专利名称：一种大豆逆境相关转录因子erf及其编码基因与应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及植物基因工程领域，具体涉及一种大豆逆境相关转录因子ERF及其编码基因与应用。
背景技术：
大豆是重要的经济作物，在世界范围内普遍种植，不仅是人类蛋白和脂类的主要来源，同时也是重要的家畜饲料和工业原料，在医学上也有很大价值。然而生物和非生物胁迫，包括病害、盐害、低温及干旱等都对大豆的生长和发育产生极为不利的影响，从而导致大豆产量降低，造成严重的经济损失。因此，阐明大豆对逆境的响应机制，鉴定逆境相关的重要基因并利用它们来提高大豆的抗逆性显得尤为重要。植物可以通过调节体内一系列基因的表达或合成大量相关胁迫蛋白来适应环境。 其中，转录因子由于可以调节多个基因的表达而在植物的胁迫响应中发挥重要作用，逐渐成为人们的研究热点。ERF转录因子分属于植物中特有的AP2/ERF转录因子大家族中的ERF 亚家族，最初从烟草中分离得到。它们表达的蛋白共同含有1个保守的由58或59个氨基酸组成的ERF结合域，此结合域由3个β折叠和1个α螺旋组成，可以特异的结合GCC和 DRE/CRT元件，而这些元件通常分别位于植物的病程相关蛋白基因和干旱、冷诱导相关基因的启动子中。ERF正是通过调节这些基因的表达从而参与到植物的生物胁迫和非生物胁迫中去。植物的逆境响应被多条信号途径所调节，其中，乙烯、水杨酸、茉莉酸、脱落酸等逆境胁迫信号物质通常会调节ERF的表达，这四个信号分子通过ERF转录因子参与了不同防御相关基因的表达。番茄JERF3既是GCC box结合蛋白，又能识别DRE元件，在番茄中能被乙烯、茉莉酸、低温、高盐和脱落酸诱导，同时能提高转基因烟草的耐盐性。烟草的Tsil不仅在乙烯、NaCl、ABA和水杨酸处理的叶片中表达，还可以被干旱和水淹诱导表达。Tsil的超表达提高了植株对高盐和病原的抗性。木花生中的JcERF的表达可以被高盐、干旱、乙烯和机械伤害诱导，但不被ABA诱导，在拟南芥中超表达JcERF增强了植物对盐和寒冷的抗性。目前，已从拟南芥、烟草、番茄、辣椒、水稻、小麦、棉花等不同植物中克隆到大量 ERF基因，但在大豆中仅报道过3个ERF的功能，它们均参与到大豆的胁迫响应中去，在提高植物抗逆性方面发挥积极的调控作用。单子叶植物和双子叶植物中均可能存在大量的ERF 转录因子，鉴于ERF在植物应对逆境中发挥的重要作用，因此，对大豆ERF家族中其他的成员作进一步的鉴定与应用有利于大豆胁迫抗(耐)性的改良。
发明内容
本发明提供一种大豆逆境相关转录因子ERF及其编码基因与应用。本发明所提供的大豆逆境相关ERF转录因子来源于大豆品种吉林32，由吉林省农科院富健研究员馈赠，地址吉林省长春市彩宇大街1363号吉林省农业科学院；命名为 GmERF6。大豆逆境相关转录因子ERF的氨基酸序列为kquence NO. 2。
所述大豆逆境相关转录因子ERF的编码基因的核苷酸序列为kquence NO. 1。所述的大豆逆境相关转录因子ERF在提高植物的抗旱性中的应用。序列kquence NO. 1由582个碱基组成、Sequence NO. 2由193个氨基酸残基组成，含一个ERF结构域。。利用任何一种可以引导外源基因在植物中表达的载体，将本发明所提供的GmERF6 的编码基因导入植物细胞，可获得对干旱抗性提高的转基因植株。使用本发明的基因构建植物表达载体时，可在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强启动子或诱导型启动子。 携带有本发明GmERF6的表达载体可通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化植物细胞或组织，并将转化的植物组织培育成植株。被转化的宿主既可以是单子叶植物，也可以是双子叶植物。本发明的有益效果是本发明克隆了一个逆境诱导相关的大豆GmERF6转录因子基因，研究该基因在大豆中的表达模式及转录调节活性，比较了野生型和转GmERF6基因拟南芥的抗旱性，为其有效应用提供依据，对提高植物的抗逆性，特别是培育抗旱大豆品种具有重要意义。
图1是本发明GmERF6基因的PCR扩增结果图2是本发明GmERF6重组蛋白的表达图3是本发明GmERF6基因逆境诱导表达模式图4是本发明GmERF6基因组织表达模式图5是本发明报告质粒、效应质粒载体结构示意图6是本发明GmERF6基因转录调节活性分析图7是本发明GmERF6基因在部分T2代转基因拟南芥中的PCR鉴定结果图8是本发明T3代转基因拟南芥中GmERF6下游基因半定量结果图9A是本发明野生型拟南芥干旱处理结果图9B是本发明T3代转基因拟南芥干旱处理结果 图。图10是本发明野生型拟南芥和T3代转基因拟南芥干旱处理后失水率测定结果
具体实施例方式实施例1 :GmERF6基因的克隆及序列分析大豆RNA的提取及cDNA的合成用RNAplant plus Reagent (购自TIANGEN)提取大豆吉林 32 叶片总 RNA，用 M-MLV reverse transcriptase (RNase H_)(购自 TaKaRa)进行反转录，合成cDNA。引物的设计与合成将大豆品种吉林32的3个时期O0、30和50天)未成熟胚表达谱测序所得序列(华大基因完成)输入NCBI中进行Blast比对，获得一个与植物中 ERF转录因子蛋白序列同源性较高的未知cDNA序列。根据已获得的未知cDNA序列，其核苷酸序列如 kquence NO. 1 所述，设计合成引物，F :5，-CTTCCTACTCCTCCCTTTCAC-3’，R 5，-CGTAGTAGTGTTCCCAGATGC-3，。以上述cDNA为模板，按照以下反应体系及条件进行PCR扩增25 μ L 体系，内含 10XPCR Buffer2. 5μ L,2. 5mM dNTP mix 2 μ L，10 μ M 的弓丨物 F 禾口引物R各1pL，cDNA IyL, EX Taq (购自TaKaRa) 0. 3 μ L，补去离子水至25 μ L。反应条件 预变性 94°C 8min ；94°C 40s, 60°C 40s, 72°C lmin,30 个循环；72°C延伸 8min。将上述扩增片段回收后与克隆载体PMD18-T (购自TaKaRa)进行连接，鉴定后送华大基因测序，验证序列正确。经PCR扩增得到包含有GmERF6基因全长OFR的序列，编码一个由193个氨基酸残基组成的蛋白质，包含一个保守的ERF结合域，两个核定位信号和一个EAR抑制元件。实施例2 :GmERF6基因在原核中的表达根据GmERF6基因序列设计合成引物，并在其上、下游引物中分别引入 Sac I 和 Hind III 酶切位点，F :5 ‘ -GAGCTCATGGCCCCAAGAGACAGC-3 ‘ ；R 5' -TTCGAATCAGGCAACCTCCGGGAG-3‘。以pMD18-T_GmERF6质粒为模板，进行PCR扩增。将扩增产物经琼脂糖凝胶DNA纯化回收试剂盒(购自TIANGEN)纯化后，用Mc I和Hind III (各种限制性内切酶均购自TaKaRa)双酶切，回收纯化后，与同样用Mc I和Hind III双酶切的pET28a(购自Novagen)载体连接。连接产物转化埃希氏大肠杆菌(E. coli)DH5a (购自 Biovector)，经验证后，转入宿主菌Rosetta(DEIB)(购自Novagen)中进行表达。重组蛋白的原核表达分别取阳性和空载体菌株接于5mL附加50mg/L卡那霉素和 15mg/L氯霉素的LB培养基(蛋白胨10g/L、酵母粉5g/L、NaCl 10g/L)中，37°C振摇培养过夜。取按1 100的比例转接到IOmL附加50mg/L卡那霉素和15mg/L氯霉素的LB培养基中，37°C震荡培养至菌液OD6tltl为0. 4-0. 6时，加入终浓度为0. 3mmol/L的IPTG，37°C震荡培养汕后，取ImL菌液，12000rpm离心lmin，收集菌体。 表达产物的SDS-PAGE分析按照SDS-PAGE电泳常规方法进行。经IPTG诱导后，GmERF6重组蛋白(分子量大小约为30kDa)可以在Rosetta (DE3) 菌株中稳定有效地表达(图2)。实施例3 :GmERF6基因在逆境诱导下的表达模式大豆吉林32的逆境处理用Hoagland培养液(Ca(NO3)2 · 4H20 0. 62g/L、 KNO3O. 34g/L、KH2PO4O. 06g/L、NH4NO3O. 053g/L、MgSO4 · 7H20 0. 493g/L、MgCl2O. 67mg/L、 H3BO3O. 38mg/L、ZnSO4 · 7H20 0. 29mg/L, CuSO4 · 5H20 0. 015625mg/L、FeSO4 · 7H200. 02785g/ L、EDTA-Na2O. 0373g/L, PH 5. 7-5. 8)，28°C、16h光照/8h黑暗条件培养大豆水培苗，取四叶期的水培苗进行以下处理高盐(NaCl)处理将大豆幼苗置于含有200mM NaCl的Hoagland培养液中，处理 Oh、lh、2h、5h、IOh和24h后分别取样，迅速置于液氮中，_80°C保存备用；干旱(Drought)处理将大豆幼苗置于含有20 % PEG8000的Hoagland培养液中， 处理0h、lh、2h、5h、10h和24h后分别取样，迅速置于液氮中，_80°C保存备用；低温(Cold)处理将大豆幼苗置于41培养箱中，处理011、111、211、511、1011和2411后分别取样，迅速置于液氮中，-80°C保存备用；机械伤害(Wound)处理用灭菌的解剖刀对大豆幼苗叶片造成数处伤口，处理 0h、lh、2h、5h、10h和24h后分别取样，迅速置于液氮中，-80°C保存备用；脱落酸(ABA)处理用含有200 μ M ABA的Hoagland培养液喷洒大豆幼苗，处理 Oh、lh、2h、5h、IOh和24h后分别取样，迅速置于液氮中，_80°C保存备用；
乙烯(ETH)处理将大豆幼苗置于带盖的塑料桶中，桶中放有500mL烧杯，内装有 200mL蒸馏水、2mL 40%乙烯利、IgNaHCO3，用胶带密封，处理Oh、lh、2h、5h、IOh和24h后分
别取样，迅速置于液氮中，_80°C保存备用；水杨酸(SA)处理用含有2mM SA的Hoagland培养液喷洒大豆幼苗，处理Oh、lh、 au5h、10h和24h后分别取样，迅速置于液氮中，_80°C保存备用；茉莉酸甲酯(MeJA)处理用含有100 μ M MeJA的Hoagland培养液喷洒大豆幼苗， 处理0h、lh、2h、5h、10h和24h后分别取样，迅速置于液氮中，_80°C保存备用；总RNA的提取和cDNA的合成方法同实施例1。根据GmERF6的cDNA 序列设计实时荧光定量PCR引物(F 5 ‘ -CAACAACATTCGCAGTCCCA-3 ‘ ；R 5 ‘ -AGTCGTTACGGCGGAAATC-3 ‘)。以大豆组成型表达基因β -Tubuin为内部参照 (F 5 ‘ -GGAAGGCTTTCTTGCATTGGTA-3 ‘ ；R 5 ‘ -AGTGGCATCCTGGTACTGC-3 ‘)。利用ABIPRISM7500实时定量PCR仪以大豆各逆境处理取样点的cDNA为模板进行 real-timeRT-PCR 分析。反应体系含 2XSYBR Premix Ex Taq(购自 TaKaRa) 10 μ L、ROX ReferenceDye II 0. 14μ L> cDNA 2 μ L、Primer F 0. 4μ L> Primer R 0· 4μ L，辛卜HLg、# 积 20yL。反应程序为 95°C 30s ；95°C 5s, 58°C 34s, 72°C 30s，40 个循环。采用 2-ΔΔετ 法分析数据，确定基因的相对表达量。每个取样点设3次技术重复，试验共设3次生物学重复。逆境处理下GmERF6因的相对表达量；
权利要求
1.一种大豆逆境相关转录因子ERF，其特征在于其氨基酸序列Sequence NO. 2。
2.如权利要求1所述的大豆逆境相关转录因子ERF，其特征在于其编码基因的核苷酸序列为 Sequence NO. 1。
3.如权利要求1所述的大豆逆境相关转录因子ERF在提高植物的抗旱性中的应用。
全文摘要
本发明涉及一种大豆逆境相关转录因子ERF及其编码基因与应用，属于植物基因工程领域，大豆逆境相关转录因子ERF的其氨基酸序列为SequenceN0.2，其编码基因的核苷酸序列为SequenceN0.1。本发明克隆了一个逆境诱导相关的大豆GmERF6转录因子基因，研究该基因在大豆中的表达模式及转录调节活性，比较了野生型和转GmERF6基因拟南芥的抗旱性，为其有效应用提供依据，对提高植物的抗逆性，特别是培育抗旱大豆品种具有重要意义。
文档编号C07K14/415GK102336826SQ20111030484
公开日2012年2月1日 申请日期2011年10月10日 优先权日2011年10月10日
发明者张鑫生, 李景文, 李艳杰, 王庆钰, 王洪预, 王英, 翟莹, 苏连泰, 闫帆, 雷婷婷 申请人:吉林大学