专利名称：使用添加渗透物的萃取发酵生产丁醇的方法
技术领域：
本发明涉及生物燃料领域。更具体地讲，本发明涉及通过微生物发酵生产丁醇的方法，其中在发酵培养基中存在至少一种渗透物，其浓度至少足以提高相对于在基础发酵培养基的渗透物浓度和任选的可发酵碳源的存在下的丁醇分配系数，并且通过把丁醇产物萃取到与水不混溶的有机萃取剂中将其移除。
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背景技术：
丁醇是重要的具有多种用途的工业化学品，例如用作燃料添加剂，用作柴油燃料的共混组分，在塑料工业中用作化学原料，以及在食品和香料工业中用作食品级萃取剂。每年，通过石化方法生产出100至120亿磅丁醇。随着对丁醇的需求增加，对通过发酵由可再生资源如玉米、甘蔗或纤维素进料生产这种化学制品的关注不断增加。在制备丁醇的发酵过程中，就地产物移除有利地降低了丁醇对微生物的抑制，并且通过控制发酵液中的丁醇浓度来改善发酵速率。就地产物移除技术包括反萃取、吸附、全蒸发、膜溶剂萃取和液-液萃取。在液-液萃取中，使萃取剂与发酵液接触以使丁醇在发酵液与萃取相之间分配。由分离过程例如通过蒸馏回收丁醇和萃取剂。公布的专利申请US 2009/0171129A1公开了从稀释水溶液如发酵液中回收C3-C6醇的方法。该方法包括将水溶液部分中的C3-C6醇活性提高到该部分中至少饱和的C3-C6醇活性。如本发明实施方案所述，C3-C6醇活性的提高可包括将亲水性溶质加入到水溶液中。添加足量的亲水性溶质以形成第二液相，该过程或者通过单独加入亲水性溶质或者与其他方法步骤组合进行。加入的亲水性溶质可为盐、氨基酸、水溶性溶剂、糖或那些溶质的组合。提交于2009年6月4日的美国专利公开申请12/478，389公开了从发酵液中生产并回收丁醇的方法，所述方法包括使发酵液与水不混溶的有机萃取剂接触以形成包含水相和含丁醇有机相的两相混合物的步骤，所述有机萃取剂选自C12-C22脂肪醇、C12-C22脂肪酸、C12-C22脂肪酸的酯、C12-C22脂肪醛、以及它们的混合物。美国临时专利申请61/168，640 ;61/168，642 ;和61/168，645 ;同时提交于2009年4 月 13 日;以及 61/231，697 ;61/231，698 ;和 61/231，699 ;同时提交于 2009 年 8 月 6 日，公
开了从发酵液中生产并回收丁醇的方法，所述方法包括使发酵液与水不混溶的有机萃取剂接触以形成包含水相和含丁醇有机相的两相混合物的步骤，所述萃取剂包括第一溶剂和第二溶剂，所述第一溶剂选自C12-C22脂肪醇、C12-C22脂肪酸、C12-C22脂肪酸的酯、C12-C22脂肪醛、以及它们的混合物，并且所述第二溶剂选自C7-C11醇、C7-C11羧酸、C7-C11羧酸的酯、C7-C11醛、以及它们的混合物。用于从发酵培养基生产和回收丁醇的改进的方法在不断地被寻求。期望其中将渗透物加入到发酵培养基中的丁醇就地产物移除方法，该方法提供了改善的丁醇萃取效率和可接受的微生物生物相容性。发明概沭本 发明提供了从发酵培养基中回收丁醇的方法，所述发酵培养基包含丁醇、水、至少一种渗透物和经基因修饰的微生物，该微生物从至少一种可发酵碳源中生产丁醇。存在于发酵培养基中的渗透物浓度至少足以提高相对于在基础发酵培养基的渗透物浓度和任选的可发酵碳源的存在下的丁醇分配系数。本发明也提供了使用此类微生物不能够加入渗透物生产丁醇的方法。所述方法包括使发酵培养基与以下物质接触i)第一与水不混溶的有机萃取剂和任选的ii)第二与水不混溶的有机萃取剂，任选地从所述有机相中分离含丁醇有机相，并且从含丁醇有机相中回收所述丁醇。在本发明的一个实施方案中，提供了从发酵培养基中回收丁醇的方法，所述方法包括a)提供包含丁醇、水、至少一种渗透物和从至少一种可发酵碳源中生产丁醇的经基因修饰的微生物的发酵培养基，所述渗透物浓度至少足以提高相对于在所述基础发酵培养基的渗透物浓度和任选的可发酵碳源的存在下的丁醇分配系数；b)使所述发酵培养基与以下物质接触以形成包含水相和含丁醇有机相的两相混合物i)第一与水不混溶的有机萃取剂，所述有机萃取剂选自C12-C22脂肪醇、C12-C22脂肪酸、C12-C22脂肪酸的酯、C12-C22脂肪醛、C12-C22脂肪酰胺、以及它们的混合物，和任选地ii)第二与水不混溶的有机萃取剂，所述有机萃取剂选自C7-C22脂肪醇、C7-C22脂肪酸、C7-C22脂肪酸的酯、C7-C22脂肪醛、C7-C22脂肪酰胺、以及它们的混合物；c)任选地将所述含丁醇有机相与所述水相分离；以及d)任选地从所述含丁醇有机相中回收丁醇以生产回收的丁醇。在一些实施方案中，一部分丁醇通过包括以下步骤的方法同时从发酵培养基中被移除a)用气体从所述发酵培养基中汽提丁醇以形成含丁醇气相；以及b)从所述含丁醇气相中回收丁醇。如本发明方法所述，可将渗透物加入发酵培养基、第一萃取剂、任选的第二萃取齐U、或它们的组合。在一些实施方案中，所述渗透物包括单糖、二糖、甘油、甘蔗汁、糖蜜、聚乙二醇、葡聚糖、高果糖玉米糖浆、玉米醪、淀粉、纤维素、以及它们的组合。在一些实施方案中，所述渗透物包括单糖，所述单糖选自鹿糖、果糖、葡萄糖、以及它们的组合。在一些实施方案中，所述渗透物选自聚乙二醇、葡聚糖、玉米醪、淀粉、纤维素、以及它们的组合。如本发明方法所述，在一些实施方案中所述经基因修饰的微生物选自细菌、蓝细菌、丝状真菌和酵母。在一些实施方案中，所述细菌选自发酵单胞菌属、埃希氏菌属、沙门氏菌属、红球菌属、假单胞菌属、芽孢杆菌属、乳杆菌属、肠球菌属、片球菌属、产碱菌属、克雷伯氏菌属、类芽孢杆菌属、节杆菌属、棒状杆菌属和短杆菌属。在一些实施方案中所述酵母选自毕赤酵母属、假丝酵母属、汉逊酵母属、克鲁维酵母属、伊萨酵母属和糖酵母属。如本发明方法所述，所述第一萃取剂可选自油醇、二十二醇、鲸蜡醇、月桂醇、肉豆蘧醇、硬脂醇、油酸、月桂酸、肉豆蘧酸、硬脂酸、肉豆蘧酸甲酯、油酸甲酯、月桂醛、I-十二烷醇、以及这些的组合。在一些实施方案中，所述第一萃取剂包括油醇。在一些实施方案中，所述第二萃取剂可选自I-壬醇、I-癸醇、I-十一烷醇、2-十一烷醇、I-壬醛、以及这些的组
口 ο
在一些实施方案中，所述丁醇为I- 丁醇。在一些实施方案中，所述丁醇为2- 丁醇。在一些实施方案中，所述丁醇为异丁醇。在一些实施方案中，所述发酵培养基还包含乙醇，并且所述含丁醇有机相包含乙醇。在本发明的一个实施方案中，提供了生产丁醇的方法，所述方法包括a)提供从至少一种可发酵碳源中生产丁醇的经基因修饰的微生物；b)使所述微生物在双相发酵培养基中生长，所述双相发酵培养基包含水相和i)第一与水不混溶的有机萃取剂，所述有机萃取剂选自C12-C22脂肪醇、 C12-C22脂肪酸、C12-C22脂肪酸的酯、C12-C22脂肪醛、C12-C2Jg肪酰胺、以及它们的混合物，和任选地ii)第二与水不混溶的有机萃取剂，所述有机萃取剂选自C7-C22醇、C7-C22羧酸、C7-C22羧酸的酯、C7-C22醛、C7-C22酰胺、以及它们的混合物，其中所述双相发酵培养基还包含至少一种渗透物，所述渗透物浓度至少足以提高相对于在所述基础发酵培养基的渗透物浓度和任选的可发酵碳源的存在下的丁醇分配系数，培养时间足以使所述丁醇被萃取至所述有机萃取剂以形成含丁醇有机相；c)将所述含丁醇有机相与所述水相分离；以及d)任选地从所述含丁醇有机相中回收所述丁醇以生产回收的丁醇。在本发明的一个实施方案中，提供了生产丁醇的方法，所述方法包括a)提供从至少一种可发酵碳源中生产丁醇的经基因修饰的微生物；b)使所述微生物在发酵培养基中生长，其中所述微生物将丁醇生产到所述发酵培养基中以生产含丁醇的发酵培养基；c)将至少一种渗透物加入到所述发酵培养基中以提供至少足以提高相对于在所述基础发酵培养基的渗透物浓度和任选的可发酵碳源的存在下的丁醇分配系数的渗透物浓度；d)使至少一部分所述含丁醇的发酵培养基与以下物质接触以形成包含水相和含丁醇有机相的两相混合物i)第一与水不混溶的有机萃取剂，所述有机萃取剂选自C12-C22脂肪醇、C12-C22脂肪酸、C12-C22脂肪酸的酯、C12-C22脂肪醛、C12-C22脂肪酰胺以及它们的混合物，和任选的ii)第二与水不混溶的有机萃取剂，所述有机萃取剂选自C7-C22醇、C7-C22羧酸、C7-C22羧酸的酯、C7-C22醛、C7-C22酰胺以及它们的混合物；e)将所述含丁醇有机相与所述水相分离；f)任选地从所述含丁醇有机相中回收所述丁醇；以及g)任选地使至少一部分所述水相返回至所述发酵培养基。在一些实施方案中，当所述微生物生长期减缓时，可将所述渗透物加入到步骤(C)的发酵培养基中。在一些实施方案中，当所述丁醇生产期结束时，可将所述渗透物加入到步骤(C)的发酵培养基中。在一些实施方案中，所述经基因修饰的微生物包含灭活碳流竞争性途径的修饰。在一些实施方案中，所述经基因修饰的微生物不产生丙酮。附图
简沭和序列描述图I是对本发明的方法的一个实施方案的图解，其中在使发酵培养基与萃取剂在发酵容器中接触之前，所述第一萃取剂和所述第二萃取剂在容器中被合并。图2是对本发明的方法的一个实施方案的图解，其中所述第一萃取剂和所述第二萃取剂被分别加入至发酵容器，发酵培养基在该容器中与萃取剂接触。图3是对本发明的方法的一个实施方案的图解，其中所述第一萃取剂和所述第二萃取剂被分别加入不同的发酵容器中。图4是对本发明的方法的一个实施方案的图解，其中对产物的萃取在发酵罐的下游进行，并且在使发酵培养基与萃取剂在容器中接触之前，所述第一萃取剂和所述萃取剂在不同的容器中被合并。
图5是对本发明的方法的一个实施方案的图解，其中对产物的萃取在发酵罐的下游进行，并且第一萃取剂和第二萃取剂被分别加入容器中，其中发酵培养基与所述萃取剂接触。图6是对本发明的方法的一个实施方案的图解，其中对产物的萃取在发酵罐的下游进行，并且第一萃取剂和第二萃取剂被分别加入不同容器中以与发酵培养基接触。图7是对本发明的方法的一个实施方案的图解，其中对产物的萃取在至少一个分批发酵罐中进行，通过与发酵醪液底部或接近底部处的(使发酵罐充满萃取剂)与水不混溶的有机萃取剂共流，其中所述萃取剂在该发酵罐的顶部或接近顶部处的一点流出该发酵罐。下列序列符合37C. F. R. I. 821 I. 825 (“对含有核酸序列和/或氨基酸序列公开的专利申请的要求一序列规则”)，并且与世界知识产权组织(WIPO)标准ST. 25 (2009)和EPO和PCT的序列列表要求(规则5. 2和49. 5 (a bis)，以及行政指导的208节和附录C)相一致。表Ia :编码序歹Ij矛口蛋白质的序歹Ij号(SEQ ID Number)
说明I SEQ ID NO: I SEQ ID NO:
____氨基酸
肺炎克雷伯氏菌i Klebsiella pneumoniae ) budB (乙醜乳I2
酸合酶)
大肠杆菌//vC (乙酰羟酸还原异构酶)——34
大肠杆菌//vD (乙酰羟酸脱水酶)5 一 6 一
乳酸乳球菌i Lactococcus Iactis) kivD (支链α-酮酸脱後 7 (密码子8
酶)优化的) _
木糖氧化无色杆菌 i Achromobacter xylosoxidans ) sadB910
(丁醇脱氢酶)___
枯草芽抱杆菌i Bacillus subtilis) alsS (乙醜乳酸合酶)1112
啤酒糖酵母(/S1· cerevisiae ) ILV5 (乙醜择酸还原异构1314
酶；“KART，)___
突变体 KARI (由 Pf5.ilvC-Z4B8 编码) 15 16变异链球菌{ Streptococcus mutans、ilvD (乙醜幾酸脱水 17 18酶)____
权利要求
1.从发酵培养基中回收丁醇的方法，所述方法包括 a)提供包含丁醇、水、至少一种渗透物和从至少一种可发酵碳源中生产丁醇的经基因修饰的微生物的发酵培养基，所述渗透物浓度至少足以提高相对于在所述基础发酵培养基的渗透物浓度和任选的可发酵碳源的存在下的丁醇分配系数； b)使所述发酵培养基与以下物质接触以形成包含水相和含丁醇有机相的两相混合物i)第一与水不混溶的有机萃取剂，所述有机萃取剂选自C12-C22脂肪醇、C12-C22脂肪酸、C12-C22脂肪酸的酯、C12-C22脂肪醛、C12-C22脂肪酰胺、以及它们的混合物，和任选地ii)第二与水不混溶的有机萃取剂，所述有机萃取剂选自C7-C22脂肪醇、C7-C22脂肪酸、C7-C22脂肪酸的酯、C7-C22脂肪醛、C7-C22脂肪酰胺以及它们的混合物；以及 c)任选地从所述含丁醇有机相中回收所述丁醇以生产回收的丁醇。
2.权利要求I的方法，其中一部分所述丁醇通过包括以下步骤的方法同时从所述发酵培养基中被移除 a)用气体从所述发酵培养基中汽提丁醇以形成含丁醇气相；以及 b)从所述含丁醇气相中回收丁醇。
3.权利要求I的方法，其中将所述渗透物加入到所述发酵培养基、所述第一萃取剂、所述任选的第二萃取剂、或它们的组合中。
4.权利要求I的方法，其中所述渗透物包括单糖、二糖、甘油、甘蔗汁、糖蜜、聚乙二醇、葡聚糖、高果糖玉米糖浆、玉米醪、淀粉、纤维素、以及它们的组合。
5.权利要求I的方法，其中所述渗透物包括单糖，所述单糖选自蔗糖、果糖、葡萄糖、以及它们的组合。
6.权利要求I的方法，其中所述渗透物选自聚乙二醇、葡聚糖、玉米醪、淀粉、纤维素、以及它们的组合。
7.权利要求I的方法，其中所述经基因修饰的微生物选自细菌、蓝细菌、丝状真菌和酵母。
8.权利要求7的方法，其中所述细菌选自发酵单胞菌属、埃希氏菌属、沙门氏菌属、红球菌属、假单胞菌属、芽孢杆菌属、乳杆菌属、肠球菌属、片球菌属、产碱菌属、克雷伯氏菌属、类芽孢杆菌属、节杆菌属、棒状杆菌属和短杆菌属。
9.权利要求7的方法，其中所述酵母选自毕赤酵母属、假丝酵母属、汉逊酵母属、克鲁维酵母属、伊萨酵母属和糖酵母属。
10.权利要求I的方法，其中所述第一萃取剂选自油醇、二十二醇、鲸蜡醇、月桂醇、肉豆蘧醇、硬脂醇、油酸、月桂酸、肉豆蘧酸、硬脂酸、肉豆蘧酸甲酯、油酸甲酯、月桂醛、I-十二烷醇、以及这些的组合。
11.权利要求I的方法，其中所述第一萃取剂包括油醇。
12.权利要求I的方法，其中所述第二萃取剂选自I-壬醇、I-癸醇、I-i^一烷醇、2-十一烷醇、I-壬醛、以及这些的组合。
13.权利要求I的方法，其中所述丁醇为I-丁醇。
14.权利要求I的方法，其中所述丁醇为2-丁醇。
15.权利要求I的方法，其中所述丁醇为异丁醇。
16.权利要求I的方法，其中所述发酵培养基还包含乙醇，并且所述含丁醇有机相包含乙醇。
17.权利要求I的方法，其中所述经基因修饰的微生物包含灭活碳流竞争性途径的修饰。
18.权利要求I的方法，其中所述经基因修饰的微生物不生产丙酮。
19.生产丁醇的方法，包括 a)提供从至少一种可发酵碳源中生产丁醇的经基因修饰的微生物； b)使所述微生物在双相发酵培养基中生长,所述双相发酵培养基包含水相和i)第一与水不混溶的有机萃取剂，所述有机萃取剂选自C12-C22脂 肪醇、C12-C22脂肪酸、C12-C22脂肪酸的酯、C12-C22脂肪醛、C12-C2Jg肪酰胺、以及它们的混合物，和任选地ii)第二与水不混溶的有机萃取剂，所述有机萃取剂选自C7-C22醇、C7-C22羧酸、C7-C22羧酸的酯、C7-C22醛、C7-C22酰胺以及它们的混合物，其中所述双相发酵培养基还包含至少一种渗透物，所述渗透物浓度至少足以提高相对于在所述基础发酵培养基的渗透物浓度和任选的可发酵碳源的存在下的丁醇分配系数，培养时间足以使所述丁醇被萃取至所述有机萃取剂以形成含丁醇有机相； c)将所述含丁醇有机相与所述水相分离；以及 d)任选地从所述含丁醇有机相中回收所述丁醇以生产回收的丁醇。
20.权利要求19的方法，其中将所述渗透物在所述微生物生长期内加入到所述水相中、在所述丁醇生产期内加入到所述水相中、当所述水相中的丁醇浓度抑制时加入到所述水相中、加入到所述第一萃取剂中、加入到所述任选的第二萃取剂中、或加入到它们的组合中。
21.权利要求20的方法，其中所述渗透物得自发酵碳水化合物底物。
22.生产丁醇的方法，包括 a)提供从包含至少一种可发酵碳源的发酵培养基中生产丁醇的经基因修饰的微生物； b)使所述微生物在发酵培养基中生长，其中所述微生物将丁醇生产到所述发酵培养基中以生产含丁醇的发酵培养基； c)将至少一种渗透物加入到所述发酵培养基中以提供至少足以提高相对于在所述基础发酵培养基的渗透物浓度和任选的可发酵碳源的存在下的丁醇分配系数的渗透物浓度； d)使至少一部分所述含丁醇的发酵培养基与以下物质接触以形成包含水相和含丁醇有机相的两相混合物i)第一与水不混溶的有机萃取剂，所述有机萃取剂选自C12-C22脂肪醇、C12-C22脂肪酸、C12-C22脂肪酸的酯、C12-C22脂肪醛、C12-C22脂肪酰胺以及它们的混合物，和任选地ii)第二与水不混溶的有机萃取剂，所述有机萃取剂选自C7-C22醇、C7-C22羧酸、C7-C22羧酸的酯、C7-C22醛、C7-C22酰胺以及它们的混合物； e)将所述含丁醇有机相与所述水相分离； f)任选地从所述含丁醇有机相中回收所述丁醇；以及 g)任选地使至少一部分所述水相返回至所述发酵培养基。
23.权利要求22的方法，其中当所述微生物生长期减缓时，将所述渗透物加入到步骤(C)的发酵培养基中。
24.权利要求22的方法，其中当所述丁醇生产期结束时，将所述渗透物加入到步骤(c)的发酵培养基中。
25.权利要求I、19或22中的任一项的方法，其中所述至少一种可发酵碳源存在于所述发酵培养基中且包括可再生的碳，所述碳来自农业原料、藻类、纤维素、半纤维素、木质纤维素、或它们的任何组合。
26.组合物，包含 (a)包含丁醇、水、至少一种渗透物和从至少一种可发酵碳源中生产丁醇的经基因修饰的微生物的发酵培养基，所述渗透物浓度至少足以提高相对于在所述基础发酵培养基的渗透物浓度和任选的可发酵碳源的存在下的丁醇分配系数； b)第一与水不混溶的有机萃取剂，所述有机萃取剂选自C12-C2Jg肪醇、C12-C2Jg肪酸、C12-C22脂肪酸的酯、C12-C22脂肪醛、C12-C22脂肪酰胺以及它们的混合物；和 c)任选地第二与水不混溶的有机萃取剂，所述有机萃取剂选自C7-C22脂肪醇X7-C22脂肪酸、C7-C22脂肪酸的酯、C7-C22脂肪醛、C12-C22脂肪酰胺以及它们的混合物； 其中可形成包含水相和含丁醇有机相的两相混合物，并且从而可从(a)的发酵培养基中分离丁醇。
全文摘要
本文提供了通过微生物发酵生产丁醇的方法，其中在发酵期间在至少一种渗透物的存在下通过把丁醇产物萃取到与水不混溶的有机萃取剂中将其移除，所述渗透物浓度至少足以提高相对于在所述基础发酵培养基的渗透物浓度和任选的可发酵碳源的存在下的丁醇分配系数。所述渗透物可包括单糖、二糖、甘油、甘蔗汁、糖蜜、聚乙二醇、葡聚糖、高果糖玉米糖浆、玉米醪、淀粉、纤维素、以及它们的组合。本文还提供了从发酵培养基中回收丁醇的方法和组合物。
文档编号C07C29/86GK102666867SQ201080052282
公开日2012年9月12日 申请日期2010年11月23日 优先权日2009年11月23日
发明者M·C·格拉迪, R·帕特奈克 申请人:布特马斯先进生物燃料有限责任公司