专利名称：一种寡核苷酸“直接缩合法”试剂及其用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种寡核苷酸“直接缩合法”合成用试剂的结构及其制备方法，该结构 为包含一个亚磷酰胺基团及连接臂的核苷琥珀酸酯结构，该试剂可在固相载体表面羟基基 团或氨基基团上高效快速的连接核苷，进一步用于寡核苷酸的合成。
背景技术：
寡核苷酸是现代分子生物学研究中一类重要的研究手段，从诊断探针法到PCR到 基因表达的抑制作用，其在技术上被广泛应用，寡核苷酸的广泛使用使得寡核苷酸高效廉 价合成方法的需求快速增长。反义寡核苷酸和用于诊断试剂研究用的引物等的合成目前 已经很常规。早期合成方法包括磷酸二酯(Khorana et al, J Molec Biol, 1972 ；72 209) 和磷酸三酯(Reese, Tetrahedron Lett, 1978 ；34 :3143_3179)化学合成，这些早期的方 法为亚磷酰胺和H-磷酸酯等化合物用于寡核苷酸的合成奠定了基础。之后，Beaucage和 Caruthers (Tetrahedron Lett, 1981 ；22 =1859-1862)采用亚磷酰胺合成脱氧寡核苷酸， Agrawal 和 GoodchiId (Tetrahedron Lett, 1987 ；28 :3539_3542)采用亚磷酰胺合成甲基膦 酸酯寡核苷酸，Connolly等(Biochemistry，1984 ;23 3443)采用亚磷酰胺合成硫代磷酸 酯寡核苷酸。Jager等(Biochemistry，1988 ；27 7237)采用亚磷酰胺合成磷酸酰胺寡核苷 酸，Agrawal 等(Proc Natl Acad Sci USA, 1988 ；85 :7079_7083)采用 H-磷酸酯化合物合 成磷酸酰胺寡核苷酸和硫代磷酸酯寡核苷酸。采用亚磷酰胺方法固相合成寡核苷酸是大多数实验室选择的方法，起始物质是与 固相载体相连的核苷，它将成为核苷酸的3’羟基末端，然后依次将后一个核苷单体的活性 3’磷酸基团连接到前一个核苷酸的5’羟基上，每合成上去一个核苷单体均包括脱保护-偶 联-氧化/硫化-封闭四步，如此循环直至完成全部序列长度。由于合成的寡核苷酸链始终 连接在固相载体上，液相中过量的试剂可以过滤除去，因此每步合成循环间不需要进行纯 化(Matteucci andCaruthers, J Amer Chem Soc, 1981 ；103 :3185)。当链合成完毕，粗品寡 核苷酸还需要从载体上切割下来，并脱掉保护。目前有多种固相载体用于寡核苷酸的固相 合成，最常用的是控制孔径玻璃(Controlled Pore Glass, CPG)珠(Adams et al, J Amer Chem Soc, 1983 ；105 661)禾口聚苯乙j；希丰对月旨(McCollum andAndrus，Tetrahedron Lett, 1991 ；32:4069)，其中树脂载体比CPG在氨水条件下进行寡核苷酸的切割和脱保护时更为 稳定。固相合成时多采用核苷3’位羟基连接的琥珀酸酯作为碱切割的位点，该琥珀酸酯 键对碱不稳定，用氨可以从载体上切去，合成完成后，寡核苷酸被定量切下，保留一个游离 的3’羟基。而琥珀酸与固体载体表面羟基的酯化反应则比较困难，产率低，而且该反应需 要在高温下反应很长时间。为了提高载量，所使用的CPG通常采用氨基硅烷化试剂处理，即 将一个氨基烷基链通过硅氧烷键连接到其表面，可以增强反应基团的柔性，减小空间位阻； 而聚苯乙烯通常采用氨基甲基连接臂连接到其表面，核苷3’位羟基连接的琥珀酸羧基可以 共价结合到载体的氨基基团上。但琥珀酸羧基与氨基的缩合依然需要在高温下反应过夜。
而本发明提出的采用包含亚磷酰胺基团及连接臂的核苷琥珀酸酯，即“直接缩合 法”试剂，在固相载体表面羟基或氨基基团上连接核苷的方法，反应条件温和，反应时间短， 可以实现高载量，同时合成的寡核苷酸纯度和产率均较高。与CPG载体合成效果相比，采用 羟基树脂进行合成时，寡核苷酸合成载量和产率明显高于采用CPG合成的产品，并且采用 羟基树脂合成的寡核苷酸n-1杂质明显低于采用氨基树脂合成的产品，而后者又明显低于 采用CPG合成的产品
发明内容
本发明的目的在于利用化学合成方法提供一种能使固相载体表面羟基基团上快 速高效连接核苷的新结构，该结构包含一个亚磷酰胺基团及连接臂的核苷琥珀酸酯，采用 该试剂进行的“直接缩合法”可提高寡核苷酸固相合成效率。根据本发明，上述“直接缩合法”试剂的结构通式为式中R为H时，结构为β -D-呋喃脱氧核苷，R为OH时，结构为β -D-呋喃核苷；B 为碱基，选自腺嘌呤(Α)、鸟嘌呤(G)、胞嘧啶(C)、胸腺嘧啶(T)或尿嘧啶(U) ；η取值为2、 3、6 或 12。本发明中的“直接缩合法”是指，在没有连接首个核苷的载体上直接进行亚磷酰胺 合成循环的寡核苷酸合成方法，这与目前寡核苷酸常用的合成方式不同。目前寡核苷酸合 成的起始物质多是采用已事先连接到固相载体表面的核苷，核苷与固相载体表面氨基的连 接方式是酰胺键。核苷的种类根据待合成寡核苷酸的3’末端首个碱基的种类来确定，这样 在实际合成过程中，核苷单体偶联的次数为理论碱基数目减“ 1”，这种寡核苷酸的合成方法 可以认为是一种“间接”的合成方法。本发明的另一目的在于提供所述的寡核苷酸“直接缩合法”试剂在天然寡核苷酸、 硫代寡核苷酸、RNA及其混合物等化合物分子合成领域中的用途。本发明提出的“直接缩合法”试剂通过化学合成方法制备，包括1)在β -D-呋喃脱氧核苷或β -D-呋喃核苷的呋喃糖环部位3’位羟基与琥珀酸 的一个羧基缩合形成一个具备碱敏感切隔位点的琥珀酸酯结构；2)琥珀酸的第二个羧基基团与连接臂相连接；3)连接臂含有一个氨基基团和一个羟基基团，氨基基团与琥珀酸的羧基基团以酰 胺键进行连接，羟基基团与2-氰乙氧基-N，N- 二异丙基亚磷酰胺以亚磷酸酯键进行连接。根据本发明，结构为β-D-呋喃脱氧核苷时，核苷碱基可以为腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶和胸腺嘧啶，结构为β-D-呋喃核苷时，核苷碱基可以为腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶和尿 嘧啶。根据本发明，反应的连接臂部分由具备游离氨基和羟基基团的氨基醇试剂制得， 结构通式(I)所用氨基醇选自2-氨基乙醇、3-氨基-1-丙醇、6-氨基-1-己醇、12-氨 基-1-十二烷醇；结构通式(II)所用氨基醇选自2_氨基乙氧基-乙醇、3-氨基乙氧 基-1-丙醇、6-氨基乙氧基-1-己醇、12-氨基乙氧基-1-十二烷醇。进一步，本发明 提出的“直接缩合法”试剂用于固相载体表面羟基或氨基基团上高 效快速连接核苷的方法，包括1)提供一种表面具备游离羟基或游离氨基的固相载体，固相载体表面负载羟基或 氨基基团的载量范围在每克载体可合成20 μ mol到300 μ mol的寡核苷酸；2) “直接缩合法”试剂以亚磷酸酯键或亚磷酰胺键共价结合到固相载体表面游离 羟基或氨基上；3)采用封闭试剂对固相载体表面未反应的游离羟基或氨基进行封闭；4)采用氧化或硫化方法使三价亚磷酸酯或亚磷酰胺氧化或硫化成稳定的五价磷 酸酯或磷酰胺。根据本发明，具备游离羟基或游离氨基的固相载体可选自控制孔径玻璃(CPG)、大 孔羟基甲基聚苯乙烯树脂、大孔氨基甲基聚苯乙烯树脂、大孔羟基甲基聚氯苯乙烯树脂、大 孔氨基甲基聚氯苯乙烯树脂；固相载体的孔径范围在500 A到1000 A，粒径范围在25 μ m到 200 μ Hlo根据本发明，封闭试剂可选自醋酐、吡啶和N-甲基咪唑，醋酐和吡啶，苯甲酸酐和
二甲基氨基吡啶。根据本发明，用于亚磷酸酯或亚磷酰胺氧化或硫化的试剂可选自碘的吡啶水溶 液、氢化黄原素的吡啶乙腈溶液、二硫酸四乙基硫脲(TETD)的乙腈溶液等。根据本发明的另一目的，提供一种在固相载体上合成寡核苷酸的方法，包括1)采用“直接缩合法”试剂在固相载体表面羟基或氨基基团上连接核苷；2)在β -D-呋喃脱氧核苷或β -D-呋喃核苷的已知位点上，即DMT保护的5’反应 性羟基上采用标准的亚磷酰胺方法进行寡核苷酸合成循环；3)采用切割用的碱试剂从固相载体上将合成的寡核苷酸切割下来，切割部位为具 备碱敏感切割位点的琥珀酸酯，过滤回收滤液，获得一个具有3’位游离羟基的寡核苷酸粗
女口
广 PFt ο根据本发明，在固相载体上合成的寡核苷酸包括DNA、RNA及其混合物，合成的寡 核苷酸长度不限，范围在1到100个核苷单体，通常为15到30个核苷单体。根据本发明，切割用的碱试剂可选择氨水、电化学生成的碱、氢氧化钠、氢氧化钾、 甲胺、乙胺及其混合物，这样从固相载体表面切割下来的寡核苷酸包括DNA和RNA具有一个
3’羟基。本发明提供的采用“直接缩合法”试剂在固相载体表面羟基或氨基基团上连接核 苷的制备过程可应用于天然寡核苷酸、化学修饰寡核苷酸及RNA等分子的合成。本发明提供的“直接缩合法”试剂应用于寡核苷酸的合成方法，反应条件温和，反 应时间短，可以实现高载量，同时合成的寡核苷酸纯度和产率均较高，采用羟基树脂合成寡核苷酸的载量和产率明显高于采用CPG合成的结果，采用羟基树脂合成的寡核苷酸n-1杂 质明显低于采用氨基树脂合成的产品，而后者又明显低于采用CPG合成的产品。本发明提供的方法可应用于寡核苷酸各个规模的合成，包括从实验室小量制备到 大规模的工业化生产，根据本发明方法制备的寡核苷酸终产品可应用于研究、诊断及治疗 等目的。
图1 “直接缩合法”试剂(I)的合成及在羟基固相载体表面连接核苷方法的示意 图。图中，R = H β -D-呋喃脱氧核苷；R = OH β -D-呋喃核苷；B =碱基，可选自腺嘌呤 (A)、鸟嘌呤(G)、胞嘧啶(C)、胸腺嘧啶⑴或尿嘧啶⑶；η = 2、3、6或12 ;Χ = 0 氧代；X =S 硫代。图2 “直接缩合法”试剂(II)的合成及在氨基固相载体表面连接核苷方法的示意 图。图中，R = H β -D-呋喃脱氧核苷；R = OH β -D-呋喃核苷；B =碱基，可选自腺嘌呤 (A)、鸟嘌呤(G)、胞嘧啶(C)、胸腺嘧啶(T)或尿嘧啶(U) ；η = 2、3、6或12 ;Χ = 0 氧代；X =S 硫代。图3用于制备“直接缩合法”试剂T-氨基己醇亚磷酰胺的代表性化合物。A为脱 氧胸苷琥珀酸酯(T-succinate)，B为N-羟基琥珀酰亚胺，C为6_氨基-1-己醇，D为2-氰 乙氧基_双(N，N- 二异丙基)亚磷酰胺。图4连接核苷的羟基固相载体封闭前后载体表面的变化。A为封闭前，B为封闭后。图5连接核苷的氨基固相载体封闭前后载体表面的变化。A为封闭前，B为封闭后。图6羟基固相载体合成硫代寡核苷酸癌泰得的合成路线图。
具体实施例方式实施例一“直接缩合法”试剂T-氨基己醇亚磷酰胺的制备过程步骤一 T-活泼酯(脱氧胸苷琥珀酸酯琥珀酰亚胺酯，2)的合成T-succinate (1,39. 6g,0. 061mol)溶于干燥的四氢呋喃(450ml)，冰浴冷却至 0 10°C，加入二环己基碳二亚胺(DCC，19. 2g,0. 093mol)和N-羟基琥珀酰亚胺(9. 6g， 0.083mol)，0 10°C搅拌3h。将反应液倒入冰水中搅拌片刻，用乙酸乙酯(600mlX2)提 取。合并乙酸乙酯层，依次用1 3%碳酸钾溶液(300 400ml)和水(500ml X 2)洗涤至 PH中性，无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压浓缩至干，得油状物，用无水乙醚浸泡，得松散白 色固体，抽滤，少量无水乙醚淋洗，得2 (38. Sg,收率85. 8% )。步骤二 T-氨基己醇(3)的合成2(自制，12. Og, 0. 016mol)溶于N，N- 一二甲基甲酰胺(DMF，120ml)，冰浴冷却至 0 5°C，滴加含氨基己醇(1.8g，0.015mol)的甲醇水溶液(120ml，1 l，v/v)，控制滴速大 约30min滴毕，维持此温度，继续搅拌6. 5h。将反应液倒入冰水中搅拌片刻，得到乳白色液 体，用乙酸乙酯(200mlX2)提取。合并乙酸乙酯层，用水(500ml)洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压浓缩至干，得泡状物。用无水乙醚浸泡得3粗品(10. Og)，经硅胶柱层析纯化 (洗脱剂苯丙酮=3 7)得3纯品(5. 8g，收率52.0%)。步骤三T-氨基己醇亚磷酰胺(4)的合成
3(自制，3. Og, 0. 004mol)溶于干燥氯仿(20ml)中，通氮气，磁力搅拌至全溶，冰浴 冷却至0 5°C，加入2-氰乙氧基-双(N，N-二异丙基)亚磷酰胺(2. 6g，0. 0086mol)和 四唑乙腈溶液(10ml，2.8%，v/g)，控制温度在20°C保持90min。反应液减压浓缩至干，力口 入氯仿溶解，用饱和碳酸氢钠溶液(100ml X 2)洗涤，合并水层，水层再用氯仿提取一次，合 并氯仿层，无水硫酸钠干燥。滤液减压浓缩三分之二时，慢慢滴加30 60°C石油醚，有油状 物析出，倾去上清液，再用氯仿溶解油状物，再次滴加石油醚，析出油状物，减压浓缩至干， 再用高真空泵抽至发泡。得白色固体4(3.5g，收率94.6% )。实施例二在固相载体表面羟基上连接脱氧胸苷(T)采用实施例一中自制的4(即“直接缩合法”试剂)溶于无水乙腈中，配制成 0. lmol/L的溶液，活化剂为四唑乙腈溶液(0.25mol/L)。采用OligoPilot II合成仪 (Pharmacia Biotech 公司)，合成柱为 6. 3ml 柱(Pharmacia Biotech 公司)，柱内装载 1. Ig 羟基甲基聚苯乙烯树脂(孔径500埃，粒径范围75微米到150微米)，载体用无水乙腈冲洗 四个柱体积，将4的乙腈溶液和四唑溶液分别以1. 2ml/min和1. 8ml/min的流速同时输入 柱子，持续时间3min，之后用无水乙腈洗涤，采用0.05mol/L碘的吡啶/水溶液(90 10， ν/ν)氧化得到5，无水乙腈洗涤后对载体表面未发生偶联反应的羟基进行封闭，封闭剂采 用吡啶/醋酐/N-甲基咪唑/乙腈(3 2 2 13，ν/ν)溶液，封闭后采用无水乙腈洗 涤，干燥，测定固相载体表面连接核苷的载量。得到的连接有脱氧核糖胸苷的固相树脂载体 即作为实施例三中的起始反应物。实施例三合成硫代寡核苷酸为检测采用本发明方法合成寡核苷酸的有效性，进行下述硫代寡核苷酸的合成 硫代寡核苷酸为以端粒酶催化亚基hTERT为靶的反义寡核苷酸癌泰得(抑制端粒酶活性的 反义寡核苷酸及其应用，专利号ZL981244610)，序列为ACTCACTCAGGCCTCAGACT，磷酸骨架 硫代修饰。所有合成均采用OligoPilot II合成仪(Pharmacia Biotech公司)进行，合成柱 为6. 3ml柱(Pharmacia Biotech公司)，采用实施例二中连接脱氧核糖胸苷的固相载体作 为起始反应物，后续碱基的合成均采用标准亚磷酰胺法进行，合成规模约为200 μ mol。合成 粗品采用55°C氨解12h后过滤定量，在260nm波长下测定紫外吸收值，计算粗品产率。合 成粗品纯度采用IE-HPLC和CGE方法进行检测。载体合成结果为载量106 μ mol/g,产率 1300D/ymol，HPLC和 CGE 纯度分别为 59. 09%和 76. 48%，P = O1 和 n_l 含量分别占 6. 75% 和4. 78%。采用氨基固相载体和CPG同法合成的产品n-1杂质则要明显高于羟基固相载体 合成的产品(分别在5%和7%左右)。
权利要求
提供一种寡核苷酸“直接缩合法”合成用试剂，该试剂包含一个亚磷酰胺基团及连接臂的核苷琥珀酸酯的结构，通式为式中R为H时，结构为β-D-呋喃脱氧核苷，R为OH时，结构为β-D-呋喃核苷；B为碱基，选自腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(G)、胞嘧啶(C)、胸腺嘧啶(T)或尿嘧啶(U)；n取值为2、3、6或12。FSA00000120399000011.tif
2.按照权利要求1所述的“直接缩合法”试剂通过化学合成方法制备，包括1)在β-D-呋喃脱氧核苷或β -D-呋喃核苷的呋喃糖环部位3’位羟基与琥珀酸的一 个羧基缩合形成一个具备碱敏感切隔位点的琥珀酸酯结构；2)琥珀酸的第二个羧基基团与连接臂相连接；3)连接臂含有一个氨基基团和一个羟基基团，氨基基团与琥珀酸的羧基基团以酰胺键 进行连接，羟基基团与2-氰乙氧基-N，N- 二异丙基亚磷酰胺以亚磷酸酯键进行连接。
3.按照权利要求2所述的连接臂部分，由具备游离氨基和羟基基团的氨基醇试剂制 得，结构通式(I )所用氨基醇选自2_氨基乙醇、3-氨基-1-丙醇、6-氨基-1-己醇、 12-氨基-1-十二烷醇；结构通式(II )所用氨基醇选自2_氨基乙氧基-乙醇、3-氨基乙 氧基-1-丙醇、6-氨基乙氧基-1-己醇、12-氨基乙氧基-1-十二烷醇。
4.按照权利要求1所述的“直接缩合法”试剂用于固相载体表面羟基或氨基基团上高 效快速连接核苷的方法，包括1)提供一种表面具备游离羟基或游离氨基的固相载体，固相载体表面负载羟基或氨基 基团的载量范围在每克载体可合成20 μ mol到300 μ mol的寡核苷酸；2)“直接缩合法”试剂以亚磷酸酯键或亚磷酰胺键共价结合到固相载体表面游离羟基 或氨基上；3)采用封闭试剂对固相载体表面未反应的游离羟基或氨基进行封闭；4)采用氧化或硫化方法使三价亚磷酸酯或亚磷酰胺氧化或硫化成稳定的五价磷酸酯 或磷酰胺。
5.按照权利要求4所述的固相载体选自控制孔径玻璃(CPG)、大孔羟基甲基聚苯乙烯 树脂、大孔氨基甲基聚苯乙烯树脂、大孔羟基甲基聚氯苯乙烯树脂、大孔氨基甲基聚氯苯乙 烯树脂；固相载体的孔径范围在500 A到1000 A，粒径范围在25μπι到200 μ m。
6.按照权利要求4提供一种在固相载体上合成寡核苷酸的方法，包括1)采用“直接缩合法”试剂在固相载体表面羟基或氨基基团上连接核苷；2)在β-D-呋喃脱氧核苷或β-D-呋喃核苷的已知位点上，即DMT保护的5’反应性羟 基上采用标准的亚磷酰胺方法进行寡核苷酸合成循环；3)采用切割用的碱试剂从固相载体上将合成的寡核苷酸切割下来，切割部位为具备碱 敏感切割位点的琥珀酸酯，过滤回收滤液，获得一个具有3’位游离羟基的寡核苷酸粗产品。
7.按照权利要求6，合成的寡核苷酸包括DNA、RNA及其混合物。
8.按照权利要求7，合成的寡核苷酸长度范围在1到100个核苷单体。
9.按照权利要求8，合成的寡核苷酸长度范围通常在15到30个核苷单体。
全文摘要
本发明涉及一种寡核苷酸“直接缩合法”试剂的结构及其用途，该结构包含一个亚磷酰胺基团及连接臂的核苷琥珀酸酯，通式为式中R为H或OH，B为碱基，n为2、3、6或12。该试剂的制备方法如下核苷糖环的3’位羟基与琥珀酸的一个羧基缩合形成酯键，琥珀酸的第二个羧基与氨基醇连接臂的氨基以酰胺键进行连接，连接臂上羟基再连接2-氰乙氧基-N，N-二异丙基亚磷酰胺得到。该试剂可分别以亚磷酸酯键或亚磷酰胺键与固相载体表面的羟基或氨基共价结合，之后再氧化或硫化成稳定的磷酸酯或磷酰胺。本发明提供的“直接缩合法”试剂在固相载体表面羟基或氨基上高效快速连接核苷的制备过程可应用于寡核苷酸的合成循环。
文档编号C07H19/073GK101870717SQ201010185499
公开日2010年10月27日 申请日期2010年5月28日 优先权日2010年5月28日
发明者丁雨, 李鲁, 王升启, 鲁丹丹 申请人:中国人民解放军军事医学科学院放射与辐射医学研究所