专利名称：玉米褪绿斑驳病毒单克隆抗体及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种玉米褪绿斑驳病毒单克隆抗体及其应用。
背景技术：
玉米褪绿斑驳病毒属是番茄丛矮病毒科下的一个属，该属只有玉米褪绿斑驳病毒一个种(Maize chlorotic mottle virus, NCBI登录号码为X14736)。玉米褪绿斑驳病毒的自然寄主是玉米，引起褪绿斑驳、坏死、矮化、穗发育差或无穗、过早死亡等症状。玉米褪绿斑驳病毒易通过机械接种传播，也可以经种子传播，在阿根廷、墨西哥、秘鲁、美国等地有报道。玉米褪绿斑驳病毒的相对分子质量为6. 1 X IO6,标准沉降常数^ciw = 109S,在氯化铯中的浮力密度为1. 365g/cm3，病毒对乙醚、氯仿和非离子去垢剂不敏感，在体外可稳定33 天以上，热钝化点在80-85°C，病毒在pH 6稳定，可由二价阳离子稳定。玉米褪绿斑驳病毒的病毒粒子为等轴对称二十面体(T = 3)，用磷钨酸负染色直径约30nm，用醋酸铀负染色直径约33nm，无包膜，粒子外形呈六边形，有的被染色剂渗透， 有180个蛋白结构亚基。玉米褪绿斑驳病毒的外壳蛋白由一种多肽组成(由近3’端的0RF4 编码)，分子质量25. IkDa0玉米褪绿斑驳病毒的核酸为单分子线形正义ssRNA，长4437nt， 核酸占病毒粒子重量的18%，有的病毒粒子还偶尔含有一个IlOOnt的亚基因组RNA。
发明内容
本发明的目的是提供一种玉米褪绿斑驳病毒单克隆抗体及其应用。本发明提供的杂交瘤细胞株，命名为2C6，已于2011年02月22日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，菌种保藏号为CGMCC No. 4579。分泌抗玉米褪绿斑驳病毒的单克隆抗体的杂交瘤细胞株2C6 CGMCC No. 4579简称杂交瘤细胞株2C6。本发明提供的单克隆抗体，是由杂交瘤细胞株2C6 CGMCC No. 4579分泌产生的。所述单克隆抗体可应用于如下(a)和/或(b)(a)制备辅助鉴定待测病毒是否为玉米褪绿斑驳病毒的试剂盒；(b)制备辅助检测待测植物样本中是否含有玉米褪绿斑驳病毒的试剂盒。本发明还保护包括所述单克隆抗体的试剂盒；所述试剂盒为如下(C)和/或(d)(c)辅助鉴定待测病毒是否为玉米褪绿斑驳病毒的试剂盒；(d)辅助检测待测植物样本中是否含有玉米褪绿斑驳病毒的试剂盒。所述试剂盒还可包括玉米褪绿斑驳病毒包被抗体(如购自购自Agdia公司，产品目录号为SRA17001的玉米褪绿斑驳病毒包被抗体)。所述试剂盒还可包括酶标二抗(如购自中山金桥公司的碱性磷酸酯酶标记的马抗小鼠酶标抗体)。所述单克隆抗体或所述试剂盒可用于辅助鉴定待测病毒是否为玉米褪绿斑驳病毒。所述待测病毒具体可为玉米褪绿斑驳病毒(Maize chlorotic mottle virus)、麝香石竹环斑病毒(Carnation ringspot virus)或番前丛矮病毒(Toma to bushy stuntvirus)。所述单克隆抗体或所述的试剂盒可用于辅助检测待测植物样本中是否含有玉米褪绿斑驳病毒。所述待测植物样本具体可为玉米(Zea mays L.)(如京科2 叶片、昆诺藜 (Chenopodium guinoa)叶片或曼陀罗(Datura stramonium)叶片。本发明提供了一种玉米褪绿斑驳病毒单克隆抗体及分泌该单克隆抗体的杂交瘤细胞株。本发明提供的单克隆抗体可作为玉米褪绿斑驳病毒的血清学诊断试剂，避免了交叉反应(特异性好)，大大提高了检测玉米褪绿斑驳病毒的灵敏度(效价高)。应用本发明提供的单克隆抗体鉴定待测病毒是否为玉米褪绿斑驳病毒，或检测待测植物样本中是否含有玉米褪绿斑驳病毒，具有简单、重复性好、一次可处理多个样品、特异性好、灵敏度高、 应用广泛等优点。本发明提供的单克隆抗体可用于研制玉米褪绿斑驳病毒的免疫学诊断试剂，如酶联诊断试剂、胶体金免疫试纸条、抗体芯片、生物传感器等。本发明为玉米褪绿斑驳病毒的血清学诊断试剂的研制奠定了基础，将在玉米褪绿斑驳病毒的检测和鉴定中发挥重要作用。
具体实施例方式以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。ATCC即American type culture collection的缩写，网址为atcc. org。玉米褪绿斑驳病毒兔多克隆抗体购自美国ACD公司。碱性磷酸酯酶标记的马抗小鼠酶标抗体购自中山金桥公司。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验， 结果取平均值。实施例的细胞培养均采用购自ATCC的DMEM培养基(货号30-2002)作为 ■石出i首养■ ο玉米(Zea mays L.)品种京科25 购自北京农科院种植科技有限公司。昆诺藜(Chenopodium guinoa)公众可以从中国检验检疫科学研究院获得；参考文献李桂芬，朱水芳、周群等，侵染紫松果菊的黄瓜花叶病毒分离物的鉴定，植物保护， 2007年第33卷，第1期，54-56页。曼陀罗(Datura stramonium)公众可以从中国检验检疫科学研究院获得；参考文献李桂芬，朱水芳、周群等，侵染紫松果菊的黄瓜花叶病毒分离物的鉴定，植物保护， 2007年第33卷，第1期，54-56页。玉米褪绿斑驳病毒(Maizechlorotic mottle virus ；缩写为 MCMV)购自 ATCC， ATCC 编号为 PV-262。麝香石竹环斑病毒(Carnation ringspot virus, CRSV)购自 ATCC， ATCC 编号为 PV-21。番茄丛矮病毒(Tomato bushy stunt virus, TBSV)购自 ATCC，ATCC 编号为PV-500。底物溶液二乙醇胺(C4H11NO2) 97mL,硝基苯磷酸二钠lg，蒸馏水(H2O) 600mL，用盐酸(HCl)调pH值至9. 8，然后用蒸馏水定容至IL ；4°C储存。样品抽提缓冲液(pH7. 4)将亚硫酸钠1. 3g和聚乙烯基吡咯烷酮20g溶于PBST缓冲液中，用PBST缓冲液定容至1L。包被缓冲液(pH9. 6)将碳酸钠1. 59g、碳酸氢钠2. 93g和叠氮化钠0. 20g溶于水，用水定容至1L。实施例1、杂交瘤细胞株的获得一、病毒繁殖与纯化(玉米褪绿斑驳病毒制剂的制备)将玉米褪绿斑驳病毒(毒源)接种在玉米上，19d采收病叶，病叶加4倍体积的0. lmol/L磷酸盐缓冲液(含0.5%巯基乙醇，pH7. 0)，勻浆，双层纱布过滤，低速离心(6450Xg，IOmin)，取上清；加入 NaCl 至浓度为 0. 2mol/L、PEG(MV6000)至浓度 8%、 TritonX-IOO 至浓度 2%，4°C搅拌 3h ；离心(10100Xg，30min)，沉淀悬浮于 0. 02mol/L 磷酸盐缓冲液(pH7. 0)中，4°C搅拌过夜；离心(15008Xg, IOmin)；取上清离心(160070Xg, 160min)，沉淀悬浮于0. 02mol/L磷酸钠缓冲液中，4°C搅拌过夜；离心(6620 X g，lOmin)，取上清做10% 40%蔗糖梯度离心(160070 X g，150min)，吸取蔗糖梯度中的病毒带，即为纯化的玉米褪绿斑驳病毒制剂。二、小鼠免疫将纯化的玉米褪绿斑驳病毒制剂在与其同体积的福氏完全佐剂中乳化，乳化后对 8周龄的BALB/c小鼠做腹腔注射，每只小鼠100 μ g纯化病毒。2周后，将纯化的玉米褪绿斑驳病毒制剂在与其同体积的福氏不完全佐剂中乳化作第二次腹腔注射，每只小鼠IOOyg 纯化病毒。3周后第三次免疫小鼠(同第二次)。在进行步骤三的融合前3天加强免疫，加强免疫是采用200 μ g纯化的玉米褪绿斑驳病毒制剂直接注射小鼠腹腔。三、细胞融合、杂交瘤细胞的筛选将免疫小鼠的脾细胞与SP2/0细胞进行细胞融合，用纯化的玉米褪绿斑驳病毒制剂4yg/ml的浓度包被酶标板，采用间接ELISA进行测定。对阳性孔的细胞用有限稀释法克隆3次，使阳性率达100%，阳性克隆细胞及时冻存。经间接ELISA法筛选，3次亚克隆化获得了 1株能稳定分泌抗MCMV的单克隆抗体的杂交瘤细胞株。将筛选得到的杂交瘤细胞株命名为2C6，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为No. 4579。分泌抗玉米褪绿斑驳病毒的单克隆抗体的杂交瘤细胞株2C6 CGMCC No. 4579简称杂交瘤细胞株2C6。实施例2、单克隆抗体的制备、Ig类型的鉴定和效价测定一、病毒繁殖与纯化1、将玉米褪绿斑驳病毒(毒源)接种在玉米叶片上，19天后采收病叶(玉米叶片出现系统褪绿斑症状)。2、步骤1的病叶加4倍体积的pH7. 0-0. lmol/L磷酸盐缓冲液(含0. 5%体积百分含量的巯基乙醇)，勻浆，双层纱布过滤，低速离心(6450 X g，lOmin)，取上清。3、步骤2的上清中加入NaCl至浓度为0. 2mol/L、PEG(MV6000)至终浓度为8% (质量百分含量)、TritonX-IOO至终浓度2% (体积百分含量)，4°C搅拌汕，离心(10100 X g， 30min)收集沉淀。4、步骤3的沉淀悬浮于pH7. 0-0. 02mol/L磷酸盐缓冲液中，4°C搅拌过夜，离心 (15008Xg，IOmin)，取上清。5、步骤4的上清离心(160070Xg，160min)，取沉淀。6、步骤5的沉淀悬浮于pH7. 0-0. 02mol/L磷酸钠缓冲液中，4°C搅拌过夜，离心(6620 X g，IOmin)，取上清。7、步骤6的上清进行蔗糖10% 40% (质量百分含量)连续梯度离心 (160070Xg，150min)，吸取蔗糖梯度中的病毒带(蔗糖-35%梯度)，得到病毒液(含有病毒的蔗糖溶液)。8、检测步骤7得到的病毒液中的病毒含量。测定病毒溶液的OD26tlnm值，按照公式“病毒浓度=病毒溶液的OD26tlnm值/病毒的吸光常数”计算病毒含量，玉米褪绿斑驳病毒的溶液的OD26tlnm值为77. 655，吸光常数为6. 46， 病毒浓度为12. 02mg/ml。二、单克隆抗体1、将杂交瘤细胞株2C6置于细胞培养基(含体积百分含量为20%的胎牛血清) 中，在37°C条件培养72小时08-96小时均可)，得到培养上清。2、效价测定将步骤1得到的培养上清进行效价测定。采用步骤一的7得到的病毒液包被酶标板(玉米褪绿斑驳病毒的使用浓度为4 μ g/ml)。二抗为碱性磷酸酯酶标记的马抗小鼠酶标抗体。培养上清的抗体效价为1 105。3、单克隆抗体的制备用G蛋白柱(G蛋白柱购自GE公司，产品目录号为17-0404-01)对步骤1的培养上清进行纯化(完全按照G蛋白柱的使用说明进行操作)，得到单克隆抗体(浓度为0. 46mg/ ml)，-20°C保存。三、单克隆抗体Ig类型的鉴定单克隆抗体Ig类型的鉴定采用Sigma公司单抗分型试剂按说明书进行。2C6单克隆抗体为IgGl亚类。实施例3、单克隆抗体的特异性测定和检测应用采用TAS-ELISA方法，检测实施例2的步骤二制备的单克隆抗体分别与玉米褪绿斑驳病毒同科病毒-麝香石竹环斑病毒、番茄丛矮病毒有无交叉反应。一、实验样本的制备将玉米褪绿斑驳病毒(MCMV)接种玉米品种京科25的叶片；取病叶(发生明显褪绿斑的叶片；命名为病叶甲)分别进行步骤二和步骤三。将没有接种该病毒且没有上述发病表征的健康叶片(命名为对照叶甲)分别进行步骤二和步骤三。将麝香石竹环斑病毒(CRSV)接种昆诺藜(Chenopodium guinoa)的叶片；取病叶 (出现枯斑的病叶；命名为病叶乙)分别进行步骤二和步骤三。将没有接种该病毒且没有上述发病表征的健康叶片(命名为对照叶乙)分别进行步骤二和步骤三。将番茄丛矮病毒(TBSV)接种曼陀罗(Datura stramonium)的叶片；取病叶(出现褪绿斑的病叶；命名为病叶丙)分别进行步骤二和步骤三。将没有接种该病毒且没有上述发病表征的健康叶片(命名为对照叶丙)分别步骤二和步骤三。二、单克隆抗体的特异性测定分别将步骤一的各种叶片进行10倍体积的稀释(稀释液为样品抽提缓冲液)研磨，得到各种汁液。病叶甲得到的汁液为汁液甲，对照叶甲得到的汁液为对照液甲。病叶乙得到的汁液为汁液乙，对照叶乙得到的汁液为对照液乙。病叶丙得到的汁液为汁液丙，对照叶丙得到的汁液为对照液丙。通过酶联免疫法检测单克隆抗体的特异性，待测样本为汁液甲、对照液甲、汁液乙、对照液乙、汁液丙或对照液丙，具体步骤如下1、将玉米褪绿斑驳病毒包被抗体(购自Agdia公司；产品目录号SRA17001)按照说明书指明的使用浓度包被酶标板，37 °C孵育池，洗酶标板。2、加入待测样本(100 μ 1/孔)，4°C冰箱过夜，洗酶标板。3、将实施例2的步骤二制备的单克隆抗体与碱性磷酸酶标记的马抗小鼠混勻后一起加入到酶标板中(总体积为100μ 1/孔，碱性磷酸酶标记的马抗小鼠的使用浓度为说明书建议的工作浓度，单克隆抗体的使用浓度为ι μ g/ml)，37°C孵育4h，洗酶标板。4、加入底物溶液，37°C避光放置40分钟后检测OD4tl5nm值。结果见表1。表1单克隆抗体的特异性
权利要求
1.分泌抗玉米褪绿斑驳病毒的单克隆抗体的杂交瘤细胞株2C6，其保藏编号为CGMCC No. 4579。
2.一种单克隆抗体，是由分泌抗玉米褪绿斑驳病毒的单克隆抗体的杂交瘤细胞株2C6 CGMCC No. 4579分泌产生的。
3.权利要求2所述单克隆抗体在如下(a)和/或(b)中的应用(a)制备辅助鉴定待测病毒是否为玉米褪绿斑驳病毒的试剂盒；(b)制备辅助检测待测植物样本中是否含有玉米褪绿斑驳病毒的试剂盒。
4.包括权利要求2所述单克隆抗体的试剂盒；所述试剂盒为如下(c)和/或(d)(c)辅助鉴定待测病毒是否为玉米褪绿斑驳病毒的试剂盒；(d)辅助检测待测植物样本中是否含有玉米褪绿斑驳病毒的试剂盒。
5.如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于所述试剂盒还包括玉米褪绿斑驳病毒包被抗体。
6.如权利要求4或5所述的试剂盒，其特征在于所述试剂盒还包括酶标二抗。
7.权利要求2所述单克隆抗体或权利要求4至6中任一所述的试剂盒在辅助鉴定待测病毒是否为玉米褪绿斑驳病毒中的应用。
8.如权利要求7所述的应用，其特征在于所述待测病毒为玉米褪绿斑驳病毒(Maize chlorotic mottle virus)、廣香石竹环斑病毒(Carnation ringspot virus)或番丛矮病毒(Tomato bushy stunt virus)。
9.权利要求2所述单克隆抗体或权利要求4至6中任一所述的试剂盒辅助检测待测植物样本中是否含有玉米褪绿斑驳病毒中的应用。
10.如权利要求9所述的应用，其特征在于所述待测植物样本为玉米(ZeamaysL.)叶片、昆诺薬(Chenopodium guinoa)卩十片或曼陀罗(Datura stramonium)卩十片。
全文摘要
本发明公开了一种玉米褪绿斑驳病毒单克隆抗体及其应用。本发明提供的单克隆抗体可作为玉米褪绿斑驳病毒的血清学诊断试剂，特异性好，灵敏度高。应用本发明提供的单克隆抗体鉴定待测病毒是否为玉米褪绿斑驳病毒，或检测待测植物样本中是否含有玉米褪绿斑驳病毒，具有简单、重复性好、一次可处理多个样品、特异性好、灵敏度高、应用广泛等优点。本发明为玉米褪绿斑驳病毒血清学诊断试剂的研制奠定了基础，将在玉米褪绿斑驳病毒的检测和鉴定中发挥重要作用。
文档编号C07K16/10GK102199575SQ20111006312
公开日2011年9月28日 申请日期2011年3月16日 优先权日2011年3月16日
发明者张永江, 朱水芳, 李桂芬, 马洁 申请人:中国检验检疫科学研究院