得到、阴离子交换树脂1型可以从Eichrom Technologies有限公司得到、Source Q、ANX Sepharose 4、deae Sepharose (例如 CL-6B 型、ff 型)、 Q Sepharose 、Capto Q 、Capto S 都可以从 GE Healthcare 得到、AX-300 可以从 PerkinElmer 得到、Asahipak ES-502C、AXpak WA(例如 624 型、G 型)、IEC DEAE 都可以从 Shoko Ameri ca 有限公司得到、Amberlite IRA-96、Toyopearl DEAE、TSKge 1 DEAE 都可以从德国的iTosoh Bioscience GmbH得到。膜离子交换材料可以从不同的公司得到，例如膜阳离子交换材料Mustang C和Mustang S可以从I^all公司得到、Sartobind CM、 Sartobind S可以从Sartorius得到，并且阴离子交换膜例如Mustang Q可以从I^all公司得到、Sartobind Q可以从Sartorius得到。在膜离子交换材料中，结合位点存在于流通孔壁而不是隐藏在扩散孔内，这允许物质通过对流而不是扩散来进行转移。在一个实施方案中，额外的层析步骤是应用膜阳离子交换材料的阳离子交换层析步骤，所述膜阳离子交换材料选自 Sartobind CM 或 Sartobind S 或者 Mustang S 或 Mustang C。在另一实施方案中，阴离子交换材料是Q型膜阴离子交换材料或Q-型阴离子交换柱。“多肽”是通过肽键结合的氨基酸残基的多聚体，无论其是天然还是合成产生的。 少于约20个氨基酸残基的多肽称为“肽”。“蛋白质”是包含一个或多个多肽链或者至少一个多于100个氨基酸残基的多肽链的大分子。蛋白质也可以包含非肽组分，例如糖类基团。通过产生该蛋白质的细胞，可以将糖类和其他非肽取代基加入到蛋白质中，并且所述糖类和其他非肽取代基随着细胞类型的变化而变化。在本文中，根据蛋白质的氨基酸骨架结构定义蛋白质；一般并不明确指明取代基例如糖类基团，但所述取代基可以是存在的。 术语“免疫球蛋白，，和其语法等同形式表示由两条轻多肽链和两条重多肽链组成的分子。每一重和轻多肽链包含可变区(一般是多肽链的氨基端部分)，其含有与抗原相互作用的结合结构域。每一重多肽链和轻多肽链也包含恒定区(一般是多肽链的羧基端部分)，其可以介导抗体与宿主组织或因子的结合，所述宿主组织或因子包括免疫系统的多种细胞、一些吞噬细胞和经典补体系统的第一组分(Clq)。在一个实施方案中，轻和重多肽链是这样的链，每一链由可变区，即\或Vh，和恒定区，即在轻多肽链的情况下是Q或者在重多肽链的情况下是CH1、铰链区、Ch2、Ch3和任选地(^4组成。术语“免疫球蛋白”也指由免疫球蛋白基因编码的多肽组成的蛋白质。公认的免疫球蛋白基因包括不同的恒定区基因以及无数的免疫球蛋白可变区基因。免疫球蛋白也可以以多种形式存在。免疫球蛋白片段是例如，Fv, Fab 和 F(ab)2 以及单链(例如 Huston, J. S.，等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85(1988)5879-5883 ；Bird 等人，Science 242(1988)423-426 ；Hood 等人，Immunology, Benjamin N. Y.，第 2 版(1984)；和 Hunkapiller 和 Hood，Nature 323(1986) 15-16)。在根据本发明的方法的一个实施方案中，免疫球蛋白是单克隆免疫球蛋白。术语“单体形式的免疫球蛋白”和其语法等同形式表示不与第二免疫球蛋白分子结合的，即既不共价地也不非共价地与另一免疫球蛋白分子结合的免疫球蛋白分子。术语 “聚集形式的免疫球蛋白”和其语法等同形式表示共价地或者非共价地与至少一个额外的免疫球蛋白分子或其片段结合的免疫球蛋白分子，其在用大小排阻层析柱的层析中在单体形式的免疫球蛋白之前被洗脱下来。在本申请中所用的术语“单体形式”和其语法等同形式并非一定表示100%的免疫球蛋白分子是以单体形式存在的。它表示，由免疫球蛋白的大小排阻层析的峰面积测定的免疫球蛋白基本上是单体形式，即至少90%的免疫球蛋白是单体形式，在一个实施方案中，至少95%的免疫球蛋白是单体形式，在另一实施方案中，至少98%的免疫球蛋白分子是单体形式，在另一实施方案中，至少99%的免疫球蛋白是单体形式，并仍在另一实施方案中，99%以上的免疫球蛋白是单体形式。术语“单体形式和聚集的/片段的形式”表示这样的混合物，所述混合物至少包含不与其他免疫球蛋白分子结合的免疫球蛋白分子、与其他免疫球蛋白分子和/或其他免疫球蛋白分子的部分结合的免疫球蛋白分子。在该混合物中，并不仅仅只存在单体形式或聚集形式或者片段形式。术语“100%”表示组分并非指定组分的量在指定的条件下低于所参考的分析方法的检测极限。术语“ 90 %'\"95%，，、“ 98%'\ “ 99 %，，并非表示精确值，而表示在指定的条件下数
值在所参考的分析方法的准确度内。术语“去除了免疫球蛋白聚集物和免疫球蛋白片段的单体免疫球蛋白”表示单体免疫球蛋白在某些实施方案中占按重量计至少90%、按重量计至少95%、按重量计至少 98 %或按重量计至少99 %。反过来，免疫球蛋白聚集物和免疫球蛋白片段在某些实施方案中占按重量计不多于10%、按重量计不多于5%、按重量计不多于2%或按重量计不多于制备物的1%。一般的层析方法及其用途对本领域技术人员是已知的。参见例如， Chromatography,第 5 片反，A 部分！Fundamentals and Techniques，Heftmann，E 编辑， Elsevier Science Publishing Company, New York，(1992) ；Advanced Chromatographic and Electromigration Methods in Biosciences，Deyl，Z 编辑，Elsevier Science BV, Amsterdam，The Netherlands，(1998) ；Chromatography Today, Poole, C. F.禾口 Poole， S. K.，Elsevier Science Publishing Company, New York，(1991) ；Scopes，Protein Purification Principles and Practice(1982) ；Sambrook, J·等人编辑，MolecularCloning :A Laboratory Manual,第二版，Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor,N. Y. , 1989 ；Current Protocols in Molecular Biology,Ausubel,F. M.等人编辑，John Wiley& Sons，InC.，New York。对于重组产生的免疫球蛋白的纯化，通常应用不同的层析步骤的组合。一般地， 通常在A蛋白亲和层析然后是一个或两个其他分离步骤。最后的纯化步骤称为“精纯步骤 (polishing step) ”，用于去除痕量杂质和污染物如残留HCP (宿主细胞蛋白质)、DNA (宿主细胞核酸)、病毒或内毒素。对于该精纯步骤，通常仅使用流通模式中的阴离子交换材料。术语“流通模式(flow-through mode) ”和其语法等同形式表示纯化方法的运行模式，其中将含有待纯化的目标物质，例如单体形式的免疫球蛋白，的溶液与固定相接触， 在一个实施方案中是固相，而目标物质不与固定相结合。结果，目标物质在流通液(如果纯化方法是层析方法)或上清液(如果纯化方法是分批处理法)中获得。将在与固定相接触之前也在溶液中存在的非目标物质，例如聚集形式的免疫球蛋白和/或免疫球蛋白片段与固定相结合，并以此从溶液中去除。这并不代表从溶液中去除了 100%的非目标物质，但是基本上去除了 100%的非目标物质，在具体的实施方案中，如通过大小排阻层析的峰面积测定的那样，从溶液中去除了至少50%的非目标物质、从溶液中去除了至少75%的非目标物质、从溶液中去除了至少90%的非目标物质或从溶液中去除了 95%以上的非目标物质。术语“应用于”和其语法等同形式表示纯化方法的部分步骤，其中将含有待纯化的目标物质的溶液与固定相接触。这表示a)将溶液加入到放置了固定相的层析设备中，或b) 将固定相加入到溶液中。在a)的情况下，使含有待纯化的目标物质的溶液流过固定相，以允许固定相和溶液中的物质之间相互作用。取决于例如PH、传导性、盐浓度、温度和/或流速之类的条件，溶液的一些物质与固定相结合，并因此从溶液中去除。其他物质仍留在溶液中。留在溶液中的物质可以在流通液中发现。“流通液”表示在通过层析设备后得到的溶液。在一个实施方案中，层析设备是具有层析材料的柱，或者在另一实施方案中，是具有膜层析材料的盒。通过本领域技术人员熟知的方法，例如如沉淀、盐析、超滤、渗滤、冷冻干燥、 亲和层析或溶剂体积缩减以获得浓缩的溶液，可以从流通液中回收不与固定相结合的目标物质。在b)的情况下，将固定相，例如作为粉末加入到含有待纯化的目标物质的溶液中，以允许固定相与溶液中的物质之间相互作用。相互作用之后，例如，通过过滤，去除固定相，并在上清液中获得未与固定相结合的目标物质。术语“不与......结合”和其语法等同形式表示当将溶液与固定相，例如膜离子
交换材料接触时，目标物质例如免疫球蛋白仍留在溶液中。这并不表示100%的目标物质仍留在溶液中，但基本上100%的目标物质留在溶液中，在具体的实施方案中，如通过大小排阻层析的峰面积测定的那样，至少50%的目标物质仍留在溶液中，至少65%的目标物质仍留在溶液中，至少80%的目标物质仍留在溶液中，至少90%的目标物质仍留在溶液中或 95%以上的目标物质仍留在溶液中。术语“缓冲的”表示通过缓冲物质调整的溶液，其中pH的改变由于酸性或碱性物质的添加或释放。可以使用造成该效果的任一缓冲物质。在一个实施方案中，使用可药用缓冲物质，例如如磷酸和其盐、柠檬酸和其盐、吗啉、2-(N-吗啉代)乙磺酸和其盐、组氨酸和其盐、甘氨酸和其盐、或三(羟甲基)氨基甲烷(TRIQ和其盐。在另一实施方案中，缓冲物质选自磷酸和其盐、柠檬酸和其盐、或组氨酸和其盐。任选地，缓冲溶液可以包含其他盐，
7例如氯化钠、硫酸钠、氯化钾、硫酸钾、柠檬酸钠或柠檬酸钾。术语“结合和洗脱模式”和其语法等同形式表示纯化方法的运行模式，其中将含有待纯化的目标物质的溶液与固定相接触，在一个实施方案中与固相接触，从而使目标物质与固定相结合。结果，目标物质留在了固定相上，而非目标物质随流通液或上清液除去。然后，在第二步中，将目标物质从固定相中洗脱并由此用洗脱液从固定相中回收。因此，本发明报道了获得单体形式的免疫球蛋白的方法，其中该方法包括以下步骤在免疫球蛋白不与阴离子交换层析材料结合的条件下，将包含单体和聚集形式的免疫球蛋白和/或免疫球蛋白片段的缓冲水溶液应用于阴离子交换层析材料，从而将单体形式的免疫球蛋白从流通液中回收，并且其中，缓冲水溶液具有pH7. 8至pH8. 8的pH值。术语“在单体形式的免疫球蛋白不与阴离子交换层析材料结合的条件下”和其语法等同形式表示当将单体形式的免疫球蛋白与阴离子交换材料接触时，单体形式的免疫球蛋白不被阴离子交换层析材料结合的条件。这并不表示100%的单体形式的免疫球蛋白是不结合，但基本上100%的单体形式的免疫球蛋白是不结合的，在具体的实施方案中，如通过大小排阻层析中的峰面积测定的那样，至少50%的单体形式的免疫球蛋白是不结合的、 至少65%的单体形式的免疫球蛋白是不结合的、至少80%的单体形式的免疫球蛋白是不结合的、至少90%的单体形式的免疫球蛋白是不结合的或95%以上的单体形式的免疫球蛋白是不与阴离子交换材料结合的。在一个实施方案中，缓冲水溶液具有PH7. 8至pH8. 8 的PH值。在一个另外的实施方案中，该条件是缓冲水溶液的pH值是pH8. 0至pH8. 5。目前，已经令人惊奇地发现，可以从流通模式的阴离子交换材料中获得单体形式的免疫球蛋白的阴离子交换层析步骤可以在PH7. 8至pH8. 8，在一个实施方案中从pH8. 0 至pH8. 5的窄pH值范围内进行。令人惊奇地，较小地偏离该pH值范围，例如至pH7. 0或 PH9.0，降低了该效果。用根据本发明的方法，可以从聚集形式的免疫球蛋白中和从免疫球蛋白片段中一步分离单体形式的免疫球蛋白。根据本发明的方法可以作为一步法或者与其他步骤，例如，在一个实施方案中与A 蛋白层析步骤或疏水电荷诱导层析步骤(hydrophobic charge induction chromatography step)组合使用。在一个实施方案中，阴离子交换层析材料是膜阴离子交换层析材料。这对于例如去除大部分宿主细胞蛋白质和在使用亲和层析的主要纯化步骤中的培养副产物也是有利的。亲和层析可以例如是A蛋白亲和层析、G蛋白亲和层析、疏水电荷诱导层析(HCIC)或疏水相互作用层析(HIC，例如用苯基琼脂糖凝胶、亲杂氮芳基树脂(aza-arenophilic resin) 或间氨基苯硼酸)。在一个实施方案中，根据本发明的方法包括在阴离子交换层析步骤前的 A蛋白层析步骤或HCIC层析步骤。在根据本发明的方法的一个实施方案中，其中该方法包括一个以上的层析步骤， 在将溶液应用于纯化方法的一个步骤(或随后的步骤)前，必须调节参数，例如如溶液的 PH值或导电性。在一个实施方案中，应用于阴离子交换层析材料的缓冲水溶液的pH值是 ρΗ7· 8至ρΗ8· 8，在另一实施方案中是ρΗ8· 0至ρΗ8· 5。提供了以下实施例和图以助于理解本发明，本发明的实际范围如所附权利要求所述。应当理解，在没有背离本发明的精神的情况下，可以在所述方法中进行修改。附图
描述图Ia将含有抗CCR5抗体的溶液调整至pH7. 0,7. 5和8. 0(称为ρΗ χ. χ上样级分)；在流通模式下，将每5mg蛋白质与15cm2膜吸附剂接触(称为ρΗ χ. χ流通级分)。将结合的物质用氯化钠洗脱(称为PH χ. χ洗脱级分)。通过SDS-PAGE用考马斯亮蓝染色分析级分。图Ib将含有抗CCR5抗体的溶液调整至ρΗ8. 5和9. 0 (称为ρΗ χ. χ上样级分)； 在流通模式下，将每5mg蛋白质与15cm2膜吸附剂接触(称为ρΗ χ. χ流通级分)。将结合的物质用氯化钠洗脱(称为PH χ. χ洗脱级分)。通过SDS-PAGE用考马斯染色分析级分。图Ic通过分析大小排阻层析，比较ρΗ7. 5的含抗CCR5抗体的溶液的上样级分和流通级分(Α和B)以及ρΗ8. 5的上样级分和流通级分(C和D)。在ρΗ7. 5，而非ρΗ8. 5，在流通液中能检测到聚集物和片段。图加显示在pH7. 5 (A)和pH8. 5 (B)，⑶19抗体的上样级分和流通级分的叠加。可以在ρΗ7. 5的流通液中检测到聚集物，但是在ρΗ8. 5的流通液中检测不到。图2b显示从抗CCR5抗体和抗⑶19抗体溶液中去除聚集物的表。在pH7. 5以上的PH值，例如pH8. 5，流通液中聚集物减少。图3放大实验将含有抗CCR5抗体的溶液调整至pH8. 5，并泵送25mg通过75cm2膜吸附剂(称为PH χ. χ流通级分)。将结合的物质用氯化钠洗脱(称为ρΗ χ. χ洗脱级分)。 通过SDS-PAGE用考马斯染色分析级分。图4将含有抗CCR5抗体的溶液调整至pH8. 5 (称为pH8. 5上样级分)，并泵送6mg 蛋白质通过lml Q-Sepharose 快速流动性阴离子交换层析柱(称为PH8. 5流通级分)。 用氯化钠洗脱柱(称为PH8. 5洗脱级分)。通过SDS-PAGE用考马斯染色分析级分。
实施例材料和方法条件性A蛋白洗脱物在第一步中，用A蛋白亲和层析纯化抗CCR5抗体(在此后称为mAb CCR5，参见例如WO 2006/103100)和抗CD19抗体(在此后称为mAb CD19)。在酸性条件下，将mAb CCR5从A蛋白柱洗脱。在进一步处理前，通过针对缓冲液 (例如三(羟甲基)氨基甲烷(TRIQ或磷酸盐缓冲液)的透析，将含有免疫球蛋白的级分的PH值调整至7. 0、7. 5、8. 0、8. 5和9. 0的ρΗ值。在下面，称该材料为mAb CCR5的条件性 A蛋白洗脱物。在酸性条件下，将mAb⑶19从A蛋白柱洗脱。在进一步处理前，通过针对缓冲液 (例如三(羟甲基)氨基甲烷(TRIQ或磷酸盐缓冲液)的透析，将含有免疫球蛋白的级分的PH值调整至8. 5的ρΗ值。在下面，称该材料为mAb⑶19的条件性A蛋白洗脱物。分析方法大小排阻层析树脂TSK3000 (Tosohaas)柱300 X 7. 8mm
流速0.5ml/ 分钟缓冲液调整至pH7. 0的含有250mM氯化钾的200mM磷酸钾缓冲液波长 J80nmSDS-PAGE LDS 上样缓冲液，4 倍浓度 GX) :4g 甘油、0. 682g TRIS 碱、0. 666g TRIS-盐酸、 0. 8g LDS (十二烷基硫酸锂)、0· 006g EDTA (乙二胺四乙酸)、0· 75ml的按重量计(w/w)的
的在水中的krva Blue G250溶液、0. 75ml的按重量计(w/w)的的酚红溶液，添加水至IOml的总体积。将含有免疫球蛋白的溶液离心以去除碎片。将等份的澄清上清液与1/4体积(ν/ν)的4ΧLDS上样缓冲液和1/10体积(ν/ν)的0. 5Μ 1，4-二硫苏糖醇(DTT)混合。然后将样品在70°C温育10分钟并通过SDS-PAGE分离蛋白质。根据厂商说明书使用 The NuPAGE I^re-Cast 凝胶系统(Invitrogen Corp.)。特别地，使用 10 % NuPAGE Novex Bis-TRIS I^e-Cast 凝胶(pH 6.4)和NuPAGE MOPS 运行缓冲液。实施例1将每一具有pH7. 0、7. 5、8. 0、8. 5和9. 0的mAb CCR5的条件性A蛋白洗脱物调整至lmg/ml的浓度。将5ml的每一溶液分别应用至借助于层析系统的流通模式的经再生和平衡(到各自的PH)的Q-膜吸附剂(膜阴离子交换材料，膜面积15cm2)。然后，将膜用相应PH的缓冲液洗涤。结合的蛋白质用相应pH值的盐梯度洗脱。已经发现，在pH7. 0和7. 5,mAb CCR5不与膜吸附剂结合。在pH8. 0和8. 5之间实现了轻微的结合。在PH9.0出现了抗体的强结合。通过大小排阻层析和SDS-PAGE分析流通液和洗脱级分显示，在PH8. 0和8. 5，显著地从流通液中去除了免疫球蛋白聚集物和免疫球蛋白片段。在PH7. 0和7. 5没有可见的去除物，并且由于基质结合，在pH9. 0发生了高的产物损失。在pH8. 0和pH8. 5，用电导性驱动的洗脱(conductivity driven elution)获得了富含免疫球蛋白聚集物和免疫球蛋白片段的级分。实施例2将每一具有pH7. 0、7. 5、8. 0、8. 5和9. 0的mAb CD19的条件性A蛋白洗脱物调整至lmg/ml的浓度。将5ml的每一溶液分别应用至借助于层析系统的流通模式的再生和平衡(到各自的pH)Q-膜吸附剂(15cm2)。然后，将膜用相应pH的缓冲液洗涤。结合的蛋白质用相应PH值的盐梯度洗脱。已经发现，在pH7. 0和7. 5，mAb CD19不与膜吸附剂结合。在pH8. 0和8. 5之间实现了轻微的结合。在PH9.0出现了免疫球蛋白的强结合。通过大小排阻层析和SDS-PAGE 分析流通液和洗脱级分显示，在PH8. 0和8. 5，显著地从产物中去除了免疫球蛋白的免疫球蛋白聚集物和免疫球蛋白片段。在PH7. 0和pH7. 5没有可见的去除物，并且由于基质结合， 在PH9. 0发生了高的产物损失。在pH8. 0和pH8. 5，用电导性驱动的洗脱获得了富含免疫球蛋白聚集物和免疫球蛋白片段的级分。实施例3将mAb CCR5的A蛋白洗脱物调节到pH8. 5并调整至lmg/ml的浓度。将25ml的溶液应用至借助于层析系统的流通模式的经再生和平衡(到pH8. 5)的Q-膜吸附剂(75cm2膜表面积)。然后，将膜用pH8. 5的缓冲液洗涤。结合的蛋白质用相应 PH值的盐梯度洗脱。可以以放大5倍的规模再现实施例1的结果。流通液去除了免疫球蛋白聚集物和免疫球蛋白片段。两种杂质都可以用盐梯度从膜吸附剂中洗脱。实施例4在pH8. 5，将mAb CCR5的条件性A蛋白洗脱物调整至lmg/ml的浓度。将6mi的溶液应用至借助于层析系统的流通模式的经再生和平衡(到PH8.5)QSepharose FF。然后，将琼脂糖凝胶用相应PH的缓冲液洗涤。结合的蛋白质用相应pH值的盐梯度洗脱。通过大小排阻层析和SDS-PAGE分析流通液和洗脱级分显示，在pH8. 5，显著地从产物中去除了免疫球蛋白的免疫球蛋白聚集物和免疫球蛋白片段。在PH8.0和pH8. 5，用电导性驱动的洗脱获得了富含免疫球蛋白聚集物和免疫球蛋白片段的级分。
权利要求
1.用于获得单体形式的免疫球蛋白的方法，其中所述方法包括以下步骤将包含单体形式和聚集形式的免疫球蛋白和/或免疫球蛋白片段的缓冲水溶液应用于阴离子交换层析材料，其中，所述缓冲水溶液具有PH8. 0至pH8. 5的pH值，由此从阴离子交换层析材料的流通液中回收去除了免疫球蛋白聚集物和免疫球蛋白片段的免疫球蛋白，并由此获得单体形式的免疫球蛋白。
2.根据权利要求1的方法，其特征在于所述阴离子交换层析材料是膜阴离子交换层析材料。
3.根据权利要求1的方法，其特征在于所述阴离子交换层析材料是强阴离子交换层析材料。
4.根据前述权利要求中任一项的方法，其特征在于所述方法包括在步骤a)之前的额外的A蛋白层析步骤或HCIC层析步骤。
全文摘要
本发明报道了纯化免疫球蛋白的方法，其中该方法包括在单体形式的免疫球蛋白不与阴离子交换材料结合的条件下，将包含单体形式、聚集形式和片段形式的免疫球蛋白的缓冲水溶液应用于阴离子交换层析材料，并从阴离子交换层析材料的流通液中回收单体形式的免疫球蛋白，其中缓冲水溶液具有8.0至8.5的pH值。在一个实施方案中，阴离子交换层析材料是膜阴离子交换层析材料。
文档编号C07K1/18GK102264392SQ200980151951
公开日2011年11月30日 申请日期2009年12月18日 优先权日2008年12月22日
发明者A·肖布马尔, M·蓬皮阿蒂 申请人:弗·哈夫曼-拉罗切有限公司