专利名称：木轮毂刺桐的水醇提取物、药物组合物和生产这些物质的方法
技术领域：
本发明涉及对胆碱能和/或5-羟色胺能系统起作用的分子。更具体，而言，本发明涉及可用于制备抗焦虑药物的刺桐副产物。还提供了含有所述分子的药物组合物以及制备所述药物组合物的方法。
背景技术：
木轮毂刺桐(Erythrina mulungu)(蝶形花科(Papilionaceae)一豆科(Leguminoseae))为具有红色花朵的木本植物(高10-14米)，生长在巴拉那盆地的半落叶性阔叶森林和主要在圣保罗州的西部地区和米那斯三角洲的灌木丛林地区(LORENZI，1992)。该植物的树皮被当地人用作安定药和镇静药。一般称之为木轮毂(mulungu)、珊瑚树、珊瑚木轮毂和珊瑚灌木(种族名称包括capa-homem，suiná-suiná，tiricoiro等)(LORENZI，1992)。巴西出产八个品种的刺桐木轮毂刺桐(E.mulungu)、E.velurina、鸡冠刺桐(E.crita-galli)、E.poeppigiana，褐花刺桐(E.fusca)、E.faleata、象牙花(E.speciosa)和E.verna(LORENZI，1992)。尽管对木轮毂刺桐种的研究很少，但是已进行很多工作以确认该品种的其它种的植物化学(fitochemical)和药理学性质，所述其它种还因为被广泛地用作镇静药、安定药并且还用作轻泻剂、抗炎剂和抗利尿剂而广为人知 et al.，2000)。
植物化学(Fitochemistry)对刺桐属种的研究产生兴趣始于1877年，当时 和Altamirano发现美国刺桐(E.americana)的种子提取物的药理学作用与右旋氯筒箭毒碱(从南美防己(Chondodendron tomentosum)中提取得到的物质)的作用相似(HARGREAVES et al.，1974；HIDER et al.，1986； et al.，2000)。此后进行了对刺桐不同种的提取物的植物化学和药理学性质的研究。数年之后，在确认了刺桐不同种的提取物中所展示的药理学作用后，研究致力于在这类植物中分离和鉴定生物碱(SARRAGIOTO et al.，1981)。直到此时药理学测试依然是在粗提产物上进行。1937年，Folkers和Major(1937)对美国刺桐(E.americana Mill.)的种子进行了化学研究，并分离了结晶生物碱刺桐定(erythroidine)，刺桐定呈现出与右旋氯筒箭毒碱相似的胆碱能活性。随后的分析(BOEKELHEIDE and GRUNDON，1953；BOEKELHEIDE et al.，1953)表明刺桐定是命名为α-刺桐定和β-刺桐定的两种同分异构生物碱的混合物，后者具有胆碱能活性(HARGREAVES et al.，1974；HIDER etal.，1986； et al.，2000)。分离了美国刺桐的α和β-刺桐定后，对刺桐的其它种进行了研究，并分离出新的刺桐骨架生物碱(FOLKERS and KONIUSZY，1940；FOLKERS et al.，1944；BOEKELHEIDE and GRUNDON，1953；BOEKELHEIDE et al.，1953；TANDONet al.，1969；ITO et al.，1970；BARTON et al.，1970；GHOSAL，1970；GHOSAL et al.，1971；ITO et al.，1971；MIANA et al.，1972；GHOSALet al.，1972a，b；BARTON et al.，1973；ITO et al.，1973，a，b，c，d；GHOSAL and SRIVASTAVA，1974；MILLINGTON et al.，1974；GAMES etal.，1974；ITO et al.，1976；BARAKAT et al.，1977；EL-OLEMY etal.，1978；AHMAD et al.，1979；TIWARI and MASSOD，1979a，b；SARRAGIOTO et al.，1981)。
对刺桐生物碱的基本结构的了解可通过降解和合成实现(GRUNDONand BOEKELHEIDE，1953；GRUNDON et al.，1953；WEINSTOCK andBOEKELHEIDE，1953；BOEKELHEIDE et al.，1953)。证实了这些生物碱的结构中存在螺旋胺骨架(spiroaminic skeleton)，所述碱具有如下通式(表示二烯类(dienic type)刺桐生物碱)。
对该结构的了解有助于随后鉴定新的化合物。目前，已知有三类刺桐生物碱。二烯类(Dienoid)代表A环和B环中的二烯系统。所述生物碱在A环中具有双键Δ1，6。第三组刺桐碱包括刺桐二烯酮碱(erysodienone)、3-去甲氧基刺桐替定酮碱(3-desmethoxyerythratidinone)、α-刺桐定和β-刺桐定。还分离了并不存在刺桐骨架的某些刺桐种的一些生物碱，这些生物碱包括东罂粟灵(orientaline)、N-降东罂粟灵(N-Noorientaline)、原汉防己碱(protosinomenine)、N-降原汉防己碱(N-Norprotosinomenine)、异波尔定碱(isoboldine)、刺桐双定(erybidine)、scoureline、异种荷包牡丹碱(coreximine)、hypaforin、coline。
使用由干花制得的乙醇提取物对木轮毂刺桐进行植物化学研究分离得到五种碱(erysothrina、N-erysothrina oxide、刺桐阿亭(erythrartine)、N-氧化刺桐阿亭(N-erythrartine oxide)和hypaforin)和萜类化合物fithol(SARRAGIOTO et al.，1981；SARRAGIOTO，1981)。最近的植物化学研究表明刺桐种还富含其它类物质，如黄烷酮、异黄烷酮、异黄酮和紫檀碱(pterocarpane)(DA-CUNHAet al.，1998；TANAKA et al.，1996，1997a，b；1998；2001；OH et al.，1999；YENESEW et al.，2000；NKENGFACK et al.，2001)。
药理学活性自刺桐获得的物质的主要药理学作用是其对胆碱能系统的外周活性，该活性已与右旋氯筒箭毒碱的作用相比较(HARGREAVES et al.，1974；HIDER et al.，1986； et al.，2000)。该作用归因于生物碱二氢-β-刺桐定(DHBE)，它是从美国刺桐(E.americana)(BOEKELHEIDE and GRUNDON，1953；BOEKELHEIDE et al.，1953)和E.tholloniana(CHAWLA et al，1985)分离获得的烟碱样拮抗剂受体(HIDER et al.，1986)。近来，在一个体外实验中，DHBE被表征为5-羟色胺3拮抗剂受体(5-HT3)( et al.，1993)。刺桐品种的一些种还表现出对中枢神经系统的其它活性，例如抗惊厥、催眠、麻醉、镇静和抗焦虑作用(GHOSAL et al.，1972；HARGREAVES et al.，1974；RATNASOORIYA and DHARMASIRI，1999；ONUSIC et al.，2002)。但是，已报道的研究并未分析刺桐生物碱在这些活性中的作用。
对E.velutina的研究表明，用水醇提取物(hydroalcoholicextract)短暂处理降低了小鼠在旷场实验中的活动情况(剂量为250和500mg/kg，口服摄入)，并且还增加了由戊巴比妥引起的睡眠周期以及毛果云香碱引起惊厥的起始周期(剂量为500和1000mg/kg，口服摄入)，这表明它对中枢神经系统有抑制作用(CABRAL et al.，2000)。另一项研究工作( et al.，2000)表明，与地西泮相似，用美国刺桐的己烷(hexanic)级分短暂处理(3mg/kg，i.p)降低了雄性小鼠的攻击行为。最近，对木轮毂刺桐的水醇提取物的研究(ONUSICet al.，2002)观察到，在高架式T迷宫试验的抑制性逃避学习中，用200mg/kg的剂量短暂处理(口服摄入)表现出对小鼠的抗焦虑作用，这与苯二氮革类抗焦虑药(BDZ)地西泮的作用相当。ONUSIC和他的同事们(2002)还在明暗箱模型中观察到相同剂量木轮毂刺桐的抗焦虑作用，包括在两箱之间的穿越次数以及在明箱里停留的时间。另一项研究工作表明，通过口服摄入剂量为50、100和200mg/kg的木轮毂提取物长期处理(9天)，在抑制性逃避学习和从高架式T迷宫的开放臂脱逃中表现出抗焦虑作用(ONUSIC et al.，2003)。在明暗箱模型中，剂量为50mg/kg的木轮毂刺桐提取物在长期处理14天后也表现出抗焦虑效应(ONUSICet al.，2003)。
尽管已有很多方法，但是迄今为止，现有报道中并没有将分离得到的刺桐活性成分或通过进行化学合成将其开发为抗焦虑药剂，也没有任何制备该药剂的方法。
发明内容
本发明的主题是提供能对胆碱能和/或5-羟色胺能系统起作用的分子以及包含所述分子的药物组合物。
一方面，本发明的分子在动物模型中被证实为有活性的抗焦虑药。因此，本发明的主题是提供可用于治疗需要使用抗焦虑药的焦虑相关疾病或其它临床表现的分子。
另一方面，对本发明分子的分离、结构表征以及药理学活性的评估使得能开发出旨在治疗焦虑疾病的标准化药物组合物。因此，本发明的另一个主题在于提供包含抗焦虑分子的药物组合物。
又一方面，本发明分子的分离和/或合成提供了生产包含所述分子的药物组合物的简便方法。因此，本发明的另一个主题在于提供生产药物组合物的方法。
图1示出木轮毂刺桐水醇粗提产物的提取和分级分离以及使用木轮毂刺桐水醇粗提产物分离生物碱刺桐阿亭、erythravine和11-OH-erythravine的步骤的总体示意图。
具体实施例方式
就本发明的目的而言，“药物组合物”应该意味着含有活性成分、具有预防、缓解和/或治疗目的、起着维持和/或恢复稳态作用的全部和任何一种组合物，并且可被局部给药、肠胃外给药、肠内给药和/或鞘内给药。
本发明中所说的药物组合物属于刺桐副产物类，包括11-OH-erythravine、其可药用电子等排体(isotheral)、盐、副产物和/或溶剂合物，任选地包含自木轮毂刺桐提取或通过化学合成获得的刺桐阿亭和/或erythravine。
本发明化合物的治疗应用在多个阶段进行。下文给出的所进行实验及其各自的结果仅为示例性的，并不限定所附权利要求的范围。
实施例1-使用植物材料制备提取物并分级分离在Rifaina郡(SP)的冬天里，从成年树收集花。通过采用乙醇/水(EtOH/H2O)(7∶3)的浸渍法将新鲜植物材料(6kg)处理7天进行提取。然后过滤提取物并借助旋转蒸发器将其浓缩，得到292g干燥水醇提取物。然后进行化学组成的生物监控分级分离和分离。接着进行酸碱提取，目的在于优化刺桐生物碱的分离。为实现该目的，将干的水醇提取物(120g)溶于醋酸的水溶液(10％)中，并用氯仿(CHCl3)进行液/液萃取。将氯仿相与水相分离并将溶剂蒸发得到级分1(7.83g)。然后，用足以获得9-10之间pH的体积的氢氧化铵(NH4OH)碱化水相，然后再用CHCl3萃取。将氯仿相分离并将溶剂蒸发得到级分2(F2)(670mg)。
实施例2-色谱法、仪器操作和光谱测定法使用Degree溶剂用于“分析”。为进行分析，使用二氧化硅薄层色谱法(CCD)，CHCl3/甲醇(MeOH)(9∶1)用作溶剂系统。F2中的生物碱Dragendorf测试为阳性，将所述F2进行空心柱色谱分析(open-columnchromatography，CCA)(直径为5cm，高为15cm)。为进行CCA(0,035-0,070mm，Φ6ηm)，将硅胶用作固定相，CHCl3/MeOH(10∶0-8∶2)用作流动相。为进行分离，使用了670mg F2，并收集到约20ml的101级分。对101级分进行了流动相为CHCl3/MeOH(7∶1)的分析性CCD并用Dragendorf分析显示后，101级分被分为级分A(FA-136.2mg)(1-27)、级分B(FB-93.4mg)(28-50)、级分C(FC-148.3mg)(51-69)、级分D(FD-284.5mg)(70-101)。为分离和纯化生物碱，使用制备型薄层色谱法(CCDP)，将荧光素(fluoresceine)用作硅胶固定相(Merck)，将甲苯、丙酮、乙醇和NH4OH(45∶45∶7∶3)用作流动相。为了对从CCDP分离得到的物质进行光谱测定分析，使用在500MHz进行的核磁共振(NMR)光度计Varian Unit。将氘化氯仿(CDCl3)用作溶剂。为测定分离出的生物碱的化学结构，使用1H和13C的NMR光谱测定法，以及HMQC、HMBC和COSY二维光谱测定法。将结果与当前可在关于刺桐生物碱的文献中获得的信息相比较。通过对FB的CCDP手段分离得到生物碱1，自FC和FD分离出生物碱2。使用FD还可分离得到生物碱3。物质1、2和3在CDCl3中的1H和13C NMR光谱(表1)表明存在具有刺桐碱骨架特征的信号。
表1-刺桐阿亭，erythravine和11-OH-erythravine的1H和13C(在CD3Cl中)的NMR(500MHz)的化学位移值(δ)和耦合(J)。
如表1所示，可以鉴定与氢H-14和H-17相关的芳香族质子的两个单峰信号以及由碳C-15和C-16位的甲氧基氢所引起的两个单峰信号。三个烯属质子信号(较宽单峰(s1)，H-7；较宽双峰(d1)，H-1；两个双峰(dd)，H-2)的存在可能是由于刺桐骨架的二烯系统氢所导致。尽管先前的工作(Sarragioto et al.，1982)已报道C-1和C-2分别在δ125.3和δ131.2发生共振，但是在本发明的开发工作中，HMQC二维光谱的化学位移之间的关系表明这些共振分别发生在δ131.5和δ125.5。
11-羟基-erythravine(11-OH-erythravine)与erythravine相似，11-OH-erythravine的1H NMR光谱(表2)中，在C-3位没有甲氧基氢信号，而对于刺桐阿亭，相对于氧合取代基在δ4.5处仅有一个多重峰，这是由于C-3位所引起。与在刺桐阿亭观察到的方式相同，1H和13C NMR光谱发现在δ4.74(t)和δ63.69分别存在化学位移，这是由于在C-11存在羟基。这些结果首次公开，因此物质3被认为是新的刺桐生物碱，并被称为11-羟基-erythravine(11-OH-erythravine)。生物碱11-OH-erythravine分离自木轮毂刺桐的花的粗提产物，其化学结构如下图所示。
实施例3-药理学评估使用自圣保罗州立大学(UNESP/Araraquara)的中心动物实验室获得的、重25-35g的Swiss小鼠。动物被分为10-12只/组、在底部填有木屑的聚丙烯笼中饲养，给予足量的食物和水。将动物实验室保持在22±1℃的恒定温度，光照控制为12小时一个循环，从7:00am至7:00pm，湿度保持在50-60％之间。用提取物、标准药物和载体进行药理学评估。因此，除了使用F2(3、6、10、17和30mg/kg)和生物碱刺桐阿亭、erythravine和11-OH-erythravine(3和10mg/kg)外，还使用了冷冻干燥的水醇提取物(50、100、200和400mg/kg)，通过采用管饲法的口服摄入给药。所使用的标准药物是剂量为2mg/kg的地西泮(DZP)(通过腹膜内给药，i.p)。所有溶液在实验当天由0.9％氯化钠制备得到，并对其进行超声处理15分钟，而地西泮溶于0.9％氯化钠和Tween-80的溶液中。实验在11:00am和5:00pm之间进行，实验仪器和方法如上所述。高架式T迷宫由透明玻璃壁和木质地板制成，由两个开放臂(30×5×0.25cm)和与其垂直连接的一个封闭臂(30×5×15cm)组成，由木质支持物使其距离地面38.5cm。在该测试中，对抑制性逃避进行了五次连续测量(基础时间、逃避1、2、3和4)并对从开放臂脱逃进行了一次测量，每次测试之间间隔30秒钟。在逃避测量中，将动物置于封闭臂的远端，记录从该封闭臂爬行至开放臂的脱逃时间。在脱逃测量中，将动物置于右手侧开放臂的端部，并测量从该开放臂离开的时间。在这些测量中动物停留在迷宫的臂中的最长时间为300秒。对每只动物进行测量之后，用20％乙醇清洗该装置。为了避免假阳性或假阴性，在高架式T迷宫中测试后，立即在活动场所对动物进行活动度测试。所述装置具有由30cm高的壁体围绕的矩形基底(40×48cm)的白色聚丙烯盒组成。将地面分为30个正方格(8×8cm)。在该测试中，将动物置于盒中央，并将其活动情况录像记录五分钟，用于随后进行对穿过方格区域(quadrant area)的数目以及stretch-attend姿势的数目的分析(WALSH and CUMMINS，1976)。
来自动物模型的所有结果首先进行Levene同质性检验。将异质性结果转化为对数尺度，随后进行统计分析。自高架式T迷宫获得的数据用于双因子方差分析(ANOVA)，处理情况作为独立因子，测试情况作为非独立因子。处理效果被证明为显著时，使用单因子ANOVA然后使用Duncan post hoc检验对数据进行分析。将得自活动场所的结果进行单因子ANOVA检验，然后进行Duncan post hoc检验。数值P≤0.05被当作显著结果。
高架式T迷宫测试如表2所示，在高架式T迷宫模型的抑制性逃避学习中，11-OH-erythravine损害了动物的行为表现。双因子ANOVA表明在处理(F(3，33)＝8,30；p＜0,001)、测试(F(4，132)＝14,75；p＜0,0001)以及处理和测试之间的相互作用(F(12，132)＝2,42；p＜0,01)中有显著差异。单因子ANOVA表明E1(F(3，33)＝4,47；p＜0,01)、E2(F(3，33)＝5,29；p＜0,01)、E3(F(3，33)＝5,29；p＜0,01)和E4(F(3，33)＝10,29；p＜0,0001)中处理组次之间有显著差异，但是在基础时间(F(3，33)＝0,51；p＜0,67)中没有显著差异。表2示出根据Duncanpost hoc检验的、与对照组相比的组次的差异。
关于从开放臂脱逃的测量，单因子ANOVA表明，在与对照组相比较时处理组之间没有差异(F(3，33)＝0,71；p＜0,54)。
表2-将小鼠用11-OH-erythravine进行短暂处理、随后进行高架式T迷宫测试的效果(平均值±EPM)
活动度-活动场所单因子ANOVA表明，就穿过活动场所的方格的数目(F(3，33)＝0,76；p＜0,51)以及stretch-attend姿势(F(3，33)＝1,20；p＜0,32)而言，所使用的11-OH-erythravine剂量均未改变活动度。表3示出通过活动度测试获得的数据。
表3-用11-OH-erythravine进行短暂处理对小鼠在活动场所的活动度的影响(平均值±EPM)
(按照条约第19条的修改)1.木轮毂刺桐(Erythrina mulungu)的水醇提取物，其特征在于含有具有如下通式的物质或其可药用电子等排体、盐和/或溶剂合物，它们与胆碱能和/或5-羟色胺能系统的功能异常相关 2.根据权利要求1的水醇提取物，其特征在于与胆碱能和/或5-羟色胺能系统的功能异常相关的疾病是焦虑。
3.含有木轮毂刺桐水醇提取物的药物组合物，其特征在于包含可药用载体和至少一种如下通式的活性物质或其可药用电子等排体、盐和/或溶剂合物 用于治疗与胆碱能和/或5-羟色胺能系统的功能异常相关的疾病。
4.根据权利要求3的药物组合物，其特征在于与胆碱能和/或5-羟色胺能系统的功能异常相关的疾病是焦虑。
5.根据权利要求3和4的药物组合物，其特征在于还包含刺桐阿亭和/或erythravine。
6.生产用于治疗与胆碱能和/或5-羟色胺系统的功能异常相关的疾病的药物的方法，其特征在于包括如下步骤-制备可药用载体；并
-将至少一种如下通式的活性物质或其可药用电子等排体、盐和/或溶剂合物掺入所述载体中 7.根据权利要求6的方法，其特征在于任选地将活性物质刺桐阿亭和/或erythravine加入所述载体。
8.根据权利要求6的方法，其特征在于所述活性物质由刺桐属(Erythrina)植物的水醇提取物获得。
9.根据权利要求8的方法，其特征在于所述活性物质由木轮毂刺桐植物种的水醇提取物获得。
权利要求
1.活性物质或其可药用离子等排体、盐、副产物和/或溶剂合物在脊椎动物的胆碱能和/或5-羟色胺能系统模型中的用途，所述活性物质的特征在于具有通式
2.根据权利要求1的用途，其中所述物质用作抗焦虑药。
3.用于治疗与胆碱能和/或5-羟色胺能系统的功能异常相关的障碍的药物组合物，所述药物组合物的特征在于包含可药用载体和至少一种如下通式的活性物质或其可药用离子等排体、盐、副产物和/或溶剂合物
4.根据权利要求3的组合物，其中所述物质用作抗焦虑药。
5.根据权利要求3和4的组合物，其特征在于还包含刺桐阿亭和/或erythravine。
6.根据权利要求3、4或5的组合物，其特征在于包含含有所述活性物质的木轮毂刺桐(Erythrina mulungu)的水醇提取物。
7.生产用于脊椎动物的胆碱能和/或5-羟色胺系统模型的药物的方法，其特征在于包括如下步骤-制备可药用载体；并-将至少一种如下通式的活性物质或其可药用离子等排体、盐、副产物和/或溶剂合物掺入所述载体中
8.根据权利要求7的方法，其中所述活性物质通过化学合成获得。
9.根据权利要求7的方法，其中所述活性物质刺桐阿亭和/或erythravine另外掺入所述载体中。
10.根据权利要求7的方法，其中所述活性物质由刺桐品种植物的水醇提取物获得。
11.根据权利要求10的方法，其中所述活性物质由木轮毂刺桐植物的水醇提取物获得。
全文摘要
本发明提供了用于胆碱能和/或5－羟色胺能系统模型的分子的用途，公开了用于治疗焦虑疾病的药物组合物，所述药物组合物含有11－OH－erythravine、erythravine、刺桐阿亭、其可药用电子等排体、盐、副产物和/或溶剂合物，任选含有其它刺桐副产物；还公开了获得所述药物组合物的方法。
文档编号A61K31/4748GK101060853SQ200580035748
公开日2007年10月24日 申请日期2005年10月20日 优先权日2004年10月20日
发明者B·范德兰·达·席尔瓦, R·L·努涅斯·迪·索撒, F·J·奥塔维沃·阿佩尔西多 申请人:圣保罗州立大学儒利奥清真学院