专利名称：Fgf21突变体及其用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及编码FGF21突变体多肽的核酸分子、FGF21突变体多肽、包含FGF21突变体多肽的药物组合物和使用这类核酸、多肽或药物组合物用于治疗代谢紊乱的方法。
背景技术：
FGF21是属于包括FGF19、FGF21和FGF23的成纤维细胞生长因子(FGF)亚家族的分泌多肽(Itoh等，2004，Trend Genet. 20 :563-69)。FGF21是非典型的FGF，因为它不依赖于肝素，并且在葡萄糖、脂质和能量代谢的调节中起激素的作用。 从肝cDNA文库中分离出作为肝分泌因子的FGF21。它在肝和胰腺中高表达，并且是主要在肝中表达的FGF家族的唯一成员。过量表达FGF21的转基因小鼠具有生长速率缓慢、血浆葡萄糖和甘油三酯水平低下的代谢表型，并且不存在年龄相关性2型糖尿病、胰岛增大和肥胖症。在啮齿动物和灵长类模型中药理性给予重组FGF21蛋白导致血浆葡萄糖水平正常化、甘油三酯和胆固醇水平降低以及葡萄糖耐量和胰岛素敏感性得到改善。另外，FGF21通过增加能量消耗、体力活动和代谢率而减轻体重和体脂肪。实验研究为药理性给予FGF21以治疗人的2型糖尿病、肥胖症、血脂异常(dyslipidemia)和其它代谢病况或代谢紊乱提供了支持。人FGF21具有短的体内半寿期。在小鼠中，人FGF21的半寿期为1-2小时，在食蟹猴(cynomolgus monkey)中，半寿期为2. 5_3小时。在开发在2型糖尿病的治疗中用作治疗剂的FGF21蛋白时，可能需要延长半寿期。具有半寿期延长的FGF21蛋白可允许较低频率地给予待给予该蛋白质的患者。本文中描述了这类蛋白质。发明概述本发明公开ー种分离的多肽，包含SEQ ID NO :4的氨基酸序列，并且还包含(a)至少ー个在180位的氨基酸取代；和(b)选自以下的至少ー个氨基酸取代(i)在171位的取代；和(ii)在98位的取代；以及(c)它们的组合。在一个实施方案中，分离的多肽包含在98位的取代和在180位的取代，并且其中
(a)所述在98位的取代选自精氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、赖氨酸和苏氨酸；和(b)所述在180位的取代选自甘氨酸、脯氨酸、丝氨酸或谷氨酸；以及(c)它们的组合。在ー个实施方案中，98位的残基是精氨酸并且180位的残基是谷氨酸。还提供了ー种融合多肽，包含与异源氨基酸序列融合的分离的多肽。在一个实施方案中，异源氨基酸序列是Fe结构域或其片段，并且可包含SEQ ID N0:11的氨基酸序列。在另ー实施方案中，多肽通过接头与Fe结构域融合，以及在又一实施方案中，接头包含GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO :31)。在一个特定实施方案中，多肽包含SEQ ID N0:47。还公开了一种多聚体，包含两个或更多个融合多肽。也公开ー种药物组合物，包含分离的多肽和诸如水凝胶等药学上可接受的配制剂(formulation agent)。在另一方面,提供了ー种治疗代谢紊乱的方法以及在一个实施方案中，该方法包括向有需要的人患者给予本文提供的药物组合物。在一个实施方案中，代谢紊乱是糖尿病和在另ー个中，代谢紊乱是肥胖症。也提供了编码分离的多肽的核酸，以及在一个实施方案中核酸包含SEQ ID NO :46。核酸可存在于载体中,所述载体可自身存在于宿主细胞中。在又一实施方案中，多肽包含(a)不超过8个氨基酸残基的氨基末端截短，其中多肽能够降低哺乳动物的血糖；(b)不超过12个氨基酸残基的羧基末端截短，其中多肽能够降低哺乳动物的血糖；或(c)不超过8个氨基酸残基的氨基末端截短和不超过12个氨基酸残基的羧基末端截短，其中多肽能够降低哺乳动物的血糖。还在其它的实施方案中，多肽共价连接一种或多种聚合物，例如PEG。在另ー实施方案中，分离的多肽包含在171位的取代和在180位的取代，并且其中(a)所述在180位的取代选自甘氨酸、脯氨酸、丝氨酸和谷氨酸；(b)所述在171位的取代选自丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、组氨酸、赖氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸和酪氨酸；以及(c)它们的组合。在一个实施方案中，在171位的残基是甘氨酸和在180位的残基是谷氨酸。也提供ー种融合多肽，包含与异源氨基酸序列融合的分离的多肽。在一个实施方案中，异源氨基酸序列是Fe结构域或其片段，并且可包含SEQ ID NO :11的氨基酸序列。在另ー实施方案中，多肽通过接头与所述Fe结构域 融合，以及在另ー实施方案中，接头包含GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ IDNO 31)。在ー个特定实施方案中，多肽包含SEQ ID NO 470还公开一种多聚体，包含两个或更多个融合多肽。也公开ー种药物组合物，包含分离的多肽和诸如水凝胶等药学上可接受的配制剂。在另一方面，提供ー种治疗代谢紊乱的方法，以及在一个实施方案中，该方法包括给有需要的人患者给予本文提供的药物组合物。在一个实施方案中，代谢紊乱是糖尿病和在另ー个中，代谢紊乱是肥胖症。也提供了编码分离的多肽的核酸，以及在一个实施方案中核酸包含SEQ IDN0:46。核酸可存在于载体中，所述载体可自身存在于宿主细胞中。在又一实施方案中，多肽包含(a)不超过8个氨基酸残基的氨基末端截短，其中多肽能够降低哺乳动物的血糖；
(b)不超过12个氨基酸残基的羧基末端截短，其中多肽能够降低哺乳动物的血糖；或(c)不超过8个氨基酸残基的氨基末端截短和不超过12个氨基酸残基的羧基末端截短，其中多肽能够降低哺乳动物的血糖。还在其它的实施方案中，多肽共价连接ー种或多种聚合物，例如 PEG。在又一实施方案中，多肽包含SEQ ID NO :4的在98位的取代、在171位的取代和在180位的取代，并且其中(a)在171位的取代选自丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、组氨酸、赖氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸或酪氨酸；(b)在98位的取代选自精氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、赖氨酸或苏氨酸；以及(c)在180位的取代选自甘氨酸、脯氨酸、丝氨酸或谷氨酸；及其组合。在又一个实施方案中，在98位的残基是精氨酸，在171位的残基是甘氨酸和在180位的残基是谷氨酸。也提供ー种融合多肽，包含与异源氨基酸序列融合的分离的多肽。在一个实施方案中，异源氨基酸序列是Fe结构域或其片段，并且可包含SEQ ID NO :11的氨基酸序列。在另ー实施方案中，多肽通过接头融合至所述Fe结构域，以及在另ー实施方案中，接头包含GGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO:
31)。在ー个特定实施方案中，多肽包含SEQ ID N0:47。还公开一种多聚体，包含两个或更多个融合多肽。也公开ー种药物组合物，包含分离的多肽和诸如水凝胶等药学上可接受的配制剂。在另一方面，提供ー种治疗代谢紊乱的方法，以及在一个实施方案中，该方法包括给有需要的人患者给予本文提供的药物组合物。在一个实施方案中，代谢紊乱是糖尿病和在另ー个中，代谢紊乱是肥胖症。也提供了编码分离的多肽的核酸，以及在一个实施方案中核酸包含SEQ ID N0:46。核酸可存在于载体中，所述载体可自身存在于宿主细胞中。在又一实施方案中，多肽包含(a)不超过8个氨基酸残基的氨基末端截短,其中多肽能够降低哺乳动物的血糖；(b)不超过12个氨基酸残基的羧基末端截短，其中多肽能够降低哺乳动物的血糖；或(c)不超过8个氨基酸残基的氨基末端截短和不超过12个氨基酸残基的羧基末端截短，其中多肽能够降低哺乳动物的血糖。还在其它的实施方案中，多肽共价连接ー种或多种聚合物，例如PEG。根据下面某些实施方案更详细的说明和权利要求书，本发明的具体实施方案将是显而易见的。附图简述
图1A-1B显示对FGF21截短突变体7_181和8_181 (图1A)及FGF21截短突变体1-172、1-171、1-169和1-164(图1B)进行的ELK-萤光素酶活性测定结果；各图表示所得到的对于人FGF21対照的結果。图2 显示对人FGF21 对照及 FGF21 截短突变体 3-181、4-181、5-181、7-181、8-181、1-180、1-178、1-177、1-176、1-175、1-174、1-173、1-172、9-181 和 1-149 进行的 ELK-萤光素酶活性測定結果。图3显示在注射PBS (实心条形柱)、人FGF21对照(空心条形柱)或FGF21截短突变体8-181 (灰色条形柱)和9-181 (点状条形柱)的小鼠中測定的血糖水平。图4显示在注射PBS (实心圆)、Fc_FGF21对照(WT)(空心圆)或者包含氨基酸残基5-181 (实心三角)或7-181 (空心三角)的截短FC-FGF21融合蛋白的小鼠中测定的血糖水平变化百分比。图5显示在注射PBS (实心圆)、FGF21-Fc对照(WT)(空心圆)、包含残基1-175的截短FGF21-FC融合蛋白(实心三角)或包含氨基酸残基1-171的截短FC-FGF21蛋白(空心三角)的小鼠中測定的血糖水平变化百分比。图6A-6D 显示人 Fc-(G5)-FGF21 (SEQ ID NO :107)对照样品(图 6A)和注射后 6小时(样品D6 ;图6B)、24小时(样品D24 ;图6C)和48小时(样品D48 ;图6D)从小鼠中抽取的Fc-(G5)-FGF21样品的液相色谱-质谱法(LC-MS)分析結果。图7A-7D显示哺乳动物衍生的人FGF21-(G3)-Fc(SEQ ID NO :105)对照样品(图7A)和注射后6小时(样品E6 ；图7B)、24小时(样品E24 ；图7C)和48小时(样品E48 ；图7D)从小鼠中抽取的FGF21-(G3)-Fc样品的LC-MS分析結果。图8A-8D 显示 Fc-(L15)-FGF21 (SEQ ID NO :49)对照样品(图 8A)和注射后 6 小时(图8B)、24小时(图8C)和48小时(图8D)从小鼠中抽取的Fe-(L15)-FGF21样品的LC-MS分析結果。图9A-9D 显示 FGF21-(L15)-Fe (SEQ ID NO 41)对照样品(图 9A)和注射后 6 小时(图9B)、24小时(图9C)和48小时(图9D)从小鼠中抽取的FGF21-(L15)-Fe样品的LC-MS分析結果。图10A-10B 显示由注射入小鼠的 Fc-(L15)-FGF21(图 10A, SEQ ID NO 49)和FGF21-(L15)-Fc (图10B, SEQ ID NO 41)融合蛋白的LC-MS分析而鉴定出的切割位点。
图11显示在注射PBS (实心条形柱)、Fc-(L15)-FGF21 (SEQ IDNO :49)(空心条形柱)或者 Fc-(L15)-FGF21 突变体 Fc-(L15)-FGF21 G170E(SEQ ID NO :51)(灰色条形柱)、Fc-(L15)-FGF21 P171A(SEQ ID NO :53)(点状条形柱)、Fe-(L15)-FGF21 S172L(SEQ IDNO :55)(空心斜线交叉条形柱)、Fc-(L15)-FGF21(G170E, P171A, S172L) (SEQ ID NO :59)(实心水平交叉条形柱)或Fc-(L15)-FGF21G151A(SEQ ID NO :61)(空心斜线交叉条形柱)的小鼠中测定的血糖水平。图12 显示在注射 PBS(实心圆)、Fc-(L15)-FGF21(SEQ ID NO :49)(空心圆)、或者 Fc-(L15)-FGF21 突变体 Fe-(L15)-FGF21 G170E(SEQ IDNO :51)(实心三角)、Fc-(L15)-FGF21 P171A(SEQ ID NO :53)(空心三角)、Fe-(L15)-FGF21 S172L(SEQ ID NO:55)(实心菱形)、Fc-(L15)-FGF21(G170E，P171A, S172L) (SEQ ID NO :59)(空心菱形)或Fc-(L15)-FGF21 G151A(SEQ ID NO :61)(实心方形)的小鼠中测定的血糖水平变化百分比。图13显示在注射PBS (实心条形柱)、Fc-(L15)-FGF21 (SEQ IDNO :49)(空心条形
柱)、或者 Fc-(L15) -FGF21 突变体 Fc_(L15) -FGF21 (P150A，G151A，I152V)(灰色条形柱)、Fe-(L15)-FGF21G170E(SEQ ID NO 51)(空心斜线交叉条形柱)、Fe-(L15)-FGF21 (G170E，P171A) (SEQ ID NO :63)(灰色斜线交叉条形柱)、或 Fc-(L15)-FGF21(G170E，S172L) (SEQIDNO 67)(空心斜线交叉条形柱)的小鼠中測定的血糖水平。图14 显示在注射 PBS (实心方形)、Fc-(L15)-FGF21 (SEQ IDNO :49)(空心方形)、或者Fc-(L15)-FGF21 突变体Fc-(L15)-FGF21(P150A，G151A，I152V) (SEQ ID NO :65)(实心倒三角)、Fc-(L15)-FGF21 G170E(SEQ ID NO :51)(空心倒三角)、Fe-(L15)-FGF21 (G170E，P171A) (SEQ IDNO 63)(实心圆)或 Fe-(L15)-FGF21 (G170E，S172L) (SEQ ID NO 67)(空心圆)的小鼠中測定的血糖水平变化百分比。图15显示在注射PBS(实心条形柱)或者Fc-(L15)-FGF21突变体Fc-(L15)-FGF21G170E(SEQ ID NO :51)(空心条形柱)、Fc-(L15)_FGF21G170A(SEQ ID NO :69)(灰色条形柱)、Fc-(L15)-FGF21 G170C(SEQ IDNO :71)(空心交叉条形柱)、Fe-(L15)-FGF21Gl7OD (SEQ ID NO:73)(灰色与白色条形柱)、Fc-(Ll5)-FGF2I Gl7ON (SEQ ID NO :75)(实心交叉条形柱)、或者Fc-(L15)-FGF21 G170S(SEQ ID NO :77)(空心交叉条形柱)的小鼠中测定的血糖水平。图16显示在注射PBS(实心圆)或者Fc-(L15)-FGF21突变体Fc-(L15)-FGF21G170E(SEQ ID NO :51)(空心圆)、Fe-(L15)-FGF21 G170A(SEQ ID NO :69)(实心三角)、Fe- (L15) -FGF21G170C (SEQ ID NO :71)(空心三角)、Fe- (L15) -FGF21G170D (SEQID NO 73)(实心菱形)、Fe- (L15) -FGF21G170N (SEQ ID NO 75)(空心菱形)、或者Fc-(L15)-FGF21G170S(SEQ ID NO :77)(实心倒三角)的小鼠中测定的血糖水平变化百分比。图17显示在注射PBS(实心条形柱)或者Fc-(L15)_FGF21突变体Fe-(L15)-FGF21G170E(SEQ ID NO :51)(空心条形柱)、Fe-(L15)-FGF21P171E(SEQID NO :79)(灰色条形柱)、Fc-(L15)-FGF21P171H(SEQ IDNO :81)(实心交叉条形柱)Fc-(L15)-FGF21P171Q(SEQ ID NO :83)(空心交叉条形柱)、Fe-(L15)-FGF21P171T (SEQ IDNO :85)(点状条形柱)、或者Fc-(L15)-FGF21P171Y(SEQ ID NO :87)(灰色交叉条形柱)的小鼠中測定的血糖水平。
图18显示在注射PBS(实心圆)或者Fc-(L15)_FGF21突变体Fe-(L15)-FGF21G170E(SEQ ID NO :51)(空心圆)、Fe-(L15)-FGF21P171E(SEQID NO 79)(实心三角)、Fc-(L15)-FGF21P171H(SEQ ID NO :81)(空心三角)、Fe-(L15)-FGF21P171Q(SEQ ID NO :83)(实心菱形)、Fc-(L15)_FGF21P171T(SEQ ID NO :85)(空心菱形)、或者Fc-(L15)-FGF21P171Y(SEQ ID NO :87)(实心方形)的小鼠中测定的血糖水平变化百分比。图19A-19D 显示 Fe-(L15)-FGF21 对照样品(图 19A, SEQ ID NO 49)和注射后 6 小时(图19B)、24小时(图19C)和48小时(图19D)从小鼠中抽取的样品的LC-MS分析结果。图 20A-20D 显示 Fe-(L15)-FGF21G170E 对照样品(图 20A，SEQ IDNO :51)和注射后6小时(图20B)、24小时(图20C)和48小时(图20D)从小鼠中抽取的Fc-(L15)-FGF21G170E 样品的 LC-MS 分析結果。图21A-21D 显示 Fe-(L15)-FGF21P171A 对照样品(图 21A, SEQ IDNO 53)和注射后6小时(图21B)、24(图21C)、48小时(图21D)从小鼠中抽取的Fe-(L15)-FGF21P171A样品的LC-MS分析結果。图 22A-22D 显示 Fe-(L15)-FGF21S172L 对照样品(图 22A，SEQ IDNO : 55)和注射后6小时(图22B)、24小时(图22C)和48小时(图22D)从小鼠中抽取的Fc-(L15)-FGF21S172L 样品的 LC-MS 分析結果。图23A-23D 显示由注射入小鼠中的 Fe-(L15)-FGF21 (图 23A, SEQ IDNO 49)、Fc-(L15)-FGF21G170E (图 23B，SEQ ID NO :51)、Fc_ (L15)-FGF21P171A (图 23C，SEQ ID NO:53)和Fc-(L15)-FGF21S172L(图23D，SEQ IDNO :55)融合蛋白的LC-MS分析而鉴定出的切割位点。图 24A-24C 显示对 FGF21 突变体 FGF21L99R(SEQ ID NO :109)、FGF21L99D (SEQ IDNO 111)和 FGF21A111T(SEQ ID NO :113)(图 24A) ；FGF21 突变体 FGF21A129D (SEQ ID NO 115)、FGF21A129Q(SEQ IDNO :117)和 FGF21A134K (SEQ ID NO :119)(图 24B);以及 FGF21突变体 FGF21A134Y(SEQ ID NO :121)、FGF21A134E (SEQ ID NO :123)和 FGF21A129K (SEQ IDNO 125)(图24C)进行的ELK-萤光素酶活性測定结果；各图表示所得到的对于人FGF21对照的結果。图 25A-25D 显示对 Fe-(L15)-FGF21 突变体 Fe-(L15)-FGF21P171G (SEQ IDNO :89)、Fc-(L15)-FGF21 P171S(SEQ ID NO :91)和 Fe-(L15)-FGF21P171T (SEQ IDNO 85)(图 25A) ；Fc-(L15)-FGF21 突变体 Fe-(L15)-FGF21P171Y(SEQ ID NO :87)、Fe- (L15)-FGF2IP17Iff(SEQ IDNO :93)和 Fe-(L15)-FGF21P171C(SEQ ID NO :95)(图 25B)；Fc-(L15)-FGF21 (SEQ ID NO :49)、Fe-(L15)-FGF21 (A45K、G170E) (SEQ IDNO :97)和 FGF21A45K(SEQ ID NO :99)(图 25C);以及 Fe-(L15)-FGF21 (SEQ ID NO :49)、Fe-(L15)-FGF21P171E(SEQ ID NO :79)和 Fe-(L15)-FGF21 (A45K、G170E) (SEQ ID NO :97)(图 25D)进行的ELK-萤光素酶活性測定结果；各图表示所得到的对于人FGF21対照的結果。图26A-B显示野生型成熟FGF21和各种FGF21突变体随时间而变化的聚集；图26A显示将65mg/mL蛋白质在4°C下温育I天、2天和4天后FGF21对照(WT，实心菱形)和FGF21A45K(实心圆)的聚集百分比变化，而图26B显示将65mg/mL蛋白质在4°C下温育 I 天、6 天和 10 天后 FGF21 对照(WT) (SEQ ID NO 4)和 FGF21P78C (SEQ ID NO :127)、FGF21P78R(SEQ ID NO : 129)、FGF21L86T (SEQ ID NO : 131)、FGF21L86C (SEQ ID NO :133)、FGF21L98C(SEQ ID NO :135)、FGF21L98R (SEQ ID NO :137)、FGF21A111T(SEQ ID NO :113)、FGF21A129D(SEQ IDNO :115)、FGF21A129Q (SEQ ID NO :117)、FGF21A129K (SEQ IDNO :125)、FGF21A134K(SEQ ID NO :119)、FGF21A134Y (SEQ ID NO :121)和 FGF21A134E (SEQ ID NO:123)(在图中均有标记)的聚集百分比变化。图27 显示对人 FGF21 对照和 FGF21 突变体 FGF21A45K (SEQ IDNO :99)、FGF21L52T(SEQ ID NO :139)和 FGF21L58E (SEQ ID NO :141)进行的 ELK-萤光素酶活性测
定结果。图28A图示在4 °C下温育I天、4天和8天后Fe-(L15)-FGF21突变体Fe-(L15)-FGF21 (6-181，G170E) (SEQ ID NO :101)(实心菱形)、Fe-(L15)-FGF21 (A45K, G170E) (SEQ ID NO :97)(空心方形)、Fe-(L15)-FGF21P171E(SEQ ID NO :79)(实心三角)、Fc-(L15)-FGF21P171A(SEQ ID NO :53)(交叉线)、Fe-(L15)-FGF21G170E (SEQ IDNO 51)(空心三角)和FGF21对照(实心圆)聚集水平的变化，图28B是同样显示温育结果的柱状图。图29显示在注射PBS(溶媒)(实心圆)或者Fc-(L15)_FGF21突变体Fc-(L15)-FGF21(A45K, G170E) (SEQ ID NO :97)(空心圆)、Fe-(L15)-FGF21 (A45K，P171G)(SEQ ID N0:103)(实心三角)、或者 Fc-(L15)-FGF21(L98R，P171G) (SEQ ID NO :43)(空心三角)的小鼠中測定的血糖水平。图30 图示对人 FGF21(实心圆，实线)、Fe-(L15)-FGF21 (SEQ IDNO 49)(空心圆，实线)和 Fc-(L15)FGF21(L98R，P171G) (SEQ IDNO :43)(实心三角，虚线)进行的 ELK-萤光素酶活性測定結果。图31图示在室温(图31A)和4 °C (图31B)下9天后观察到的FGF21 (SEQID NO 4)(实心圆，实线)、Fc-(L15)-FGF21(SEQ ID NO :49)(空心圆，实线)和Fc-(L15)-FGF21(L98R，P171G) (SEQ ID NO :43)(实心三角，虚线)的高分子量聚集物百分比。图32是显示在168小时时间内在各个时间点上观察到的Fe-(L15)-FGF21 (L98R，P171G) (SEQ ID NO 43)变化的系列MALDI质谱迹线。图33图示ob/ob小鼠中由PBS溶媒对照(空心圆)、野生型成熟FGF21 (实心方形)、以及 FGF21 突变体 Fc-(L15)-FGF21(L98R, P171G)(SEQ IDNO :43)(实心倒三角)；Fc-(L15)-FGF21(L98R, P171G，182P) (SEQ IDNO :143)(空心菱形)和Fc-(L15)-FGF21(L98R, P171G，182G) (SEQ IDNO :145)(实心圆)中的每ー种所引起的血糖水平变化百分比。图34图示ob/ob小鼠中由PBS溶媒对照(实心圆)及FGF21突变体Fc-(L15)-FGF21(L98R, P171G)(SEQ ID NO :43)(实心三角)；Fc-(L15)-FGF21(L98R,P171G, 182G, 183G) (SEQ ID NO :147)(空心三角)、Fe-(L15)-FGF21 (L98R，P171G，182G) (SEQID NO 145)(实心菱形)和 Fc-(L15)-FGF21(L98R，P171G，182P) (SEQ ID NO :143)(空心菱形)中的每ー种所引起的血糖水平变化百分比。图35图示ob/ob小鼠中PBS溶媒对照(空心圆)及FGF21突变体Fc-(L15)-FGF21(L98R, P171G)(SEQ ID NO :43)(实心方形)；Fc-(L15)-FGF21(L98R,P171G, Y179S) (SEQ ID NO :149)(空心三角)、Fe-(L15)-FGF21 (L98R, P171G, Y179A) (SEQID NO :153)(实心倒三角)、Fe-(L15)-FGF21(L98R，P171G，A180S) (SEQ ID N0:155)(空心菱形)和 Fc-(L15)-FGF21(L98R，P171G，A180G) (SEQ ID NO :157)(实心圆)中的每ー种所引起血糖水平变化百分比。图36图示ob/ob小鼠中PBS溶媒对照(实心圆)和FGF21突变体Fc-(L15)-FGF21(L98R, P171G)(SEQ ID NO :43)(空心方形)；Fc-(L15)-FGF21(L98R,P171G，Y179F) (SEQ ID NO :151)(实心三角)和 Fe-(L15)-FGF21 (L98R，P171G，A180E) (SEQID NO :57)(空心菱形)中的每ー种所引起的血糖水平变化百分比。图37图示称猴(Rhesus monkey)中进行6周剂量递增研究的研究设计简图；图中，阴影符号表示在空腹状态下抽血，点状符号表示在进食状态下抽血。图38A-D是描述猕猴在OGTT分布曲线、OGTT AUC和体重方面如何随机化的系列 图；图38ム表示在化合物或溶媒分配给各组前在OGTTl中的基线葡萄糖水平，实心方形对应于A组，实心圆、实线对应于B组，和空心圆、短划线对应于C组；图38B表示在化合物或溶媒分配给各组前，在0GTT2中的基线葡萄糖水平，实心方形对应于A组，实心圆、实线对应于B组，和空心圆、实线对应于C组；图38(表示以AUC显示的OGTT I和2的基线葡萄糖水平，点状条形柱对应于A组，阴影条形柱对应于B组，空心条形柱对应于C组；图38D表示基线体重，点状条形柱对应于A组，阴影条形柱对应于B组，空心条形柱对应于C组。图39 图示猕猴中溶媒、FGF21(SEQ ID NO 4)和 Fe-(L15)-FGF21 (L98R，P171G)(SEQ ID NO 43)相对于基线的体重变化百分比；阴影条形柱I和2对应于低剂量下的第I周和第2周，空心条形柱3和4对应于中等剂量下的第3周和第4周，实心条形柱5和6对应于高剂量下的第5周和第6周，点状条形柱7、8和9对应于洗净期(washout peroid)的第7-9周。图 40 图示溶媒、FGF21 (SEQ ID NO 4)和 Fe-(L15)-FGF21 (L98R, P171G) (SEQ IDNO 43)对猕猴空腹胰岛素水平的相对于基线的空腹胰岛素变化百分比；阴影条形柱I和2对应于低剂量下的第I周和第2周，空心条形柱3和4对应于中等剂量下的第3周和第4周，实心条形柱5和6对应于高剂量下的第5周和第6周，点状条形柱7和8对应于洗净期的第7和8周。图41图示在研究第5和第6周期间得到的以高剂量给予的溶媒、FGF21 (SEQ IDNO 4)和Fc-(L15)-FGF21(L98R，P171G) (SEQ ID NO :43)对猕猴的餐后胰岛素水平的作用；实心条形柱对应于第5周，阴影条形柱对应于第6周。图42 图示在两周高剂量 Fc-(L15)-FGF21(L98R，P171G) (SEQ IDNO :43)治疗结束时进行的0GTT5的葡萄糖分布；实心圆、实线对应于溶媒，空心方形、虚线对应于FGF21，以及实心三角、实线对应于Fc-(L15)-FGF21(L98R，P171G) (SEQ ID NO :43)。图43 图示在两周高剂量 Fc-(L15)-FGF21(L98R，P171G) (SEQ IDNO :43)治疗结束时进行的0GTT5的胰岛素分布；实心圆、实线对应于溶媒，空心方形、虚线对应于FGF21，以及实心三角、实线对应于Fc-(L15)-FGF21(L98R，P171G) (SEQ ID NO :43)。图44图示在猕猴的各剂量期(低、中和高剂量)结束时測定的葡萄糖OGTTAUC3-5自基线的变化百分比；空心条形柱对应于在0GTT3期间由葡萄糖測量值计算的AUC3，实心条形柱对应于在0GTT4期间由葡萄糖測量值计算的AUC4，阴影条形柱对应于在0GTT5期间由葡萄糖测量值计算的AUC5。图45 图示溶媒、FGF21 和 Fe-(L15)-FGF21 (L98R，P171G) (SEQ IDNO :43)对猕猴各组的空腹血浆甘油三酯水平自基线的变化百分比的作用；阴影条形柱I和2对应于低剂量下的第I周和第2周，空心条形柱3和4对应于中等剂量下的第3周和第4周，实心条形柱5和6对应于高剂量下的第5周和第6周和点状条形柱7、8和9对应于洗净期的第7_9周。图46图示在以高剂量用溶媒、？6 21或？(-(し15)ザ6 21(し981 ，？1716)(5￡0 IDNO 43)治疗第5周和第6周期间测量的猕猴各组的餐后血浆甘油三酯水平；阴影条形柱对应于第5周，实心条形柱对应于第6周。图47图示给药前以及5天、12天、19天和26天測定的每只猴的人FGF21水平，其中样品在毎次注射后约21小时获得。
图48图示给药前以及5天、12天、19天和26天测定的每只猴的Fc-(L15)-FGF21(L98R, P171G) (SEQ ID NO :43)水平，其中样品在每次注射后约5天获得。图49图示根据在各低、中和高剂量后进行的三次OGTT测定的FGF21和Fc-(L15)-FGF21(L98R，P171G) (SEQ ID NO :43)水平的平均浓度；阴影条形柱对应于低剂量的0GTT3，实心条形柱对应于中等剂量的0GTT4，空心条形柱对应于高剂量的0GTT5。图50 是 Fc-(G4S)3-FGF21(L98R，P171G，A180E)融合蛋白(SEQ IDNO 47)的氨基酸序列；IgGl Fe残基(SEQ ID NO 11)呈粗体，(G4S) 3接头(SEQ ID NO 31)呈斜体，以及在FGF21序列(SEQ ID NO 39)中的点突变呈粗体和加下划线的。图51图示在Erk-萤光素酶测定中试验化合物的剂量反应；测试Fc-(G4S)3-FGF21(L98R, P171G, A180E) (SEQ ID NO :47)、Fe-(L15)-FGF21 (L98R, P171G,A180E) (SEQ ID NO :57)、野生型FGF21和含野生型FGF21的Fe融合物。图 52 图示 Fc-(G4S) 3-FGF21 (L98R，P171G，A180E) (SEQ ID NO :47)和Fc-(L15)-FGF21(L98R，P171G) (SEQ ID NO :43)对人(右)和食蟹猴(cyno) P-Klotho (左)的 Biacore 溶液平衡结合测定法(Biacore solutionequilibrium binding assay)结果。图53 图示在单ー注射后在 db/db 小鼠中 Fe-(G4S) 3-FGF21 (L98R, P171G, A180E)(SEQ ID NO -Al)的剂量反应的两张图；图53A显示在注射溶媒或Fc-(G4S)3-FGF21(L98R，P171G，A180E)后db/db小鼠在各个时间点的血糖水平，而图53B显示在单ー注射Fc-(G4S)3-FGF21 (L98R, P171G, A180E)至 db/db 小鼠后对体重的影响。图 54 是图示在 DIO 小鼠中 Fc-(G4S)3-FGF21(L98R，P171G，A180E) (SEQ ID NO :47) Fc-(L15)-FGF21(L98R, P171G) (SEQ ID NO :43)的给药频率研究的示意图。图55图示在不同的给药频率下用溶媒、Fc-(G4S)3-FGF21(L98R，P171G，A180E)(SEQ ID NO 47)或 Fe-(L15)-FGF21 (L98R，P171G) (SEQID NO :43)治疗的小鼠的 GTT 分布图。图56图示在不同的给药频率下用溶媒、Fc-(G4S)3-FGF21(L98R，P171G，A180E)(SEQ ID NO 47)或 Fe-(L15)-FGF21 (L98R，P171G) (SEQID NO :43)治疗的小鼠中自基线(0天)的体重改变。图57图示包含FGF21 (L98R，P171G) (SEQ ID NO 37)FGF21突变体的水凝胶的体内
研究結果。
图58图示给予各种水凝胶制剂对8周大db/db小鼠的血糖水平的影响。图59图示给予各种水凝胶制剂对8周大db/db小鼠的血糖水平的影响。图60图示给予各种水凝胶制剂对8周大db/B6小鼠的血糖水平的影响；实心圆表示给予水凝胶对照的小鼠，实心方形表示给予10mg/kg含FGF21(L98R，P171G) (SEQ ID NO 37)的水凝胶的小鼠，实心三角表示给予30mg/kg含FGF21(L98R，P171G)的水凝胶的小鼠，以及倒三角表示单独给予 Fc-(L15)-FGF21(L98R，P171G，A180E) (SEQ ID NO :57)的小鼠。图61图示给予各种水凝胶制剂的8周大db/B6小鼠的血糖水平的变化百分比；实心圆表示给予水凝胶对照的小鼠，实心方形代表给予10mg/kg含FGF21(L98R，P171G) (SEQID NO 37)的水凝胶的小鼠，实心三角表示给予30mg/kg含FGF21(L98R，P171G)的水凝胶 的小鼠，以及倒三角表示单独给予Fc-(L15)-FGF21(L98R，P171G，A180E) (SEQ ID NO :57)的小鼠。图62图示给予各种水凝胶制剂对8周大db/B6小鼠的体重的影响；实心圆表示给予水凝胶对照的小鼠，实心方形代表给予10mg/kg含FGF21(L98R，P171G) (SEQ ID NO 37)的水凝胶的小鼠，实心三角表示给予30mg/kg含FGF21 (L98R，P171G)的水凝胶的小鼠，以及倒三角表示单独给予ド(-(し15)ザ6 21(し981 ，？1716，六18( ) (SEQ ID NO 57)的小鼠。图63图示给予各种水凝胶制剂的8周大db/B6小鼠重量的变化百分比；实心圆表示给予水凝胶对照的小鼠，实心方形代表给予10mg/kg含FGF21(L98R，P171G) (SEQ ID NO 37)的水凝胶的小鼠，实心三角表示给予30mg/kg含FGF21(L98R，P171G)的水凝胶的小鼠，以及倒三角表示单独给予 Fc-(L15)-FGF21(L98R，P171G，A180E) (SEQ ID NO :57)的小鼠图64是图示在有葡萄糖耐量降低(IGT)的食蟹猴中进行的九周剂量递增研究的研究设计的图。图65 图示溶媒、Fc-(L15)-FGF21 (L98R，P171G) (SEQ ID NO :43)和Fc-(G4S)3-FGF21(L98R, P171G, A180E) (SEQ ID NO :47)对研究的 IGT 食蟹猴的 AM 餐食物摄入的影响。图66 图示溶媒、Fc-(L15)-FGF21 (L98R，P171G) (SEQ ID NO :43)和Fe- (G4S) 3-FGF21 (L98R, P171G, A180E) (SEQ ID NO 47)对研究的 IGT 食蟹猴的水果摄入的影响。图67 图示溶媒、Fc-(L15)-FGF21 (L98R，P171G) (SEQ ID NO :43)和Fc-(G4S)3-FGF21(L98R, P171G, A180E) (SEQ ID NO :47)对研究的 IGT 食蟹猴的 PM 餐食物摄入的影响。图68 图示溶媒、Fc-(L15)-FGF21 (L98R，P171G) (SEQ ID NO :43)和Fc-(G4S)3-FGF21(L98R, P171G, A180E) (SEQ ID NO :47)对研究的 IGT 食蟹猴的体重的影响。图69 图示溶媒、Fc-(L15)-FGF21 (L98R，P171G) (SEQ ID NO :43)和Fe- (G4S) 3-FGF21 (L98R, P171G, A180E) (SEQ ID NO 47)对研究的 IGT 食蟹猴的体重指数的影响。图70 图示溶媒、Fc-(L15)-FGF21 (L98R，P171G) (SEQ ID NO :43)和Fe- (G4S) 3-FGF21 (L98R, P171G, A180E) (SEQ ID NO 47)对研究的 IGT 食蟹猴的皮褶厚度的影响。
图71 图示溶媒、Fc-(L15)-FGF21 (L98R，P171G) (SEQ ID NO :43)和Fc-(G4S)3-FGF21(L98R, P171G, A180E) (SEQ ID NO :47)对研究的 IGT 食蟹猴的腹围的影响图72 图示溶媒、Fc-(L15)-FGF21 (L98R，P171G) (SEQ ID NO :43)和Fe- (G4S) 3-FGF21 (L98R, P171G, A180E) (SEQ ID NO 47)对研究的 IGT 食蟹猴的血浆葡萄糖水平的影响。图73 图示溶媒、Fc-(L15)-FGF21 (L98R，P171G) (SEQ ID NO :43)和Fe- (G4S) 3-FGF21 (L98R, P171G, A180E) (SEQ ID NO 47)对研究的 IGT 食蟹猴的葡萄糖耐量的影响。图74 图示溶媒、Fc-(L15)-FGF21 (L98R，P171G) (SEQ ID NO :43)和Fe- (G4S) 3-FGF21 (L98R, P171G, A180E) (SEQ ID NO 47)对研究的 IGT 食蟹猴的血浆甘油三酷水平的影响。图75 图示溶媒、Fc-(L15)-FGF21 (L98R，P171G) (SEQ ID NO :43)和Fe- (G4S) 3-FGF21 (L98R, P171G, A180E) (SEQ ID NO 47)对研究的 IGT 食蟹猴的血浆总胆固醇水平的影响。图76 图示溶媒、Fc-(L15)-FGF21 (L98R，P171G) (SEQ ID NO :43)和Fe- (G4S) 3-FGF21 (L98R, P171G, A180E) (SEQ ID NO :47)对研究的 IGT食蟹猴的血浆HDL-胆固醇水平的影响。图77是显示在168小时时间段内的各个时间点下，观察的Fc-(L15)-FGF21(L98R，P171G)(左图，SEQ ID NO 43)和 Fe-(L15)-FGF21 (L98R，P171G，A180E)(右图，SEQ ID NO:57)变化的一系列的MALDI质谱迹线。 图78图示在Asp-N消化后，如通过MRM LC/MS/MS分析的全长C-末端肽占由Fc-(L15)-FGF21(L98R, P171G)和 Fe-(L15)-FGF21 (L98R，P171G, A180E)衍生的总 C-末端肽片段的相对丰度(％)。图79图示在给小鼠静脉内注射后240小时内，完整全长的Fc_(L15)-FGF21(L98R, P 171G) (SEQ ID NO :43)和 Fc_(L 15)-FGF21 (L98R, P171G, A180E) (SEQID NO 57)的血浆浓度的ELISA测定結果，图80图示对阴性对照；人FGF21 (SEQ ID NO 4)；和FGF21糖基化突变体FGF21(Y179N，S181T) (SEQ ID NO :161)、FGF21Y179N (SEQ IDNO :163)和 FGF21P124S (SEQ IDNO 165)进行的ELK-萤光素酶活性測定結果。发明详述可以采用本文公开的方法和标准分子生物学方法制备具有改进性质(例如半寿期延长和/或聚集減少)的人FGF21蛋白。任选可通过抗体或其部分与野生型FGF21序列的N末端或C末端融合而使半寿期进ー步延长。还可通过将氨基酸取代引入蛋白质中而进一步延长野生型FGF21蛋白的半寿期或减少聚集。这类经过修饰的蛋白质在本文被称为突变体或FGF21突变体，并构成本发明的实施方案。本文(包括在实施例中)使用的重组核酸方法一般是Sambrook等，MolecularCloning A Laboratory Manual(Cold Spring Harbor LaboratoryPress,1989)或CurrentProtocols in Molecular Biology (Ausubel 等，主编，Green Publishers Inc.和 Wiley 和Sons 1994)中给出的方法，两个參考文献均通过引用并入到本文中用于任何目的。I. 一般定义术语“分离的核酸分子”是指本文提供的核酸分子，其1)从当总核酸从来源细胞分离时与之天然共存的至少约50%的蛋白质、脂质、碳水化合物或其它材料中分离出来，
(2)不与“分离核酸分子”天然连接的多核苷酸的全部或部分连接，(3)与天然不与之连接的多核苷酸有效连接，或(4)天然不作为较大多核苷酸序列的部分存在。优选地，分离的核酸分子基本上无任何其它的污染核酸分子或在其自然环境存在的可能干扰其在多肽产生中的用途或其治疗、诊断、预防或研究用途的其它污染物。术语“载体”用来指用于向宿主细胞传递编码信息的任何分子(例如核酸、质粒或病毒)。 术语“表达载体”是指适于宿主细胞转化并含有指导和/或控制插入异源核酸序列表达的核酸序列的载体。表达包括但不限于诸如转录、翻译和RNA剪接(如果内含子存在的话)等过程。术语“有效连接”本文用来指侧翼序列的排列方式，其中配置或装配如此所述的侧翼序列从而发挥其常规功能。因此，与编码序列有效连接的侧翼序列可能能够实现编码序列的复制、转录和/或翻译。例如，当启动子能够指导编码序列转录时，该编码序列与该启动子有效连接。侧翼序列不必与编码序列邻接，只要其正确起作用即可。因此，例如，间插的非翻译但却转录的序列可存在于启动子序列和编码序列之间，启动子序列仍可被视为与编码序列“有效连接”。术语“宿主细胞”用来指被核酸序列(例如本文提供的核酸)转化或能够被所述核酸序列转化然后能够表达选定的目标基因的细胞。该术语包括亲代细胞的子代，无论子代在形态或遗传组成上是否与最初的亲代相同，只要存在选定的基因。术语“分离的多肽”是指本发文提供的多肽，其(I)从当从来源细胞分离时与之天然共存的至少约50%的多核苷酸、脂质、碳水化合物或其它物质中分离出来，(2)不与“分离多肽”天然连接的多肽的全部或部分连接(通过共价或非共价相互作用)，(3)与天然不与之连接的多肽有效连接(通过共价或非共价相互作用)，或(4)天然不存在。优选分离多肽基本上无任何其它污染多肽或在其自然环境中存在的可能干扰其治疗、诊断、预防或研究用途的其它污染物。术语“天然存在的”当与生物材料例如核酸分子、多肽、宿主细胞等联用时，是指自然界中存在的且未受人为操作的材料。同样，本文使用的“非天然存在的”是指自然界不存在的或经过人为在结构上修饰或合成的材料。当与核苷酸联用吋，术语“天然存在的”是指碱基腺嘌呤(A)、胞嘧啶(C)、鸟嘌呤(G)、胸腺嘧啶(T)和尿嘧啶(U)。当与氨基酸联用吋，术语“天然存在的”是指20种氨基酸，即丙氨酸(A)、半胱氨酸(C)、天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)、苯丙氨酸(F)、甘氨酸(G)、组氨酸(H)、异亮氨酸(I)、赖氨酸(K)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)、天冬酰胺(N)、脯氨酸(P)、谷氨酰胺(Q)、精氨酸(R)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、缬氨酸(V)、色氨酸(W)和酪氨酸(Y)。术语“FGF21多肽”是指在人体内表达的天然存在的野生型多肽。对于本公开内容的目的，术语“FGF21多肽”可互換使用，是指任何全长FGF21多肽，例如由209个氨基酸残基组成并分别由SEQ ID NO :1和5的核苷酸序列编码的SEQ ID NO 2和6 ;多肽的任何成熟形式，例如由181个氨基酸残基组成并分别由SEQ ID NO 3和7的核苷酸序列编码的SEQ ID NO :4和8，其中剔除了在全长FGF21多肽的氨基末端的28个氨基酸残基(S卩，其构成信号肽)。全长和成熟FGF21多肽可但不要求包含氨基末端甲硫氨酸，其可由工程改造引入或作为细菌表达过程的結果。术语“FGF21多肽突变体”和“FGF21突变体”可互換使用，并且是指其中天然存在的FGF21氨基酸序列(例如，SEQ ID N0:2、4、6或8)已被修饰的FGF21多肽。这类修饰包括但不限于ー个或多个氨基酸取代，包括被非天然存在的氨基酸和非天然存在的氨基酸类似物的取代；和截短。因此，FGF21多肽突变体包括但不限于本文所述的位点定向FGF21突变体、截短FGF21多肽、蛋白酶解抗性FGF21突变体、聚集减少的FGF21突变体、FGF21组合突变体和FGF21融合蛋白。为了鉴定本发明的FGF21突变体的具体截短和氨基酸取代，截短或突变的氨基酸残基编号与成熟181-残基FGF21多肽的编号相对应。FGF21突变体可以但不要求包含氨基末端甲硫氨酸，其可由工程改造引入或作为细菌表达过程的結果。在本发明的其它实施方案中，FGF21多肽突变体包含与突变体FGF21的氨基酸序列有至少约85%同一性的氨基酸序列，但是其中为FGF21多肽突变体提供所需性质(例如蛋白酶解抗性、半 寿期延长或聚集减少性质及其组合)的特定残基不被进一歩修饰。换句话讲，除已被修饰以提供蛋白酶解抗性、减少聚集或其它性质的FGF21突变体序列中的残基之外，在FGF21突变体序列中约15%的所有其它氨基酸残基都可被修饰。例如在FGF21突变体Q173E中，至多15%的所有氨基酸残基都可被修饰，除取代173位上的谷氨酰胺的谷氨酸残基以外。还在其它的实施方案中，FGF21多肽突变体包含与突变体FGF21的氨基酸序列有至少约90%，或约95%、96%、97%、98%或99%同一性的氨基酸序列，但是其中赋予FGF21多肽突变体蛋白酶解抗性或聚集减少性质的特定残基不被进一歩修饰。这类FGF21多肽突变体具有至少ー种野生型FGF21多肽的活性。本发明还涵盖编码FGF21多肽突变体的核酸分子，所述FGF21多肽突变体包含与突变体FGF21的氨基酸序列有至少约85%同一性的氨基酸序列，但是其中赋予FGF21多肽突变体所需性质(例如蛋白酶解抗性、半寿期延长或聚集减少性质及其组合)的特定残基不被进ー步修饰。换句话讲，除已被修饰以提供蛋白酶解抗性、减少聚集或其它性质的FGF21突变体序列的残基之外，FGF21突变体序列中约15%的所有其它氨基酸残基都可被修饰。例如在FGF21突变体Q173E中，至多15%的所有氨基酸残基都可被修饰，除取代173位上的谷氨酰胺的谷氨酸残基的氨基酸残基以外。本发明还涵盖包含与编码FGF21突变体的核苷酸序列有至少约90%、或约95%、96%、97%、98%或99%同一性的核苷酸序列的核酸分子，但是其中编码赋予编码的FGF21多肽突变体蛋白酶解抗性或聚集減少性质的氨基酸残基的核苷酸不被进ー步修饰。这类核酸分子编码具有至少ー种野生型FGF21多肽的活性的FGF21突变体多肽。术语“有生物活性的FGF21多肽突变体”是指不论已引入FGF21多肽突变体的修饰的类型或数目，具有野生型FGF21多肽活性的本文所述的任何FGF21多肽突变体，所述活性为例如降低血糖、胰岛素、甘油三酯或胆固醇的能力；减轻体重的能力；和改善葡萄糖耐量、能量消耗或胰岛素敏感性的能力。虽然如此，与野生型FGF21多肽相比，FGF21活性的水平略微降低的FGF21多肽突变体仍可视为是有生物活性的FGF21多肽突变体。
术语“有效量”和“治疗有效量”各自是指用来支持野生型FGF21多肽的ー种或多种生物活性的可观察水平的FGF21多肽突变体的量，例如降低血糖、胰岛素、甘油三酯或胆固醇水平的能力；减轻体重的能力；或改善葡萄糖耐量、能量消耗或胰岛素敏感性的能力。本文使用的术语“药学上可接受的载体”或“生理学上可接受的载体”是指适用于完成或促进FGF21多肽突变体递送至人体或非人受试者的ー种或多种配制剂。该术语包括生理上相容的任何和所有溶剂、分散介质、包衣材料、抗菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等。药学上可接受的载体的实例包括水、盐水、磷酸缓冲盐水、右旋糖、甘油、こ醇等及其组合的ー种或多种。在一些情况下，优选在药物组合物中包含等渗剂，例如，糖；诸如甘露醇、山梨醇等多元醇；或氯化钠。増加FGF21多肽突变体的保存期或效カ的药学上可接受的物质(例如润湿物质或少量的辅助物质，例如润湿剂或乳化剤、防腐剂或缓冲剂)也可作为或形成载体的组分。术语“抗原”是指能够被抗体结合，并且还能够用于动物中以产生能结合该抗原表位的抗体的分子或分子部分。抗原可具有ー个或多个表位。术语“天然Fe”是指不论是以単体形式还是以多聚体形式包含非抗原结合片段的序列的分子或序列，并且可含有铰链区，所述非抗原结合片段由整个抗体消化得到或通过其它方法产生。天然Fe最初的免疫球蛋白源优选、但并不一定为人源的，并可以是任ー种免疫球蛋白，尽管优选为IgGl和IgG2。也可使用IgG4。天然Fe分子由可通过共价(即ニ硫键)和非共价缔合连接成ニ聚体或多聚体形式的単体多肽构成。天然Fe分子的单体亚基之间的分子间ニ硫键的数目为I至4的范围，这取决于类别(例如IgG、IgA和IgE)或亚类(例如IgGU IgG2、IgG3、IgG4、IgAl和IgGA2)。天然Fe的ー个实例是由木瓜蛋白酶消化IgG得到的ニ硫键键合的ニ聚体(參见Ellison等，1982,Nucleic Acids Res. 10 :4071-9)。本文使用的术语“天然Fe”通用于单体、ニ聚体和多聚体形式。Fe多肽序列的实例见SEQID NO: 11，其由人IgGl分子衍生。天然Fe可以但不要求包括氨基末端甲硫氨酸，其可通过工程改造或作为细菌表达过程的结果引入；这类Fe分子依然被认为是“天然Fe”分子。术语“Fe变体”是指是自天然Fe修饰但仍包含补救受体(salvagereceptor)FcRn (新生Fe受体)的结合位点的分子或序列。国际申请号W097/34631和WO 96/32478描述示例性Fe变体以及与补救受体的相互作用，并通过引用并入本文。因此，术语“Fe变体”可包含从非人类天然Fe人源化的分子或序列。此外，天然Fe包含可被剔除的区域，因为它们提供本发明FGF21突变体的融合分子不需要的结构特征或生物活性。因此，术语“Fe变体”包含缺失ー个或多个天然Fe位点或残基，或者其中ー个或多个Fe位点或残基被修饰的分子或序列，所述Fe位点或残基影响或參与(1) ニ硫键形成，(2)与所选的宿主细胞不相客，(3)在选定宿主细胞中表达时的N末端异质性，(4)糖基化，(5)与补体相互作用，
(6)与补救受体以外的Fe受体结合，或(7)抗体依赖性细胞毒性(ADCC)。下文中将进ー步详述Fe变体。Fe变体可以但不要求包含氨基末端甲硫氨酸，其可通过工程改造或作为细菌表达过程的结果引入；这类Fe分子依然被认为是“Fe变体”。术语“Fe结构域”涵盖天然Fe和Fe变体及如上定义的序列。至于Fe变体和天然Fe分子，术语“Fe结构域”包括単体或多聚体形式的分子，不论是由整个抗体消化还是通过其它方法产生。在本发明的一些实施方案中，Fe结构域可通过例如Fe结构域和FGF21 序列之间的共价键与FGF21或FGF21突变体(包括FGF21或FGF21突变体的截短形式)融合。这类融合蛋白可通过Fe结构域的缔合形成多聚体，这些融合蛋白及其多聚体两者均属于本发明的方面。Fe结构域可以但不要求包含氨基末端甲硫氨酸，其可通过工程改造或作为细菌表达过程的结果引入。2. FGF21 突夺体术语“FGF21突变体”是指具有以下氨基酸序列的FGF21突变体多肽，所述氨基酸序列因ー个或多个氨基酸而不同于天然存在的FGF21多肽序列(例如SEQ ID N0:2、4、6或8)的氨基酸序列。FGF21突变体可通过利用天然或非天然存在的氨基酸在FGF21多肽的特定位置引入保守或非保守的一个或多个氨基酸取代，来产生。“保守氨基酸取代”可包括天然氨基酸残基(即存在于野生型FGF21多肽序列给定位置上的残基)被非天然残基(即不存在于野生型FGF21多肽序列给定位置上的残基)取代，使得对该位置上的氨基酸残基的极性或电荷几乎没有或没有影响。保守氨基酸取代还包括通常通过化学上的肽合成而不是通过在生物系统中的合成而掺入的非天然存在的氨 基酸残基。这些包括肽模拟物(peptidomimetics)和氨基酸部分的其它反转形式或反向形式。可根据共同的侧链性质将天然存在的残基分为以下几类(I)疏水性:正亮氨酸、Met、Ala、Val、Leu、Ile ；(2)中性亲水性Cys、Ser、Thr ;(3)酸性Asp、Glu ;(4)碱性:Asn、Gin、His、Lys、Arg ;(5)影响链方向的残基Gly、Pro ;和(6)芳族的Trp、Tyr、Phe。保守取代可包括这些类别之ー的成员被同一类别的另ー个成员交換。非保守取代可包括这些类别之ー的成员被另ー类别的成员交換。本领域的技术人员在需要这类取代时，可确定所需要的氨基酸取代(不管是保守还是非保守)。示例性(但不是限制性的)氨基酸取代表见表I。激I氨基酸取代
初始残基示例性取代
AlaVal, Leu, He
ArgLys, Gin, Asn
AsnGln
AspGlu
CysSer, Ala
GlnAsn
权利要求
1.一种分离的多肽，包含SEQ ID NO 4的氨基酸序列，并且还包含 (a)至少ー个在180位的氨基酸取代；和 (b)至少ー个选自以下的氨基酸取代 ⑴在171位的取代；和 (ii)在98位的取代；以及 (c)它们的组合。
2.权利要求I的分离的多肽，其中所述多肽包含在98位的取代和在180位的取代，并且其中 (a)所述在98位的取代选自精氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、赖氨酸和苏氨酸；和 (b)所述在180位的取代选自甘氨酸、脯氨酸、丝氨酸或谷氨酸；以及 (c)它们的组合。
3.权利要求2的分离的多肽，其中98位的残基是精氨酸并且180位的残基是谷氨酸。
4.ー种融合多肽，包含与异源氨基酸序列融合的权利要求3的分离多肽。
5.权利要求4的融合多肽，其中所述异源氨基酸序列是Fe结构域或其片段。
6.权利要求5的融合多肽，其中所述Fe结构域包含SEQID NO 11的氨基酸序列。
7.权利要求6的融合多肽，其中所述多肽通过接头与Fe结构域融合。
8.权利要求7的融合多肽，其中所述接头包含GGGGSGGGGSGGGGS(SEQID NO :31)。
9.权利要求8的融合多肽，其中所述多肽包含SEQID NO -Al.
10.一种多聚体，包含两个或更多个权利要求9的融合多肽。
11.ー种药物组合物，包含权利要求2的分离的多肽和药学上可接受的配制剂。
12.权利要求11的药物组合物，其中所述药学上可接受的配制剂是水凝胶。
13.ー种治疗代谢紊乱的方法，包括向有需要的人患者给予权利要求12的药物组合物。
14.权利要求13的方法，其中所述代谢紊乱是糖尿病。
15.权利要求13的方法，其中所述代谢紊乱是肥胖症。
16.—种编码权利要求2的多肽的分离的核酸。
17.权利要求16的分离的核酸，其中所述核酸包含SEQID N0:46。
18.—种载体,包含权利要求17的核酸分子。
19.ー种宿主细胞,包含权利要求18的核酸分子。
20.权利要求2的分离的多肽，其中所述多肽包含 (a)不超过8个氨基酸残基的氨基末端截短，其中所述多肽能够降低哺乳动物的血糖； (b)不超过12个氨基酸残基的羧基末端截短，其中所述多肽能够降低哺乳动物的血糖；或 (c)不超过8个氨基酸残基的氨基末端截短和不超过12个氨基酸残基的羧基末端截短，其中所述多肽能够降低哺乳动物的血糖。
21.权利要求2的分离的多肽，其中所述多肽与一种或多种聚合物共价连接。
22.权利要求21的分离的多肽，其中所述聚合物是PEG。
23.权利要求I的分离的多肽，其中所述多肽包含在171位的取代和在180位的取代，并且其中(a)所述在180位的取代选自甘氨酸、脯氨酸、丝氨酸和谷氨酸； (b)所述在171位的取代选自丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、组氨酸、赖氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸和酪氨酸；以及 (C)它们的组合。
24.权利要求23的分离的多肽，其中在171位的残基是甘氨酸和在180位的残基是谷氨酸。
25.ー种融合多肽，包含与异源氨基酸序列融合的权利要求24的分离的多肽。
26.权利要求25的融合多肽，其中所述异源氨基酸序列是Fe结构域或其片段。
27.权利要求26的融合多肽，其中所述Fe结构域包含SEQID NO 11的氨基酸序列。
28.权利要求27的融合多肽，其中所述多肽通过接头与所述Fe结构域融合。
29.权利要求28的融合多肽，其中所述接头包含GGGGSGGGGSGGGGS(SEQID NO :31)。
30.权利要求29的融合多肽，其中所述多肽包含SEQID NO :47。
31.一种多聚体，包含两个或更多个权利要求30的融合多肽。
32.—种药物组合物，包含权利要求30的分离的多肽和药学上可接受的配制剂。
33.权利要求32的药物组合物，其中所述药学上可接受的配制剂是水凝胶。
34.ー种治疗代谢紊乱的方法，包括向有需要的人患者给予权利要求32的药物组合物。
35.权利要求34的方法，其中所述代谢紊乱是糖尿病。
36.权利要求34的方法，其中所述代谢紊乱是肥胖症。
37.ー种编码权利要求23的多肽的分离的核酸。
38.权利要求37的分离的核酸，其中所述核酸包含SEQID NO :46。
39.ー种载体,包含权利要求38的核酸分子。
40.ー种宿主细胞，包含权利要求39的核酸分子。
41.权利要求23的分离的多肽，其中所述多肽包含 (a)不超过8个氨基酸残基的氨基末端截短，其中所述多肽能够降低哺乳动物的血糖； (b)不超过12个氨基酸残基的羧基末端截短，其中所述多肽能够降低哺乳动物的血糖；或 (c)不超过8个氨基酸残基的氨基末端截短和不超过12个氨基酸残基的羧基末端截短，其中所述多肽能够降低哺乳动物的血糖。
42.权利要求23的分离的多肽，其中所述多肽与一种或多种聚合物共价连接。
43.权利要求42的分离的多肽，其中所述聚合物是PEG。
44.权利要求I的分离的多肽，其中所述多肽包含SEQID NO :4的在98位的取代、在171位的取代和在180位的取代，并且其中 (a)所述在171位的取代选自丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、组氨酸、赖氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸或酪氨酸； (b)所述在98位的取代选自精氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、赖氨酸或苏氨酸；以及 (c)所述在180位的取代选自甘氨酸、脯氨酸、丝氨酸或谷氨酸；及其组合。
45.权利要求44的分离的多肽，其中在98位的残基是精氨酸，在171位的残基是甘氨酸和在180位的残基是谷氨酸。
46.ー种融合多肽，包含与异源氨基酸序列融合的权利要求45的分离的多肽。
47.权利要求46的融合多肽，其中所述异源氨基酸序列是Fe结构域或其片段。
48.权利要求47的融合 多肽，其中IgG恒定结构域包含SEQID NO 11的氨基酸序列。
49.权利要求48的融合多肽，其中所述多肽通过接头与所述Fe结构域融合。
50.权利要求49的融合多肽，其中所述接头包含GGGGSGGGGSGGGGS(SEQID NO :31)。
51.权利要求50的融合多肽，其中所述多肽包含SEQID NO -Al.
52.—种多聚体，包含两个或更多个权利要求51的融合多肽。
53.—种多肽,包含 (a)SEQ ID NO 4的多肽，其中 (i)98位的亮氨酸被精氨酸取代； (ii)171位的脯氨酸被甘氨酸取代；以及 (iii)180位的丙氨酸被谷氨酸取代； (b)包含SEQID NO 31的接头序列；以及 (c)包含SEQID NO : 11的Fe结构域。
54.一种多肽，包含SEQ ID NO 47的序列。
55.ー种由SEQ ID NO :46的核酸序列编码的多肽。
56.ー种药物组合物，包含权利要求44或53的分离多肽和药学上可接受的配制剂。
57.权利要求56的药物组合物，其中所述药学上可接受的配制剂是水凝胶。
58.ー种治疗代谢紊乱的方法，包括向有需要的人患者给予权利要求57的药物组合物。
59.权利要求58的方法，其中所述代谢紊乱是糖尿病。
60.权利要求58的方法，其中所述代谢紊乱是肥胖症。
61.ー种编码权利要求44或53的多肽的分离核酸。
62.权利要求61的分离核酸，其中所述核酸包含SEQID NO 460
63.—种载体,包含权利要求62的核酸分子。
64.—种宿主细胞，包含权利要求63的核酸分子。
65.权利要求44或53的分离的多肽,其中所述多肽包含 (a)不超过8个氨基酸残基的氨基末端截短，其中所述多肽能够降低哺乳动物的血糖； (b)不超过12个氨基酸残基的羧基末端截短，其中所述多肽能够降低哺乳动物的血糖；或 (c)不超过8个氨基酸残基的氨基末端截短和不超过12个氨基酸残基的羧基末端截短，其中所述多肽能够降低哺乳动物的血糖。
66.权利要求44或53的分离的多肽，其中所述多肽与一种或多种聚合物共价连接。
67.权利要求66的分离的多肽，其中所述聚合物是PEG。
全文摘要
本发明提供编码FGF21突变体多肽的核酸分子、FGF21突变体多肽、包含FGF21突变体多肽的药物组合物、以及使用这类核酸、多肽或药物组合物来治疗代谢紊乱的方法。
文档编号C07K14/50GK102655877SQ201080031036
公开日2012年9月5日 申请日期2010年5月4日 优先权日2009年5月5日
发明者A·E·汉伯格, E·J·贝罗斯基, M·L·迈克尔斯, M·M·埃利森, R·I·赫奇特, Y-S·李, 宣廷勋, 徐京 申请人:安姆根有限公司