专利名称：一类荧光染料、制备方法及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及精细化工领域中一类新的荧光染料、制备方法及其应用，特别是涉及 一类单电荷含氮菁类荧光染料、其制备方法，以及利用该荧光染料、其缀合物或其组合物在 生物染色方面的应用。
背景技术：
荧光染料作为功能性色素在科学技术的各个领域得到广泛应用，尤其在生命科 学、临床医疗诊断、免疫分析检测等方面的研究在全世界备受瞩目。目前，菲啶类(EB、PI)、 吖啶类(AO)、咪唑类(Hoechst、DAPI)和花菁家族类(Cy、Τ0Τ0、SYT0)等商品化荧光染料 在基因组学技术、核酸定量检测、血细胞分析等领域中都起到了重要的作用。然而，这些染 料都各自存在着应用的局限性。其一主要表现在大多荧光染料受限于固定细胞样品。例 如T0PR0、TOTO家族染料、溴乙锭(EB)、碘化丙啶(PI)等需要通过增大细胞膜的通透性或 类似使膜崩解的方法才能对生物样品进行有效的荧光标记。然而，这种固定方法往往对细 胞和生物组织真实形态的观察有负面影响[Kozubek S, Lukasova E,Amrichova J，Kozubek M, Liskova A, Slotova J. Anal Biochem 2000 ；282 29 38]。同时，溴乙锭等吖啶，菲啶类 染料有很大的毒性和致癌性。其二，有相当一部分荧光染料的激发光处在紫外光区，如能 够专一识别脱氧核糖核酸(DNA)的荧光染料4’，6-二氨基-2-苯基吲哚啉化合物(DAPI)、 Hoechst33258, HoeChst34580等，与DNA结合后，在紫外光激发放下产生蓝色荧光。由于 紫外光对细胞内的核酸、蛋白等组分会造成严重的损伤，因此这类荧光在荧光显微技术中 的使用受到光激发时间的限制[Davis SK, Bardeen CJ. Photochem Photobiol 2003 ；77 675-679]。此外，在紫外区进行荧光检测时，生物样品在这个区间的吸收使光进入生物组织 内部变得困难，同时生物样品中某些成分的自发荧光形成很强的背景干扰，使检测效率大 大降低。因此，研究开发出具有良好荧光光谱性能，毒性小，活细胞通透性的新型荧光染料 仍然是推动荧光分析技术和生命科学等领域发展的关键和核心。在众多种类的荧光染料中，菁类荧光染料以其波长范围宽，摩尔消光系数大，荧光 量子产率适中等优点，作为生物分子荧光探针、CD和VCD记录材料、感光材料光敏剂、光电 转换材料等已被广泛的应用。其中喹啉类不对称菁类荧光染料与核酸有高度亲和力，而与 其他生物大分子基本不结合的特异性使其在基因组学技术、核酸定量检测、血细胞分析等 领域的应用中脱颖而出。该类化合物与核酸的结合方式包括静电吸引、碱基对嵌入及沟槽 结合。具体的结合方式与结合能力取决于该标识物的结构及其与核酸浓度的比例。不对称 菁类化合物中最典型的为TOTO及其类似物(YOYO)和衍生物类(TOPRPO)。TOTO (噻唑橙二 聚体)、Υ0Υ0(恶唑黄二聚体)是由Glazer研究组开发的一类对核酸具有高度亲和力的多 正电荷不对称菁类荧光染料，通过改变多亚甲基链的长度和两端的芳香母核(噻唑、恶唑、 喹啉、吡啶和吲哚啉)的结构可以得到不同的异二聚体类似物和衍生物。这类染料在溶液 中几乎无荧光，降低了检测过程中的荧光背景干扰，与核酸结合后荧光增强。Jason等用溶 液粘度测定法和原子力显微镜解释了 TOTO和YOYO与DNA的双嵌入作用[J. A. Bordelon,K. J. Feierabend, S. A. Siddiqui, L. L. Wright. J. Phys. Chem. B，2002，106，4838-3843]。 Furstenberg等利用超快速荧光转换和时间相关单光子计数法进一步阐述了荧光增强的动 力学机理。[A. Furstenberg, M. D. Julliard, T. G. Deligeorgiec, N. I. Gadjev. J. AM. CHEM. S0C.，2006，128，7661-7669]此类染料中的有些品种已经商品化了，如=SYTOX Blue, Τ0Τ0, Ρ0Ρ0, Β0Β0, YO-PRO等。但这些商品化的染料大部分分子较大，结构复杂，属活细胞非通透 性，只能应用于活体外核酸的识别与检测。
发明内容
因此，需要开发新的荧光染料，该荧光染料应当具有以下优点在不存在核酸时具 有较低的荧光背景，与核酸结合后具有较高的荧光量子产率，且对核酸以外的生物分子无 亲和力；具有一定水平的水溶性，同时具有良好的细胞膜通透性；光谱范围与生物样品的 光谱范围有较大差异。在本发明的第一方面，本发明针对现有技术的不足，在其基础上改进，提供了一类 结构简单、灵敏度高、长波长、且具有良好的细胞膜通透性的新化合物，其具有下列结构通 式I:
权利要求
1. 一类荧光染料，所述染料具有如下结构通式I
2.权利要1所述的化合物，其中R1和&各自独立选自H或CV18烷基。
3.权利要求1所述的化合物，其中R3为NHR5、N(R6)2、吡咯基或哌啶基。
4.权利要求1所述的化合物，其中R4为C1,烷基或者苄基。
5.权利要求1所述的化合物，其中所述的Y_为卤素离子、cio4_、PF6_、BF4_、CH3COO-或 0IV。
6.权利要求1-5中任一项的化合物，其中所述化合物为
7.一种缀合物，其特征在于，所述缀合物中包含权利要求1-6中任一项的化合物。
8.一种制备权利要求1所述的化合物的方法，所述方法包括以下步骤1)式II的4-甲基喹啉芳香杂环化合物与R4Z化合物反应制得第一季铵盐中间体III，其中ζ为卤素或ots，τ为反应生成的卤素负离子或Oiv
9.一种用于生物样品染色的组合物，其特征在于所述组合物包含权利要求1-6中任一 项的化合物或权利要求7的缀合物。
10.一种染色生物样品的方法，所述方法包括将权利要求1-6中任一项的化合物、权利 要求7的缀合物或权利要求9的组合物与生物样品接触。
全文摘要
本发明提供一类式I的荧光染料，式中X为C(CH3)2、O、S或Se；m为1～18的整数；R1和R2各自独立选自H、C1-18烷基、OR7、-C1-6烷基-OR7或卤素；R3为吡咯基、咪唑基、哌啶基、哌嗪基、吗啉基、胍基、NHR5或N(R6)2；R4为C1-18烷基、苄基或(CH2)mR3；R5为饱和或不饱和、直链或支链的C1-18烷基、羟基C1-18烷基、巯基C1-18烷基、氨基C1-18烷基、酰基、苯基、萘基或苄基；R6为C2-18烷基；R7为H或C1-18烷基；Y-为负离子。该荧光染料可用于生物染色，应用于核酸标记、血细胞分析、临床医疗诊断、免疫分析检测等领域。
文档编号C07D417/06GK102115610SQ20101002241
公开日2011年7月6日 申请日期2010年1月5日 优先权日2010年1月5日
发明者吴彤, 孙世国, 彭孝军, 樊江莉 申请人:大连理工大学