专利名称：通过中电导钙激活钾通道调控细胞-细胞融合的组合物及方法
技术领域：
本发明总的涉及调控细胞-细胞融合(也称为细胞内摄作用(cellocytosis))的组合物和方法，更具体地涉及调控巨噬细胞同型和异型细胞-细胞融合的组合物和方法。 本发明因此提供组合物和方法，其用于调控细胞融合，以及与多种疾病或障碍相关的破骨细胞分化和功能。
背景技术：
细胞融合是重要的生物学事件，对于多种发育和稳态过程是必要的。尽管众所周知在细胞器转运(organelle trafficking)期间胞内膜融合，但对于介导精子-卵母细胞、 成肌细胞-成肌细胞的细胞-细胞融合，以及巨噬细胞-巨噬细胞融合还知之甚少。参见 Vignery(2000)Int. J. Exp. Pathol. 81 :291_304。就巨噬细胞而言，这些细胞在组织中可与其自身融合(即同型融合)从而形成巨细胞，巨细胞与慢性炎性疾病有关。参见MacLauchlan等，(2009) J. Leukoc. Biol. 85 617-626 ；和上述Vignery (2000)。另外，巨噬细胞在骨中可与其自身融合从而形成破骨细胞，破骨细胞介导骨质吸收。最近，人们认为巨噬细胞可与体细胞或癌细胞融合(即异型融合)。参见 VignerH2005) TrendsCell Biol. 15 :188_193。遗憾的是，巨噬细胞通过何种机制与其自身及其他细胞融合在很大程度上仍然是未知的。参见上述MacLauchlan等，(2009)；和上述Vignery (2005)。当这些细胞以不适当或未经调控的方式融合时，了解该过程可能有助于调节巨噬细胞功能，还可能限制由炎性和感染性疾病引起的损伤。基于上述原因，需要抑制巨噬细胞融合的组合物和方法。破骨细胞通过单核细胞-巨噬细胞细胞系的细胞融合而形成。破骨细胞是一类大细胞，特征在于多细胞核以及高浓度小泡(vesicle)和液泡(vacuole)。破骨细胞在骨质吸收活跃的部位形成特殊的细胞膜，促进移除骨基质(bonymatrix)。该机制引起骨质疏松症(osteoporosis)或骨质减少(osteopenia)(骨矿物质密度低于正常水平，但并没有足够低至界定成骨质疏松)。由于破骨细胞增加骨质吸收，类类风湿性关节炎(Mieumatoid arthritis)通常合并全身骨质减少。因此，存在对组合物和方法的需要，其用于调控，特别是抑制，破骨细胞分化和功能。发明概述本发明总的涉及调控细胞-细胞融合的组合物和方法，通过利用调控中电导 (intermediate-conductance) 1 ^ 7 ffl iS (calcium-activated potassiumchannel) (SK4通道或IK通道或KCNN4通道或KCa3. 1通道或IKCal通道)表达、活性或功能的试剂。 本发明的组合物包括有效量的SK4通道调节剂(抑制剂或激活剂)，单独或与其他治疗剂组合。在一个实施方案中，本发明的方法包括向具有融合可能性的细胞或正活跃融合的细胞提供有效量的SK4通道抑制剂。任选地，所述方法包括随SK4通道抑制剂一起联合提供治疗剂。还包括鉴定能够抑制细胞-细胞融合的SK4通道抑制剂的方法。
在另一个实施方案中，本发明涉及激活细胞-细胞融合。因此，方法包括向具有融合可能性的细胞或正活跃融合的细胞提供有效量的SK4通道激活剂。还包括鉴定能够促进细胞_细胞融合的SK4通道激活剂的方法。在一些实施方案中，本发明的组合物和方法提供巨噬细胞融合的调控。在其他实施方案中，所述组合物和方法提供破骨细胞分化和功能的调控，包括其抑制作用。本发明的组合物和方法用于预防或治疗由源自巨噬细胞的多核细胞介导的疾病或障碍，包括与破骨细胞、巨细胞或转移癌细胞有关的疾病。本发明包括以下实施方案。
1. 一种调控表达中电导钙激活钾(SK4)通道的细胞的细胞融合的方法，所述方法包括使细胞与有效量的SK4通道抑制剂或激活剂接触的步骤，其中细胞融合受到调控。2.实施方案1的方法，其中细胞融合受到抑制。3.实施方案1的方法，其中所述细胞为造血细胞。4.实施方案1的方法，其中所述细胞选自巨噬细胞、树突细胞和B细胞。5.实施方案1的方法，其中所述细胞为巨噬细胞。6.实施方案1的方法，其中所述细胞融合为同型或异型。7.实施方案1的方法，其中所述SK4通道抑制剂选自抑制性核酸、单克隆抗体和小分子抑制剂。8.实施方案7的方法，其中所述抑制性核酸靶向包含SEQ ID NO :2所示序列的SK4 通道的表达。9.实施方案7的方法，其中所述单克隆抗体识别SK4通道的孔道区(poreregion) 或小分子结合区。10.实施方案7的方法，其中所述小分子抑制剂选自1-[(2_氯苯基)二苯基甲基]-IH-咪唑；2，2-双(4-氟苯基)-2-苯基乙酰胺；1- [ (2-氯苯基)二苯基甲基]-IH-吡唑；1-[(2-氟苯基)二苯基甲基]-1Η-吡唑；1-[(4_氯苯基)二苯基甲基]-1Η-吡唑； 1_[ (2-氟苯基)二苯基甲基]-IH-吡唑；以及1-[ (2-氯苯基)二苯基甲基]-IH-四唑。11.实施方案7的方法，其中所述小分子抑制剂为1-[(2_氯苯基)_ 二苯基甲基]-IH-咪唑。12.实施方案7的方法，其中所述小分子抑制剂为2，2-双(4_氟苯基)_2_苯基乙酰胺。13.实施方案7的方法，其中所述小分子抑制剂为1-[(2_氯苯基)二苯基甲基]-IH-吡唑。14.实施方案7的方法，进一步包括测定细胞中SK4通道表达或活性的步骤。15.实施方案1的方法，其中所述方法为体内方法，其中所述的SK4通道抑制剂的有效量为向已有或者怀疑有异常细胞融合的受试者提供的治疗有效量。16.实施方案15的方法，进一步包括向受试者联合提供治疗有效量的抗炎剂、抗骨丢失剂(anti-bone-loss agent)、免疫抑制剂，或者化疗剂。17. 一种调控破骨细胞分化和功能的方法，所述方法包括使破骨细胞或破骨细胞前体与有效量的中电导钙激活钾(SK4)通道抑制剂或激活剂接触的步骤。18.实施方案17的方法，其中破骨细胞形成受到抑制。
19.实施方案17的方法，其中所 述SK4通道抑制剂选自抑制性核酸、单克隆抗体和小分子抑制剂。20.实施方案19的方法，其中所述单克隆抗体识别SK4通道的孔道区或小分子结合区。21.实施方案19的方法，其中所述小分子抑制剂选自1-[(2_氯苯基)_ 二苯基甲基]-IH-咪唑；2，2-双(4-氟苯基)-2-苯基乙酰胺；1- [ (2-氯苯基)二苯基甲基]-IH-吡唑；1-[(2-氟苯基)二苯基甲基]-1Η-吡唑；1-[(4_氯苯基)二苯基甲基]-IH-吡唑； 1_[ (2-氟苯基)二苯基甲基]-IH-吡唑；以及1-[ (2-氯苯基)二苯基甲基]-IH-四唑。22.实施方案19的方法，其中所述小分子抑制剂为1-[(2_氯苯基)_ 二苯基甲基]-IH-咪唑。23.实施方案19的方法，其中所述小分子抑制剂为2，2-双(4_氟苯基)_2_苯基
乙酰胺。24.实施方案19的方法，其中所述小分子抑制剂为1-[(2_氯苯基)二苯基甲基]-IH-吡唑。25.实施方案17的方法，其中所述方法为体内方法，其中所述的SK4通道抑制剂的有效量为向已有或者怀疑有异常破骨细胞分化或功能的受试者提供的治疗有效量。26.实施方案25的方法，进一步包括向受试者联合给药治疗有效量的抗炎剂、抗骨丢失剂、免疫抑制剂，或者化疗剂。27. 一种预防或治疗易患或已患骨丢失的受试者中骨丢失的方法，所述方法包括向受试者给药治疗有效量的中电导钙激活钾(SK4)通道抑制剂从而抑制破骨细胞形成的步骤，其中受试者中骨丢失得到预防或减少。28.实施方案27的方法，其中所述SK4通道抑制剂选自抑制性核酸、单克隆抗体和小分子抑制剂。29.实施方案28的方法，其中所述单克隆抗体识别SK4通道的孔道区或小分子结合区。30.实施方案28的方法，其中所述小分子抑制剂选自1-[(2_氯苯基)_ 二苯基甲基]-IH-咪唑；2，2-双(4-氟苯基)-2-苯基乙酰胺；1- [ (2-氯苯基)二苯基甲基]-IH-吡唑；1-[(2-氟苯基)二苯基甲基]-1Η-吡唑；1-[(4_氯苯基)二苯基甲基]-IH-吡唑； 1_[ (2-氟苯基)二苯基甲基]-IH-吡唑；以及1-[ (2-氯苯基)二苯基甲基]-IH-四唑。31.实施方案28的方法，其中所述小分子抑制剂为1-[(2_氯苯基)_ 二苯基甲基]-IH-咪唑。32.实施方案28的方法，其中所述小分子抑制剂为2，2-双(4_氟苯基)_2_苯基
乙酰胺。33.实施方案28的方法，其中所述小分子抑制剂为1-[(2_氯苯基)二苯基甲基]-IH-吡唑。34.实施方案27的方法，进一步包括向受试者联合给药治疗有效量的抗炎剂、抗骨丢失剂、免疫抑制剂，或者化疗剂。35. 一种预防或治疗易患或已患炎性疾病或自身免疫疾病的受试者中特征在于巨细胞形成的炎性疾病或自身免疫疾病的方法，所述方法包括向受试者给药治疗有效量的中电导钙激活钾(SK4)通道抑制剂以抑制巨细胞形成的步骤，其中受试者中所述炎性疾病或自身免疫疾病得到预防或治疗。36.实施方案35的方法，其中所述SK4通道抑制剂选自抑制性核酸、单克隆抗体和小分子抑制剂。37.实施方案36的方法，其中所述单克隆抗体识别SK4通道的孔道区或小分子结 合区ο38.实施方案36的方法，其中所述小分子抑制剂选自1_[ (2_氯苯基)-二苯基甲基]-IH-咪唑；2，2-双(4-氟苯基)-2-苯基乙酰胺；1- [ (2-氯苯基)二苯基甲基]-IH-吡唑；1-[(2-氟苯基)二苯基甲基]-1Η-吡唑；1-[(4_氯苯基)二苯基甲基]-IH-吡唑； 1_[ (2-氟苯基)二苯基甲基]-IH-吡唑；以及1-[ (2-氯苯基)二苯基甲基]-IH-四唑。39.实施方案36的方法，其中所述小分子抑制剂为1-[(2_氯苯基)_ 二苯基甲基]-IH-咪唑。40.实施方案36的方法，其中所述小分子抑制剂为2，2-双(4_氟苯基)_2_苯基
乙酰胺。41.实施方案36的方法，其中所述小分子抑制剂为1-[(2_氯苯基)二苯基甲基]-IH-吡唑。42.实施方案35的方法，进一步包括向受试者联合给药(co-administering)治疗有效量的抗炎剂、抗骨丢失剂、免疫抑制剂，或者化疗剂。43. 一种预防在有植入物或移植物位于其体内部位的受试者中，植入物或移植物排斥的方法，所述方法包括向受试者给药治疗有效量的中电导钙激活钾通道抑制剂以抑制巨细胞在该部位或该部位附近形成的步骤，其中受试者中植入物或移植物的排斥得到预防。44.实施方案43的方法，其中所述SK4通道抑制剂选自抑制性核酸、单克隆抗体和小分子抑制剂。45.实施方案44的方法，其中所述单克隆抗体识别SK4通道的孔道区或小分子结
合区ο46.实施方案44的方法，其中所述小分子抑制剂选自1_[ (2_氯苯基)-二苯基甲基]-IH-咪唑；2，2-双(4-氟苯基)-2-苯基乙酰胺；1- [ (2-氯苯基)二苯基甲基]-IH-吡唑；1-[(2-氟苯基)二苯基甲基]-1Η-吡唑；1-[(4_氯苯基)二苯基甲基]-IH-吡唑； 1_[ (2-氟苯基)二苯基甲基]-IH-吡唑；以及1-[ (2-氯苯基)二苯基甲基]-IH-四唑。47.实施方案44的方法，其中所述小分子抑制剂为1_[ (2_氯苯基)-二苯基甲基]-IH-咪唑。48.实施方案44的方法，其中所述小分子抑制剂为2，2-双(4_氟苯基)_2_苯基
乙酰胺。49.实施方案44的方法，其中所述小分子抑制剂为1-[(2_氯苯基)二苯基甲基]-IH-吡唑。50.实施方案43的方法，进一步包括向受试者联合给药治疗有效量的抗炎剂或免疫抑制剂。51.实施方案43的方法，其中所述移植物为细胞、器官或组织移植物。
52. 一种预防患癌症的受试者中癌症转移的方法，所述方法包括向受试者给药治疗有效量的中电导钙激活钾(SK4)通道抑制剂从而抑制转移癌细胞形成的步骤，其中受试者中癌症转移得到预防。
53.实施方案52的方法，其中所述SK4通道抑制剂选自抑制性核酸、单克隆抗体和小分子抑制剂。54.实施方案53的方法，其中所述单克隆抗体识别SK4通道的孔道区或小分子结
合区ο55.实施方案53的方法，其中所述小分子抑制剂选自1_[ (2_氯苯基)-二苯基甲基]-IH-咪唑；2，2-双(4-氟苯基)-2-苯基乙酰胺；1- [ (2-氯苯基)二苯基甲基]-IH-吡唑；1-[(2-氟苯基)二苯基甲基]-1Η-吡唑；1-[(4_氯苯基)二苯基甲基]-IH-吡唑； 1_[ (2-氟苯基)二苯基甲基]-IH-吡唑；以及1-[ (2-氯苯基)二苯基甲基]-IH-四唑。56.实施方案53的方法，其中所述小分子抑制剂为1_[ (2_氯苯基)-二苯基甲基]-IH-咪唑。57.实施方案53的方法，其中所述小分子抑制剂为2，2-双(4_氟苯基)_2_苯基
乙酰胺。58.实施方案53的方法，其中所述小分子抑制剂为1-[(2_氯苯基)二苯基甲基]-IH-吡唑。59.实施方案52的方法，进一步包括向受试者联合给药治疗有效量的抗炎剂、抗骨丢失剂、免疫抑制剂，或者化疗剂。60. 一种鉴定抑制细胞-细胞融合的中电导钙激活钾(SK4)通道的抑制剂的方法， 所述方法包括以下步骤使细胞群与候选SK4通道抑制剂接触；和确定是否候选试剂抑制细胞群内的细胞_细胞融合。61.实施方案60的方法，其中所述细胞群包括巨噬细胞，所述SK4通道抑制剂抑制巨噬细胞的细胞-细胞融合。62.实施方案60的方法，其中所述细胞群包括至少两种细胞类型，其中一种为巨噬细胞。63.组合物，包括有效量的中电导钙激活钾(SK4)通道抑制剂；和治疗剂，其中所述治疗剂选自抗炎剂、抗骨丢失剂、免疫抑制剂和化疗剂。64.实施方案63的组合物，其中所述SK4通道抑制剂选自抑制性核酸、单克隆抗体和小分子抑制剂。65.实施方案64的组合物，其中所述单克隆抗体识别SK4通道的孔道区或小分子
结合区。66.实施方案64的组合物，其中所述小分子抑制剂选自1-[(2_氯苯基)_ 二苯基甲基]-IH-咪唑；2，2-双(4-氟苯基)-2_苯基乙酰胺；1-[(2_氯苯基)二苯基甲基]-IH-吡唑；1-[(2-氟苯基)二苯基甲基]-IH-吡唑；1-[(4_氯苯基)二苯基甲基]-IH-吡唑；1-[(2_氟苯基)二苯基甲基]-IH-吡唑；以及1-[(2_氯苯基)二苯基甲基]-IH-四唑。
67.实施方案64的组合物，其中所述小分子抑制剂为1_[ (2_氯苯基)-二苯基甲基]-IH-咪唑。68.实施方案64的组合物，其中所述小分子抑制剂为2，2-双(4_氟苯基)_2_苯
基乙酰胺。69.实施方案64的组合物，其中所述小分子抑制剂为1_[(2_氯苯基)二苯基甲基]-IH-吡唑。70.实施方案63的组合物，进 一步包括药学可接受载体。71. 一种鉴定激活细胞-细胞融合的中电导钙激活钾(SK4)通道的激活剂的方法， 所述方法包括以下步骤使细胞群与候选SK4通道激活剂接触；和确定候选试剂是否激活该细胞群内的细胞_细胞融合。72.实施方案71的方法，其中所述细胞群包括巨噬细胞，所述SK4通道激活剂激活巨噬细胞的细胞-细胞融合。73.实施方案71的方法，其中所述细胞群包括至少两种细胞类型，其中一种为巨噬细胞。
参考本发明下文的详细描述，本发明将得到更好理解，而且除了上文所述的那些之外的特征、方面和优势将更加显而易见。所述详细描述参考以下附图，其中图IA显示新近接种到平板的大鼠肺泡巨噬细胞的照片；图IB显示在成融条件 (fusogenic condition)下培养5天后，从融合的大鼠肺泡巨噬细胞形成的多核细胞的照片。图2显示，在成融条件下，24小时大鼠肺泡巨噬细胞中SK4通道mRNA表达上调，其持续至第5天(χ轴代表在0小时、1小时、24小时或120小时平行测定肺泡巨噬细胞样本)。 数据显示为3个单个样本的平均信号(+标准差)，利用Affymetrix Genechip RAT230 Plus Array experiments (Probe ID1368930_at)得至lj。图3A显示，在M-CSF和RANKL刺激下，人外周血单核细胞(PBMCs)分化成破骨细胞期间，SK4通道表达上调(χ轴代表在0小时、3天、7天、14天或21天平行测定人PBMC 样本)。数据显示为4个单个样本的平均信号(+标准差)，利用Affymetrix Genechip U133 Plus 2 Array chips 得到。图 3B 显示利用TaqMan Real-Time RT-PCR进一步证实 Genechip 数据(χ轴代表在0小时、3天、7天、14天或21天平行测定人PBMC样本)。图 3C显示与其他细胞相比，SK4/IK在人B细胞、树突细胞和巨噬细胞中的高mRNA表达。图3C 的数据来自于Affymetrix Genechip RAT230 Plus Array芯片，显示为细胞样本的平均信号。细胞采样和平行测定的次数在图3C中标明。图4A显示，与纯合野生型(WT ； sk4+/+)小鼠相比，SK4通道在M-CSF和RANKL下培养7天，杂合(sk4+勺和纯合敲除(sk4+)小鼠的脾细胞产生的破骨细胞样细胞(即TRAP+) 减少。图4B显示与WT小鼠相比，这些细胞的表面积减少。图5显示，与WT(sk4v+)小鼠相比(上图)，SK4通道缺乏不明显影响来自纯合敲除(sk4+)小鼠(下图)的巨噬细胞的相对比例。FACS图从左至右显示不同组合(全部细胞、CDllb/F480、CD11C/F480、CDllC/CDllb)。图6A显示，与WT (sk4+/+)小鼠相比，由在成融条件(M-CSF+RANKL)下培养7天的纯合敲除(sk4+)小鼠骨髓来源的巨噬细胞产生的破骨细胞样细胞(即TRAP+)减少。图6B 显示与WT小鼠相比，这些细胞的总表面积减少。图7A-B 显示，两种不同的SK4通道抑制剂(ICA-17043，图7A ；和TRAM-34， 图7B)以剂量依赖性方式，阻止WT小鼠骨髓来源的巨噬细胞中破骨细胞形成 (osteoclastogenesis)。评估了 TRAP+破骨细胞样细胞的表面积(P0C是相对于无化合物对照的百分比)。数据来自于5次平行测定，误差线代表标准差。图7C显示ICA-17043治疗的样本的TRAP-染色图。图8A-B显示，在抗胶原抗体诱导的关节炎模型中，与WT小鼠(M和F)相比，纯合敲除(sk4+)小鼠(雄性(M)和雌性(F))的关节炎评分明显降低。显示了两次单独实验的数据。各研究组中动物的数量在图8A-B中标明，误差线代表平均值的标准差。图9A显示，在抗胶原抗体诱导的关节炎模型中(图8，实验2)，与WT小鼠相比，纯合敲除(sk4+)小鼠(雌性(F))的骨损伤、软骨损伤、血管翳(parmus)和爪关节炎症的组织学评分明显降低。图9B显示，在抗胶原抗体诱导的关节炎模型中，与WT小鼠相比，纯合敲除(sk4+)小鼠(雄性(M))的骨损伤评分明显降低。图10A-B显示，两种不同的SK4通道抑制剂(ICA-17043和TRAM-34，分别为图IOA 和图10B)以剂量依赖性方式，预防在M-CSF+RANKL刺激下人PBMCs中的破骨细胞形成。评估了 TRAP+破骨细胞样细胞的表面积(P0C是相对于无化合物对照的百分比)。数据来自于 4次平行测定，误差线代表标准差。图IlA显示，SK4-缺乏的破骨细胞在吸收骨矿物质方面有缺陷。源自sk4v+和 sk4+小鼠的骨髓来源巨噬细胞在M-CSF(20ng/ml)和RANKL(100ng/ml)存在下，在涂有由磷酸钙晶体构成的人工骨的BiOCoatTM0SteologiCTM载玻片上培养20天。通过记录每孔溶解的磷酸钙表面积估计破骨细胞活性。结果代表3次独立实验(η = 3 ；SD)。图IlB显示 sk4+A和sk4+小鼠的骨吸收陷窝(resorption pits)的典型图像。图12显示，SK4-缺乏的小鼠的小梁骨密度(trabecular bone density)增加。 雄性和雌性sk4+小鼠股骨远端骨的小梁骨密度比sk4v+小鼠更高。8周龄雄性和雌性 sk4+和sk4+/+小鼠的股骨远端利用pQCT扫描(η = 8 ；SD)。图13显示小鼠头部的背外侧解剖图。箭头代表在体内的破骨细胞形成试验中，颅盖以上局部皮下注射脂多糖(lipolysaccharide，LPS)的部位。注射LPS引起局部、迅速、 有效的炎症应答，导致吸收骨质的破骨细胞形成。图14显示，SK4缺乏显著阻止应答在颅盖之上局部皮下注射LPS的骨吸收。向8 周龄sk4v+和sk4+雄性和雌性小鼠右颅盖的骨膜中注射2 μ 1体积25 μ g LPS (见图13)。 头部经显微CT扫描。记录SK4-缺乏的小鼠对LPS应答的缺乏(η = 5)。图15A-C显示，sk4v+相对于SK4-缺乏(sk4+)的颅盖3D参数的体内反应，以应答在颅盖之上局部皮下注射LPS。颅盖骨表面密度(骨表面积相对于骨体积，图15A)；骨厚度(图15B)；以及骨密度(图15C)。SK4-缺乏的小鼠在注射LPS 5天后，保持较高的颅盖骨厚度和密度，以及较少的吸收的骨表面。
发明详述 本发明涉及在细胞-细胞融合期间，尤其是在涉及巨噬细胞的同型和异型融合期间，增加的中电导钙激活钾(SK4或KCNN4或IK)通道表达的鉴定。本发明包括利用SK4抑制剂或激活剂调节细胞_细胞融合。即，本发明提供组合物和方法，通过调节SK4通道表达、 活性或功能，从而调控细胞-细胞融合。因此，SK4通道表达、活性或功能可能减少(即抑制)或增加，以分别降低(即抑制)或增加细胞-细胞融合。特别感兴趣的是调节包括巨噬细胞的细胞-细胞融合。例如，细胞(例如巨噬细胞)的融合可导致多核破骨细胞形成，其与骨发育、骨再塑和骨修复有关。功能失调的破骨细胞活性可能是骨疾病，例如骨质疏松症和类类风湿性关节炎的成因。同样，巨噬细胞的融合可导致多核巨细胞形成，用于应答异物例如病原体或植入物。本发明因此集中研究SK4通道在巨噬细胞融合中的作用。在一些实施方案中，本发明提供抑制细胞-细胞融合的方法，更具体地为巨噬细胞的细胞-细胞融合。在此类实施方案中，SK4通道表达、活性或功能，以及该细胞-细胞融合，可例如通过使所研究细胞与有效量的SK4通道抑制剂接触而减少(即抑制)。通过这种方式，与适当对照相比，SK4通道表达、活性或功能在那些所研究细胞中可得到统计学显著的降低，包括但不限于 5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、 60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95% 或 100%。在其他实施方案中，可能需要细胞-细胞融合增加，例如巨噬细胞融合增加。因此，例如巨噬细胞融合增加和多核破骨细胞形成可能是对抗异常增加的骨密度或者治疗慢性感染或骨硬化症所需的。在此类实施方案中，巨噬细胞的SK4通道表达、活性或功能可增力口，例如通过使巨噬细胞与有效量的SK4通道表达、活性或功能的激活剂接触。当所需结果是细胞_细胞融合增加时，与适当对照相比，SK4通道表达、活性或功能在那些所需细胞中可得到统计学显著量的增加，包括但不限于5% ,10% ,15%,20%,25%,30%,35%,40%, 45 %,50 %,55 %,60 %,65 %,70 %,75 %,80 %,85 %,90 %,95 %,100 %,110 %,120 130%、140%、150% 或更高。本发明的组合物和方法通过调控破骨细胞和/或破骨细胞前体的SK通道表达、活性或功能，从而用于调控破骨细胞分化和功能。破骨细胞是同型、特化、多核的源自巨噬细胞的细胞，通过除去骨组织的矿化基质而溶解骨组织。通过调控破骨细胞前体例如巨噬细胞的破骨细胞形成，可能改变破骨细胞形成，并因此改变破骨细胞数量和/或破骨细胞表面积，从而改变总体破骨细胞功能。破骨细胞功能可经调节而改变，例如这些细胞的骨矿物质吸收活性。因此，在一些实施方案中，本发明提供调控破骨细胞分化和功能的方法，其中所述方法包括使破骨细胞和/或破骨细胞前体与有效量的SK4通道抑制剂或激活剂接触。在一些实施方案中，利用SK通道抑制剂来抑制破骨细胞分化和/或功能。因此，当所需结果是降低破骨细胞分化和/或功能时，可以抑制破骨细胞前体例如巨噬细胞的SK4 通道表达、活性或功能，以减少巨噬细胞融合，从而减少破骨细胞形成(包括减少破骨细胞数量和/或破骨细胞表面积)，这导致破骨细胞功能的总体降低。可抑制破骨细胞的SK4通道表达、活性或功能，从而降低破骨细胞功能，例如包括降低破骨细胞骨矿物质吸收活性。 与适当对照相比，SK4通道表达、活性或功能在破骨细胞和/或破骨细胞前体中可得到统计学显著量的降低，包括但不限于 5% ,10% ,15%,20%,25%,30%,35%,40%,45%,50%,55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95% 或 100%。 在本发明其他实施方案中，本方法利用SK通道激活剂，提供增加的破骨细胞分化和/或功能。这样，例如破骨细胞分化和/或功能增加可能是对抗异常增加的骨密度，或者治疗慢性感染或骨硬化症所需的。因此，当所需结果是破骨细胞分化和/或功能增加时， 可增加破骨细胞前体例如巨噬细胞的SK4通道表达、活性或功能，以增加巨噬细胞融合，从而增加破骨细胞形成(包括增加破骨细胞数量和/或破骨细胞表面积)，这导致破骨细胞功能的总体增加，例如包括破骨细胞骨矿物质吸收活性的增加。可增加破骨细胞的SK4通道表达、活性或功能，从而增加破骨细胞功能，例如增加破骨细胞骨矿物质吸收活性。与适当对照相比，SK4通道表达、活性或功能在破骨细胞和/或破骨细胞前体中可得到统计学显著量的增加，包括但不限于 5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、 60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、100%、110%、120%、130%、140%、150%或更高。抑制细胞-细胞融合不希望束缚于任何具体理论，但SK4通道抑制剂可调节SK4通道表达，SK4通道活性，或者正活跃融合的(actively fusing)细胞和/或新融合的多核细胞例如破骨细胞、巨细胞或转移癌细胞的上游或下游SK4通道效应物。因此，描述了以SK4通道抑制剂来抑制细胞_细胞融合的组合物和方法，更具体地抑制巨噬细胞融合，包括导致破骨细胞、巨细胞和转移癌细胞形成的同型和异型融合。SK4通道抑制剂因此可在体内或体外提供以抑制细胞_细胞融合。当在体外提供时，所述SK4通道抑制剂可用于抑制细胞-细胞融合或筛选调节细胞_细胞融合的试剂。当在体内提供时，所述SK4通道抑制剂可用于预防和/或治疗涉及源自巨噬细胞的多核细胞， 尤其是破骨细胞、巨细胞或转移癌细胞的多种疾病或障碍。特别地，所述SK4通道抑制剂可用于预防或减少骨吸收/骨丢失，预防或治疗自身免疫或者炎性疾病或障碍，预防植入物或移植物排斥，或者预防癌症转移。如本文所用的,“中电导钙激活钾通道(intermediate-conductancecalcium-acti vated potassium channe) ”，“SK4通道(SK4 channel) ”指的是不依赖电压的、内向整流的钾通道,其电导小于IOOpS或在约12pS至约50pS之间(参见例如Christopherson (1991) J. Membr. Biol. 119 :75_83 ；禾口 Tharp &Bowles (2009)Cardiovasc. Hematological Agents Med. Chem. 7 :1_11 ；在此将每一篇以其整体引入作为参考)，但通常在约30pS至约40pS之间。SK4通道受亚微摩尔(submicromolar)的胞内钙浓度(约100nmol/L至约300nmol/L) 激活，受北非蝎毒素(charybdotoxin)和三芳基甲烷例如克霉唑，TRAM-34和ICA-15451阻断，但不受iberiotoxin、蜂毒明肽(apamin)或酮康唑阻断。SK4通道在本领域以不同方式被理解为中电导钙激活钾通道蛋白4、Gardos, flK、hIK、mIK、IK、IKl、IKCal、IKCAl、ImK、 KCa4、KCA4、KCa3. 1、KCNN4 或 SK4 通道。参见例如 Cho 等，(2008) Expert Rev. Mol. Diagn. 8 179-187 ；和 Reich 等，(2005)Eur. J. Immunol. 35 :1027_1036 ；在此将每一篇以其整体引入作为参考。因此，为了本发明的目的，术语“SK4通道”预期包括这些通道所理解的各种名称,包括KCNN4和SK4通道。对于许多物种例如小鼠、大鼠和人类来说，SK4通道单体的核酸和氨基酸序列是已知的。参见例如 Joiner 等，(1997)Proc. Natl. Acad. Sci. USA94 11013-11018 ；Logsdon 等，(1997) J. Biol. Chem. 272 32723-32726 ；Neylon 等，(1999) Circ. Res. 85 E33-E43 ；Vandorpe 等，(1998) J. Biol. Chem. 273 :21542_21553 ；Warth 等，(1999)Pflugers Arch. 438 :437_444 ；以及美国专利6，692，937和6，894，147 ；在此将每一篇以其整体引入作为参考；还参见SEQID NOS :1-6。SK4通道单体有6个跨膜片段(S1-S6)，在S5和S6之间有一个孔基序(pore motif)，其包含钾选择性氨基酸序列GYG。SK4通道单体在孔基序附近还有N-连接糖基化位点。SK4通道的N端包含内质网滞留信号(endoplasmic retention signal)(上述 Tharp & Bowles(2009))，C端包含感受细胞内钙的钙调蛋白结合区(Fanger等，(1999) J. Biol. Chem. 274 :5746_5754 ；和 Joiner 等，(2001) J. Biol. Chem. 276 :37980_37985 ；在此将每一篇以其整体引入作为参考)。C端还包含蛋白激酶A(PKA)、蛋白激酶C(PKC)和蛋白激酶G(PKG)磷酸化的许多共有序列(上述Joiner等，(1997))，以及酪氨酸磷酸化的共有序列(RLLQEAWMY ;SEQ ID NO :7;上述 Tharp & Bowles (2009))。SK4 通道单体形成同源四聚体，以调节钾离子外流。SK4通道在许多类型细胞中表达，包括T细胞、B细胞、巨噬细胞、小胶质细胞、红细胞、平滑肌细胞、内皮细胞和上皮细胞，但该通道表达时机和作用在这些细胞中可能不同。 然而，SK4通道在正在融合或最近融合的细胞中的表达和作用以前并未见报道。
如本文所用的，“巨噬细胞(macrophage) ”指的是CD68+(人类)或F4/80+(小鼠) 单核白细胞，在组织稳态以及先天免疫和获得性免疫中发挥作用。巨噬细胞还可为CDllb+。 从形态学上，它们表现为大细胞( 25 μ m至50 μ m)，有圆形的核，包含一至两个核仁，聚集染色质，有液泡和许多嗜苯胺蓝颗粒(azurophilic granules)的丰富的细胞质。巨噬细胞位于身体各处组织中，源自循环的单核细胞(即血源性单核白细胞)。它们有两个主要作用吞噬作用和抗原呈递。作为吞噬细胞，巨噬细胞吞噬然后消化细胞碎片和病原体(例如细菌、真菌、原生动物、病毒和酵母)，刺激淋巴细胞和其他免疫细胞对这些病原体产生应答。作为抗原呈递细胞，巨噬细胞处理来自吞噬的病原体的抗原，并将其呈递到淋巴细胞和其他免疫细胞表面。巨噬细胞还分泌大量单核因子，包括酶、补体蛋白和调节因子，例如白细胞介素-ι和肿瘤坏死因子-α。另外，巨噬细胞有淋巴因子受体，使它们活化成攻击性的病原体-和肿瘤-破坏细胞。一些巨噬细胞集中(即固定)在特定器官或组织，尤其是可能出现病原体侵袭或尘埃聚集的区域。固定的巨噬细胞的功能是不同的，被认为是受微环境刺激素例如细胞因子和病原性产物的影响。固定的巨噬细胞的实例列于表1。表1固定的巨噬细胞命名
权利要求
1.一种调控表达中电导钙激活钾(SK4)通道的细胞的细胞融合的方法，所述方法包括使细胞与有效量的SK4通道抑制剂或激活剂接触的步骤，其中细胞融合受到调控。
2.权利要求1的方法，其中细胞融合受到抑制。
3.权利要求1的方法，其中所述细胞为造血细胞。
4.权利要求1的方法，其中所述细胞选自巨噬细胞、树突细胞和B细胞。
5.权利要求1的方法，其中所述细胞为巨噬细胞。
6.权利要求1的方法，其中所述细胞融合为同型或异型。
7.权利要求1的方法，其中所述SK4通道抑制剂选自抑制性核酸、单克隆抗体和小分子抑制剂。
8.权利要求7的方法，其中所述抑制性核酸靶向包含SEQID N0:2所示序列的SK4通道的表达。
9.权利要求7的方法，其中所述单克隆抗体识别SK4通道的孔道区或小分子结合区。
10.权利要求7的方法，其中所述小分子抑制剂选自氯苯基)-二苯基甲基]-IH-咪唑；2，2-双(4-氟苯基)-2-苯基乙酰胺；1- [ (2-氯苯基)二苯基甲基]-IH-吡唑；1-Κ2-氟苯基)二苯基甲基]-1Η-吡唑；1-[(4_氯苯基)二苯基甲基]-IH-吡唑； 1_[ (2-氟苯基)二苯基甲基]-IH-吡唑；以及1-[ (2-氯苯基)二苯基甲基]-IH-四唑。
11.权利要求7的方法，其中所述小分子抑制剂为1-[(2_氯苯基)-二苯基甲基]-IH-咪唑。
12.权利要求7的方法，其中所述小分子抑制剂为2，2_双(4-氟苯基)-2-苯基乙酰胺。
13.权利要求7的方法，其中所述小分子抑制剂为1-[(2_氯苯基)二苯基甲基]-IH-吡唑。
14.权利要求7的方法，进一步包括测定细胞中SK4通道表达或活性的步骤。
15.权利要求1的方法，其中所述方法为体内方法，其中所述的SK4通道抑制剂的有效量为向已有或者怀疑有异常细胞融合的受试者提供的治疗有效量。
16.权利要求15的方法，进一步包括向受试者联合提供治疗有效量的抗炎剂、抗骨丢失剂、免疫抑制剂，或者化疗剂。
17.—种调控破骨细胞分化和功能的方法，所述方法包括使破骨细胞或破骨细胞前体与有效量的中电导钙激活钾(SK4)通道抑制剂或激活剂接触的步骤。
18.权利要求17的方法，其中破骨细胞形成受到抑制。
19.权利要求17的方法，其中所述SK4通道抑制剂选自抑制性核酸、单克隆抗体和小分子抑制剂。
20.权利要求19的方法，其中所述单克隆抗体识别SK4通道的孔道区或小分子结合区。
21.权利要求19的方法，其中所述小分子抑制剂选自1-[(2_氯苯基)-二苯基甲基]-IH-咪唑；2，2-双(4-氟苯基)-2-苯基乙酰胺；1- [ (2-氯苯基)二苯基甲基]-IH-吡唑；1-K2-氟苯基)二苯基甲基]-1Η-吡唑；1-[(4_氯苯基)二苯基甲基]-1Η-吡唑； 1_[ (2-氟苯基)二苯基甲基]-IH-吡唑；以及1-[ (2-氯苯基)二苯基甲基]-IH-四唑。
22.权利要求19的方法，其中所述小分子抑制剂为1-[(2_氯苯基)-二苯基甲基]-IH-咪唑。
23.权利要求19的方法，其中所述小分子抑制剂为2，2_双(4-氟苯基)-2-苯基乙酰胺。
24.权利要求19的方法，其中所述小分子抑制剂为1-[(2_氯苯基)二苯基甲基]-IH-吡唑。
25.权利要求17的方法，其中所述方法为体内方法，其中所述的SK4通道抑制剂的有效量为向已有或者怀疑有异常破骨细胞分化或功能的受试者提供的治疗有效量。
26.权利要求25的方法，进一步包括向受试者联合给药治疗有效量的抗炎剂、抗骨丢失剂、免疫抑制剂，或者化疗剂。
27.一种预防或治疗易患或已患骨丢失的受试者中骨丢失的方法，所述方法包括向受试者给药治疗有效量的中电导钙激活钾(SK4)通道抑制剂以抑制破骨细胞形成的步骤，其中受试者中骨丢失得到预防或减少。
28.权利要求27的方法，其中所述SK4通道抑制剂选自抑制性核酸、单克隆抗体和小分子抑制剂。
29.权利要求观的方法，其中所述单克隆抗体识别SK4通道的孔道区或小分子结合区。
30.权利要求观的方法，其中所述小分子抑制剂选自1-[(2_氯苯基)-二苯基甲基]-IH-咪唑；2，2-双(4-氟苯基)-2-苯基乙酰胺；1- [ (2-氯苯基)二苯基甲基]-IH-吡唑；1-K2-氟苯基)二苯基甲基]-IH-吡唑；1-[(4_氯苯基)二苯基甲基]-IH-吡唑； 1_[ (2-氟苯基)二苯基甲基]-IH-吡唑；以及1-[ (2-氯苯基)二苯基甲基]-IH-四唑。
31.权利要求观的方法，其中所述小分子抑制剂为1-[(2_氯苯基)-二苯基甲基]-IH-咪唑。
32.权利要求观的方法，其中所述小分子抑制剂为2，2-双(4-氟苯基)-2-苯基乙酰胺。
33.权利要求观的方法，其中所述小分子抑制剂为1-[(2_氯苯基)二苯基甲基]-IH-吡唑。
34.权利要求27的方法，进一步包括向受试者联合给药治疗有效量的抗炎剂、抗骨丢失剂、免疫抑制剂，或者化疗剂。
35.一种预防或治疗易患或已患炎性疾病或自身免疫疾病的受试者中特征在于巨细胞形成的炎性疾病或自身免疫疾病的方法，所述方法包括向受试者给药治疗有效量的中电导钙激活钾(SK4)通道抑制剂以抑制巨细胞形成的步骤，其中受试者中所述炎性疾病或自身免疫疾病得到预防或治疗。
36.权利要求35的方法，其中所述SK4通道抑制剂选自抑制性核酸、单克隆抗体和小分子抑制剂。
37.权利要求36的方法，其中所述单克隆抗体识别SK4通道的孔道区或小分子结合区。
38.权利要求36的方法，其中所述小分子抑制剂选自1-[(2_氯苯基)-二苯基甲基]-IH-咪唑；2，2-双(4-氟苯基)-2-苯基乙酰胺；1- [ (2-氯苯基)二苯基甲基]-IH-吡唑；1-[(2_氟苯基)二苯基甲基]-IH-吡唑；1-[(4_氯苯基)二苯基甲基]-IH-吡唑； 1_[ (2-氟苯基)二苯基甲基]-IH-吡唑；以及1-[ (2-氯苯基)二苯基甲基]-IH-四唑。
39.权利要求36的方法，其中所述小分子抑制剂为1-[(2_氯苯基)-二苯基甲基]-IH-咪唑。
40.权利要求36的方法，其中所述小分子抑制剂为2，2-双(4-氟苯基)-2-苯基乙酰胺。
41.权利要求36的方法，其中所述小分子抑制剂为1-[(2_氯苯基)二苯基甲基]-IH-吡唑。
42.权利要求35的方法，进一步包括向受试者联合给药治疗有效量的抗炎剂、抗骨丢失剂、免疫抑制剂，或者化疗剂。
43.一种预防在有植入物或移植物位于其体内部位的受试者中植入物或移植物排斥的方法，所述方法包括向受试者给药治疗有效量的中电导钙激活钾通道抑制剂以抑制巨细胞在该部位或该部位附近形成的步骤，其中受试者中植入物或移植物的排斥得到预防。
44.权利要求43的方法，其中所述SK4通道抑制剂选自抑制性核酸、单克隆抗体和小分子抑制剂。
45.权利要求44的方法，其中所述单克隆抗体识别SK4通道的孔道区或小分子结合区。
46.权利要求44的方法，其中所述小分子抑制剂选自氯苯基)-二苯基甲基]-IH-咪唑；2，2-双(4-氟苯基)-2-苯基乙酰胺；1- [ (2-氯苯基)二苯基甲基]-IH-吡唑；1-Κ2-氟苯基)二苯基甲基]-1Η-吡唑；1-[(4_氯苯基)二苯基甲基]-IH-吡唑； 1_[ (2-氟苯基)二苯基甲基]-IH-吡唑；以及1-[ (2-氯苯基)二苯基甲基]-IH-四唑。
47.权利要求44的方法，其中所述小分子抑制剂为1-[(2_氯苯基)-二苯基甲基]-IH-咪唑。
48.权利要求44的方法，其中所述小分子抑制剂为2，2-双(4-氟苯基)-2-苯基乙酰胺。
49.权利要求44的方法，其中所述小分子抑制剂为1-[(2_氯苯基)二苯基甲基]-IH-吡唑。
50.权利要求43的方法，进一步包括向受试者联合给药治疗有效量的抗炎剂或免疫抑制剂。
51.权利要求43的方法，其中所述移植物为细胞、器官或组织移植物。
52.一种预防患癌症受试者中癌症转移的方法，所述方法包括向受试者给药治疗有效量的中电导钙激活钾(SK4)通道抑制剂以抑制转移性癌细胞形成的步骤，其中所述受试者中癌症转移得到预防。
53.权利要求52的方法，其中所述SK4通道抑制剂选自抑制性核酸、单克隆抗体和小分子抑制剂。
54.权利要求53的方法，其中所述单克隆抗体识别SK4通道的孔道区或小分子结合区。
55.权利要求53的方法，其中所述小分子抑制剂选自1-[(2_氯苯基)-二苯基甲基]-IH-咪唑；2，2-双(4-氟苯基)-2-苯基乙酰胺；1- [ (2-氯苯基)二苯基甲基]-IH-吡唑；1-K2-氟苯基)二苯基甲基]-1Η-吡唑；1-[(4_氯苯基)二苯基甲基]-IH-吡唑； 1_[ (2-氟苯基)二苯基甲基]-IH-吡唑；以及1-[ (2-氯苯基)二苯基甲基]-IH-四唑。
56.权利要求53的方法，其中所述小分子抑制剂为1-[(2_氯苯基)-二苯基甲基]-IH-咪唑。
57.权利要求53的方法，其中所述小分子抑制剂为2，2-双(4-氟苯基)-2-苯基乙酰胺。
58.权利要求53的方法，其中所述小分子抑制剂为1-[(2_氯苯基)二苯基甲基]-IH-吡唑。
59.权利要求52的方法，进一步包括向受试者联合给药治疗有效量的抗炎剂、抗骨丢失剂、免疫抑制剂，或者化疗剂。
60.一种鉴定抑制细胞-细胞融合的中电导钙激活钾(SK4)通道的抑制剂的方法，所述方法包括以下步骤使细胞群与候选SK4通道抑制剂接触；和确定所述候选试剂是否抑制该细胞群内的细胞-细胞融合。
61.权利要求60的方法，其中所述细胞群包括巨噬细胞，所述SK4通道抑制剂抑制巨噬细胞的细胞-细胞融合。
62.权利要求60的方法，其中所述细胞群包括至少两种细胞类型，其中一种为巨噬细胞。
63.组合物，包括有效量的中电导钙激活钾(SK4)通道抑制剂；和治疗剂，其中所述治疗剂选自抗炎剂、抗骨丢失剂、免疫抑制剂和化疗剂。
64.权利要求63的组合物，其中所述SK4通道抑制剂选自抑制性核酸、单克隆抗体和小分子抑制剂。
65.权利要求64的组合物，其中所述单克隆抗体识别SK4通道的孔道区或小分子结合区。
66.权利要求64的组合物，其中所述小分子抑制剂选自1-[(2_氯苯基)-二苯基甲基]-IH-咪唑；2，2-双(4-氟苯基)-2-苯基乙酰胺；1- [ (2-氯苯基)二苯基甲基]-IH-吡唑；1-K2-氟苯基)二苯基甲基]-IH-吡唑；1-[(4_氯苯基)二苯基甲基]-IH-吡唑； 1_[ (2-氟苯基)二苯基甲基]-IH-吡唑；以及1-[ (2-氯苯基)二苯基甲基]-IH-四唑。
67.权利要求64的组合物，其中所述小分子抑制剂为1_[(2-氯苯基)-二苯基甲基]-IH-咪唑。
68.权利要求64的组合物，其中所述小分子抑制剂为2，2-双(4-氟苯基)-2-苯基乙酰胺。
69.权利要求64的组合物，其中所述小分子抑制剂为1-[(2_氯苯基)二苯基甲基]-IH-吡唑。
70.权利要求63的组合物，进一步包括药学可接受载体。
全文摘要
本发明提供通过利用调节中电导钙激活钾(SK4)通道表达、活性或功能的试剂用于调控细胞-细胞融合的组合物和方法。在一些实施方案中，本发明所述的组合物和方法抑制多核破骨细胞形成和细胞-细胞融合，尤其是涉及巨噬细胞的细胞融合。在此类实施方案中，所述组合物可包括SK4通道的抑制性核酸、单克隆抗体或者小分子抑制剂，可用于预防和/或治疗多种疾病或障碍，包括骨丢失、自身免疫和炎性疾病或障碍、植入物和移植排斥，以及癌症转移。在其他实施方案中，本发明所述的组合物和方法激活细胞-细胞融合。本发明还提供筛选SK4通道调节剂(抑制剂或激活剂)的方法，所述SK4通道调节剂调控细胞-细胞融合(特别是巨噬细胞的细胞融合)。
文档编号C07K14/705GK102272152SQ200980154131
公开日2011年12月7日 申请日期2009年11月10日 优先权日2008年11月10日
发明者李军, 阿格尼斯.维格纳里 申请人:耶鲁大学, 贝林格尔.英格海姆国际有限公司