一种萃取发酵生产异丙醇和丁醇的装置和方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物工程领域，设及异丙醇和下醇萃取发酵的装置和方法，特别是利 用十二酸在一个纤维床固定化反应器和液-液萃取器串联的萃取发酵系统里进行异丙醇和 下醇在线连续萃取发酵的装置和方法。
【背景技术】
[0002] 异丙醇和下醇是两种在化工领域非常重要的有机溶剂，可W用来做溶解试剂和化 学合成的基本骨架。更为重要的是由于它们能量密度高，能与汽油和柴油W任意比例互溶， 且能够运用生物工程技术进行发酵生产，所W被认为是最为理想的可再生燃料或是燃料添 加剂之一。（详见非专利文献：①化Isson , B. ,Fathi-Af shar, SRudd ,D Lightfoot, E.1981 .Biomass as a source of chemical feedstocks :an economic evaluation.Science,213(4507),513-517;②Lee,S.Y.,Park,J.H.,Jang,S.H.,Nielsen, L.K. ,Kim,J. , Jung ,K.S.2008.Fermentative butanol production by Clostridia.Biotechnology and bioengineering,101(2),209-228).
[0003] 然而，异丙醇和下醇的发酵对其生产菌株的毒害使得产量一直都很低，并且下醇 的高沸点使得将其从发酵液中分离出来变得非常很难，而萃取发酵可W有效地缓解运一难 题。萃取发酵是一个可W有效减少产物抑制、增加底物转化率和醇类产出率的发酵生产方 法，它在减少产物抑制促进产物产出的同时，实现了对目的产物的有效分离和提纯。液-液 萃取是一种利用液态萃取剂处理与之不互溶的双组分或多组分溶液，实现组分分离的传质 分离过程。由于它有常溫操作、节省能源、操作简单、不设及固体、气体等优点，因此被广泛 地应用于化学、化工及生物等多个领域。很多研究报道了采用植物油、脂肪酸醋、烧控和长 链脂肪醇对下醇进行液-液原位萃取发酵(详见非专利文献= Offeman RD，St邱henson SK， Robertson GH,Orts WJ.2006.Solvent extraction of ethanol from aqueous solutions using biobased oils,alcohols,and esters.J Am Oil Chem Soc 83(2): 153-156)。但运些萃取技术一直都受到萃取剂有限的溶剂分配系数的制约而未能有效的提 高溶剂萃取效果。因此，寻求一种具有较高脂肪醇分配系数、无毒、不溶于水且具有较高的 生物相互适应性的萃取剂对于运用液-液原位萃取发酵技术生产异丙醇和下醇尤为重要。
【发明内容】
[0004] 本发明目的之一是运用溶解于有机介质中的十二酸进行液-液原位在线连续萃取 发酵生产异丙醇和下醇，能够在发酵的同时将两种醇有效地从培养基中分离纯化出来，减 少培养基中产物抑制作用。
[0005] 本发明目的之二是将萃取器通过管道与纤维床固定化反应器和生物反应器串联 起来，然后连同萃取剂一起进行异丙醇和下醇萃取发酵。
[0006] -种萃取发酵生产异丙醇和下醇的装置，包括由管道依次串联普通生物反应器、 纤维床固定化反应器和液-液萃取器;所述纤维床固定化反应器跟生物反应器再由回流管 道连接，构成第一个液体循环系统;所述萃取器跟生物反应器再由回流管道连接，构成第二 个液体循环系统;该装置可W控制液体从生物反应器出发，经过不同的液体循环系统，最后 再返回生物反应器。
[0007] 在萃取器1/4高度位置和底部分别设置了进样口和出样口。
[0008] -种上述装置在线连续萃取发酵生产异丙醇和下醇的方法，先在生物反应器中培 养产醇菌的种子液，待其至对数生长中期，将菌种固定至纤维床固定化反应器中，发酵至进 入产醇阶段，将发酵液通入萃取器进行萃取，最后再回流到生物反应器;所述萃取器中加有 萃取剂，萃取剂为溶解于有机介质的十二烧酸，所述有机介质为非水溶性液体。
[0009] 所述萃取剂按2/5~3/5(W/W)溶于有机介质。更优选地，所述萃取剂按1/2(W/W)溶 于有机介质。
[0010]所述有机介质包括油醇、菜巧油、栋桐油或小桐子油。
[0011] 在菌种进行固定化时，开启第一个液体循环系统，使培养基仅在生物反应器和纤 维床固定化器之间循环;待发酵液细胞浓度不再下降并开始继续升高时，更换新鲜发酵培 养基完成细胞固定化。
[0012] 当发酵进入产醇阶段时，关闭第一个液体循环系统，使发酵液流入萃取器中并达 到萃取器1/4高度处(有机相萃取剂在上层，水相发酵液在下层），然后开始低速揽拌萃取， 并开启第二个液体循环系统，让培养基流回生物反应器。
[0013] 萃取时的揽拌速度控制在100~15化pm，使发酵液在萃取器的低速揽拌下能与萃 取剂有明显的相分离，通过揽拌速度控制使发酵液离开萃取器回流至生物反应器时不携带 萃取剂。
[0014] 当生物反应器中OD持续下降时，终止萃取发酵，更换新鲜发酵液，进行新一轮的萃 取发酵;连续重复上述萃取发酵，直至萃取剂失去萃取效果;终止萃取发酵，完成一次完整 的异丙醇和下醇在线连续萃取发酵过程。
[0015] 整个装置使用前先灭菌，并向其中通入无菌高纯氮气，使其成为一个严格厌氧的 环境。
[0016] 本发明所述的产醇菌株为产异丙醇和下醇或是所有产下醇的厌氧梭菌，没有特别 的限制。可列举菌株为拜氏梭菌（Clostridi um beijerinckii)、丙酬下醇梭菌 (Clostridium acetobutylicum)、糖乙酸下醇梭菌（Clostridium 3日。油日1'〇9日1'1311171日。日1：〇]1；[州111)和糖下酸梭菌（〔103付1(1；[加18日。油日1'01311171；[州111)四种，本 发明优选产异丙醇和下醇的拜氏梭菌。
[0017] 本发明的发酵溫度为36 °C ;培养基pH值为6.5，发酵过程不调控pH;发酵体积为 2.萃取溫度为30~36°C ;发酵液循环流速为50ml/min。
[0018] 本发明具有如下有益效果和优点：
[0019] ①本发明将长链脂肪酸十二烧酸(又称月桂酸)运用于异丙醇和下醇的萃取发酵， 旨在提高液-液原位萃取发酵的效果，实现对异丙醇和下醇在线高效萃取分离和发酵。十二 酸具有水不溶性，对菌株生长无毒害和对细胞产醇无抑制作用，且具有较高的下醇分配系 数，能够有效吸附发酵液中低浓度的异丙醇和下醇。
[0020] ②溶解于有机介质的十二酸能够迅速高效地降低发酵液中醇的浓度，运是由于发 酵液和萃取剂对醇类分配系数的差异，发酵液中的醇类优先分配到萃取剂中，并在其中达 到较高浓度，从而降低产物抑制作用。
[0021] ③利用十二酸原位萃取和发酵偶联，可W提高葡萄糖的利用率，有效地提高底物 转化率，提高发酵的生产强度，提高菌株的产醇量和产醇率。
[0022] ④利用十二酸原位连续萃取发酵，可W将醇类W较高浓度富集到萃取剂中，有效 地降低后续分离纯化难度和成本。
【附图说明】
[0023] 图1为本发明萃取发酵生产异丙醇和下醇的装置的结构示意图。
[0024] 图2为四次连续萃取发酵异丙醇和下醇的产出和浓度变化情况。
【具体实施方式】
[0025] 下面结合附图对本发明做进一步说明。
[0026] 本发明所有实施例中使用的产醇菌株均为拜氏梭菌（Clostridium beijerinckii,ATCC6014)。
[0027] 本发明所有实施例中使用的种子培养基(CM149)(g/L):酵母提取物3g，牛肉浸膏 粉IOg，蛋白腺IOg，葡萄糖5g，可溶性淀粉Ig，化Cl Sg，乙酸钢3g，盐酸半脫氨酸0.5g，p册.8 ±0.2。
[0028] 本发明所有实施例中使用的发酵培养基(P2)(g/L)(ml/L):葡萄糖50g，酵母提取 物3g，醋酸盐缓冲液母液IOml，维生素溶液母液IOml，矿物盐溶液IOml，初始pH值为6.5。
[0029] 上述各溶液的母液配方如下(溶液均为过滤除菌）：
[0030] ①醋酸盐缓冲液母液(g/L):K出P〇4 50g，K2HP〇4 50g，乙酸锭220g;
[0031] ②维生素溶液母液(g/L):对氨基苯甲酸O.lg，生物素 O.OOlg，硫胺素 O.lg;
[0032] ③矿物盐溶液（g/L):MgS〇4 20g，MnS〇4 lg，FeS〇4 ? 7出0 Ig，化Cl Ig.
[0033] 本发明提供了运用溶解于有机介质的十二酸进行液-液原位在线连续萃取发酵生 产异丙醇和下醇的装置和方法，包括如下步骤：
[0034] ①萃取发酵装置的组装和灭菌，如附图1所示:包括补料瓶1、生物反应器2、蠕动累 3、纤维床固定化反应器4、液-液萃取器5和单向阀（11个）。由管道依次串联普通生物反应器 2、纤维床固定化反应器4和液-液萃取器5;所述纤维床固定化反应器4跟生物反应器2再由 第一回流管道6连接，构成第一个液体循环系统;所述萃取器5跟生物反应器2再由第二回流 管道7连接，构成第二个液体循环系统。
[0035] ②先将所设及仪器装置灭菌，然后将纤维床固定化反应器和液-液萃取器由管道 连接起来，再跟生物反应器连接成一个液体可流动的循环系统。用纯氮气将萃取发酵装置 中的空气置换掉，使其成为一个充分厌氧的环境。
[0036] ③用纯氮气将萃取发酵装置中的空气置换掉，使其成为一个充分厌氧的环境。
[0037] ④萃取剂的配制:将萃取剂按1/2(W/W)比例溶于非水溶性无毒液体有机介质，然 后倒入萃取器。
[003引⑤菌种培养和固定化:先在生物反应器中培养产醇菌种子液，待菌液浓度ODsoo达 到2.OW上时，打开蠕动累使得发酵液在系统中循环起来，从而把细胞固定到纤维床固定化 反应器上。待发酵液细胞浓度不再下降并开始继续升高时，更换新鲜发酵培养基完成菌株 固定化。此过程中培养基循环不流经萃取器而走第一回流管道6。
[0039] ⑥更换新鲜培养基后，发酵处于产酸阶段的初期时，培养基循环不流经萃取器而 走第一回流管道6。
[0040] ⑦当发酵进入产醇阶段(约发酵起始后12小时），关闭第一回流管道6上的阀口，使 培养基流入萃取器5中并达到约1/4萃取器体积（有机相萃取剂在上层，水相培养基在下 层），然后开始低速揽拌萃取，并打开让培养基流回生物反应器2。此过程中要控制揽拌速 度，使其在萃取器的低速揽拌下还能与萃取剂有明显的相分离，保证发酵液离开萃取器流 回生物反应器时不携带参杂萃取剂，W免造成萃取剂随发酵液循环于萃取发酵系统中。 [0041 ]⑧当发酵液对菌种的抑制作用很