专利名称：具有降低的免疫原性的改进的假单胞菌外毒素a的制作方法
技术领域：
本发明提供具有高细胞毒性和降低的免疫原性的改进的假单胞菌(pseudomonas)外毒素A(PE)分子、含有所述改进的假单胞菌外毒素A的组合物以及使用方法。
背景技术：
在过去的数年中，免疫偶联物已被开发为治疗恶性肿瘤的备选治疗方法。免疫偶联物最初由抗体与植物或细菌毒素通过化学偶联组成，该免疫偶联物为一种被称为免疫毒素的形式。抗体与靶细胞上表达的抗原结合，并且毒素被内化，从而通过阻止蛋白合成和诱导凋亡引起细胞死亡(Brinkmann,U. ,Mol. Med. Today, 2 :439-446 (1996))。最近，已经将编码抗体和毒素的基因融合，并将免疫毒素表达为融合蛋白。已有很多研究在利用称为假单胞菌外毒素A ( “PE”)的细菌毒素作为毒性部分的免疫毒素上进行。通常，将PE截短或突变，从而降低其非特异性毒性，但又不会破坏其对于被免疫毒素的靶向部分所靶向的细胞的毒性。目前，对利用基于PE的免疫毒素作为多种癌症的治疗手段的测试正进行临床试验。目前的基于PE的免疫毒素的免疫原性很强。经证实，这一点在血液学恶性肿瘤的治疗中不是问题，因为在血液学恶性肿瘤中，免疫系统产生应答的能力通常遭受破坏。通常可以将免疫毒素多次给予血液学恶性肿瘤患者。然而，实体瘤患者通常在首次给药后的数周内产生对基于PE的免疫毒素的中和抗体。因为很多方案要求在免疫毒素给药之间具有3周的时间，所以该时间段内抗体的产生实际上意味着，对于实体瘤而言，在患者的抗体致使基于PE的免疫毒素失效之前，通常仅可以对其进行一次给药。尽管如此，基于PE的免疫毒素的单次给药也能非常有助于减小患者的肿瘤负荷、消灭较小的转移灶和缓解症状。但是，仍希望能拥有可降低患者的免疫原性应答的抗原性较低形式的基于PE的免疫毒素。本发明满足这些需要，并且还满足其它需要。发明概述本发明提供具有降低的免疫原性的改进的假单胞菌外毒素A( “PE”)。在结构上，本发明的改进的PE中去除了结构域I和大部分的结构域II，并且结构域III中的氨基酸残基位置D406、R432、R467、R490、R513、E548、K590和Q592被取代为甘氨酸，丙氨酸或丝氨酸。在功能上，本发明的改进的PE分子保留高的细胞毒性活性，同时去除了 B细胞表位。接受了 5次注射本发明的改进PE的小鼠不会产生针对所述毒素的免疫应答。用本文中称为LR-8M(之前称为LR-8X)的本发明具体实施方案对所述改进的PE分子进行举例说明。因此，一方面，本发明提供了分离的假单胞菌外毒素A( “PE”)，其中对应SEQ IDNO I的氨基酸残基，所述假单胞菌外毒素A中去除了残基1-273和285-394，并且氨基酸残基D406、R432、R467、R490、R513、E548、K590和Q592被取代为丙氨酸、甘氨酸或丝氨酸。
在相关方面中，本发明提供了嵌合分子，其包含与(b)假单胞菌外毒素A( “PE”)偶联或融合的(a)靶向部分，其中对应SEQ ID NO 1的氨基酸残基，所述假单胞菌外毒素A中去除了残基 1-273 和 285-394，并且氨基酸残基 D406、R432、R467、R490、R513、E548、K590和Q592被取代为丙氨酸、甘氨酸或丝氨酸。另一方面，本发明提供了组合物，其包含
(a)嵌合分子，所述嵌合分子包含与假单胞菌外毒素A( “PE”)偶联或融合的靶向部分，其中对应SEQ ID NO :1的氨基酸残基，所述假单胞菌外毒素A中去除了残基1-273和285-394，并且氨基酸残基 D406、R432、R467、R490、R513、E548、K590 和 Q592 被取代为丙氨酸、甘氨酸或丝氨酸；和(b)药学可接受的载体。在相关方面中，本发明提供编码修饰的假单胞菌外毒素A( “PE”)的分离的核酸，其中对应SEQ ID NO :1的氨基酸残基，所述假单胞菌外毒素A中去除了残基1-273和285-394，并且氨基酸残基 D406、R432、R467、R490、R513、E548、K590 和 Q592 被取代为丙氨酸、甘氨酸或丝氨酸。在一些实施方案中，所述核酸还编码靶向部分。另一方面，本发明提供抑制携带靶分子的细胞的生长的方法，所述方法包括将所述细胞与嵌合分子接触，所述嵌合分子包含(a)特异性地结合所述靶分子的靶向部分，和(b)假单胞菌外毒素A(“PE”)，其中对应SEQ ID NO 1的氨基酸残基，所述假单胞菌外毒素A中去除了残基1-273和285-394，并且氨基酸残基D406、R432、R467、R490、R513、E548、K590和Q592被取代为丙氨酸、甘氨酸或丝氨酸，其中将所述细胞与所述嵌合分子接触能抑制所述细胞的生长。关于所述实施方案,在一些实施方案中，对应SEQ ID NO :I的氨基酸残基,所述假单胞菌外毒素A中任选地至少一个选自D403、R412、R427、E431、R458、D461、R505、E522、R538、R551、R576和L597的氨基酸残基被取代为丙氨酸、甘氨酸或丝氨酸。在一些实施方案中，所述假单胞菌外毒素A具有SEQ ID NO :2的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述假单胞菌外毒素A具有SEQ ID NO : 3的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述祀向部分是抗体。在一些实施方案中，所述抗体选自scFv、dsFv、Fab、单结构域抗体和 F (ab，)2。在一些实施方案中，所述抗体针对选自以下的细胞表面抗原⑶19、⑶21、⑶22、CD25、CD30、CD33、CD79b、转铁蛋白受体、EGF受体、间皮蛋白(mesothelin)、钙粘蛋白和Lewis Y。在一些实施方案中，所述抗体选自B3、RFB4、SS1、HN1、HN2、MN和HB21。在一些实施方案中，所述抗体具有包含3个互补决定区(OTR)的可变轻链(VL)和包含3个⑶R的可变重链(VH)，其中(i)所述 VL CDRl 具有序列 QDIXXY，其中 XX 选自 SN、HG、GR、RG 和 AR ；(ii)所述 VL CDR2 具有序列 YTS ；(iii)所述 VL CDR3 具有序列 QQGNTLPWT ；(iv)所述 VH CDRl 具有序列 GFAFSIYD ；(V)所述 VH CDR2 具有序列 ISSGGGTT ；
(vi)所述 VH CDR3 具有序列 ARHSGYGXXXGVLFAY，其中 XXX 选自 SSY、THW、YNW、TTW和 STY。在一些实施方案中，所述抗体具有包含3个互补决定区(OTR)的可变轻链(VL)和包含3个⑶R的可变重链(VH)，其中⑴所述VL CDRl具有序列QDISNY ；(ii)所述 VL CDR2 具有序列 YTS ；(iii)所述 VL CDR3 具有序列 QQGNTLPWT ；
(iv)所述 VH CDRl 具有序列 GFAFSIYD ；(V)所述 VH CDR2 具有序列 ISSGGGTT ；(vi)所述 VH CDR3 具有序列 ARHSGYGTHWGVLFAY。在一些实施方案中，所述抗体具有包含3个互补决定区(OTR)的可变轻链(VL)和包含3个⑶R的可变重链(VH)，其中⑴所述VL CDRl具有序列QDIHGY ；(ii)所述 VL CDR2 具有序列 YTS ；(iii)所述 VL CDR3 具有序列 QQGNTLPWT ；(iv)所述 VH CDRl 具有序列 GFAFSIYD ；(V)所述 VH CDR2 具有序列 ISSGGGTT ；(vi)所述 VH CDR3 具有序列 ARHSGYGTHWGVLFAY。在一些实施方案中，所述抗体包含HA22的Fv部分。在一些实施方案中，所述抗体是人的或人源化的。在一些实施方案中，所述靶向部分是细胞因子、淋巴因子或生长因子。其它实施方案对于本领域技术人员是显而易见的，并且在本文中进行了描述。定义按照国际单位制(SI)可接受的形式表示单位、前缀以及符号。数值范围包括限定范围的数值。除非另外指明，核酸按照5'至3'的方向从左至右书写；氨基酸序列按照从氨基至羧基的方向从左至右书写。本文提供的标题不是限制本发明的的各个方面或实施方案，应参考整个说明书理解本发明的各个方面或实施方案。因此，下文紧接着定义的术语的应当参考整个说明书进行进行更充分的定义。假单胞菌外毒素A(“PE”)是由铜绿假单胞菌(Psedomonas aerugmosa)分泌的活性极高的单体蛋白(分子量66kD)，其抑制真核细胞中的蛋白合成。美国专利第5，602，095号中提供了天然PE序列(SEQ ID NO :1)，通过引用将其并入本文。PE的作用方法和结构以及能导致多种PE变体的修饰在文中为此目的的节段中进行了较详细的讨论。本文所述的PE突变参考天然PE的613个氨基酸的序列(SEQ ID NO I)的具体位置处存在的氨基酸残基，其后面为在讨论的具体突变中取代了所述残基的氨基酸。因此，例如，术语“R490A”表示参考分子中第490位的“R”(精氨酸的标准单字母代码)被替换为“A” (丙氨酸的标准单字母代码)，而“K590Q”表示第590位上通常存在的赖氨酸被替换为谷氨酰胺。常见氨基酸的标准单字母代码如下文所示。“⑶22”是指谱系限制性B细胞抗原，其属于Ig超家族。60-70%的B细胞淋巴瘤和白血病中表达⑶22，并且在B细胞发育早期中的细胞表面上或在干细胞上不存在⑶22。参见，例如 Vaickus et al.，Crit. Rev. Oncol/Hematol. 11 :267-297 (1991)。本文所用的术语“抗⑶22”是指特异性地结合⑶22的抗体，并且包括针对⑶22产生的抗体。在优选实施方案中，⑶22是灵长类⑶22，例如，人⑶22。在一个优选实施方案中，所述抗体是针对人⑶22产生的，所述人⑶22是将编码人⑶22的cDNA引入非灵长类哺乳动物后由所述动物合成的。“CD25”或“Tac”是指IL-2受体(IL2R)的α链。CD25是存在于活化的T细胞、活化的B细胞、部分胸腺细胞、骨髓前体细胞以及少突细胞上的I型跨膜蛋白，其与CD122缔合形成异二聚体，该异二聚体能作为IL-2的 高亲和力受体。大部分B细胞瘤、部分急性非淋巴细胞白血病以及成神经细胞瘤表达⑶25。本文所用的术语“抗⑶25”是指特异性地结合⑶25的抗体，并且包括针对⑶25产生的抗体。在优选实施方案中，⑶25是灵长类⑶25，例如，人⑶25。在一个优选实施方案中，所述抗体是针对人⑶25产生的，所述人⑶25是将编码人⑶25的cDNA引入非灵长类哺乳动物后由所述动物合成的。术语“间皮蛋白”是指存在于部分人类细胞的表面上并被例如Kl抗体结合的蛋白及其片段。间皮蛋白的核酸和氨基酸序列公开于，例如，PCT公开申请WO 97/25，068以及美国专利第6，083, 502号和第6，153，430号。也可以参见Chang，K. & Pastan,I·, Int. J. Cancer 57 :90(1994) ； Chang, K. & Pastan, I·，Proc. Nat 1 I Acad. SciUSA 93 136 (1996) ；Brinkmann U. , et al, Int.J. Cancer 71 :638(1997) ；Chowdhury,P. S. , et al, Mol Immunol. 34 :9 (1997)以及美国专利第 6，809，184 号。间皮蛋白被表达为约69kDa的前体蛋白，然后被加工而释放30kDa的蛋白，同时留下背景部分中所述的40kDa的甘油磷酸肌醇连接的细胞表面糖蛋白与细胞表面连接。40kDa的糖蛋白是本文中术语“间皮蛋白”所指的蛋白。数个物种的间皮蛋白的核酸和氨基酸序列已有记录，例如，人(ΝΜ_005823· 4 — ΝΡ_005814. 2 和 ΝΜ_013404· 3 — ΝΡ_037536. 2)、小鼠(ΝΜ_018857· I — ΝΡ_061345· I)、大鼠(ΝΜ_031658· I — ΝΡ_113846· I)、牛(ΝΜ_001100374. I — ΝΡ_001093844)。“RFB4”是指特异性地结合人⑶22的小鼠IgGl单克隆抗体。可以从多个供货商购得产品名为 RFB4 的 RFB4,例如 Southern Biotechnology Associates, Inc. (BirminghamAL ;目录号9360-01)、Autogen Bioclear UK Ltd. (Caine,Wilts,UK ;目录号AB147)、AxxoraLLC. (San Diego, CA) 0 RFB4对于B谱系细胞是高度特异性的，并且与其它正常细胞类型没有可检测的交叉反应(Li et al.，Cell. Immunol. 118 :85-99 (1989))。RFB4的重链和轻链已被克隆出。参见，Mansfield et al. ,Blood 90 :2020-2026 (1997)，通过引用将其并入本文。“BL22” (或“RFB-4(dsFv)-PE38”)是一种免疫毒素，其利用本领域称为“RFB-4"的抗C22抗体的二硫键稳定的Fv区作为靶向部分。RFB-4抗体的序列是本领域公知的。BL22 描述于 Kreitman et al. ,New Eng J Med 345(4) :241-7 (2001)。BL22 免疫毒素利用PE38作为免疫毒素的毒性部分。“HA22”是一种免疫毒素，其利用RFB-4的突变形式作为靶向部分，其中，RFB4的可变重链CDR3的残基SSY被突变为THW。RFB-4的这种突变及它对免疫毒素利用其作为靶向部分的影响描述于国际公布 WO 03/027135 和 Salvatore et al. , Clin Cancer Res 8(4)995-1002(2002)。HA22免疫毒素利用PE38作为免疫毒素的毒性部分。为了便于引用，本文所用的术语“抗体”包括全抗体(本文中有时称为“完整抗体”)、保留抗原识别和结合能力的抗体片段(包括通过对全抗体的修饰而产生的或利用重组DNA方法重头合成的)、单克隆抗体、多克隆抗体以及抗体模拟物，除非文中另作要求。抗体可以是 IgM、IgG (例如 IgG1' IgG2、IgG3 或 IgG4)、IgD、IgA 或 IgE。IgG亚类的恒定区序列是本领域多年来已经公知的(例如，Honjo et al. , Cell,18 :559-68 (1979) ；Tucker et al. , Science,206 :1303-6 (1979) ；Yamawaki et al. ,Nature283 :786-9(1980) ；Ellison et al. ,Nucl Acids Res 10:4071-9(1982) ；Ellison et al.，DNA I :11-8(1981) ；Ellison and Hood, Proc Natl Acad Sci USA 79:1984-8(1982))。因为可变区CDR决定抗体特异性，所以可以将针对靶细胞表面抗原的抗体CDR或Fv移植或工程化到选定抗体中，从而为该抗体赋予对于所述靶细胞表面抗原的特异性。例如，可以将针对靶细胞表面抗原的抗体CDR移植到已知三维结构的人抗体框架上(参见，例如，W098/45322 ；W087/02671 ;美国专利第 5，859，205 号；第 5，585，089 号和第 4，816，567 号；EP 专利申请 0173494 ;Jones, et al. Nature 321 :522(1986) ；Verhoeyen, et al, Science239 1534 (1988) ；Riechmann, et al. Nature 332:323(1988);以及 Winter & Milstein,Nature 349 :293 (1991)),从而形成当给予人时仅会引起很小的免疫原性应答或不会引起免疫原性应答的抗体。或者，可以通过将非人动物(例如小鼠)中发现的残基替换为通常在人中发现的残基将抗体恒定区工程化。按照此方式工程化的抗体被称为“人源化的抗体”并且是优选的，因为它们诱导副作用的风险较低，并且可以在循环中保持更长的时间。抗体的人源化方法是本领域已知的，并且描述于，例如，美国专利第6，180，377号、第6，407，213号、第 5，693，762 号、第 5，585，089 号和第 5，530，101 号。术语“抗体片段”表示包含完整抗体的一部分的分子，通常是完整抗体的抗原结合区或可变区。抗体片段的实例包括Fab、Fab'、F(ab' )2以及Fv片段；单结构域抗体(参见，例如，ffesolowski, Med Microbiol Immunol. (2009) 198(3) :157-74 ;Saerens, etal. , Curr Opin Pharmacol. (2008)8(5) :600-8 ；Harmsen and de Haard, Appl MicrobiolBiotechnol. (2007)77(1) :13-22);螺旋稳定抗体(参见，例如，Amdt et al.，J Mol Biol312 =221-228(2001);双链抗体(参见下文)；单链抗体分子(“scFvs”，参见，例如，美国专利第5，888，773号)；二硫键稳定抗体(“dsFvs”，参见，例如，美国专利第5，747，654号和第 6，558，672 号)以及结构域抗体(“dAbs”,参见,例如，Holt et al.，Trends Biotech21(11) :484-490(2003), Ghahroudi et al.，FEBS Lett. 414 :521-526(1997)，Lauwereyset al.，EMBO J 17 :3512-3520(1998)，Reiter et al.，J.Mol. Biol. 290 :685-698(1999)，Davies and Riechmann, Biotechnology,13 :475-479(2001))。术语“双链抗体”是指具有两个抗原结合位点的小的抗体片段，所述片段包含在同一多肽链中与可变轻结构域(“VJ或“VL”)连接的可变重结构域(“VH”或“VH”)(Vh-Vl)。通过使用由于太短而不允许同一链上的两个结构域之间配对的连接物，所述结构域被迫与另一链的互补结构域配对，并产生两个抗原结合位点。双链抗体及其制备更详细地描述于，例如，EP 404, 097 ；W0 93/11161 ;以及 Hollinger et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90 6444-6448(1993)。
术语“母体抗体”表示希望进行突变或改变而获得与母体抗体结合同一表位但具有较高亲和力的抗体或其片段的任何目的抗体。“靶向部分”是免疫偶联物中预期使免疫偶联物靶向于目的细胞的部分。通常，靶向部分是抗体或保留抗原识别能力的抗体片段，例如scFv、dsFv、Fab或F(ab' )2。“毒性部分”是免疫毒素中使免疫毒素对目的细胞产生细胞毒性的部分。对于作为本发明一个主题的免疫毒素，正如下文详细描述的，毒性部分是假单胞菌外毒素A，已对所述假单胞菌外毒素A进行突变来降低其非特异性的细胞毒性。通常，免疫球蛋白具有重链和轻链。每条重链和轻链都含有恒定区和可变区(所述区也称为“结构域”)。轻链和重链可变区含有"框架"区，所述框架区被3个高度可变区(也称为“互补决定区”或“CDR”)隔开。框架区和CDR的范围已被界定。不同轻链或重链的框架区序列在一个物种内是相对保守的。抗体的框架区，即组成型轻链和重链的组合框架区，用于三维空间中CDR的定位和排列。
⑶R主要负责与抗原的表位结合。每条链的⑶R通常称为⑶R1XDR2以及⑶R3(从N末端开始依次编号)，并且还通常由具体⑶R所位于的链来标识。因此，VfDR3位于其所在的抗体重链的可变结构域中，而'CDRl是其所在的抗体轻链的可变结构域的CDRl。“Vh”或“VH”是指免疫球蛋白重链的可变区，包括Fv、scFv、dsFv或Fab。“VJ或“VL”是指免疫球蛋白轻链的可变区，包括Fv、scFv、dsFv或Fab。词组“单链Fv”或“scFv”是指这样的抗体其中常规的两条链的抗体的重链可变结构域和轻链可变结构域已被连接从而形成一条链。通常，在两条链之间插入连接肽，以允许正确折叠和活性结合位点的产生。词组“二硫键”或“半胱氨酸-半胱氨酸二硫键”是指两个半胱氨酸之间的共价相互作用，其中半胱氨酸的硫原子被氧化从而形成二硫键。二硫键的平均键能为约60kcal/mol,而氢键为 l_2kcal/mol。 词组“二硫键稳定Fv”或“dsFv”是指轻链和重链之间具有二硫键的免疫球蛋白可变区。在本发明的背景下，形成二硫键的半胱氨酸位于抗体链的框架区内，并且用于稳定抗体的构象。通常，将抗体进行工程化，从而在框架区中取代不会干扰抗原结合的位置处引入半胱氨酸。术语“连接肽”包括抗体结合片段(例如，Fv片段)中的肽，其用于使重链可变结构域与轻链可变结构域间接结合。可以通过重组方法(例如，通过噬菌体或相似载体中重组抗体文库的选择(参见，例如，Huse, et al. , Science 246 1275-1281 (1989) ；ffard, et al. , Nature 341 544-546 (1989);和 Vaughan, et al. ,Nature Biotech. 14:309-314(1996)))或通过用抗原或编码抗原的DNA免疫动物来产生与具体抗原能发生免疫反应的抗体。术语“效应部分”表示免疫偶联物中预期对靶向部分所靶向的细胞具有作用或预期能鉴定免疫偶联物的存在的部分。在本发明的背景下，效应部分是突变的假单胞菌外毒素A。术语“免疫偶联物”包括效应分子与抗体的共价连接。术语“有效量”或“对…有效的量”或“治疗有效量”包括足以产生所需结果的治疗剂剂量，所述结果例如将细胞蛋白合成抑制至少50%或杀死细胞。术语“毒素”通常包括相思豆毒素、蓖麻毒素、假单胞菌外毒素(PE)、白喉毒素(DT)、肉毒杆菌毒素或它们的经过修饰的毒素。例如，PE和DT是高毒性化合物,它们通常通过肝毒性而导致死亡。然而，可以通过去除PE和DT的天然靶向组分(例如，PE的结构域Ia或DT的B链)并将其替换为不同的靶向部分(例如抗体)而将PE和DT修饰为能用作免疫毒素的形式。在本发明 的背景下，毒素是突变的假单胞菌外毒素A。 术语“接触”包括置于直接的物理关联中。“表达质粒”包含编码目的分子的核苷酸序列，其与启动子可操作地连接。本文所用的“多肽”、“肽”和“蛋白”可交换使用，并且包括氨基酸残基的聚合物。上述术语适用于其中一个或多个氨基酸残基是对应的天然存在的氨基酸的人工化学类似物的氨基酸聚合物，并且适用于天然存在的氨基酸聚合物。上述术语还适用于含有保守型氨基酸取代而使得蛋白仍具有功能的聚合物。术语“残基”或“氨基酸残基”或“氨基酸”包括被合并入蛋白、多肽或肽(统称“肽”)中的氨基酸。氨基酸可以是天然存在的氨基酸，并且除非另外限定，氨基酸可以包括以与天然存在的氨基酸相似的方式发挥作用的天然氨基酸的已知类似物。本文涉及的氨基酸和类似物以下文表A中的缩写名称进行描述表A :氨基酸命名
权利要求
1.分离的假单胞菌(pseudomonas)外毒素A(“PE”)，其中对应SEQID NO 1的氨基酸残基，所述假单胞菌外毒素A中去除了残基1-273和285-394，并且氨基酸残基D406、R432、R467、R490、R513、E548、K590和Q592被取代为丙氨酸、甘氨酸或丝氨酸。
2.如权利要求I所述的假单胞菌外毒素A，其中对应SEQID NO: I的氨基酸残基，所述假单胞菌外毒素 A 中至少一个选自 D403、R412、R427、E431、R458、D461、R505、E522、R538、R551、R576和L597的氨基酸残基被取代为丙氨酸、甘氨酸或丝氨酸。
3.如权利要求I所述的假单胞菌外毒素A，其中所述假单胞菌外毒素A具有SEQID NO2的氨基酸序列。
4.如权利要求I或3所述的假单胞菌外毒素A，其中所述假单胞菌外毒素A具有SEQID NO 3的氨基酸序列。
5.嵌合分子，包含与(b)假单胞菌外毒素A(“PE”)偶联或融合的(a)靶向部分，其中对应SEQ ID NO: I的氨基酸残基，所述假单胞菌外毒素A中去除了残基1-273和285-394，并且氨基酸残基D406、R432、R467、R490、R513、E548、K590和Q592被取代为丙氨酸、甘氨酸或丝氨酸。
6.如权利要求5所述的嵌合分子，其中对应SEQID NO: I的氨基酸残基，所述假单胞菌外毒素 A 中至少一个选自 D403、R412、R427、E431、R458、D461、R505、E522、R538、R551、R576和L597的氨基酸残基被取代为丙氨酸、甘氨酸或丝氨酸。
7.如权利要求5所述的嵌合分子，其中所述假单胞菌外毒素A具有SEQID NO :2的氨基酸序列。
8.如权利要求5所述的嵌合分子，其中所述假单胞菌外毒素A具有SEQID NO :3的氨基酸序列。
9.如权利要求5所述的嵌合分子，其中所述靶向部分是抗体。
10.如权利要求9所述的嵌合分子,其中所述抗体选自scFv、dsFv、Fab、单结构域抗体和 F(ab，)2。
11.如权利要求9所述的嵌合分子，其中所述抗体针对选自以下的细胞表面抗原⑶19、⑶21、⑶22、⑶25、⑶30、⑶33、⑶79b、转铁蛋白受体、EGF受体、间皮蛋白、钙粘蛋白和Lewis Y。
12.如权利要求9所述的嵌合分子，其中所述抗体选自B3、RFB4、SSl、丽、HNl、HN2和HB21。
13.如权利要求9所述的嵌合分子，其中所述抗体具有包含3个互补决定区(CDR)的可变轻链(VL)和包含3个CDR的可变重链(VH)，其中 (i)所述VLCDRl具有序列QDIXXY，其中XX选自SN、HG、GR、RG和AR ； (ii)所述VLCDR2具有序列YTS ； (iii)所述VL CDR3 具有序列 QQGNTLPWT ； (iv)所述VH CDRl 具有序列 GFAFSIYD ； (V)所述VH CDR2具有序列ISSGGGTT ；(vi)所述 VH CDR3 具有序列 ARHSGYGXXXGVLFAY，其中 XXX 选自 SSY、THW, YNff, TTff 和STY。
14.如权利要求9所述的嵌合分子，其中所述抗体具有包含3个互补决定区(CDR)的可变轻链(VL)和包含3个CDR的可变重链(VH)，其中 ⑴所述VL CDRl具有序列QDIHGY ； (ii)所述VLCDR2具有序列YTS ； (iii)所述VL CDR3 具有序列 QQGNTLPWT ； (iv)所述VH CDRl 具有序列 GFAFSIYD ； (V)所述VH CDR2具有序列ISSGGGTT ； (vi)所述 VH CDR3 具有序列 ARHSGYGTHWGVLFAY。
15.如权利要求5所述的嵌合分子，其中所述靶向部分是细胞因子、淋巴因子或生长因子。
16.组合物，包含 (a)嵌合分子，所述嵌合分子包含与假单胞菌外毒素A(“PE”)偶联或融合的靶向部分，其中对应SEQ ID N0:1的氨基酸残基，所述假单胞菌外毒素A中去除了残基1-273和285-394，并且氨基酸残基 D406、R432、R467、R490、R513、E548、K590 和 Q592 被取代为丙氨酸、甘氨酸或丝氨酸；以及 (b)药学可接受的载体。
17.如权利要求16所述的组合物，其中对应SEQID NO : I的氨基酸残基，所述假单胞菌外毒素 A 中至少一个选自 D403、R412、R427、E431、R458、D461、R505、E522、R538、R551、R576和L597的氨基酸残基被取代为丙氨酸、甘氨酸或丝氨酸。
18.如权利要求16所述的组合物，其中所述假单胞菌外毒素A具有SEQID NO 2的氨基酸序列。
19.如权利要求16所述的组合物，其中所述假单胞菌外毒素A具有EQID NO 3的氨基酸序列。
20.如权利要求16所述的组合物，其中所述靶向部分是抗体。
21.如权利要求20所述的组合物,其中所述抗体选自scFv、dsFv、Fab、单结构域抗体和F(ab，)2。
22.如权利要求20所述的组合物，其中所述抗体针对选自以下的细胞表面抗原CD19、CD21、CD22、CD25、CD30、CD33、CD79b、转铁蛋白受体、EGF受体、间皮蛋白、钙粘蛋白和LewisY。
23.如权利要求20所述的组合物，其中所述抗体选自B3、RFB4、SSl、HNl、HN2、丽和HB21。
24.如权利要求20所述的组合物，其中所述抗体具有包含3个互补决定区(OTR)的可变轻链(VL)和包含3个CDR的可变重链(VH)，其中 (i)所述VLCDRl具有序列QDIXXY，其中XX选自SN、HG、GR、RG和AR ； (ii)所述VLCDR2具有序列YTS ； (iii)所述VL CDR3 具有序列 QQGNTLPWT ； (iv)所述VH CDRl 具有序列 GFAFSIYD ； (V)所述VH CDR2具有序列ISSGGGTT ；(vi)所述 VH CDR3 具有序列 ARHSGYGXXXGVLFAY，其中 XXX 选自 SSY、THW, YNW, TTff 和STY。
25.如权利要求20所述的组合物，其中所述抗体具有包含3个互补决定区(OTR)的可变轻链(VL)和包含3个CDR的可变重链(VH)，其中 ⑴所述VL CDRl具有序列QDIHGY ； (ii)所述VLCDR2具有序列YTS ； (iii)所述VL CDR3 具有序列 QQGNTLPWT ； (iv)所述VH CDRl 具有序列 GFAFSIYD ； (V)所述VH CDR2具有序列ISSGGGTT ； (vi)所述 VH CDR3 具有序列 ARHSGYGTHWGVLFAY。
26.如权利要求16所述的组合物，其中所述靶向部分是细胞因子、淋巴因子或生长因子。
27.分离的核酸，其编码修饰的假单胞菌外毒素A(“PE”)，其中对应SEQID ΝΟ:1的氨基酸残基，所述假单胞菌外毒素A中去除了残基1-273和285-394，并且氨基酸残基D406、R432、R467、R490、R513、E548、K590和Q592被取代为丙氨酸、甘氨酸或丝氨酸。
28.如权利要求27所述的分离的核酸，其中对应SEQID NO :I的氨基酸残基，所述假单胞菌外毒素 A 中至少一个选自 D403、R412、R427、E431、R458、D461、R505、E522、R538、R551、R576和L597的氨基酸残基被取代为丙氨酸、甘氨酸或丝氨酸。
29.如权利要求27所述的分离的核酸，其中所述假单胞菌外毒素A具有SEQID NO 2的氨基酸序列。
30.如权利要求27所述的分离的核酸，其中所述假单胞菌外毒素A具有SEQID NO 3的氨基酸序列。
31.如权利要求27所述的分离的核酸，其中所述核酸还编码靶向部分。
32.如权利要求32所述的分离的核酸，其中所述靶向部分是抗体。
33.如权利要求32所述的分离的核酸,其中所述抗体选自scFv、dsFv、Fab、单结构域抗体和 F(ab’)2。
34.如权利要求32所述的分离的核酸，其中所述抗体针对选自以下的细胞表面抗原⑶19、⑶21、⑶22、⑶25、⑶30、⑶33、⑶79b、转铁蛋白受体、EGF受体、间皮蛋白、钙粘蛋白和Lewis Y。
35.如权利要求32所述的分离的核酸，其中所述抗体选自B3、RFB4、SSUHNl、HN2、丽和 HB21。
36.如权利要求32所述的分离的核酸，其中所述抗体具有包含3个互补决定区(CDR)的可变轻链(VL)和包含3个⑶R的可变重链(VH)，其中 (i)所述VLCDRl具有序列QDIXXY，其中XX选自SN、HG、GR、RG和AR ； (ii)所述VLCDR2具有序列YTS ； (iii)所述VL CDR3 具有序列 QQGNTLPWT ； (iv)所述VH CDRl 具有序列 GFAFSIYD ； (V)所述VH CDR2具有序列ISSGGGTT ；(vi)所述 VH CDR3 具有序列 ARHSGYGXXXGVLFAY，其中 XXX 选自 SSY、THW, YNW, TTff 和STY。
37.如权利要求32所述的分离的核酸，其中所述抗体具有包含3个互补决定区(CDR)的可变轻链(VL)和包含3个⑶R的可变重链(VH)，其中 ⑴所述VL CDRl具有序列QDIHGY ； (ii)所述VLCDR2具有序列YTS ； (iii)所述VL CDR3 具有序列 QQGNTLPWT ； (iv)所述VH CDRl 具有序列 GFAFSIYD ； (V)所述VH CDR2具有序列ISSGGGTT ； (vi)所述 VH CDR3 具有序列 ARHSGYGTHWGVLFAY。
38.如权利要求31所述的分离的核酸，其中所述靶向部分是细胞因子、淋巴因子或生 长因子。
39.抑制携带靶分子的细胞的生长的方法，所述方法包括将所述细胞与嵌合分子接触，所述嵌合分子包含 (a)特异性地结合所述靶分子的靶向部分，和 (b)假单胞菌外毒素A( “PE”)，其中对应SEQ ID NO : I的氨基酸残基，所述假单胞菌外毒素A中去除了残基1-273和285-394，并且氨基酸残基D406、R432、R467、R490、R513、E548、K590和Q592被取代为丙氨酸、甘氨酸或丝氨酸， 其中将所述细胞与所述嵌合分子接触能抑制所述细胞的生长。
40.如权利要求39所述的方法，其中对应SEQID NO :I的氨基酸残基，所述假单胞菌外毒素 A 中至少一个选自 D403、R412、R427、E431、R458、D461、R505、E522、R538、R551、R576和L597的氨基酸残基被取代为丙氨酸、甘氨酸或丝氨酸。
41.如权利要求39所述的方法，其中所述假单胞菌外毒素A具有SEQID NO :2的氨基酸序列。
42.如权利要求39所述的方法，其中所述假单胞菌外毒素A具有SEQID NO :3的氨基酸序列。
43.如权利要求39所述的方法，其中所述靶向部分是抗体。
44.如权利要求43所述的方法,其中所述抗体选自scFv、dsFv、Fab、单结构域抗体和F(ab，)2。
45.如权利要求43所述的方法，其中所述抗体针对选自以下的细胞表面抗原CD19、CD21、CD22、CD25、CD30、CD33、CD79b、转铁蛋白受体、EGF受体、间皮蛋白、钙粘蛋白和LewisY。
46.如权利要求43所述的方法，其中所述抗体选自B3、RFB4、SS1、HN1、HN2、MN和HB21。
47.如权利要求43所述的方法，其中所述抗体具有包含3个互补决定区(CDR)的可变轻链(VL)和包含3个⑶R的可变重链(VH)，其中 (i)所述VLCDRl具有序列QDIXXY，其中XX选自SN、HG、GR、RG和AR ； (ii)所述VLCDR2具有序列YTS ； (iii)所述VL CDR3 具有序列 QQGNTLPWT ； (iv)所述VH CDRl 具有序列 GFAFSIYD ； (V)所述VH CDR2具有序列ISSGGGTT ；(vi)所述 VH CDR3 具有序列 ARHSGYGXXXGVLFAY，其中 XXX 选自 SSY、THW, YNW, TTff 和STY。
48.如权利要求43所述的方法，其中所述抗体具有包含3个互补决定区(CDR)的可变轻链(VL)和包含3个⑶R的可变重链(VH)，其中 ⑴所述VL CDRl具有序列QDIHGY ； (ii)所述VLCDR2具有序列YTS ； (iii)所述VL CDR3 具有序列 QQGNTLPWT ； (iv)所述VH CDRl 具有序列 GFAFSIYD ； (V)所述VH CDR2具有序列ISSGGGTT ； (vi)所述 VH CDR3 具有序列 ARHSGYGTHWGVLFAY。
49.如权利要求39所述的方法，其中所述靶向部分是细胞因子、淋巴因子或生长因子。
全文摘要
本发明提供具有高的细胞毒性和降低的免疫原性的改进的假单胞菌外毒素A(PE)分子、含有所述改进的假单胞菌外毒素A的组合物以及使用方法。
文档编号C07K14/21GK102655882SQ201080049559
公开日2012年9月5日 申请日期2010年9月10日 优先权日2009年9月11日
发明者恩田正德, 理查德·比尔斯, 艾拉·H·帕斯坦 申请人:美国政府健康及人类服务部