专利名称：抗菌活性物及其制备方法和用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及一株枯草芽孢杆菌菌株ZJU15—Bacillus subtilisZJU15，以及由其发
酵产生的抗菌活性物及相应的制备方法和用途。
背景技术：
食物是人类生存和社会发展的第一物质基础，而食品(农产品)安全是全世界 共同关注的问题，其中，食品防腐保鲜则是食品安全的一个关键。目前普遍使用的化 学食品防腐剂潜在的安全隐患不容忽视，但经长期的研究，发现一些合成防腐剂有诱癌 性、致畸性和易引起食物中毒等问题。随着社会生活水平的不断提高和消费者对健康 的日益关注，人们对防腐剂之类的食品添加剂在安全性能上提出了更高的要求，高效安 全的天然食品防腐保鲜剂的开发与应用是食品科学研究的发展趋势。至今，国内外已 从动物、植物和微生物等各种生物资源开发溶菌酶、乳酸链球菌素(Nisin)、纳他霉素 (Natamycin), ε-聚赖氨酸、茶多酚、香精油、大蒜素、鱼精蛋白、蜂胶、壳聚糖等一 系列可作为天然食品防腐保鲜剂的产品，但由于原料来源、本身的产品性能、制备工艺 和价格等多种因素的限制，目前仅乳酸链球菌(Lactococcus lactis)菌株产生的乳酸链球菌 素等少数微生物源品种获得了市场的广泛认可，得到了较大规模的使用。乳酸链球菌素 是由部分乳酸链球菌菌株产生的细菌素，由34个氨基酸组成，可抑制多种革兰氏阳性细 菌的生长繁殖，并对人体安全无毒。但nisin在生产应用中存在其局限性，如它的最适活 性pH值为3，在碱性条件下溶解度很少，稳定性也差；食品的化学组成和物理性质也可 显著影响Nisin的活性，如新鲜肉中含有的谷胱甘肽能显著降低乳酸链球菌素的活性，而 且肉本身较高pH和磷脂等成分也降低了它的抗菌效果，此外，国际上已发现李斯特菌等 多种食品腐败革兰氏阳性细菌诱变后可对nisin具有较大的抗性。开发新的高效安全的天 然食品防腐保鲜剂是保证食品(农产品)安全的一项重要的任务。同时，自1941年弗莱明从青霉菌中发现第一个广谱抗生素一青霉素以来，链霉 素、氯霉素、红霉素、利福霉素、万古霉素等不同化学结构类型和不同生物活性的抗生 素相继问世，抗生素在临床上的应用成为治疗细菌感染的主要手段，从而挽救了无数人 的生命。然而随着抗生素的广泛使用，细菌的耐药性问题也随之越来越突出，病原菌耐 药性成为感染性疾病引起死亡的主要原因之一，这给临床治疗带来了严重的挑战。研究 和开发新的抑制病原菌的药物变得非常紧迫。在天然抗菌物质中，有一大类属于肽类抗菌剂，它们与抗生素在化学本质、产 生机理、抑菌机理和免疫原性等方面显著不同，其高效安全，而受到人们广泛关注，其 中微生物抗菌肽发酵周期短、生产成本低、抑菌效果好，因此成为研究热点领域。枯草 芽孢杆菌在生长代谢过程中能够产生多种抗菌物质，其中以抗菌肽类为主一类是核糖 体合成的羊毛硫抗生素(bacteriocin)，已经鉴定的有subtilosin、ericin、mersacidin、 subtilin和sublancin等，它们都是由核糖体编码翻译成前导肽后，经过肽酶剪切、翻译后 修饰形成成熟活性多肽。其中subtilin、ericin为一类具线性结构、碱性、长约34个氨
3基酸残基、具有相似的羊毛硫桥的短肽，mersacidin、sublancin、subtilosin呈略碱性或
中性、长约19氨基酸残基、C-末端残基参与共价结合形成类似球形环状的短肽。另一 类为非核糖体合成脂肽类(Iipopeptides)，已经鉴定的有surfactin、iturin和fengycin等 三个家族。这些脂肽的分子结构由环状的7个氨基酸(surfactin和iturin)或10个氨基酸 (fengycin)分别与一个脂肪酸链连接而成。Surfactin的脂肪酸链长度变化由C13到C16， iturin由C14到C17，fengycin由C14到C18，因此每一种脂肽类化合物都有多种同系物。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种利用枯草芽孢杆菌制备而得的抗菌活性物 及其制备方法和用途。为了解决上述技术问题，本发明提供一种抗菌活性物的制备方法，该枯草芽 孢杆菌保藏名称为Bacillus subtilis ZJU15，保藏单位中国典型培养物保藏中心，保 藏地址中国武汉武汉大学；保藏日期2010年4月2日，保藏号CCTCCN0: M2010074 ；依次包括以下步骤1)、制备发酵液取保存于-70°C的 Bacillus subtilis ZJUl5 CCTCC NO M2010074 接种于 LB 培养 液(LB液体培养基)中，30°C、200rpm/min振荡培养12小时，得种子培养液；将上述种子培养液以5%的体积比浓度接种于LB培养液中，在30°C、200rpm/ min振荡培养30小时，获得发酵液；2)、将发酵液以6000 8000rpm/min离心20min，在所得上清液中按照10.5 11.5g硫酸铵/IOOml上清液的投料比加入固体硫酸铵，0°C 4°C下放置10 14小时； 然后再以11000 14000rpm/min离心10 20min，得沉淀；将所得沉淀用灭菌蒸馏水悬 浮，灭菌蒸馏水的用量是上清液体积的1/20 (ν/ν)；然后再以11000 14000rpm/min离 心取上清，即得抗菌粗提液；3)、将上述抗菌粗提液经Sephadex G-75柱层析，收集具有抗菌活性的峰尖洗脱 液，经Mill Q水透析后，冷冻真空干燥，得抗菌活性物。作为本发明的抗菌活性物的制备方法的改进Superdex 75 prep grade柱层析方法 为将0.5ml枯草芽孢杆菌ZJU15的抗菌粗提液经冷冻真空干燥后，重新悬浮于0.3ml洗 脱溶液A中，上样进行Superdex 75 prep grade柱层析，洗脱溶液A为含0.15M NaCl的 20mM磷酸缓冲液(pH 7.0)，流速为l.OmL/min，按照lml/管的格式分管收集洗脱液， 以单增李斯特菌为指示菌测定抗菌活性，获得一个活性峰，收集具有抗菌活性的峰尖洗 脱液3ml，经Mill Q水4°C透析6次，每次2h，然后冷冻真空干燥。作为本发明的抗菌活性物的制备方法的进一步改进，LB培养液为蛋白胨IOg/ L，NaCl 10g/L,酵母提取物5g/L，其余为蒸馏水，于121°C灭菌20分钟，pH7.0。蛋白胨可购自Oxoid公司，酵母提取物可购自Oxoid公司。作为本发明的抗菌活性物的制备方法的进一步改进，抗菌活性测定方法为采 用琼脂扩散法(AgarDiffiutionAssay)检测拮抗活性。本发明还同时提供了利用上述方法制备而得的抗菌活性物。本发明还同时提供了该抗菌活性物的用途用于抑制或消灭单增李斯特菌。
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在本发明中，含0.15M NaCl的20mM磷酸缓冲液(pH 7.0)的制备方法如下按 照标准方法配制0.2M磷酸缓冲液(PH7.0)，然后将其稀释10倍就形成了 20mM磷酸缓冲 液(pH7.0)，再添加NaCl，直至NaCl的摩尔浓度为0.15M。在本发明的Superdex 75 prep grade柱层析方法中收集具有抗菌活性的峰尖洗
脱液3ml是指一个检测出具有活性的吸收峰(称为活性峰)，收集其中活性相对最大的3 管(3ml)。经过Superdex 75 prep grade层析柱层析所得的冷冻干燥活性产物(抗菌活性 物)，经检测，以单增李斯特菌作为指示菌，其l.Oug/ml相对抗菌活性(the arbitrary unit, AU)达到25，而l.Oug/ml乳酸链球菌素(Nisin，有效成分)的AU为8。 本发明中所用到的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis) ZJUl5的保藏名称为 Bacillussubtilis ZJUl5,保藏单位中国典型培养物保藏中心，保藏地址中国武汉武汉 大学；保藏日期2010年4月2日，保藏号CCTCC NO: M2010074。本发明的抗菌活性物实际使用时，一般在每ml液体中添加4.0 12.0ug抗菌活 性物，即可达到抑制或消灭液体中的单增李斯特菌的目的。
下面结合附图对本发明的具体实施方式
作进一步详细说明。图1是枯草芽孢杆菌ZJUl5菌株抗菌物的Hypersil ODS2色谱洗脱图；图中A， B，C表示三个具抗菌活性的洗脱峰。
具体实施例方式实施例1、抗菌活性物的制备方法，依次进行以下步骤1)、制备发酵液用接种环取一环保存于-70°C的 Bacillus subtilis ZJUl5 CCTCC NO M2010074 接种于50ml的LB液体培养基中，30°C、200rpm/min振荡培养12小时，得种子培养液；LB液体培养基为蛋白胨10g/L，NaCl 10g/L,酵母提取物5g/L，其余为蒸馏 水，于121°C灭菌20分钟，pH7.0。将上述种子培养液以5%的体积比浓度接种于LB液体培养基中，在30°C、 200rpm/min振荡培养30小时，获得发酵液；2)、将发酵液以7000rpm/min离心20min，在所得上清液中按照1 Ig硫酸铵 /IOOml上清液的投料比加入固体硫酸铵，4°C下放置10 12小时；然后再以12000rpm/ min离心15min，得沉淀；将所得沉淀用灭菌蒸馏水悬浮，灭菌蒸馏水的用量是上清液体 积的1/20 (ν/ν)；然后再以12000rpm/min离心取上清，即得抗菌粗提液；3)、将上述抗菌粗提液经Superdex 75 prep grade柱层析，具体如下Superdex 75 prep grade柱层析方法为将0.5ml枯草芽孢杆菌ZJU15的抗菌粗 提液经冷冻(-70°C )真空干燥后，重新悬浮于0.3ml的洗脱溶液A进行Superdex 75 prep grade柱层析，洗脱溶液A为含0.15M NaCl的20mM磷酸缓冲液(pH 7.0)，流速为l.OmL/ min,分管收集洗脱液(lml/管)，以单增李斯特菌为指示菌测定抗菌活性，获得一个活 性峰，收集具有抗菌活性的峰尖洗脱液3ml，经Mill Q水4°C透析6次，每次2h，透析后冷冻真空干燥；得抗菌活性物。实施例2、对实施例1所得的抗菌活性物进行RP-HPLC色谱纯化RP-HPLC色谱纯化方法为将经Superdex 75 prep grade层析柱层析所得的冷冻 干燥产物(即抗菌活性物，实施例1所得)，用150 μ L洗脱溶液B进行悬浮，洗脱溶液 B为在体积浓度为90%的甲醇水溶液中添加乙酸，乙酸与甲醇水溶液的体积比为0.05%; 然后取20 μ L悬浮液进行Hypersil ODS2色谱柱层析(购自大连依利特公司)，用洗脱溶 液B进行洗脱，流速为l.OmL/min，收集各个洗脱峰，测定对李斯特菌的抗菌活性。具 有抗菌活性的三个洗脱峰洗脱时间分别为11.762Min，12.767Min, 14.340Min,分别命名 为 ZJU15A、ZJU15B 和 ZJU15C。如图 1 所示。所得的抗菌肽ZJU15A、ZJU15B和ZJU15C提交中国人民解放军军事医学科学院 生物医学分析中心进行质谱分析，首先进行MALDI-TOF-MS质谱扫描分析确定纯度(扫 描范围50-5000Da)。再进行Q-T0F2 —级质谱扫描，得到LC-ESI-MS图。从ESI-MS 图中选出待测离子，然后进行ESI-MS/MS分析。该质谱图经Micromass的专用软件 MaxEnt3转换后。借助Micromass的专用软件Peptide Sequencing直接推导出肽段序列。 结果分析显示枯草芽孢杆菌ZJU15菌株产生的三个抗菌活性成分的氨基酸序列分别为ZJUl5A (SEQ ID NO 1)Leu1-Leu2-Glu3■ τ 4 -LeuT ￡ -Leu-Pro-Val7‘τ ε -Leuτ 9 -Leu
ZJUl5B (SEQ ID NO 2)Leu1-Leu2-Glu3-Leu4-Leu5-Pro6-Val7-Leu8-Leu9
ZJUl5C (SEQ ID NO 3)Leu1-Thr2-His3--Met4--Leu5-Val6--Pro7·-Leu8--Leu9 ο实施例3、抗菌肽的抗菌活性测定采用琼脂扩散法(Agar Diffiution Assay)检测拮抗活性。在未凝固的TSBYE固
体培养基中按接入指数生长期单增李斯特菌(OD6(K^(U)，终浓度alOTCFUmr1，倒 平板。用孔径为5_的打孔器打孔，每孔加10 μ 1各洗脱峰液。37°C下培养过夜，观 察抑菌作用，收集相对应的具抑菌作用的脱峰液。实施例4、抑菌活性的计算方式采用琼脂扩散法(Agar Diffiution Assay)检测拮抗活性。在未凝固的TSBYE固 体培养基中按(体积比)接入指数生长期单增李斯特菌(OD6tltMU),终浓度MO7CFU mr1，倒平板。用孔径为5mm的打孔器打孔，每孔加10 μ L的抗菌活性物的悬浮液，经 检测，其1.0ug/ml相对抗菌活性(the arbitrary unit，AU)达到25，而1.0ug/ml乳酸链球 菌素(Nisin，有效成分)的AU为8。实施例5、在巴氏灭菌牛奶(市购)中接种指数生长期的单增李斯特菌至终浓度 ^lO7CFU ml—1后，添加冷冻真空干燥产物(抗菌活性物，实施例1所得)至5.0Ug ml—1， 37°C下放置24小时后检测发现可完全抑制其微生物生长；添加冷冻真空干燥产物至 lO.Ougmr1, 37°C下放置24小时后检测发现可杀死牛奶中的单增李斯特菌。最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然， 本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开 的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。
权利要求
1. 一种抗菌活性物的制备方法，其特征是，所用枯草芽孢杆菌保藏名称为 Bacillussubtilis ZJUl5,保藏单位中国典型培养物保藏中心，保藏地址中国武汉武汉 大学；保藏日期2010年4月2日，保藏号CCTCCNO : M2010074 ；依次包括以下步 骤1)、制备发酵液取 Bacillus subtilis ZJUl5 CCTCC NO M2010074 接种于 LB 培养液中，30 "C、 200rpm/min振荡培养12小时，得种子培养液；将上述种子培养液以5%的体积比浓度接种于LB培养液中，在30°C、200rpm/min振 荡培养30小时，获得发酵液；2)、将发酵液以6000 8000rpm/min离心20min，在所得上清液中按照10.5 11.5g 硫酸铵/IOOml上清液的投料比加入固体硫酸铵，0°C 4°C下放置10 14小时；然后再 以11000 14000rpm/min离心10 20min，得沉淀；将所得沉淀用灭菌蒸馏水悬浮， 所述灭菌蒸馏水的用量是上清液体积的1/20 ；然后再以11000 14000rpm/min离心取上 清，即得抗菌粗提液；3)、将上述抗菌粗提液经SephadexG-75柱层析，收集具有抗菌活性的峰尖洗脱液， 经Mill Q水透析后，冷冻真空干燥，得抗菌活性物。
2.根据权利要求1所述的抗菌活性物的制备方法，其特征是所述Superdex 75 prep grade柱层析方法为将0.5ml的抗菌粗提液经冷冻真空干燥 后，重新悬浮于0.3ml洗脱溶液A中，上样进行Superdex 75 prep grade柱层析，洗脱溶液 A为含0.15MNaCl的20mM磷酸缓冲液(pH 7.0)，流速为1.0mL/min，按照Iml/管的格 式分管收集洗脱液，以单增李斯特菌为指示菌测定抗菌活性，获得一个活性峰，收集具 有抗菌活性的峰尖洗脱液3ml，经Mill Q水4°C透析6次，每次2h，然后冷冻真空干燥。
3.根据权利要求2所述的抗菌活性物的制备方法，其特征是所述LB培养液为蛋 白胨10g/L，NaCl 10g/L,酵母提取物5g/L，其余为蒸馏水，于121°C灭菌20分钟， pH7.0。
4.利用如权利要求1 3中任意一种方法制备而得的抗菌活性物。
5.如权利要求4所述的抗菌活性物的用途，其特征是用于抑制或消灭单增李斯特菌。
全文摘要
本发明公开了一种抗菌活性物的制备方法，所用枯草芽孢杆菌保藏名称为Bacillussubtilis ZJU15，保藏单位中国典型培养物保藏中心，保藏地址中国武汉武汉大学；保藏日期2010年4月8日，保藏号CCTCCM2010074；依次包括以下步骤1)制备发酵液；2)将发酵液离心、加入固体硫酸铵等处理后，得抗菌粗提液；3)将上述抗菌粗提液经Sephadex G-75柱层析，收集具有抗菌活性的峰尖洗脱液，经Mill Q水透析后，冷冻真空干燥，得抗菌活性物。本发明方法制备而得的抗菌活性物用于抑制或消灭单增李斯特菌。
文档编号C07K1/16GK102010884SQ201010202380
公开日2011年4月13日 申请日期2010年6月13日 优先权日2010年6月13日
发明者林文凭, 许松伟, 陈卫良 申请人:兰州伟日生物工程有限公司, 浙江大学