专利名称：一种抗人SIRPα的单克隆抗体及其细胞株、制备方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明属于医学生物工程技术领域。具体地说，本发明涉及一种抗人信号调节蛋 白α (SIRPa)的单克隆抗体、分泌该单克隆抗体的细胞株及该单克隆抗体的制备方法和 应用。
背景技术：
信号调节蛋白a (SIRPa)是属于免疫球蛋白超家族的成员(IgSF)。在1996年的 MOLECULAR AND CELLULAR BIOLOGY杂志和1997年发表的NATURE杂志中，大鼠的蛋白酪氨 酸磷酸酶 SIRPa 首先被鉴定。SIRPa 也叫 SHPSl、CD172 a、P84、MYDl、BIT、PTPNSl 等，是 一种主要表达于髓系细胞的跨膜蛋白，GeneID :140885。SIRPa胞外区含有三个免疫球蛋 白超家族(IgSF)结构域和多个糖基化位点。其胞浆区在大鼠，小鼠和人之间高度保守，带 有两个免疫受体酪氨酸抑制基元(ITIMs，其特征氨基酸序列为“I/VxYxxL”)，其中包含四 个酪氨酸残基。由于其特殊的细胞定位和结构，决定了它在不同细胞中传递不同的信号，发 挥不同的功能。SIRPa在细胞内传递信号主要通过胞内酪氨酸残基的磷酸化。其胞外区的三个 Ig样结构域SIRP α可被多种有丝分裂原活化而发生磷酸化，如血清、胰岛素、生长因子、 EGF、PDGF以及神经营养因子等。SIRPa被磷酸化后能结合带有SH2结构域的蛋白磷酸酶 SHP-I和SHP-2使之活化，并作为其底物被去磷酸化。SIRPa的胞外区与特异性配体相结 合，也是其实现信号转导功能的重要途径。目前对SIRPa的特异性配体研究比较多的是 另一种膜蛋白CD47。与SIRP α的严格组织细胞表达不同，CD47在大部分细胞类型都有表 达，因此SIRP α与⑶47复合体在SIRP α介导的信号转导中起着重要作用，包括介导细胞 吞噬、迁移和细胞因子分泌等。由于SIRP α的组织分布主要在髓系(巨噬细胞，树突状细胞等)，因此SIRP α在 机体免疫调节中的作用已被日益重视。总的来说，在免疫系统中SIRPa通过与CD47相互作 用发挥负向调节作用。在天然免疫中，LPS可通过转录抑制和蛋白降解途径诱导巨噬细胞中 SIRPa表达下调，SIRPa通过屏蔽SHP-2作用抑制MAPK、IKKs、NF_ κ B和IRF3激活，减少炎 性因子IL_6、TNFa和IFNi^释放。但用SIRPa抗体与SIRP α结合，能促进巨噬细胞分泌 一氧化氮，这从另一方面说明了 SIRPa有可能在天然免疫中起到一定的正向调节作用。在 SIRPa与获得性免疫关系的研究中，利用⑶47-Fc段融合蛋白作为配体与DC表面SIRP a 相互作用，能观察到DC表型和功能的抑制，包括DC成熟标志减少，细胞因子IL-12分泌减 少。DC表面的SIRP α与T细胞表面的⑶47相互结合，双向负调节DC和T细胞功能一方 面，抑制DC活化，下调其抗原递呈能力；另一方面，抑制T细胞增殖和杀伤功能。但是也有 研究用抗-SIRP α抗体刺激SIRP α的胞外区可以有效降低静息性记忆T细胞的增殖。研究 人员还证实了 SIRPa突变体小鼠对实验诱导的自身免疫性脑脊髓炎、胶原性关节炎和2，4 二硝基-1-氟苯诱导的接触过敏有很强的抵抗能力；同样，CD47缺失小鼠也能抑制包括胶原性关节炎和接触性过敏在内的自身免疫性疾病，这说明了 SIRPa在一定程度上促进 自身免疫性疾病的产生。SIRPa的这一功能主要与SIRPa抑制Thl7细胞分泌IL-17相 关，Thl7是机体一类重要的调节性T细胞，是免疫系统反应过激的抑制因素，在SIRP α突 变体小鼠诱导自身免疫性疾病模型中，可以检测到IL-17表达上调。除了对免疫细胞功能 的调节外，SIRPa对免疫细胞的发育也起了至关重要的作用。在小鼠脾细胞中，SIRPa在 CD8a+CDlIc+DCs细胞膜上表达大大强于CD8a_CDllc+DCs，当转基因鼠表达突变SIRP α时，脾 细胞中⑶8a+⑶11 c+DCs比例明显减少。检测SIRPa在临床实践中也有现实意义。SIRPa在某些白血病细胞中下调，检 测SIRP α的表达可以帮助确定其亚型；检测SIRP α的表达可以帮助鉴定DC亚群；检测 SIRPa的表达也可以确定巨噬细胞的活化状态。而现有的SIRP α抗体没有很好的能同时 进行免疫印迹、流式检测和免疫组化检测的。并且现有的功能性SIRP α抗体多为封闭型或 抑制型，而没有激活型的。
发明内容
本发明所要解决的技术问题之一是提供抗人信号调节蛋白a (SIRPa)的单克 隆抗体。本发明所要解决的技术问题之二是提供产生抗人信号调节蛋白a (SIRPa)的 单克隆抗体的杂交瘤细胞株。本发明所要解决的技术问题之三是提供抗人信号调节蛋白a (SIRPa)的单克 隆抗体的制备方法。本发明所要的解决的技术问题之四是提供抗人信号调节蛋白a (SIRPa)的单 克隆抗体在检测SIRP α中的应用。本发明还要的解决的技术问题之五是提供抗人信号调节蛋白a (SIRPa)的单 克隆抗体在制备刺激人巨噬细胞TNF-α等表达药物中的应用。本发明的具体技术方案如下a)合成作为半抗原的多肽，其序列为RVTTVSESTKRENMDFSISISC b)将上述多肽与匙孔嘁血蓝蛋白(KLH)偶联，作为免疫原免疫小鼠；c)取免疫鼠的脾细胞，与小鼠骨髓瘤细胞融合；d)经多轮筛选出与合成多肽反应阳性的细胞克隆，作为抗人SIRPa蛋白单克 隆抗体的杂交瘤细胞株，该杂交瘤细胞株已经于2010年4月12日提交位于中国北京的 中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)保藏，保藏号为=CGMCC No.3801 ；e)通过在小鼠体内接种杂交瘤细胞生产腹水抗体，将腹水进行纯化，得到抗人 SIRPa的单克隆抗体；或者通过体外细胞培养，分离纯化，得到抗人SIRP α的单克隆抗体。本发明提供了一种抗人SIRPa的单克隆抗体，该单克隆抗体由保藏号为 保藏号为CGMCC No. 3801的杂交瘤细胞株产生，其识别位于SIRPa氨基酸序列 RVTTVSESTKRENMDFSISIS 的抗原表位。本发明还提供了一种杂交瘤细胞株，其保藏号为CGMCC No. 3801。本发明还提供了一种抗人SIRPa的单克隆抗体的制备方法，包括体外培养保藏号为CGMCC No. 3801的杂交瘤细胞株，然后从培养液中回收抗人SIRP α的单克隆抗体。 在本发明中，多肽可用多肽合成仪合成。多肽片段可用戊二醛连接法等与KLH等 载体蛋白偶联，作为免疫原免疫小鼠，并用于单克隆抗体筛选。用于分泌抗人SIRP α的单克隆抗体的杂交瘤细胞株可采用本技术领域常规的方 法制备。比如，取经免疫的小鼠或大鼠的脾细胞，与小鼠或大鼠的骨髓瘤细胞如SP2/0细胞 进行融合，经筛选后即可得到杂交瘤细胞。单克隆抗体的获得可采用本技术领域常规的方法。一种方法是，通过在哺乳动物 比如小鼠体内接种杂交瘤细胞产生腹水抗体，取出腹水进行纯化而得到。另一种方法是，通 过体外培养杂交瘤细胞而获得。本发明的杂交瘤细胞株，也称杂交瘤细胞系92CT57. 39. 3，所制备的单克隆抗体是 一种免疫球蛋白，其可特异性结合于人SIRPa蛋白。经鉴定，所制备的免疫球蛋白是IgG 型的单克隆抗体。本发明还提供了上述抗人SIRP α的单克隆抗体在制备检测SIRP α的试剂中的应用。上述抗人SIRPa的单克隆抗体在在制备检测SIRP α的试剂中的应用，其中的检 测是指流式细胞术、Western Blot和免疫组化检测。本发明还提供了上述抗人SIRP α的单克隆抗体在制备刺激人巨噬细胞TNF-α表 达药物中的应用。本发明为SIRPa的临床治疗应用提供了新的思路。应当明确，在本发明中单克隆抗体和单抗系同义语，可以互换使用。本发明的抗人 SIRP α的单克隆抗体有时也以单克隆抗体92CT57. 39. 3表示。
图1是单克隆抗体92CT57. 39. 3流式细胞术检测人SIRPa蛋白的结果。A为同型对照抗体0.4% ;Β为SIRP α单克隆抗体92.8%。图2是单克隆抗体92CT57. 39. 3 Western Blot检测人SIRP α蛋白的结果。A为细胞系Huh-7/hSIRP α -4Υ裂解液；B为细胞系Jurkat裂解液。图3是单克隆抗体92CT57. 39. 3免疫组化检测人SIRP α蛋白的结果。A为肝癌组织(100Χ) ；B为肝癌组织(200Χ)；C为癌旁肝组织(100Χ) ；C为癌旁肝组织(200Χ)。
具体实施例方式下面结合附图及实施例对本发明进行详细描述，但本发明的实施不仅限于此。实施例1 抗人SIRP α的单克隆抗体的制备和纯化1.抗原的合成和偶联抗原多肽设计参考GenBank，GeneID 140885，具体序列为 RVTTVSESTKRENMDFSISISC(SEQ ID NO 1)，由百奇生物科技(上海)有限公司通过多肽自动 合成仪用固相多肽合成法合成。多肽与匙孔嘁血蓝蛋白(KLH)的偶联采用《分子克隆实验指导》第2版，萨姆布鲁克著，金冬雁译，科学出版社，北京，1999，第856页描述的戊二醛连接法。2.单克隆抗体92CT57. 39. 3的制备和纯化将上述1中纯化的多肽KLH偶联物100 μ g以PBS稀释后与等体积完全弗氏佐剂(CFA)混勻乳化，免疫5-6周龄的雌性BALB/c小鼠5只，双肩周围的皮肤下进行皮下注射和 双后腿进行肌肉注射，每个区域大约用1/8的免疫原，将剩余1/2的免疫原进行腹腔注射。 1周后加强免疫50 μ g，完全弗氏佐剂，腹腔注射。2周后加强免疫50 μ g，不完全弗氏佐剂 (IFA)，腹腔注射。3周及以后，每周直接腹腔注射50 μ g加强免疫。第5周起，每周尾静脉 采血，ELISA测定效价，应用多肽KLH偶联物抗原1. 25 μ g/ml包被，10% FCS封闭，将血清稀 释后加入，应用羊抗小鼠IgG标记HRP作为二抗，OPD显色，使用酶标仪(Bio-Rad 550型) 在492nm读数。第3次采血的ELISA结果OD值均大于0.75。取转染了人SIRP α蛋白的稳定细胞 系 Huh-7/hSIRP α -4Υ IX IO6,重悬于 100 μ 1 含 1 % BSA 的 PBS 中，加入 1 μ 1 血清 4°C 作用 30分钟，PBS洗涤2次，重悬于100 μ 1含1 % BSA的PBS中，加入1 μ g PE标记的二抗4°C 作用20分钟，PBS洗涤2次，重悬于500 μ IPBS中，用Beckman Coulter MoFlo XDP流式 细胞仪检测。在免疫小鼠的同时准备小鼠骨髓瘤细胞SP2/0细胞(购自ATCC)。最后一次加强 免疫3天后，取流式检测效果最好的小鼠的脾细胞，与SP2/0细胞比例5 1，在PEG1500 的作用下进行融合反应，植入96孔板，37°C、5% CO2条件下培养。培养14天后，镜下检测 生长出克隆细孔为融合阳性孔，计算总融合率> 95%。尽量选择单克隆细胞孔的上清进行 ELISA检测。ELISA阳性的克隆用流式细胞术检测Huh-7/hSIRP α -4Υ细胞，筛选出来的克 隆亚克隆两次，每次流式检测效果最好的克隆。筛选得到1个克隆92CT57. 39. 3。6-8周龄的雌性BALB/c小鼠用石蜡油腹腔注射10天后，取杂交瘤细胞以2X IO6 个细胞/只进行腹腔注射。7-14天后从小鼠腹腔抽出富含抗体的腹水进行检测和纯化。纯 化采用Protein G亲和层析法。Protein G亲和层析柱用PBS平衡柱子后取腹水过柱，然后 用PBS洗柱至OD值接近零，以50nmol/L的甘氨酸盐酸溶液洗脱，收集洗脱液，测定各收集 管的OD值，保留峰值区的洗脱液，透析纯化。实施例2 抗人SIRP α的单克隆抗体的鉴定和检测应用1.单克隆抗体的类型鉴定利用小鼠单克隆抗体的Ig类与亚类特异性抗体进行ELISA检测，鉴定结果见表1。 结果表明单克隆抗体的重链为IgGl型，轻链为κ链。表1 单克隆抗体92CT57. 39. 3的Ig类与亚类鉴定结果 2.单克隆抗体的流式检测应用1 X 106Huh-7/hSIRP α -4Υ 细胞，重悬于 100 μ 1 含 1 % BSA 的 PBS 中，加入 1 μ g 抗 体4°C作用30分钟，PBS洗涤2次，重悬于100 μ 1含1 % BSA的PBS中，加入1 μ g PE标记 的二抗4°C作用20分钟，PBS洗涤2次，重悬于500 μ IPBS中，用Beckman Coulter MoFlo XDP流式细胞仪检测，检测结果见图1。结果表明，相较于对照同型抗体，该单克隆抗体能特 异性地结合于Huh-7/hSIRP α -4Y细胞。3.单克隆抗体的Western Blot检测应用变性的蛋白样品进行SDS-PAGE蛋白电泳；通过电转仪将蛋白转移至硝酸纤维素 膜(Schleicher&Schcell 公司)；含 5% BSA 的 TBST 封闭 lh，TBST 洗一次，5min ；含 4% BSA 的TBST稀释抗SIRP α单克隆抗体92CT57. 39. 3 一抗(1 μ g/ml)，孵育2h，TBST洗三次， 每次5min ；含4% BSA的TBST稀释IR-800标记的抗小鼠二抗，孵育lh，TBST洗四次，每次 5min;用红外线激光扫描仪Odyssey扫描。结果见图2。结果表明，该单克隆抗体能较为特 异地识别人SIRP α分子。4.单克隆抗体的免疫组化检测应用切片置于60°C恒温箱中烘烤20分钟并脱蜡至水；3% H202 (80%甲醇)室温10分 钟灭活内源性过氧化物酶，PBS洗3次各5分钟；0. OlM枸橼酸钠缓冲溶液(pH6. 0)高压修 复抗原，PBS洗3次各5分钟；山羊血清封闭，室温20分钟，甩去多余液体；滴加以抗体稀释 液稀释的抗SIRP α单克隆抗体92CT57. 39. 3 —抗(10 μ g/ml)，室温孵育2h，PBS洗3次各 5分钟；滴加HRP标记的二抗50 μ 1，室温孵育lh，PBS洗3次各5分钟；DAB显色5_10分 钟，在显微镜下掌握染色程度，PBS洗3次各5分钟；苏木精复染2分钟，盐酸酒精分化，自 来水冲洗10-15分钟；脱水、透明、封片、拍照。结果见图3。结果表明，该单克隆抗体能较 为特异地识别人SIRP α分子。实施例3 抗人SIRP α的单克隆抗体的应用人单核细胞系THP-I细胞4Χ105，培养基中加入lOOng/ml的豆蔻佛波醇乙酯 (PMA)，24小时后换成普通培养基，继续培养48小时，重新换成普通培养基，加入相应抗体 至20μ g/ml，6小时后收集上清，测定其中TNF-α的浓度(使用达科为，DKW12-1720试剂 盒)。结果见表2。结果表明，该抗体能刺激THP-I细胞分泌TNF-α达对照的3倍左右。表2 单克隆抗体92CT57. 39. 3体刺激THP-I细胞后上清中TNF α的浓度测定结 果
权利要求
一种抗人SIRPα的单克隆抗体，其特征在于该单克隆抗体由保藏号为保藏号为CGMCC No.3801的杂交瘤细胞株产生，其识别位于SIRPα氨基酸序列如SEQ ID NO1所示的抗原表位。
2.一种杂交瘤细胞株，其保藏号为CGMCC No. 3801。
3.根据权利要求1所述的抗人SIRPα的单克隆抗体的制备方法，其特征在于该方法 包括体外培养保藏号为CGMCC No. 3801的杂交瘤细胞株，然后从培养液中回收抗人SIRP α 的单克隆抗体。
4.根据权利要求3所述的抗人SIRPα的单克隆抗体的制备方法，其特征在于该方法为a)合成作为半抗原的多肽，其序列如SEQID NO 1所示；b)将上述多肽与匙孔嘁血蓝蛋白偶联，作为免疫原免疫小鼠；c)取免疫鼠的脾细胞，与小鼠骨髓瘤细胞融合；d)经多轮筛选出与合成多肽反应阳性的细胞克隆，作为抗人SIRPα蛋白单克隆抗体 的杂交瘤细胞株，该杂交瘤细胞株保藏号为=CGMCC No. 3801 ；e)通过在小鼠体内接种杂交瘤细胞生产腹水抗体，将腹水进行纯化，得到抗人SIRPa 的单克隆抗体；或者通过体外细胞培养，分离纯化，得到抗人SIRP α的单克隆抗体。
5.根据权利要求1所述的抗人SIRPα的单克隆抗体在制备检测SIRP α的试剂中的应用。
6.根据权利要求5所述的抗人SIRPα的单克隆抗体在制备检测SIRP α的试剂中的应 用，其中的检测是指流式细胞术、Western Blot和免疫组化检测。
7.根据权利要求1所述的抗人SIRPα的单克隆抗体在制备刺激人巨噬细胞TNF-α表 达药物中的应用。
全文摘要
本发明属于医学生物工程技术领域，具体涉及一种抗人信号调节蛋白α(SIRPα)的单克隆抗体及其制备与应用。信号调节蛋白α(SIRPα)是属于免疫球蛋白超家族的成员(IgSF)，组织分布主要在髓系(巨噬细胞，树突状细胞等)，因此SIRPα在机体免疫调节中的作用已被日益重视。本发明提供了一种抗人SIRPα的单克隆抗体，是由保藏号为CGMCC No.3801的杂交瘤细胞株产生的。本发明还提供了该抗人SIRPα的单克隆抗体在制备检测SIRPα的试剂中的应用，以及制备刺激人巨噬细胞TNF-α表达药物中的应用。
文档编号C07K16/18GK101880324SQ201010185140
公开日2010年11月10日 申请日期2010年5月25日 优先权日2010年5月25日
发明者刘琼, 唐亮, 王红阳, 鄢和新 申请人:中国人民解放军第二军医大学