用于肿瘤血管系统的归巢肽的制作方法

专利名称：用于肿瘤血管系统的归巢肽的制作方法
用于肿瘤血管系统的归巢肽相关申请的交叉引用本申请依照35U. S. C. § 1. 119(e)要求享有于2009年7月四日提交的美国临时申请号61/2 ，606的权益，该临时申请的全部内容通过引用并入本文。
背景技术：
消化道肿瘤，特别是结直肠癌(CRC)是全世界最常见的第三大恶性肿瘤，并且是癌症死亡的第四大病因。因为早期的诊断是困难的，所有阶段的5年总存活率是40-60%， 以及超过一半的结直肠癌患者最终会出现局部的复发和/或远处的转移。此外，目前的化疗是非组织特异性的，并且通常会产生严重的全身毒性。因此，改进早期诊断的方法以及进一步确定选择性地靶向消化道癌组织的新治疗策略是亟需的。肿瘤不能在无血供的情况下生长，这是公知的。为此，新生血管从已存在的血管的生长，即血管生成对于肿瘤生长是必需的。已有大量的证据表明肿瘤血管系统表达将其从结构和生理学方面与正常血管系统区分开的独特标志物。血管细胞在遗传学角度是稳定的。因此，抗血管生成疗法对于消化道肿瘤的治疗提供了比现存疗法更有效、毒性更低的有前景的方法。本发明产生于利用噬菌体文库的体内生物淘选。体内噬菌体展示技术已经被成功用作鉴定选择性归巢至肿瘤血管系统的肽的工具。通过该方法选择的归巢肽已经被用作用于癌症的药物载体和成像剂。发明概述本发明提供了 9肽(CTPSPFSHC Seq. ID. No. 1)，其与支持消化道肿瘤的肿瘤血管系统选择性结合。该归巢肽既具有诊断用途，又具有治疗用途。利用包含随机肽文库的噬菌体，通过体内生物淘选发现了本发明的归巢肽。我们利用该技术鉴定了识别在BALB/C小鼠中建立的原位结直肠癌的血管系统的肽。将展示在 Ml3噬菌体上的CX7C文库通过尾静脉注射入携带原位结直肠癌的小鼠中以实现选择。体内选择四轮后，通过这一方式选出了特异性噬菌体(CTPSPFSHC噬菌体)。该噬菌体被发现选择性归巢至结肠癌肿瘤，比其他器官高10-90倍。已表明，通过该噬菌体展示的合成肽当与 CTPSPFSHC(TCP-I)噬菌体共注射入动物时，抑制了噬菌体向肿瘤块的归巢能力。同时，免疫染色分析表明，TCP-I噬菌体和FITC标记的合成肽能够与血管系统标志物⑶31共定位，并聚集在结直肠癌组织中，而不是正常对照组织中。在人类结直肠癌组织中观察到相似的结果。该肽对于鉴定结肠癌是有用的，并且用作靶向肿瘤血管系统的抗癌剂载体。对于后一目的，与用未偶联的TCP-I肽或用载体处理的对照相比，嵌合肽的全身给药导致了半胱天冬酶3 (一种凋亡标志物)在肿瘤血管系统中的更多表达，该嵌合肽由与促凋亡肽D (KLAKLAK) 2 连接的归巢肽TCP-I组成。本发明提供了消化道肿瘤血管归巢蛋白(homing protein)，其包含至少一个拷贝的由名为TCP-I的CTPSPFSHC(kq. ID. No. 1)组成的靶向或归巢结构域。归巢蛋白的分子量可以为Ι-lOOkDa。该蛋白可以具有2-10个或更多个TCP-I的重复拷贝。任选地，归巢蛋白与药学上可接受的成分混合以形成药物组合物。药物组合物可以是无菌的，并可以保持在生理PH为6-8的缓冲液中。该蛋白可以制备为冻干粉末或在无菌的水性液体中。本发明还提供了用可检测的标记物或治疗剂功能化的上述归巢蛋白。可检测的特征可以包括选自荧光团、不透射线的染料、磁成像造影剂和放射性标记物的可检测的部分。 治疗特征可以是选自烷化剂、双功能烷化剂、非留醇类芳香酶抑制剂、免疫治疗剂、亚硝基脲化合物、抗代谢药、抗肿瘤抗生素、有丝分裂抑制剂、放射物、拓扑异构酶I抑制剂和抗雌激素的抗癌剂。上述功能部分可以直接或间接与包含TCP-I的蛋白结合或融合。功能部分可以通过共价键与归巢蛋白融合或通过离子键与归巢蛋白结合。本发明还包括利用包含TCP-I结构域的归巢蛋白来检测消化道肿瘤的方法，其中该方法包括将携带实体肿瘤的哺乳动物的消化道与一定量的、包含至少一个拷贝的由 CTPSPFSHC组成的结构域的消化道肿瘤血管归巢蛋白接触，所述实体肿瘤位于哺乳动物的消化道并被肿瘤诱导的血管系统环绕，所述归巢蛋白与可检测的部分连接，其中所述一定量足以检测环绕肿瘤的肿瘤诱导的血管组织；以及包括检测肿瘤诱导的血管组织中的归巢蛋白。用于检测肿瘤的归巢蛋白可以存在于上文描述的TCP-I组合物的任一实施方案中， 包括上述的可检测部分。该方法还包括通过静脉注射将肿瘤与归巢蛋白接触。肿瘤可以位于消化道的任何部分，包括食管、胃和肠。本发明还提供了降低患者实体肿瘤负荷的方法，所述患者携带位于其消化道并被肿瘤诱导的血管系统环绕的实体肿瘤，所述方法包括给予一定量的包含上述消化道血管归巢蛋白的治疗剂，其中所述蛋白与能够降低患者肿瘤负荷的抗癌剂连接，以及其中给予患者的所述一定量的治疗剂足以降低患者的肿瘤负荷。该方法优选用于治疗癌。优选的抗癌剂如上文所列的那些。本发明的目的是通过鉴定能够选择性地靶向肿瘤血管系统的肽，提供检测和治疗消化道实体肿瘤的改善方法。附图简述

图1描述了(A)小鼠中肉眼可见的结直肠肿瘤；⑶肿瘤发生的显微确认以及(C) 利用体内生物淘选技术的肿瘤特异性噬菌体的噬菌体回收结果。图2描述了对TCP-I的结直肠肿瘤特异性的验证，(A) TCP-I噬菌体；(B) TCP-I噬菌体相对于对照噬菌体；(C)TCP-I噬菌体相对于TCP-I肽；(D)在结肠沈结直肠肿瘤和结肠26皮下肿瘤(sc)之间比较TCP-I噬菌体；(E)在结肠沈原位模型与HT-四皮下模型之间比较TCP-I噬菌体的结合特异性；以及(F)在结肠沈原位模型与HCT-116皮下模型之间比较TCP-I噬菌体的结合特异性。图3描述了 TCP-I噬菌体的生物分布。(A)比较无插入噬菌体(对照)和TCP-I 噬菌体在不同小鼠组织中的结合，以及(B)利用具有不同荧光团的多种染色剂的TCP-I噬菌体和对照噬菌体的荧光谱图。图4描述了 TCP-I肽在多种组织中的生物分布。图5描述了 TCP-I肽的器官水平检测。㈧描述了 TCP-I在结直肠肿瘤中相对于其他器官的选择性结合；以及(B)描述了 TCP-I在不同大小的结直肠肿瘤中的选择性结合； (C)TCP-I肽荧光保持在肿瘤组织的血管系统中，而不是在对照器官中。FITC-标记的对照肽在肿瘤组织中没有检测到。图6 描述了与促凋亡肽 kq. Id. No. 2 [TCP-GG-d (KLAKLAK)2]偶联的 TCP-1 对半胱天冬酶3裂解的影响。(A)描述了偶联的组合物CDK与未偶联的(DKK)和磷酸缓冲盐的促凋亡活性(裂解)的荧光谱图；(B)对用偶联的TCP-I处理的凋亡血管系统的定量；以及 (C)对正常结肠组织中凋亡血管系统的检查；(D)对脑组织中凋亡血管系统的检查。CDK: TCP-GG-d (KLAKLAK) 2、DKK =TCP-I 和 D (KLAKLAK)2 的混合物。图7描述了(A和B)来自肿瘤组织的冰冻切片的H&E染色以确认肿瘤形成；(C和 D)归巢噬菌体相对于无插入的对照噬菌体向胃肿瘤的体内聚集；以及(E)与裸鼠胃部的原位肿瘤相比，TCP-I归巢噬菌体不能选择性地聚集到皮肤中的MKN45细胞的皮下(sc)肿瘤上。图8描述了肿瘤组织和对照器官的冰冻切片，以证实CTPSPFSHC-噬菌体位于胃癌组织中，而不是对照器官中。图9描述了 CTPSPFSHC-噬菌体与胃癌组织中的⑶_31阳性内皮细胞共定位，而不与对照器官中的血管共定位。图10描述了肿瘤和对照组织的冰冻切片。血管用⑶31抗体缀合的Alexa-568和 FITC-标记的TCP-I染色。图11. TCP-I噬菌体能够内化入体外的结肠癌细胞中。图12. TCP-I能够增强促凋亡肽对体外小鼠结肠癌细胞的凋亡作用。(A)暴露于 TCP-I缀合物后，与细胞死亡有关的形态学变化；(B)结肠沈细胞的细胞活力被TCP-I缀合物抑制。CDK TCP-GG-d(KLAKLAK)2，DKK (KLAKLAK)2。图13. TCP-I能够增强促凋亡肽对体外人结肠癌细胞的凋亡作用。(A)暴露于 TCP-I缀合物后，与细胞死亡有关的形态学变化；(B) Sffl 116细胞的细胞活力被TCP-I缀合物抑制。CDK TCP-GG-d (KLAKLAK) 2, DKK :D (KLAKLAK) 2。图14.用TCP-I肽处理的小鼠体重的变化，通过静脉注射给予小鼠TCP-I肽 (100 μ g/小鼠)，隔天一次，总共8次剂量。图15.注射TCP-I (i. v. 100 μ g/小鼠)8次剂量后，测量TCP-1对小鼠血液学参数的影响。图16.注射TCP-I (i. v. 100 μ g/小鼠)8次剂量后，测量TCP-1对小鼠肝功能的影响。图17.注射TCP-I (i. v. 100 μ g/小鼠)8次剂量后，测量TCP-1对小鼠肾功能的影响。图18.小鼠用TCP-I注射(i. v. 100 μ g/小鼠)8次剂量处理后的组织学检查。发明详述本发明提供了 9个氨基酸的蛋白结构域，其具有与响应于消化道肿瘤而生长的血管系统选择性结合的能力。该肽，TCP-1，在多种应用中是有用的。它能够作为诊断工具或作为用于将化疗剂聚集至消化道肿瘤的递送工具。下文的描述提供了获得TCP-1、如果修饰它以用于特定用途以及如何配制和将其给予患者的细节。1.定义“消化道”指消化系统的粘膜内衬的管状通道，食物通过该通道进入身体，在消化道内发生消化和吸收，并且通过消化道排出废物。它从口延伸至肛门，并且包括咽部、食管、 胃、小肠、盲肠和大肠。
“消化道肿瘤血管归巢蛋白”指包含与肿瘤诱导的血管系统上的肿瘤标志物选择性结合的结构域的蛋白，其中所述肿瘤位于哺乳动物的消化道。“选择性结合”或者“选择性归巢”指通过合适的比较性对照所确定的非特异性结合事件。当结合比比较性对照中的背景结合高出至少约10、30或40倍时，该结合就是选择性的。选择性结合或选择性归巢通常能够通过以下来证实测定归巢蛋白与所选组织的结合是否是相对特异性的。对于TCP-1，可以将癌组织中特定消化道肿瘤血管归巢蛋白的量与该归巢蛋白在对照器官或组织中聚集的量进行比较。例如，表达CTPSPFSHC的噬菌体在癌组织中的富集与诸如正常心脏组织、正常脑组织、正常结肠组织、正常胃组织的对照组织相比至少为2倍、3倍或4倍(参见实施例4、5和9)。“烷化剂”是指导致氢被烷基取代的化合物，并且根据它们的亲核性或亲电子性分类。亲核性烷化剂递送等量的烷基阴离子(负碳离子)。亲电子性烷化剂递送等量的烷基阳离子。亲电子的可溶烷化剂经常是细胞毒性的，并且是高反应性的。烷化剂通过与DNA 反应抑制细胞分裂，并且用作抗肿瘤剂。烷化剂通过三种不同的机理发挥作用，以实现DNA 功能的破坏和细胞死亡。烷基与DNA碱基的附着通过DNA修复酶导致DNA片段化。烷基化的碱基阻止从受损DNA进行DNA合成和RNA转录。横桥结构在DNA的原子之间、在单分子 DNA内或两个不同DNA分子之间形成了共价键。交联阻止了双螺旋解开以用于合成或转录。 烷基化的碱基诱导核苷酸的错配，配对如果不正确的话，可能会导致永久性突变。烷化剂的一些实例有氮芥(双(氯乙基)胺、苯丁酸氮芥和环磷酰胺)、顺钼、亚硝基脲(亚硝脲氮芥、环己亚硝脲和甲基环己亚硝脲)、烷基磺酸酯(白消安)、乙撑亚胺(氮杂环丙烷、噻替派)、以及三嗪(达卡巴嗪)。“抗代谢药”是与在正常代谢功能中的特定代谢物竞争、取代该代谢物、抑制或拮抗该代谢物的利用的化学物质，其作为必需营养物的结构类似物发挥作用。这些化疗化合物使细胞生长和细胞分裂停止。这些药物的主要代表有嘌呤类似物(6-巯基嘌呤(6MP)、 咪唑硫嘌呤)、嘧啶类似物(5-氟尿嘧啶(6-TG)、5-氮杂胞啶)和抗叶酸拮抗物(氨甲喋呤)。“抗肿瘤抗生素”指通过干扰DNA、RNA或核糖体蛋白合成阻断细胞生长的抗癌药物。也被称为抗癌抗生素和抗瘤抗生素。它们包括例如多柔比星、阿霉素、柔毛霉素、表柔比星、放线菌素、博来霉素、丝裂霉素、米托蒽醌、普卡霉素等。“抗雌激素”指雌激素拮抗剂或雌激素受体调节剂，其为阻断雌激素活性的物质， 所述雌激素是促进雌性性状发育和维持的激素家族。抗雌激素是一类激素拮抗剂，要么通过对靶组织产生拮抗效应起作用，要么通过与雌激素在细胞水平竞争雌激素受体发挥作用 (它莫西芬)。“选择性雌激素受体调节剂”或SERM是“抗雌激素”药剂，其在一些组织中的作用类似雌激素(激动剂)，但在其他组织中阻断雌激素作用(拮抗剂)。“选择性雌激素受体下调剂”(SERD)或“纯”抗雌激素包括在所有组织中均阻断雌激素活性的药剂。“双功能烷化剂”指在分子相对端具有两个反应基团的烷化剂，其形成导致链内或链间交联的DNA加合物。“生物活性部分”指有生物活性的或相关的并融合到消化道肿瘤血管归巢蛋白的任何有机的、无机的或活的物质。生物活性部分可以是蛋白、多肽、多糖(例如肝素)、寡糖、 单糖或双糖、有机化合物、有机金属化合物或无机化合物。它可以包括活的或老化的细胞、细菌、病毒或以上的一部分。它可以是激素、生长因子、产生生长因子的病毒、生长因子抑制齐U、生长因子受体、抗炎剂、抗代谢药、整合素阻断剂、或者完整或部分功能的无义或反义基因。当间接融合到蛋白时，该部分还可以包括人工颗粒或材料，其携带生物相关或生物活性的材料。实例是纳米颗粒，其包含带有药物的核心以及核心上的包被。生物活性部分包括能够对生物有机体具有治疗作用的的药物诸如化学或生物化合物。“共价键”指化学键的一种形式，其特征在于原子间或者原子与其他共价键之间共享电子对。“结构域”指较大分子的亚结构。它通常用于代表蛋白内的氨基酸残基或者核酸内的碱基。蛋白结构的结构域是蛋白的一部分，它能够独立于该蛋白链或结构的其余部分折叠、发挥作用和存在。“荧光团”指能够发荧光的分子或功能基团。分子内的荧光染料功能基团会吸收特定波长的入射光，并作为响应以不同的特定波长再发射能量。“免疫治疗剂”指在治疗疾病中在治疗上增强或抑制免疫系统的功能部分。这一概念涵盖多种治疗模式，包括主动和被动免疫、疫苗、人工免疫抑制或免疫增强、非特异性全身免疫刺激剂和佐剂、对过敏原脱敏、骨髓移植、胸腺移植、细胞因子或免疫缀合物的治疗、 以及淋巴细胞消减疗法。“离子键”指通过两个带相反电荷的离子之间的吸引而形成的键，它涉及通过静电吸引的金属和非金属离子。金属贡献一个或多个电子，形成带正电荷的离子或阳离子。这些电子被贡献给非金属，从而使非金属形成带负电荷的离子或阴离子。因此原子通过带相反电荷的正离子和负离子之间的吸引力结合在一起形成键。“冻干粉末”指由通过冷冻和随后在高真空蒸发水分而由生物物质干燥形成的粉末。“磁性成像造影剂”指用于磁共振成像(MRI)的组合物。成像造影剂的作用是在从样本内的不同位置回收的信号的强度方面产生差异。这取决于激发的核素(通常是水质子)的相对密度，以及取决于脉冲后那些核素弛豫时间的差异。造影介质或造影剂改变(缩短)了这些弛豫参数。可以静脉注射造影剂以增强血管、肿瘤或炎症的表观。“有丝分裂抑制剂”也称抗有丝分裂剂或抗微管剂，其通常是在细胞周期的M期通过破坏微管蛋白聚合、导致微管形成的稳定化来阻止细胞经历分裂。有丝分裂抑制剂是一类衍生自天然物质诸如植物碱类的药物，并且主要用于癌症治疗。经常用于治疗癌症的有丝分裂抑制剂的实例包括紫杉醇、多烯紫杉醇、长春花碱、长春新碱和长春瑞滨。“亚硝基脲化合物”与烷化剂类似，抑制DNA修复所需的酶。亚硝基脲类是亲脂性的，因此能够跨越血脑屏障，所以亚硝基脲类经常用于化疗以治疗脑部肿瘤和非霍奇金氏淋巴瘤、多发性骨髓瘤、以及恶性黑色素瘤。亚硝基脲类的实例有亚硝脲氮芥、环己亚硝脲和链脲菌素。“非留醇类芳香酶抑制剂”抑制芳香酶，该酶是负责雌激素生物合成的最后一步的细胞色素P450酶。该酶通过芳构化将雄激素转化为雌激素。非留醇类芳香酶抑制剂 (NSAIs)是芳香酶的竞争性抑制剂。在绝经后妇女中，大多数体内的雌激素在肾上腺由雄激素转化而产生。因为一些乳腺癌响应于雌激素，在单独的抗雌激素治疗或多重激素治疗无效的绝经后患者中，利用芳香酶抑制剂降低雌激素水平已被证明在激素依赖的乳腺癌治疗中是有效的。使用的一些芳香酶抑制剂包括瑞宁得(arimidex)(阿那曲唑(anastrozole)) 和弗隆(femara)(来曲唑(Ietrozole))。“药学上可接受的组合物”指除治疗剂外还包含辅助剂的组合物。它们是医疗应用可接受的无毒试剂，以及选自药学上可接受的载体、稀释剂、盐、缓冲液或赋形剂，诸如无菌盐水或其他介质、水、明胶、油等。本发明的药物组合物可以是溶液或冻干产物。“不透射线的染料”也被称为不透射线的造影介质或辐射照相造影介质，它们不允许X线或其他辐射通过。它们用于放射学以增强X线图像，从而在X线检查时显示某些器官的轮廓或显示诸如心室、血管、呼吸道和胆道的中空器官内部的轮廓。通常通过注射、经口或进入直肠给予不透射线的染料(造影剂)。“放射性标记物”指用于示踪物质样本通过系统的化合物，其中放射活性同位素用作示踪剂。通过将放射性核素并入或导入化合物的化学组成中来“标记”化合物。当这些核素衰变时，可以通过检测发出的射线来确定它们的存在。放射性同位素标记是同位素标记的一个特例，其中通过在物质的化学组成中并入异常同位素来“标记”物质。当衰变粒子的量足以抑制细胞生长和降低患者肿瘤负荷时，放射性标记物是化疗剂。“降低肿瘤负荷”指抑制肿瘤生长或降低携有肿瘤的患者中的肿瘤体积。降低可以通过测定肿瘤生物标志物或者通过肉眼观测肿瘤体积来测量。“选择性结合”指通过合适的比较性对照所确定的非特异性结合事件。当结合相比于比较性对照中的背景结合高出至少10、30或40倍时，该结合是选择性的。“肿瘤诱导的血管系统”或肿瘤新生血管系统是肿瘤生长和形成转移肿瘤的特征。 肿瘤血管生成期间血管床的重塑既显示出卷曲的血管，又显示出血管网的增加。血管成熟和稳定是继发过程，其涉及血管平滑肌细胞和周细胞的募集。因此，在新形成的血管中可塑性窗口的存在提供了有前景的潜在治疗靶标。该可塑性窗口提供了选择性闭塞非成熟肿瘤新生血管系统的可能性。通过抗血管生成疗法的新生血管闭塞的治疗应用取决于成熟血管对这种损伤不敏感这一事实。“拓扑异构酶I抑制剂”是一类DNA拓扑异构酶。DNA拓扑异构酶是涉及DNA超螺旋调节的酶类。I型拓扑异构酶通过引起单链断裂和再连接而改变了 DNA超螺旋的程度。 这些活性在DNA转录和复制期尤其关键，那时DNA螺旋必须松开以允许大的酶机构发挥合适的功能，而且已表明拓扑异构酶确实能维持转录和复制。拓扑异构酶I抑制剂包括伊立替康、拓扑替康、喜树碱和片螺素Ddamellarin D)。喜树碱对于抵抗之前的顽固肿瘤是有效的，并且是被批准用于癌症治疗的唯一一类拓扑异构酶I(Topl)抑制剂。2.获取 TCP-I利用常规的固相合成方法，可以从头合成TCP-I肽及其衍生物。我们的肽通过商业服务制备。在这类方法中，通过一系列偶联反应制备肽链，其中将组成型氨基酸添加至理想序列生长的肽链中。这些通用的方法包括专一固相合成、部分固相合成方法、片段缩合、 经典溶液合成。当肽比较短(即IOkDa)和/或当它不能通过重组技术制备(即，不能被核酸序列编码)时，优选使用这些方法，并因此涉及不同的化学过程。固相肽合成流程和纯化是本领域公知的，并且还描述于Solid-Phase Synthesis A Practical Guide by Steven A Kates, Fernando Albericio(Editor), CRC Press 2000-04 以及 Peptide Synthesis Protocols, Methods in Molecular Biology, Volume35,by Michael W. Pennington and Ben M.Dunn Humana Press 1994。优选的肽合成方法遵照本领域技术人员公知的常规Merrifield固相流程。由固相合成产生的粗肽制备物可以通过本领域公知的方法诸如制备性HPLC来纯化，并且其组成可以通过氨基酸测序来确认。可选择地，可以利用基础教材中描述的重组技术来生产TCP-1，所述基础教材诸如 2007 年更新的 Current protocols in molecular biology, by Frederick M Ausubel et al ；John Wiley & Sons ；以及 Molecular Cloning :A Laboratory Manual, by Joseph Sambrook and David W Russell ；Cold Spring Harbor Laboratory Press,2001。如在 Cell-free Protein Synthesis :Methods and Protocols,by James R Swartz, Weinheim ffiley-VCH,2008中描述的，无细胞合成方法也可以用于产生TCP-1。依照首次由 Beaucage & Caruthers，Tetrahedron Letts. 22 1859-1862 (1981) 所描述的固相亚磷酰胺三酯法，利用Van Devanter et. al.，Nucleic Acids Res. 12 6159-6168(1984)中所描述的自动合成仪，能够以化学方法合成编码TCP-I蛋白的寡核苷酸。通过天然丙烯酰胺凝胶电泳或通过Pearson & Reanier，J. Chrom. 255:137-149(1983) 所描述的阴离子交换HPLC来纯化寡核苷酸。可以在克隆后，利用例如fellace et al.，Gene 16 :21-26(1981)的用于双链模板测序的链终止法来验证克隆基因和合成的寡核苷酸的序列。为了获得高水平表达的克隆基因，诸如在原核细胞和真核细胞中编码TCP-I的那些基因，本领域技术人员通常将基因亚克隆入表达载体，所述表达载体包含指导转录的强启动子、转录/翻译终止子和翻译起始的核糖体结合位点。合适的细菌启动子是本领域公知的，并且描述于上述的教科书中。用于表达TCP-I蛋白的细菌和真核表达系统易于作为多种商业来源的试剂盒获得。真核表达系统包括哺乳动物细胞、酵母和昆虫细胞。将表达载体导入细胞后，在利于TCP-I表达的条件下培养转染的细胞，利用下文指出的标准技术从培养物中回收TCP-I。可以通过标准技术将TCP-I纯化到基本纯，这些技术包括利用诸如硫酸铵的物质的选择性沉淀法、柱层析法、免疫纯化法等(参见，例如，Protein Purification Techniques :A Practical Approach(Practical Approach Series)by Simon Roe :0xford Univ. Press, 2006 ；以及 Protein purification principles and practice by Robert K Scopes Springer 1987)。3. TCP-1 的修饰TCP-1的修饰分为两类。改善其归巢能力的修饰和提供除归巢能力外的功能活性的修饰。功能活性可以进一步分为允许检测的活性和生物活性。为了改善肿瘤血管系统归巢能力，可以将TCP-I并入多种支架(scaffold)。这些包括肽支架和非肽支架。最简单的修饰是融合到TCP-I末端的氨基酸的添加以作为连接基团或间隔子。在下面的实施例中，描述了两-甘氨酸连接子。将其他氨基酸融合到TCP-I 结构域可以是简单的或复杂的，并且可以包括利用这些氨基酸作为TCP-I结构域间的间隔子或者作为单个TCP-I结构域末端的连接子。用于呈递TCP-I的肽支架是已知的，包括载体肽和抗体模拟物。一个或多个拷贝的TCP-I结构域能够插入支架的结合区以增强活性。理想的肽支架很少有或没有免疫原性，以及包括诸如人白蛋白、肽-IgG嵌合体的蛋白(Epitope-Specific ToleranceInduction with an Engineered Immunoglobulin(用工禾呈化免疫球蛋白诱导表位特异性耐受)Elias Τ. Zambidis and David W. Scott, PNAS, Vol. 93, No. 10 (May 14，1996)， pp. 5019-5024)、胶原蛋白或铁蛋白(Carter, et al.美国专利号7，097，841)。抗体模拟物包括 Ku et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. Α. 92 (14) :6552-6556(1995))公开的基于细胞色素b562的抗体替代物，以及Lipovsek et al.(美国专利号6，818，418和7，115，396)公开的以纤连蛋白或纤连蛋白样蛋白支架和至少一个可变环为特征的抗体模拟物。另外的肽支架包括 Beste et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. Α. 96 (5) :1898-1903(1999))描述的基于脂钙蛋白支架(Anticalin )的那些。Hamilton et al.(美国专利号5，770，380)公开了利用刚性、非肽杯芳烃有机支架，与作为结合位点的多个可变肽环连接的合成的抗体模拟物。Murali et al. (Cell Mol Biol 49(2) :209-216(2003))讨论了将抗体降解为更小的肽模拟物的方法，该更小的肽模拟物被称为“抗体样结合肽模拟物”(ABiP)，用作呈递TCP-I 结构域的支架。TCP-I可以导入的非蛋白质的聚合物包括，但不限于以聚乙二醇和聚丙二醇为例的聚烷基醚、聚乳酸、聚乙醇酸、聚氧化烯、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素和纤维素衍生物、葡聚糖和葡聚糖衍生物。此外，可以使用琼脂糖和透明质酸。一般地，这种亲水性聚合物的平均分子量为约500至约100，000道尔顿，包括约2000至约4000道尔顿和约5000 至约20，000道尔顿。亲水性聚合物的分子量还可以为约5，000道尔顿、10，000道尔顿和 20, 000道尔顿。聚合部分可以是经由诸如游离氨基或羧基的反应基团通过氨基酸残基而融合至 TCP-I的共价连接。反应基团是活化的聚乙二醇分子可以结合的那些基团。具有游离氨基的氨基酸残基可以包括赖氨酸残基和N-末端氨基酸残基；具有游离羧基的那些氨基酸残基可以包括天冬氨酸残基、谷氨酸残基以及C-末端氨基酸残基。巯基也可以用作连接聚乙二醇分子的反应基团。治疗目的所优选的是在氨基处连接，诸如在N-末端或赖氨酸基团处连接。为了促进上述修饰，TCP-I或其支架可以用其他功能基团进行衍生和/或连接至其他分子以便于它们与支架或功能部分连接。商业可利用的连接子包括同双功能和异双功能连接子。在同双功能偶联剂中，有提到的DITC(1，4-亚苯基二异硫代氰酸酯)、DSS(双琥珀酰亚胺辛二酸酯)等。在异双功能偶联剂中，有提到的SMCC(琥珀酰亚胺-4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸酯)或SMPB(琥珀酰亚胺-4-(p-马来酰亚胺苯基)丁酸)。TCP-I或其支架可以共价或非共价地与本文描述的其他药物、生物活性剂或其他功能部分复合。就融合蛋白或支架来说，必须实现这种衍生物作用以便不明显干扰TCP-I 的肿瘤血管归巢特性。可以与肽连接的功能基团可以包括，但不限于胺类、醇类或醚类。本发明的肽和载体分子可以直接缀合或通过连接子部分间接缀合。直接的结合可以通过诸如羟基、羧基或氨基的任一方便的功能基团发生。在一方面，结合经由共价键。在一方面，载体分子可以与本发明的TCP-I肽的任一末端连接，例如，载体分子可以与TCP-I 或其蛋白支架的末端氨基酸残基或末端羧基氨基酸残基连接。氨基末端修饰包括但不限于烷基化、乙酰化和添加羧苯甲酰基团、形成琥珀酰亚胺基团(参见，例如，Murray et al. (1995)Burger' s Medicinal Chemistry and Drug Discovery (Burger 的药物化学与药物发现),5th ed.，Vol. 1，Manfred Ε. Wolf, ed.，JohnWiley and Sons, Inc.) 0 C-末端修饰包括其中C-末端羧基被酯、酰胺取代的模拟物或者形成超出TCP-IC-C环的环肽的修饰。.用于衍生肽化合物或者将肽与这类聚合物偶联的方法已有描述(参见，例如，Zallipsky(1995)Bioconjugate Chem. ,6 :150-165 ；Monfardini et al. (1995) Bioconjugate Chem.，6 :62-69 ；美国专利号 4，640，835 ；美国专利号 4，496，689 ；美国专利号4，301，144 ；美国专利号4，670，417 ；美国专利号4，791，192 ；美国专利号4，179，337和 W095/34326，所有这些都通过引用整体并入本文)。支架和/或载体衍生化和连接后，TCP-I聚合物可以具有任何分子量，并且可以是枝化的或非枝化的。考虑到对TCP-I结构域的功能或抗原结构域的作用，缀合到TCP-I的聚合物应该是连接的。每一蛋白或支架分子的TCP-I的拷贝数不是关键的，并且可以低至 2-5拷贝或者高至5-100或更多拷贝。TCP-I结构域还可以呈现为多聚多肽。在这种构型中，TCP-I结构域合并入具有四级结构的蛋白中。例如，包含TCP-I的多肽可以经由亮氨酸拉链或异亮氨酸拉链融合。已经描述了可以将TCP-I修饰为靶向消化道肿瘤血管系统的多种构型，存在 TCP-I结构域可以连接的多种功能部分。这些包括可检测的标记物。用于测定中的特定标记物或可检测基团不是本发明的关键方面，只要它不明显干扰TCP-I结构域与其靶标血管系统的特异性结合。可检测的基团可以是具有可检测物理或化学特性的任何材料。这种可检测的标记物在诊断领域已很成熟，一般而言，大多数用于这类方法的任何标记物都能够用于本发明。因此，标记物是可通过光谱学、光化学、生物化学、免疫化学、电学、光学或化学方法检测的任何成分。本发明有用的标记物包括成像造影剂、不透射线的染料、磁珠(例如，DYNABEADS. TM.)、荧光染料(例如，异硫氰酸荧光素、Texas红、若丹明等)、放射性标记物(例如，M、125I、35S、14C或32P)、酶(例如，马辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶和其他常用于 ELISA的酶)、以及比色标记物诸如胶体金或有色玻璃或塑料珠(例如，聚苯乙烯、聚丙烯、 乳胶等)。检测标记物的手段是本领域技术人员公知的。因此，例如，当检测是在患者体内进行时，检测手段包括诸如MRI或CAT扫描仪的医用装置。当在外部检测时，可以使用闪烁计数器或放射自显影中的胶片。如果标记物是荧光标记物，可以通过利用合适波长的光激发荧光染料以及检测产生的荧光来检测该标记物。可以肉眼、借助胶片、通过利用诸如电荷耦合装置(CCD)或光电倍增器等的电子探测器等检测荧光。类似地，可以通过提供酶的合适底物和检测产生的反应产物来检测酶促标记物。最后，简单的比色标记物可以简单地通过观测与标记物相关的颜色来检测。除可检测的标记物外，功能部分包括生物活性部分，特别是通过TCP-I结构域靶向肿瘤时提供优越活性的化疗剂。能够被这种TCP-I组合物包括的药物的实例包括但不限于毒素，诸如细菌、真菌、植物或动物来源的酶活性毒素或者其片段[例如，白喉毒素、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)的外毒素A链、蓖麻毒素A链、相思豆毒素A链、 蒴莲根毒素A链、α-帚曲菌素、油桐(Aleurites fordii)蛋白、香石竹毒蛋白、美洲商陆(Phytolaca Americana)蛋白(PAPI、PAPII 禾口 PAP—S)、苦瓜(momordica charantia) 抑制剂、泻果素、巴豆毒蛋白、肥皂草(sapaonaria officinalis)抑制剂、白树毒素、 mitogellin、局限曲菌素、酚霉素、新霉素和新月毒素]；放射性同位素(例如，125I、131I、9°Y、212Bi和198Re)以及化疗剂(例如，烷化剂、叶酸拮抗剂、核酸代谢的抗代谢药、抗生素、嘧啶类似物、5-氟尿嘧啶、顺钼、嘌呤核苷、胺类、氨基酸、三氮唑核苷或皮质类固醇)。具体的实例包括阿霉素、多柔比星、5-氟尿嘧啶、阿糖胞苷(即Ara-C)、环磷酰胺、噻替派、白消安、细胞毒素、紫杉醇、泰索帝(Toxotere)、氨甲喋呤、顺钼、美法伦(Melphalan)、长春花碱、博来霉素、依托泊苷、异环磷酰胺、丝裂霉素C、米托蒽醌、长春新碱、长春瑞滨、卡钼、替尼泊苷、 道诺霉素、洋红霉素、氨喋呤、更生霉素、丝裂霉素、埃斯佩拉毒素(Esperamicins)(参见美国专利号4，675，187)、美法伦以及其他相关的氮芥。还包括用作调节或抑制激素对肿瘤作用的激素剂，诸如它莫昔芬和奥那司酮。对于体内应用，本发明的TCP-I肽或肽-活性剂缀合物可以包含药学上可接受的盐。合适的酸能够与本发明的化合物形成这种盐。这些会包括无机酸诸如盐酸、氢溴酸、过氯酸、硝酸、硫氰酸、硫酸、磷酸等；有机酸诸如甲酸、乙酸、丙酸、乙醇酸、乳酸、邻氨基苯甲酸、肉桂酸、萘磺酸、磺胺酸等。4.配制和给药上文描述的包含TCP-I结构域的组合物的药物组合物与药学上可接受的载体一起配制，所述载体与目的给药途径相兼容。给药途径的实例包括肠胃外给药，例如静脉给药、皮内给药、皮下给药、口服给药和直肠给药。药学上可接受的载体包括生理学上耐受的或可接受的稀释剂、赋形剂、溶剂或佐剂。组合物优选是无菌的和无热原的。合适载体的实例包括但不限于水、生理盐水、右旋糖、甘露醇、乳糖或其他糖类、卵磷脂、白蛋白、谷氨酸钠、盐酸半胱氨酸、乙醇、多羟基化合物(丙二醇、聚乙二醇、丙三醇等)、植物油(诸如橄榄油)、可注射的有机酯诸如油酸乙酯、乙氧基异硬脂醇、聚氧乙烯山梨醇和山梨醇酯、微晶纤维素、氢氧化铝氧化物、膨润土、高岭土、琼脂和黄芪胶或者这些物质的混合物等。用于肠胃外、皮内或皮下应用的溶液或悬浮液可以包含下述组分无菌稀释剂诸如注射用水、盐溶液、固定油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其他合成溶剂；抗细菌剂诸如苯甲醇或尼泊金甲酯；抗氧化剂诸如抗坏血酸或亚硫酸氢钠；螯合剂诸如乙二胺四乙酸 (EDTA)；缓冲剂诸如乙酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐，以及用于调整张力的试剂诸如氯化钠或右旋糖。可以用诸如盐酸或氢氧化钠的酸或碱来调整PH。在所有情形下，可注射的组合物必须是无菌的，并且流动的程度应该具有易注射性。它在生产和储存的条件下必须是稳定的，并且保藏必须避免诸如细菌和真菌的微生物的污染作用。载体可以是溶剂或分散介质，包含例如水、乙醇、多羟基化合物(例如，甘油、 丙二醇和液体聚乙二醇等)以及其适合的混合物。例如通过利用诸如卵磷脂的包被、通过在分散的情况下维持所需的粒子大小以及通过利用表面活性剂可以维持合适的流动性。预防微生物作用可以通过如苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、抗坏血酸、硫汞撒等多种抗细菌剂和抗真菌剂来实现。在许多情形下，优选的是在组合物中包含等渗剂，例如，糖、诸如甘露醇、山梨醇的多元醇、氯化钠。通过在组合物中包含延迟吸收的试剂例如单硬脂酸铝和明胶能够实现可注射组合物的延长吸收。口服组合物通常包含惰性稀释剂或可食用载体。它们可以包封在明胶胶囊或压缩在片剂中。对于口服治疗给药目的，活性化合物可以与赋形剂合并，并以片剂、锭剂或胶囊的形式使用。口服组合物还可以利用流体载体制备用作含漱剂，其中流体载体中的化合物经口施用、漱口然后吐出或吞下。药学上兼容的结合剂、和/或佐剂材料能够作为组合物的一部分并入。片剂、丸剂、胶囊、锭剂等可以包含下述成分的任一种或具有类似性质的化合物粘合剂诸如微晶纤维素、黄蓍胶或明胶，赋形剂如淀粉或乳糖、崩解剂如海藻酸、 Primogel或者玉米淀粉，润滑剂诸如硬脂酸镁或Merotes，助流剂诸如胶体二氧化硅，甜味剂诸如蔗糖或糖精，或者增味剂诸如薄荷、水杨酸甲酯或者橙香精。本文描述的化合物还可以制备为用于直肠递送的栓剂(例如，用常规的栓剂基质诸如可可油和其他甘油酯)或者保留灌肠剂形式。以易于给药的剂量单位形式和剂量均一性配制为口服或胃肠外组合物是特别有利的。用于本文的剂量单位形式指物理上离散的单位，其适合作为给予待治疗个体的单位剂量；每一单位包含预定量的活性化合物，计算的上述预定量产生与所需的药物载体相关的理想治疗作用。本发明的剂量单位形式的规格由以下条件决定以及直接依赖于以下条件活性化合物的独特特性和待实现的特定治疗作用，以及合成这种治疗个体的活性化合物的现有技术的固有局限性。药物组合物以及给药说明书可以一起包含在容器、包装或分配器中。—般地，给予的包含TCP-I的肽的量取决于肽的预期用途。如果目的是检测，技术人员给予足够的物质以检测它在肿瘤部位的浓度。对于治疗用途，目的是降低患者的肿瘤负荷，因此药物的精确量取决于递送的治疗剂。本领域技术人员可以导出适合的剂量和给药时间表以适应特定的情形和患者需求。通常，TCP-I肽的剂量是约0. OOlmg/kg体重至约 100mg/kg体重。在一些实施方案中，剂量是约0.01mg/kg体重至约60mg/kg体重。在其他实施方案中，剂量是约0. 05mg/kg体重至约5mg/kg体重。一般地，本发明TCP-I肽的给药时间表或给药时机按照公认实践进行。对于诊断， 一般每一诊断流程单次给药是足够的。对于降低肿瘤负荷，预计给药多次。肿瘤负荷降低可以通过利用上文所述的TCP-I诊断组合物肉眼测量，或通过检测消化道的肿瘤标志物。这类标志物是公知的(参见，例如公开了 ACS、骨桥蛋白和癌胚抗原作为CRC标志物的美国专利申请号20090155820和20090075312 ；公开了胃癌标志物的美国专利申请号20090170100 禾口 20070054282 ；以及 Jin Z et al. Hypermethylation of the AKAP12 promoter is a biomarker of Barrett' s-associated esophageal neoplastic progression(AKAP12 in 动子的超甲基化是巴特氏相关食道癌进程的生物标志物).Cancer Epidemiol Biomarkers Prev. 2008.Tan ； 17(1) :111-117)。本说明书所引用的所有公开出版物和专利申请通过引用并入本文，如同每一篇单独的公开出版物或专利中请被特别地和单独地指明通过引用并入一样。尽管出于清楚理解的目的，已经通过示例和举例详细描述了上述发明，但是对本领域技术人员显而易见的是，结合本发明的教导，可以在不背离所附权利要求书的实质或范围的前提下，对本发明作出某些变化和修改。
实施例提供下面的实施例仅用于示例而非限制。本领域技术人员容易认识到，可以改变或者修改多种非关键参数以产生基本相似的结果。使用利用噬菌体展示的体内淘选来鉴定TCP-I。一旦鉴定出，则证实TCP-I对于支持结肠和胃癌的血管系统是特异的。此外，证实TCP-I对于消化道的肿瘤血管系统具有选择性。下述的实施例描述了我们的工作。实施例1.通用方法肿瘤细胞系和细胞培养为了鉴定和证实TCP-I对于消化道肿瘤的血管系统的结合特异性，我们使用鼠结直肠癌细胞系结肠26、人结肠腺癌细胞HCT116和HT-29。结肠 26细胞系最初获自日本东北大学的发育、老化和癌症研究所的生物医学研究细胞资源中心 (Cell Resource Center for Biomedical Research, Institute of Development, Aging and Cancer, Tohoku University) (Sendai，Japan)。人结肠腺癌细胞 HCTl 16 和 HT-四购自美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection)。在 37°C、含有 5% (X)2 的湿润空气中，将两种细胞系培养在RPMI-1640培养基(Invitrogen)中，该培养基补充有 2g/L 碳酸氢钠、100 单位 /ml 青霉素(ICNBiomedicals, Costa Mesa, CA)、pH 7. 4 的 IOOmg/ ml 链霉素(ICN Biomedicals, Aurora, OH)和 10%胎牛血清(FBS, Invitrogen)。W001]噬菌体展示文库TCP-I从来自新英格兰生物实验室(New England Biolabs)的Ph. D. -C7C噬菌体展示肽文库分离。该噬菌体文库基于与M13噬菌体(1_6) 的次要衣壳蛋白(PlII)融合的随机七肽的组合文库。随机化的序列的侧翼为一对半胱氨酸残基。在非还原条件下，半胱氨酸自发形成二硫化物交联，从而形成环化肽的噬菌体展抗体为了检测TCP-I特异性噬菌体，从Sigma购买兔抗fd噬菌体抗体。该抗体与fd噬菌体或M13噬菌体的噬菌体衣壳蛋白特异性结合。大鼠抗-小鼠CD31单克隆抗体购自BD Pharmingen0小鼠抗-人⑶31单克隆抗体订购自DAK0。裂解的半胱天冬酶3抗体购自细胞信号传导技术公司(Cell Signaling Technology) Alexa Fluor568山羊抗-大鼠 IgG(H+L)、Alexa Fluor 568 山羊抗-小鼠 IgG(H+L)和 Alexa Fluor 488 山羊抗-兔 IgG 购买自 Invitrogen。TCP-I的肽合成从体内生物淘选中鉴定出TCP-I后，我们合成了合成肽用于进一步的实验。按照我们的规格要求，商购(AnaSpec)合成肽CTPSPFSHC、 CTPSPFSHC-GG-D(KLAKLAK)2和D(KLAKLAK)2。对于体内肽归巢验证，还获得了 FITC缀合的 CTPSPFSHC 和 FITC 缀合的 CVQTAQLLC(阴性对照)。原位结直肠癌模型9周龄的雄性BALB/c小鼠用于引导发现TCP-I的研究中。小鼠维持在香港中文大学动物设施中。在控制湿度(50士 10%)、光照(12/12小时光照/黑暗循环)和温度(23 士 2°C)的条件下，所有动物装在塑料笼子中(四或五只小鼠/笼)，自由接触饮用水和丸状的基础食物。模型的制备如以前发表的那样进行，并做了一些调整。(参见Takahashi T， Morotomi M,and Nomoto K(2004). A novel mouse model of rectal cancer established by orthotopic implantation of colon cancer cells ( fflil^nJSfgSg 1 ]^^^ ^ 立的新的直肠癌小鼠模型).Cancer Sci 95,514-519).简言之，给予所有小鼠含有3%葡聚糖硫酸钠(DSS)的自来水，持续8天以诱发结肠炎。结肠炎诱发后，使小鼠禁食18小时 (DSS)，然后用戊巴比妥钠麻醉。利用插入小鼠肛门2厘米的微量移液管，经直肠内灌注结肠沈细胞(3 X IO6细胞/40 μ 1/J鼠)。在将肿瘤细胞滴注30分钟后，立即用非破碎微压板压缩肛门以防泄漏。肿瘤细胞植入后2周，成功模型用于进行体内选择。此外，对于结肠沈诱发的皮下癌症模型，9周龄的雄性正常的BALB/c小鼠被皮下注射含2X IO6个结肠沈细胞的150 μ 1 PBS。使肿瘤生长10天，然后将小鼠用于进行噬菌体归巢能力测定。对于HT-四和HCT116诱发的皮下模型，6-8周龄的雄性BALB/c裸鼠被皮下注射3X IO6个细胞/150 μ 1 PBS。使肿瘤生长2周，然后将小鼠用于进行噬菌体归巢能力测定。体内噬菌体展示生物淘选鉴定TCP-I的生物淘选流程如以前描述的那样进行。 (参见Trepel M, Pasqualini R, and Arap W(2008). Chapter 4. Screening phage-display Peptide libraries for vascular targeted ρ印tides (筛选噬菌体展示文库的靶向血管的月太)· Methods Enzymol 445，83—106 以及Christianson DR,Ozawa MG,Pasqualini R，and Arap W(2007). Techniques to decipher molecular diversity by phage display (通过噬菌体展示解密分子多样性的技术).Methods Mol Biol 357，385-406)。简言之，将荷结肠肿瘤的小鼠麻醉并通过静脉注射C7C噬菌体文库(新英格兰生物实验室)，该噬菌体文库在300 μ 1含5 X IO10Pfu (噬菌体形成单位)噬菌体的TBS中。8 分钟后，经由心脏给小鼠灌注含BSA的DMEM。第一轮选择后，2ml灌注溶液用于获得足够的肽序列。切下每一只小鼠的肿瘤和对照器官，营救出噬菌体并进行滴定。从第二轮开始，灌注溶液增加到5ml以去除非特异性结合的克隆。第四轮生物淘选后，挑选出80个噬菌体克隆并将其悬浮在20 μ 1 PBS中。PCR用于扩增插入的片段，以及最后测序PCR产物。利用下述的引物对进行PCR: 5，-AGC AAG CTG ATA AAC CGA TAC ΑΑΤ—3，(正向)禾口 5，-TAC CGT AAC ACT GAG TTT CGT CAC-3’(反向)。66个克隆获得了它们展示的肽。在分析的66个噬菌体克隆中，四种肽出现过不止一次。选择出现频率最多的CTPSPFSHC-噬菌体(TCP-1噬菌体)用于进一步的实验。体内噬菌体靶向测定体内噬菌体靶向测定用于证实TCP-I的归巢特性是源自 TCP-1，而不是噬菌体的其他方面。该测定如在aiang L,Giraudo E,Hoffman JA,Hanahan D, and Ruoslahti E (2006). Lymphatic zip codes in premalignant lesions and tumors(癌前损伤和肿瘤中的淋巴编码).Cancer Res 66，5696-5706中所描述的。简言之，将荷肿瘤的小鼠麻醉，并通过静脉注射1 X 109pfu的CTPSPFSHC噬菌体或对照噬菌体。8分钟后，经由心脏给小鼠灌注含BSA的DMEM。从每只小鼠取出肿瘤和对照器官，营救出噬菌体并进行滴定。对于组织学分析，在注射噬菌体后1小时，小鼠用4%多聚甲醛灌注。取出组织， 将其在含沘％蔗糖的PBS中过夜浸泡，并包埋在Tissue-Tek OCT (Tissue-Tek, SAKURA)中。 制备10 μ m切片用于下述的噬菌体免疫染色。免疫组织学切割冰冻组织切片，在玻片上风干，用PBS漂洗两次，每次5分钟，然后用含10%正常山羊血清PBS封闭1小时。将组织切片在含单克隆大鼠抗⑶13(1 100)和兔抗-fd噬菌体抗体(1 200)的10%正常山羊血清中孵育1小时。然后将玻片用PBS漂洗 3次，每次5分钟，随后用0.22 μ m-过滤的含Alexa Fluor 488山羊抗-兔IgG(1 1000) 和Alexa Fluor 568山羊抗-大鼠IgG(l 500)的二抗溶液(10%正常山羊血清)孵育1 小时。玻片用PBS漂洗3次，每次5分钟，并用DAPI染细胞核5分钟。最后，将玻片用PBS 漂洗3次，每次5分钟，并用指甲油封片，然后在荧光显微镜下观察玻片。通过利用KODAK Image Station 2000MM的成像系统，在蓝光下进行组织成像。实施例2.分离归巢至原位结直肠癌组织的噬菌体
为了分离对结直肠癌特异的噬菌体，我们利用上述的原位结直肠癌小鼠模型来进行体内噬菌体文库选择。8々1^/(小鼠给予3(%053自来水并从肛门植入小鼠结肠癌细胞结肠沈后2周，原位肿瘤形成。宏观上，观测到小鼠的远端结肠和直肠中的结直肠肿瘤(图 1A)。通过组织学分析确认肿瘤形成(图1B)。结肠沈细胞植入后2周，清楚地观察到在结直肠粘膜的管腔内侧生长的结节状的肿瘤。为了富集与癌组织结合而不与对照器官结合的噬菌体，在模型上进行的7-氨基酸环肽文库的四轮体内选择产生了相对于第一轮增加3倍的集合(图1C)。在测试的几个对照器官脑、心脏和结肠中没有富集(图1C)。我们对体内第四轮噬菌体集合中分离的80 个噬菌体克隆进行了 DNA序列分析。66个克隆已经获得了它们展示的肽。在分析的66个噬菌体克隆中，四种肽出现过不止一次。选择出现频率最多的CTPSPFSHC-噬菌体(称为 TCP-I噬菌体)用于进一步的检查。实施例3.归巢至结直肠癌组织的CTPSPFSHC-噬菌体的验证为了分析CTPSPFSHC-噬菌体在体内条件下肿瘤归巢能力的特异性，我们将纯化的CTPSPFSHC-噬菌体或对照噬菌体(无插入噬菌体和不相关噬菌体)通过静脉注射入荷结肠肿瘤的小鼠中。收集肿瘤组织和正常对照器官，并对噬菌体聚集进行滴定。噬菌体展示肽CTPSPFSHC在肿瘤组织中的富集比在包括结肠、脑和心脏在内的对照器官中的富集高 11-94倍(图2A)。发现两种对照噬菌体对肿瘤组织和正常结肠器官的选择性较低(图2B)。为了研究CTPSPFSHC-噬菌体的归巢能力是否是源于所展示的肽序列，我们将 CTPSPFSHC-噬菌体与化学合成的CTPSPFSHC (300 μ g)共注射入荷肿瘤小鼠。从肿瘤组织中回收的噬菌体数目降低了 95%，但如脑和结肠的对照器官没有受太大影响(图2C)。有兴趣的是，我们发现CTPSPFSHC-噬菌体归巢到裸鼠的结肠沈皮下肿瘤的效力低于归巢到正常小鼠的相同细胞系的原位肿瘤的效力(图2D)。同时，CTPSPFSHC-噬菌体不与人结肠癌细胞系HT-四或HCT-116诱导的皮下异种移植物结合(图2E-F)。因此， CTPSPFSHC-噬菌体似乎特异性地识别原位结直肠癌组织，这提示了结肠微环境的重要性和独特性。这模拟了人结直肠癌的状况。实施例4. CTPSPFSHC-噬菌体的生物分布静脉注射后，我们利用Fd抗噬菌体抗体的免疫组化(DAB显色)检测了 CTPSPFSHC-噬菌体的生物分布。取出肿瘤组织和对照器官，并制备冰冻切片。 CTPSPFSHC-噬菌体被发现定位于肿瘤组织，而不是对照器官诸如心脏、脑和正常的结肠组织等。无插入噬菌体在肿瘤组织中没有检测到(图3A)。随后，利用双标记免疫荧光染色 (上文实施例1中描述的)来显现具有噬菌体抗体的噬菌体和标志血管系统内皮细胞的抗-⑶31抗体的共定位。CTPSPFSHC-噬菌体与肿瘤组织中的⑶_31阳性内皮细胞共定位， 而不与对照器官中的血管共定位。无插入噬菌体不与肿瘤组织的血管系统反应。通过重叠两种标记物的图像，我们确定了噬菌体与⑶31共定位，这表明了 TCP-I对肿瘤诱导的血管系统的选择性。实施例5. FITC-缀合的CTPSPFSHC的生物分布为了进一步确认选择性噬菌体归巢是否是源于CTPSPFSHC肽(TCP-1)，将化学合成的FITC-缀合的TCP-I或对照肽经静脉注射入荷肿瘤小鼠以研究肽的定位。将肽 (30011!1101，溶于30(^1 PBS)经静脉注射入荷肿瘤小鼠的尾静脉后，检查荧光素缀合的肽的生物分布。允许肽循环1小时。如上文实施例1中所述，收集肿瘤和对照组织，并制备冰冻切片。血管通过⑶31抗体(二抗缀合的Alexa-568)染色。FITC-标记的TCP-I与⑶31共定位在肿瘤组织中(图 4A)。但它在对照器官中没有检测到(图4A)。在肿瘤组织中没有发现FITC-标记的对照肽 (图4A)。与TCP-I噬菌体归巢的免疫定位分析一并考虑，肽定位数据确认了 TCP-I肽特异性归巢至肿瘤组织中的血管，而不是对照器官的血管系统。实施例6.肿瘤组织通过TCP-I肽的成像检测为了确定聚集在肿瘤组织中的FITC-标记的TCP-I是否能在器官水平可视化，给荷肿瘤的小鼠静脉注射FITC-标记的TCP-1、对照肽或单独的PBS。更具体地，给荷肿瘤的小鼠静脉注射500nmol荧光素缀合的肽(在500 μ 1 PBS中)。允许肽循环20小时。处死小鼠，并切下多种组织进行荧光检查。通过利用KODAK Image Station2000MM的成像系统， 在蓝光下进行器官成像。我们的研究显示了小至2mm的肿瘤体积能够在本实验条件下检测到。注射20小时后，来自这些小鼠的所有组织在蓝光下的检查表明，用TCP-I注射的小鼠的肿瘤中有强荧光信号(图5A)，而在来自对照肽或PBS-注射小鼠的肿瘤中没有检测到荧光信号(图5A)。我们在用肽或单独PBS的其他对照组织中也没有检测出特异性荧光信号(图5A)。此外，FITC-标记的TCP-I能够特异性地聚集在不同体积的肿瘤组织中(测试的直径为2mm，6mm，8mm)(图5B)。这些组织的组织学分析确定了 TCP-I肽荧光保持在肿瘤组织的血管系统中，而不在对照器官中。FITC-标记的对照肽在肿瘤组织中没有检测到(图5C)。实施例7. TCP-I选择性结合来自人癌的组织切片为了确立TCP-I选择性结合人肿瘤的血管系统的能力，研究了人活检样本。它们被双染，并重叠成像以确定组织特异性。更具体地，包含结肠腺癌和正常结肠组织的多个人活检样本被速冻、并包埋在OCT中，切割为5μπι的切片，然后排列在玻片上。将玻片与 10 μ mol/LFITC-CTPSPFSHC 或 FITC-CVQTAQLLC —起在 37°C孵育 1 小时，用 PBS 漂洗 3 次， 并用4%多聚甲醛固定。如上述，将血管用小鼠抗人⑶31单克隆抗体和Alexa Fluor 568 山羊抗小鼠IgG染色。结果表明FITC-标记的TCP-I肽结合癌组织的血管，而不是正常结肠组织的血管系统。FITC-标记的对照肽与癌或正常结肠组织的血管均无相互作用(图4B)。在总共21 例患者中发现50% (5/10)的结肠腺癌和55%的直肠腺癌(6/11)被该肽识别。阳性结合通常在更晚期的肿瘤组织中发现(在淋巴血管浸润方面，T分期、N分期和整个Dukes分期)。实施例8. CTPSPFSHC-GG-D (KLAKLAK) 2 的治疗性处理进行下面的实验来证实TCP-I指引治疗剂到消化道肿瘤的能力。我们将TCP-I与促凋亡肽D (KLAKLAK) 2缀合，该促凋亡肽在受体介导的细胞内化时破坏线粒体膜并导致程序性细胞死亡。这一方法已经成功用于在血管生成的内皮细胞、淋巴肿瘤和白色脂肪血管系统中的靶向凋亡诱导。参见Zhang L,Giraudo Ε,Hoffman JA,Hanahan D，and Ruoslahti E (2006). Lymphatic zip codes in premalignant lesions and tumors (癌前损伤禾口月中瘤中的淋巴编码).Cancer Res 66,5696-5706 ；Kolonin MG, Saha PK, Chan L, Pasqualini R, and Arap W(2004). Reversal of obesity by targeted ablation of adipose tissue(通过靶向切除脂肪组织的肥胖逆转).Nat Med 10，625-632 ；以及Ellerby HM, Arap W, Ellerby LM, Kain R, Andrusiak R, Rio GD, Krajewski S, Lombardo CR, Rao R,Ruoslahti E, et al. (1999). Anti-cancer activity of targeted pro-apoptotic peptides (革巴向促凋亡肽的抗癌活性)· Nat Med 5,1032-1038. All-D enantiomer D (KLAKLAK)2 was used to avoid degradation by proteases (使用所有D对应体D (KLAKLAK) 2来避免蛋白酶的降解).Ellerby HM, et al.，(1999)Nat Med 5,1032-1038。荷原位结直肠癌的小鼠被随机分为三组。治疗组被静脉注射260 μ g/剂量/小鼠的缀合的 CTPSPFSHC-GG-d (KLAKLAK) 2 [CDK]。对照组接受等摩尔的 CTPSPFSHC和D (KLAKLAK) 2 的混合物[DKK]、或者单独的PBS，每3天一次。第一次肽给药后7天终止治疗，如在Kolonin MG,Saha PK,Chan L,Pasqualini R,and Arap W(2004). Reversal of obesity by targeted ablation of adipose tissue (通过靶向切除脂肪组织的肥胖逆转).Nat Med 10,625-632 以及 Giordano RJ, Lahdenranta J, Zhen L, Chukwueke U, Petrache I， Langley RR, Fidler IJ, Pasqualini R, Tuder RM, and Arap W (2008). Targeted induction of lung endothelial cell apoptosis causes emphysema-like changes in the mouse (革巴向诱导肺内皮细胞的凋亡导致小鼠中发生肺气肿样改变).J Biol Chem 283，29447-29460中描述的。在实验结束时切下肿瘤和对照器官。进行组织学分析以评价肿瘤血管的密度。通过用抗裂解的半胱天冬酶-3抗体和⑶31抗体的双染来显现凋亡的血管内皮细胞。(参见 Zhang L, Giraudo E, Hoffman JA, Hanahan D, and Ruoslahti E (2006). Lymphatic zip codes in premalignant lesions and tumors (癌前损伤禾口月中瘤中的淋巴编码)· Cancer Res 66,5696-5706)。为了确定通过TCP-GG-D (KLAKLAK)2的血管系统凋亡，我们通过对裂解的半胱天冬酶-3和血管系统标志物CD31的染色检测了血管系统中凋亡的频数。与用PBS或未偶联的 TCP-I和D (KLAKLAK) 2混合物处理的小鼠的肿瘤相比，给予TCP_GG_D (KLAKLAK) 2的小鼠的肿瘤表达活性半胱天冬酶3的血管系统内皮细胞明显增加(图6A)。因此，活性半胱天冬酶3 的定量揭示，与其他两组相比，TCP-I缀合物处理的小鼠的肿瘤血管系统中的凋亡细胞数目显著增加(图6B)；相比之下，在所有三组中，对正常结肠组织和脑组织中凋亡血管系统的检查几乎没有显示出活性半胱天冬酶3阳性细胞(图6C和D)。实施例9.在原位胃癌小鼠模型中，TCP-I与人胃肿瘤的结合。将人胃癌细胞MKN45植入小鼠中，并将产生肿瘤的小鼠用于确定TCP-I向人肿瘤诱导的血管系统的归巢能力。人胃癌细胞系MKN45购自人类科学研究资源库(Human Science Research Resources Bank) (Tokyo，Japan)。MKN45 是分化差的人胃腺癌细胞系。在371、含5%0)2 的湿润空气中，将细胞系培养在RPMI-1640培养基(Invitrogen)中，该培养基补充有2g/L 碳酸氢钠、100 单位 /ml 青霉素(ICN Biomedicals, Costa Mesa, CA)、pH 7. 4 的 100mg/ml 链霉素(ICN Biomedicals, Aurora, OH)和 10%胎牛血清(FBS, Invitrogen)。原位胃癌模型使用6-8周龄的雄性BALB/C裸鼠。小鼠维持在香港中文大学动物设施中。如以前发表的那样制备模型，并做了一些调整。(参见Siin VY, Wu WK, Ye YN, So WH,Koo MW,Liu ES，Luo JC，Cho CH. (2004,Carcinogenesis 25,2487-2495)。将 MNK45 细胞用胰酶消化，并将细胞悬液中的总细胞数调整到4X IO7细胞/ml。将100 μ 1体积的该细胞悬液接种在小鼠的胃壁内。植入后肿瘤生长3周后，使用小鼠。此外，对于皮下(s. c.)模型，在裸鼠的右侧腹给6 8周龄的BALB/C裸鼠皮下注射3Χ106ΜΚΝ45细胞。肿瘤生长3周后使用小鼠。诸如体内噬菌体靶向测定、免疫组织学、CTPSPFSHC-噬菌体或FITC-标记的TCP-I 肽的生物分布等的其他测定参照上述的原位结直肠癌模型。3周后，我们利用肿瘤组织的石蜡切片的Η&Ε染色确认了胃肿瘤的形成(图7Α， B)。将CTPSPFSHC-噬菌体或无插入的对照噬菌体经静脉注射入荷胃癌小鼠。收集肿瘤组织和正常的对照器官，测定噬菌体聚集。CTPSPFSHC噬菌体在肿瘤组织中的富集比在包括正常胃、心脏和脑的对照器官中高14-115倍(图7C)。无插入的对照噬菌体几乎没有显示出对肿瘤组织和正常对照器官的选择性(图7D)。与此同时，我们还观察到CTPSPFSHC-噬菌体归巢到皮肤中的MKN45细胞的皮下肿瘤的效力低于归巢到裸鼠的相同细胞系的胃原位肿瘤的效力(图7E)。为了研究CTPSPFSHC-噬菌体的生物分布，我们在静脉注射后首先进行了利用Fd 抗-噬菌体抗体的免疫组化(DAB显色)。取出肿瘤组织和对照器官，制备冰冻切片。发现 CTPSPFSHC-噬菌体定位于胃癌组织，而不是诸如心脏、脑和正常胃组织等的对照器官(图 8)。无插入噬菌体在胃癌组织中没有检测到(图8)。随后，利用双标记免疫荧光染色(上文实施例1中描述的)来显现噬菌体(抗噬菌体抗体)与血管系统(CD31抗体)的共定位。 CTPSPFSHC-噬菌体与胃癌组织中的⑶31-阳性内皮细胞共定位，而不与对照器官中的血管共定位(图9)。无插入噬菌体在肿瘤组织的血管系统中没有检测到(图9底部)。为了进一步确认选择性的噬菌体归巢是源自CTPSPFSHC肽(TCP-1)，将化学合成的FITC-缀合的TCP-I或对照肽经静脉注射入荷胃癌小鼠中以研究肽的定位。在将该肽 (300nmol，溶于300 μ 1 PBS中)静脉注射入荷胃癌小鼠的尾静脉中后，检查荧光素缀合的肽的生物分布。允许肽循环1小时。如上述收集肿瘤和对照组织，并制备冰冻切片。血管通过⑶31抗体(二抗缀合的 Alexa-568)染色。FITC-标记的TCP-I与⑶31共定位在肿瘤组织中(图10)。但它在对照器官中检测不到(图10)。在肿瘤组织中没有发现FITC-标记的对照肽(图10底部)。 与TCP-I噬菌体归巢的免疫定位分析一并考虑，肽定位数据确认了 TCP-I肽还特异性归巢至胃癌组织中的血管，而不是对照器官的血管系统。表1.公开的序列
权利要求
1.消化道肿瘤血管归巢蛋白，其包含至少一个拷贝的由CTPSPFSHC组成的结构域。
2.如权利要求1所述的归巢蛋白，其具有1至IOOkDa的分子量。
3.如权利要求1所述的归巢蛋白，其具有2至10个拷贝的所述结构域CTPSPFSHC。
4.如权利要求1所述的归巢蛋白，其在药学上可接受的组合物中。
5.如权利要求4所述的归巢蛋白，其在pH为6-8的无菌水性液体中。
6.如权利要求4所述的归巢蛋白，其在冻干粉末中。
7.如权利要求4所述的归巢蛋白，其在无菌水性液体中。
8.如权利要求1所述的归巢蛋白，其与可检测的部分融合。
9.如权利要求8所述的归巢蛋白，其中所述可检测的部分选自荧光团、不透射线的染料、磁成像造影剂和放射性标记物。
10.如权利要求8所述的归巢蛋白，其中所述可检测的部分与所述归巢蛋白通过共价键融合。
11.如权利要求8所述的归巢蛋白，其中所述可检测的部分与所述归巢蛋白通过离子键连接。
12.如权利要求1所述的归巢蛋白，其与治疗剂融合。
13.如权利要求12所述的归巢蛋白，其中所述治疗剂是选自烷化剂、双功能烷化剂、非甾醇类芳香酶抑制剂、免疫治疗剂、亚硝基脲化合物、抗代谢药、抗肿瘤抗生素、有丝分裂抑制剂、放射物、拓扑异构酶I抑制剂和抗雌激素的抗癌剂。
14.检测哺乳动物消化道内肿瘤诱导的血管系统的方法，所述方法包括i.将携带实体肿瘤的哺乳动物的消化道与一定量的、包含至少一个拷贝的由 CTPSPFSHC组成的结构域的消化道肿瘤血管归巢蛋白接触，所述实体肿瘤被肿瘤诱导的血管系统环绕，所述归巢蛋白与可检测的部分连接，其中所述一定量足以检测环绕肿瘤的肿瘤诱导的血管组织；以及 .检测所述肿瘤诱导的血管组织中的归巢蛋白。
15.如权利要求14所述的方法，其中所述可检测的部分选自荧光团、不透射线的染料、 磁成像造影剂和放射性标记物。
16.如权利要求14所述的方法，其中所述接触是通过静脉给药。
17.如权利要求14所述的方法，其中所述肿瘤诱导的血管系统在肠内。
18.降低携带实体肿瘤的患者的实体肿瘤负荷的方法，所述实体肿瘤位于患者消化道并被肿瘤诱导的血管系统环绕，所述方法包括给予一定量的治疗剂，所述治疗剂包含i.消化道肿瘤血管归巢蛋白，其包含至少一个拷贝的由CTPSPFSHC组成的结构域；以及 .能够降低所述患者的肿瘤负荷的抗癌剂；其中所述归巢蛋白与生物活性部分连接；以及其中给予的所述一定量的治疗剂足以降低所述患者的肿瘤负荷。
19.如权利要求18所述的方法，其中所述肿瘤是癌。
20.如权利要求18所述的方法，其中所述抗癌剂选自烷化剂、双功能烷化剂、非留醇类芳香酶抑制剂、免疫治疗剂、亚硝基脲化合物、抗代谢药、抗肿瘤抗生素、有丝分裂抑制剂、放射物、拓扑异构酶I抑制剂和抗雌激素。
21.如权利要求18所述的方法，其中所述肿瘤位于胃或肠内。
22.如权利要求18所述的方法，其中所述治疗剂经口或经静脉给药。
全文摘要
本发明提供了与支持消化道肿瘤的血管系统选择性结合的9肽(CTPSPFSHC Seq.ID.No.l)。该归巢肽既具有诊断用途，又具有治疗用途。
文档编号C07K14/00GK102471371SQ201080031426
公开日2012年5月23日 申请日期2010年7月29日 优先权日2009年7月29日
发明者曹之宪, 李志杰 申请人:香港中文大学