抗汉坦病毒属病毒感染的dna疫苗的制作方法

专利名称：抗汉坦病毒属病毒感染的dna疫苗的制作方法
抗汉坦病毒属病毒感染的DNA疫苗本申请是本申请是2003年3月21日提交的申请号为03806701. 3 (PCT/ US2003/008810)，发明名称为“抗汉坦病毒属病毒感染的DNA疫苗”申请的分案申请。本申请是2000年1月27日提交的美国申请09/941974的部分继续申请，其要求 1999年1月29日提交的美国临时申请60/117680的优先权。本申请也对更早提交的临时申请系列享有优先权，分别是2002年3月22日提交的60/367128和2002年7月26日提交的 60/398985。
背景技术：
目前，有四种已知的肾综合征出血热(HFRS)相关的汉坦病毒属病毒汉坦病毒 (HTNV)，多布拉伐-贝尔格莱德病毒(DOBV)，普马拉病毒(PUUV)，和汉城病毒(SEOV)。因为通常不同的汉坦病毒属病毒仅是由一个主要的啮齿类宿主携带，因此，汉坦病毒属病毒的分布一般就局限在那个宿主的范围(Schmal john和Hje 11 e 1997年的综述，Emerg. Infect. Dis. 3，95-104)。黑线姬鼠(Apodemus agrarius)携带的HTNV在亚洲发现；黄颈鼠 (Apodemus flavicollis)携带的 DOBV 和欧鼠(Clethrionomys glareolus)携带的 PUUV 在欧洲发现。SEOV比其它任何已经识别的汉坦病毒属病毒散布得更广泛，因为它的宿主，普通的都市大鼠(褐家鼠(Rattus norvegicus))可以在全世界范围发现。在美洲，新的世界范围的汉坦病毒属病毒都和高致命疾病汉坦病毒肺症候群 (HPS)的爆发相关。(Schmaljohn 和 Hjellel997 年的综述，Emerg. Infect. Dis. 3，95-104)。 这种疾病的特征是发热，血管渗漏，从而导致非心源性肺水肿，接着出现休克。由绝大部分流行于北美和南美的汉坦病毒属病毒，辛诺柏病毒(SNV)，安地斯病毒(ANDV)所引起的HPS 致死病例分别是30-50%。汉坦病毒属(布尼亚病毒科)中的病毒都是包膜病毒，所含的基因组由三个单链 RNA区段组成，根据大小分别命名为大(L)，中(M)，小(S)区段(参考Schmaljohn 1996年的综沭《布尼亚病毒科(TheBunyaviridae)》,R. M. Elliott编辑，纽约，Plenum出版社， 63-90页)。汉坦病毒属病毒的L区段编码依赖RNA的RNA聚合酶，M区段编码两个包膜糖蛋白(Gl和G2)，而S区段编码核壳蛋白质(N)。从细胞培养物或啮齿类动物大脑中，开发了许多灭活的HFRS疫苗，并在亚洲进行 7 测试(Lee 等人，1990，Arch. Virol.，增刊 1，35-47 ；Song 等人，1992，Vaccine 10， 214-216 ；Lu等人，1996，J. Med. Virol. 49，333-335)。传统病毒灭活疫苗的缺点包括在病毒的生长和操作中要求适当的防护。为了克服这些缺点，开发了涉及重组DNA技术的疫苗方法，包括痘苗载体疫苗(Schmaljohn 等人，1990，J. Virol. 64，3162-3170 ；Schmaljohn 等人， 1992，Vaccine 10，10-13 ；Xu 等人，1992，Am. J. Trop. Med. Hyg. 47，397-404)，在细菌或昆虫细胞中表达的蛋白亚基疫苗(Schmaljohn等人，1990，同上，Yoshimatsu等人，1993，Arch. Virol. 130,365-376 ；Lundkvist 等人，1996，Virology 216，397-406)，和基于乙肝核心抗原的重组疫苗(Ulrich 等人，1998，Vaccine 16，272-280)。用表达HTNV或SEOV的M区段的重组痘苗接种，能诱导中和抗体的产生，保护啮齿类动物不受HTNV和SEOV的感染，这表明仅仅对G1-G2的免疫反应就能对动物起保护作用(Schmaljohn 等人，1990，同上，Xu 等人，1992，同上，Chu 等人，1995，J. Virol. 69， 6417-642 。相似地，用在昆虫细胞中表达的G1-G2蛋白接种(杆状病毒重组系统)，能诱导中和抗体的产生，保护仓鼠不受HTNV的感染(Schmaljohn等人，1990，同上)。在痘苗和杆状病毒系统这两种情况下，G1-G2接种比单独用Gl或G2接种提供的保护更完全(Schmaljohn 等人，1990，同上)。在前述疫苗研究中，中和抗体对G1-G2的应答与保护相关联，表明中和抗体在预防汉坦病毒属病毒感染中发挥了重要的作用。被动转移特异于Gl或G2的中和单克隆抗体(MAbs)能保护仓鼠免受HTNV感染(Schmaljohn等人，1990，同上，Arikawa等人， 1992，J. Gen. Virol. 70，615-6 )，支持了这样的观点，即中和抗体单独也能发挥保护作用。N蛋白在防止汉坦病毒属病毒感染中也发挥了重要作用。用在细菌，昆虫细胞表达的N蛋白接种，或用作为嵌合的乙型肝炎病毒(HBV)核心粒子的N蛋白接种能保护啮齿类动物免受汉坦病毒属病毒感染(Schmaljohn等人，1990，同上，Yoshimatsu等人，1993，同上，Lundkvist等人，1996，同上，Ulrich等人，1998，同上)。用表达S区段的重组痘苗病毒接种得到的结论比较少。表达HTNV S区段的构建体并不能保护仓鼠免受HTNV的感染，可能是因为N的表达水平低(Schmaljohn等人，1990)；而表达SEOV S区段的构建体能保护四种沙鼠中的三种免受SEOV感染(Xu等人，1992，同上)。相似的，自从20世纪90年代中叶分离第一株HPS相关汉坦病毒属病毒以来，抵御 HPS、基于基因疫苗的基础研究就一直在进行。有报道认为候选DNA疫苗包括SNV M基因的大约500核苷酸序列，或全长的S基因，是小鼠的免疫原(Miaradwaj等人，1999，Vaccine 17，2836-43)，而且在鹿鼠感染模型中能起到一些保护作用，免受SNV的感染 haradwaj等人，2002，J. Gen, Virol. 83，1745-1751)。这种保护被推测是细胞介导的，因为没有令人信服的证据表明这些构建体能诱导中和，或其他保护性抗体反应。因此，现在不是很清楚单独G1，单独G2，或者糖蛋白的片段是否诱导出中和抗体， 并且防止感染。用只含有Gl或G2的重组杆状病毒感染的细胞裂解产物以及只表达Gl或 G2的重组痘苗病毒接种，都不能诱导中和抗体，并且在仓鼠感染模型中不能表示出完全的保护作用Gchmaljohn等人，1990)。尽管这些痘苗疫苗表示出了一些潜能，但重组的痘苗病毒疫苗和基于痘苗的疫苗表示出了一些不足，包括散布感染的能力，尤其是在无免疫应答的个体中，因为该疫苗由活病毒组成。同样，用这些病毒接种会导致病灶(痘疤)，这种病灶中含有感染的病毒。这些病灶的病毒会无意地向其他部位(如眼睛)或别的个体扩散。此外，痘苗载体疫苗在以前接种过天花疫苗的人中具有很弱的免疫原性(McClain等人，2000，J.Med. Virol. 60，77-85)。基于痘苗的疫苗的其他缺点包括由于淋巴结肿胀而导致的不适以及在接种部位留下疤痕。发明概述在本报告中，我们介绍了一种新的重组DNA疫苗方法，它涉及用表达单个汉坦病毒属病毒基因组区段cDNA的裸露DNA接种。裸露DNA接种涉及到将带有目的基因的质粒 DNA构建体转移到受接种者的组织中(参考Robinson和^Torres，1997，Semin. Immunol. 9， 271-283 ；禾口 Gregoriadis, 1998，Pharm, Res. 15，661-670)。这种疫苗方法比亚单位疫苗有优点，亚单位疫苗不能诱导对防止已经出现的感染或疾病所必需的细胞毒性反应。DNA疫苗接种模仿从头合成抗原，并且用活的疫苗获得I型MHC限制的抗原呈递，而没有病原菌感染的危险。此外，这种DNA疫苗方法允许疫苗进入粘膜组织，粘膜组织能帮助抵抗病毒导入，因为病毒的进入可能通过粘膜组织。在我们的申请中，目的基因就是汉坦病毒属病毒基因组区段，它被哺乳动物或病毒启动子控制(例如巨细胞病毒立即早期启动子)，这些启动子有助于裸露DNA基因产物在受接种者细胞中的表达。这种胞内表达能诱导体液和细胞介导的免疫反应(Robinson和 Torres, 1997，同上，以及Gregoriadis，1998，同上)。DNA转移的方法包括接种针接种，口腔或肺部给药，以及通过粒子轰击法接种(即基因枪)。用这些方法中的每一种进行DNA疫苗接种都能诱导出针对许多不同的病原菌，包括众多病毒的保护性免疫反应(Robinson和 Torres, 1997，同上，以及Gregoriadis，1998，同上)。然而，迄今为止，还没有证明DNA疫苗能诱导抗汉坦病毒属病毒的免疫反应，以及防止汉坦病毒属病毒感染。在本报告中，我们证明了用裸露的SEOV M或S基因组区段接种能诱导啮齿类动物 SEOV特异的抗体反应。更重要的是，我们还证明了用SEOV M区段接种能诱导中和抗体，并保护仓鼠免受SEOV感染。也是在本申请中，我们报道了 HTNV M DNA疫苗的开发。这种疫苗表达HTNV的Gl 和G2蛋白，诱导仓鼠产生中和抗体，防止仓鼠感染HTNV，SEOV和D0BV。此外，我们还证明了 SEOV MJPHTNVM DNA疫苗在非人的灵长类动物中能诱导高效价的中和抗体反应。此外，我们介绍了第一个基于ANDV M基因的DNA疫苗的开发和检测，这种疫苗能诱导中和，或者其他保护性抗体反应。这是意料之外的结果，因为该疫苗在仓鼠中既没有免疫原性，也不是保护性的，而在猕猴中是免疫原性和保护性的。此外，对另外两种HPS相关的汉坦病毒属病毒辛诺柏病毒和黑渠港病毒的交叉保护作用是明显的。本申请也介绍了一种汉他/安地斯病毒双M基因的汉坦病毒属病毒DNA疫苗，含有HTNV和ANDV的M基因。这种疫苗在非人的灵长类动物中表示出免疫原性和保护作用。 这是第一个设计用来防止所有汉坦病毒属病毒的DNA疫苗，包括HPRS相关和HPS相关的， 这些病毒能引起严重的疾病。检测这种汉他/安地斯病毒双M基因汉坦病毒属病毒DNA疫苗，pWRG/HA-M在猕猴中的免疫原性。这种疫苗能诱导抗体反应，该反应能中和汉坦病毒和安地斯病毒(参看表8)。在单一的仓鼠实验中，我们发现这种质粒和安地斯病毒质粒相似， 因为它在仓鼠中不能诱导抗体反应。然而，它在猴子中能诱导中和抗体的事实表明它在人体中能诱导中和抗体。此外，本申请也介绍了一种汉坦病毒属病毒免疫球蛋白组合物，这种组合物有预防或治疗作用，与汉坦病毒属病毒接触后，能防止汉坦病毒属病毒感染，和/或能治疗汉坦病毒属病毒疾病。目前，没有特异的药物或免疫治疗手段来治疗HPS或HFRS疾病，或施用给可能暴露在汉坦病毒属病毒中或患汉坦病毒属病毒疾病的人。本发明的汉坦病毒属病毒免疫球蛋白组合物由多克隆抗血清组成，这种血清来自接种了 DNA疫苗的动物/人群，DNA 疫苗包括一种能表达安地斯病毒和/或汉坦病毒M基因的质粒。这种多克隆血清含有中和抗体，能预防安地斯病毒和/或汉坦病毒。不像常规的多克隆免疫血清产品，用在本发明的方法(产生灵长类动物抗体的受接种者的DNA疫苗接种)并不涉及活病毒，而且不要求识别从汉坦病毒属病毒疾病中幸存下来的患者。因此，本发明的一个目的是提供一种汉坦病毒属病毒DNA疫苗，这种疫苗含有汉坦病毒属病毒基因组区段。更具体地说，本发明涉及一种SEOV汉坦病毒属病毒DNA疫苗，这种疫苗含有如SEQ ID NO :1所示的SEOV M基因组区段或如SEQ ID NO :2所示的SEOV S 区段。本发明也涉及HTNV汉坦病毒属病毒DNA疫苗，这种疫苗包括HTNVM基因组区段，如 Genebank登录号M14627的2-3565这一段延伸序列所示。本发明还进一步涉及到ANDV DNA 疫苗，它包括ANDV M基因组区段，如Genebank登录号AF291703的2-3671这一段延伸序列所示。本发明也涉及到HTNV/ANDV疫苗，这种疫苗含有SEQ ID NO :3的HTNV M基因组区段和SEQ ID NO :4的ANDV M基因组区段。上面介绍的汉坦病毒属病毒DNA片段可以单独作为DNA疫苗的一部分呈递给供试者，或者和其他汉坦病毒属病毒DNA片段一起呈递给供试者，而不管它们是组合在相同还是不同的构建体上。本发明的另一个目的是提供一种能在供试者中诱导免疫反应防止汉坦病毒属病毒的方法，该方法包括给供试者施用一种含有汉坦病毒属病毒基因组区段的DNA片段。更具体地说，本发明涉及通过提供SEOV M或S基因组区段来诱导免疫反应防止SEOV病毒的方法，通过提供HTNV M基因组区段来诱导免疫反应防止HTNV病毒的方法，通过提供ANDV M 基因组区段来诱导免疫反应防止ANDV病毒的方法。交叉保护防止别的汉坦病毒属病毒如汉坦病毒和多布拉伐病毒或辛诺柏病毒和黑渠港病毒也是本发明的一个目的。提供一种DNA疫苗也是本发明的一个目的，该疫苗是汉坦病毒M基因DNA疫苗与安地斯病毒M基因DNA疫苗的结合，通过给供试者提供这种DNA疫苗，使每个M基因在供试者中表达，从而诱导抗HFRS和HFS汉坦病毒属病毒的免疫反应，并能防止所有能引起严重疾病的汉坦病毒属病毒。汉坦病毒M基因或安地斯病毒M基因可以单独给药，即通过单独的载体给药，或者如本发明的一个方面所介绍的那样可以结合在同一个载体上。此外，为了制造一种多价的疫苗，可以将别的汉坦病毒属病毒，如普马拉病毒的M基因区段同汉坦病毒DNA疫苗以及安地斯DNA疫苗结合，这种多价病毒能提供额外的保护，防止汉坦病毒属病毒感染。在本发明的一个方面，DNA疫苗的转移方法是在一个小的载体粒子上涂上DNA疫苗，通过粒子轰击法将涂有DNA疫苗的粒子转移到动物的表皮组织。这个方法适用于将DNA 疫苗转移到表皮或粘膜组织，或转移到外周血细胞，而且可以在接种个体中用于诱导体液， 细胞介导的，以及是分泌的免疫反应。本发明的DNA疫苗本质上是安全的，给药时不痛苦，而且不会给接种的个体带来不利的副作用。此外，本发明不要求生长或使用汉坦病毒属病毒，这会通过空气悬浮粒子传输进行扩散。本发明进一步的目的是提供一种灵长类动物多克隆血清组合物，这种组合物含有中和抗体，针对至少一种，优选的是两种或多种汉坦病毒属如安地斯病毒和/或汉坦病毒的M区段。本发明的另一个目的是提供在功能上和上述抗体等效的抗体。这些功能上等效的抗体和上下文介绍的抗体基本上共享至少一种主要功能特性，包括体外免疫反应活性，预防性给药或治疗用给药时能防止汉坦病毒属病毒攻击，竞争Gl和/或G2上同一个结合位点。抗体可以是诸如IgG，IgM，或IgA中的任何一类或诸如IgGl，IgG2a以及别的本领域已知的亚类中的任何一亚类。此外，可以通过任何方法来制造抗体，如噬菌体展示，或在任何生物或细胞系中制造抗体，包括细菌，昆虫，哺乳动物或别的能产生具所需特征的抗体，如人源化抗体的细胞类型或细胞系。将来自不同物种的Fab部分和Fc部分结合在一起也能形成抗体。本发明的另一个目的是通过施用治疗或预防有效量的本发明血清或抗体混合物给需要这种治疗的供试者来治疗或预防汉坦病毒属病毒感染。本发明的另一个目的是提供被动疫苗用于治疗或预防汉坦病毒属病毒感染，这种疫苗包括治疗或预防有效量的能防止汉坦病毒属病毒疾病的本发明抗体以及可药用的载体或赋型剂。本发明的另一个目是提供一种用于诊断汉坦病毒属病毒感染的方法，即通过使用本发明的抗体测试样品中汉坦病毒属病毒的存在。本发明的另一个目的是提供新的含有本发明抗体的用于检测汉坦病毒属病毒感染的免疫探针和检测试剂盒。对于免疫探针，抗体直接或间接地连接到合适的报告分子如酶或放射性核素上。检测试剂盒包括一个容器，容器中容纳了一或多种本发明的抗体，还包括抗体使用说明书，目的是使抗体结合到汉坦病毒属病毒形成免疫复合物，并检测免疫复合物的形成，这样就将免疫复合物的存在与否和汉坦病毒属病毒的存在与否联系起来了。附图简述参考下列说明书，随附的权利要求书及附图，可以更好的理解本发明的特征，方面以及优点，这些附图是

图1 裸露SEOV DNA表达构建体。通过RT-PCR扩增SEOV M或S基因组区段， 并将其克隆到 PWRG7077 的 NotI 和 BamHI 位点(PowderJect Vaccines 公司，Madison, Wisconsin，在khmaljohn等人1997年的文章中介绍了，同上)。pffRG7077的特征和以前介绍的PWRG1602的特征相似(Dimmock,N. J.，1995,Med. Virol. 5 :165)，并且包括一个人巨细胞病毒早期启动子(CMV IE启动子)和内含子A，牛生长激素转录终止子，多腺苷酸化信号序列(BGH pA)，以及卡那霉素抗性基因。CMV IE启动子巨细胞病毒立即早期启动子和内含子A，BGHpA 牛生长激素多腺苷酸化信号，KAN 卡那霉素抗性基因。图 2A和 2B :pWRG/SE0_M(SEQ ID NO 3)和 pWRG/SEO-S (SEQID NO 4)的瞬时表达。 A)在转染了 SEOV M或S构建体的单层COS细胞中进行IFAT。转染了 pWRG/7077的单层细胞用作阴性对照。抗SEOV多克隆兔抗血清用作一级抗体。B)用所示质粒转染COS细胞，放射性标记的表达产物用抗SEOV多克隆兔血清进行免疫沉淀。kDa大小的分子标准(MW)表示在左边，而SEOV G1，G2和N蛋白的位置表示在右边。图3A和;3B:通过基因枪或接种针肌内接种了裸露SEOV DNA的小鼠的抗体反应(ELISA)。用ELISA评估通过基因枪或接种针肌内接种了 pWRG/SEO-M(图A)或 pWRG-SEO-S (图B)的抗体反应。接种了阴性对照质粒PWRG7707的小鼠通过两次ELISA进行评估。预放血前的血清，第一次接种(Ivacc)后4周收集的血清，第二次接种(2vaCC)后 4周收集的血清，最后一次接种(3vaCC)后3周收集的血清在一次试验中进行检测。符号表示的是单个小鼠血清样品双重检测的平均值。图4 接种了裸露SEOV DNA的小鼠的中和抗体反应。在用基因枪或接种针肌内注射(接种针)进行第三次接种后3周收集的小鼠血清样品进行PRNT。柱形表示的是接种了所示免疫原的单个小鼠血清。加热灭活血清(56°C，30分钟)，并且在5%豚鼠补体存在的情况下进行试验。PRNT5(I%效价表示成导致噬菌斑减少50%时最高血清稀释度的倒数。图5 接种pWRG/SEO-M能交叉保护防止汉坦病毒感染。根据下面介绍的方法用pWRG/SEO-M或阴性对照质粒(pWRG7707)对分组仓鼠接种，每组仓鼠4_5只。最后一次接种后3周，获得攻击前的血清样品，然后用1000PFU的汉坦病毒攻击仓鼠。攻击后28天，获得攻击后血清样品。对攻击前和攻击后的血清样品进行评估，方法是通过抗NELISA检测核壳的抗体，以及通过汉坦病毒噬菌斑降低中和测验(PRNT)检测汉坦病毒中和抗体。ELISA效价表示的是使得OD值比背景OD值+标准差3大的最低稀释度倒数。PRNT50%效价表示的是在血清缺乏的情况下导致噬菌斑数目减少50%的最低稀释度倒数。图6 用pffRG/SEO-M接种能交叉保护防止多布拉伐病毒感染。根据介绍的方法， 用pWRG/SEO-M或阴性对照质粒(pWRG7077)对分组仓鼠进行接种，每组5只仓鼠。最后一次接种后3周，获得攻击前的血清样品，然后用1000PFU的多布拉伐病毒攻击仓鼠。攻击后28天，获得攻击后血清样品。对攻击前和攻击后的血清样品进行评估，方法是通过抗N ELISA检测核壳的抗体，以及通过多布拉伐病毒噬菌斑降低中和测验(PRNT)检测多布拉伐病毒的中和抗体。ELISA效价表示的是使得OD值比背景OD值+标准差3大的最低稀释度倒数。PRNT50%效价表示的是在血清缺乏的情况下导致噬菌斑数目减少50%的最低稀释度倒数。汉城病毒攻击前的中和抗体效价(由疫苗诱导)也被检测。汉城病毒的PRNT80%值表示成空环。图7 用pWRG/SEO-M接种不能交叉保护防止普马拉病毒感染。根据介绍的方法，用 pWRG/SEO-M或阴性对照质粒(pWRG7077)对分组仓鼠进行接种，每组5只仓鼠。最后一次接种后3周，获得攻击前的血清样品，然后用1000PFU的普马拉病毒攻击仓鼠。攻击后28天， 获得攻击后血清样品。对攻击前和攻击后的血清样品进行评估，方法是通过抗N ELISA检测核壳的抗体，以及通过普马拉病毒噬菌斑降低中和测验(PRNT)检测普马拉病毒的中和抗体。ELISA效价表示的是使得OD值比背景OD值+标准差3大的最低稀释度倒数。PRNT50% 效价表示的是在血清缺乏的情况下导致噬菌斑数目减少50%的最低稀释度倒数。汉城病毒攻击前的中和抗体效价(由疫苗诱导)也被检测。汉城病毒的PRNT80%值表示成空环。图8 =HTNV Gl和G2的瞬时表达。用pWRG/HTN_M或阴性对照质粒(pWRG7077) 转染Cos细胞，并在24小时后，用RIPA制备用于分析的放射性标记的细胞裂解液。用抗 HTNV的多克隆小鼠超免疫腹水(HTNV HMAF)，即Gl特异的MAb (Mab 6D4)，或G2特异的 MAb (Mab-23G10)免疫沉淀表达产物。分子标准(M)在左边表示成kDa大小，而Gl和G2的位置表示在右边。图9々，98，9(，90:有效表达61要求上游外源序列。(A)含有SEOV M基因的DNA疫苗质粒pWRG/SEO-M的示意图，表示的是载体NotI位点和SEOV Gl起始密码子之间的核苷酸序列[SEQ ID NO 5]。NotI位点后是来自以前的克隆方法的24个外源的核苷酸[SEQ IDNO 6]，这些核苷酸后接的是SEOV M反基因组5’非编码区，从位置2开始。汉坦病毒属病毒M 基因被克隆进PWRG7077的NotI-BamHI位点，或NotI-BglII位点。G1/G2，编码Gl和G2糖蛋白的开放阅读框，CMV IE内含子A，巨细胞病毒立即早期启动子，后面接着内含子A序列， KANr 卡那霉素抗性基因，BGH polyA 牛生长激素多腺苷酸化信号。⑶外源序列的改变能影响SEOV Gl的表达。用pWRG/SEO-M (SEO-M)(在这栏中的序列对应SEQ ID NO :6)，或有如下变化的质粒转染COS细胞去掉外源序列(0)；恢复外源序列(1-24)(在这栏中的序列对应SEQ ID NO 6)；反向放置外源序列(24-1)(在这栏中的序列对应SEQ ID NO 7)；去掉外源序列的3’部分(1-12)(在这栏中的序列对应SEQ ID NO :6的核苷酸1_12)；去掉外源序列的5’部分(13-24)(在这栏中的序列对应SEQ ID NO 6的核苷酸13-24)；在外源序列的 9，10位用CC取代AG (1-24)(在这栏中的序列对应SEQ IDNO :6，这个序列的9，10位用CC 取代了 AG)。用多克隆兔抗SEOV抗体进行免疫沉淀，抗SEOV抗体含有Gl特异的和G2特异的抗体(1)，或G2特异多克隆抗体池(3)。在载体的NotI位点和SEOV M基因非翻译区的位置2之间的序列如图所示。Δ表示外源序列被去掉了。有下划线的GGATCTGC(SEQ ID NO 6的核苷酸1-8)是和Gl有效表达相关的最小未改变序列。(C)如果外源基因的1-8位核苷酸，GGATCTGC(SEQ ID NO 6的1_8位核苷酸)包括在NotI位点和SEOV M非编码区之间，Gl就能恢复有效表达。用pWRG/SEO-M(SEO-M)或质粒转染COS细胞，所述质粒去掉了外源基因(0)；恢复了外源序列(1-24) (SEQ ID NO 6)；或外源序列截短了 (1-8) (SEQ ID NO 6的1-8位核苷酸)。用多克隆兔抗SEOV抗体进行免疫沉淀，抗SEOV抗体含有Gl特异的和G2特异的抗体(1)，G1特异的MAb池O)，或G2特异的MAb-IlElO (3)。(D)去掉外源序列能影响HTNV Gl表达。用含HTNV M基因的DNA疫苗质粒，pWRG/HTN_M(x) (HTN-M)(在这栏中的序列对应SEQ ID NO :6)，或有下列变化的质粒转染COS细胞去掉外源序列(0)；恢复外源序列(1-24)(在这栏中的序列对应SEQID NO 6)。用抗HTNV的小鼠超免疫腹水进行免疫沉淀，超免疫腹水含有Gl特异的和G2特异的抗体(1)，Gl特异的MAb池O)，或G2 特异的MAb-IlElO (3)。分子标准(M)在左边表示成kDa大小，而Gl和G2的位置表示在右边。图 10 表达 Gl 和 G2 的质粒 pWRG/HTNV-M (χ)的示意图。pWRG/HTNV-M (χ)采用了 hCMV立即早期启动子和外显子1和2的5’非编码区，在它们之间有一个天然插入的内含子A。汉坦病毒M基因5'开放阅读框(ORF)之前有汉坦病毒M基因的非翻译区(UTR)，而后面是汉坦病毒M基因的3’ -UTR。我们发现的外源序列对Gl有效表达是必要的，它介于内含子A和汉坦病毒5’UTR之间。牛生长激素多腺苷酸化信号(BGH polyA)有助于转录终止。质粒骨架是PUC19，而卡那霉素抗性基因(KanR)提供了抗生素抗性。图11 用表达HTNV Gl和G2的质粒DNA接种能防止HTNV感染。这张图结合了两个独立的实验结果。在第一个实验中，一组仓鼠(659-666)用pWRG/HTN-M接种，而第二组阴性对照(667-674)用载体质粒PWRG7077接种。在第二个实验中，一组仓鼠(2101-2108) 用pWRG/HTN-M (χ)接种，而第二组阴性对照(2109-2116)没有接种。最后接种后3周，收集攻击前的血清，并用HTNV攻击仓鼠。攻击后观天收集攻击后血清。用抗N ELISA检测攻击前和攻击后血清中N特异的抗体，而用PRNT检测中和抗体。每个仓鼠攻击前和攻击后， 终点抗体效价如图所示。对于每个试验，攻击前的同型PRNT8(I%效价按从最高到最低，从左到右进行分类。图12 :12A，12B，12C，12D和12E 交叉保护。仓鼠用图示质粒(含有外源序列的 pffRG/SEO-M, pWRG/HTN-M (χ)或阴性对照质粒)接种，然后用图示的病毒攻击。图Α，图B和图C中的阴性对照仓鼠用基于pWRG7077的质粒接种，而图D和图E中的阴性对照仓鼠不接种。用抗N ELISA检测攻击前和攻击后血清样品中的抗N抗体，并用PRNT检测中和抗体。 同型病毒的PRNT8(I%效价和异型病毒的PRNT5(I%也检测了。攻击前和攻击后，每个仓鼠的终点抗体效价如图所示。攻击前的同型PRNT8(I%效价(从最高到最低，从左到右进行分类)表示成带符号的线。每只仓鼠的识别代码表示在X轴上。仓鼠943，944，945和948的HTNV PRNT 和抗 N ELISA 数据以前发表了(Kamrud 等人，1999，Virology，263，209-219)。
图13 用表达SEOV或HTNV Gl和G2的质粒DNA接种，在猕猴中能诱导高效价的中和抗体反应。根据所述方法中所示的路线，用pWRG/SE0-M(x)，pffRG/HTN-M(x)或rVV/ HTN-M+S接种猕猴。接种前收集血清样品(P)，然后在第一次(1)，第二次(2)，和第三次(3) 接种后3周收集血清样品。在最后一次接种后2个月(a)，4个月(b)，和6个月(c)后也收集血清。PRNT效价表示的是中和病毒噬菌斑数80%或50%血清稀释度的倒数，每只猴子的识别代码表示在各自的图下面。图14 猴子中中和抗体反应的持续时间。由DNA疫苗接种所诱发的中和抗体反应仍在最后接种后8个月的猕猴中检测到了。用所示疫苗接种的猕猴在每次接种后3周放血， 然后在最后接种后2，4，6和8个月(分别是14，22，30和38周)放血。用PRNT对第一次接种后所示的周(0周)的同源中和抗体反应进行评估。每一条线代表一只猴子。第9周的数据在图13也表示了。图15 在仓鼠/ANDV致死病模型中评估HFRS DNA疫苗。用pWRG/HTN_M (χ)或阴性对照质粒PWRG7077接种仓鼠，然后用ANDV攻击。对于死亡的动物，死亡日期用圆括号表示。从第一次攻击后幸存下来的动物继续用ANDV进行第二次攻击。用PRNT对攻击当天 (攻击前)，攻击后4-6周(攻击后)，以及第二次攻击后28-48周(重新攻击后)收集的血清样品检测HTNV和ANDV特异的MAbS。柱子表示PRNT效价。仓鼠识别代码(ID#) 68-91 以及501-523表示的是两个独立的实验；N表示没有做。图16 质粒pWRG/AND-M的示意图。pWRG/AND_M采用了 hCMV立即早期启动子和外显子1和2的5'非编码区，在它们之间有一个天然插入的内含子A。安地斯病毒M基因开放阅读框(ORF)之前有安地斯病毒M非翻译区(UTR)，而后面是安地斯病毒M基因的3’-UTR 序列。我们发现的外源序列对Gl有效表达是必要的，它介于内含子A和安地斯病毒5’UTR 之间。牛生长激素多腺苷酸化信号(BGH polyA)有助于转录终止。质粒骨架是pUC19，而卡那霉素抗性基因(KanR)提供了抗生素抗性。图 17A，17B 禾Π 17C :pWRG/AND_M 的表达。Α)用 pWRG/AND-M(+)或空的质粒 pffRG7077(-)转染COS细胞，然后用阿根廷或美国的HPS康复期血清对来自COS细胞的放射标记的蛋白进行免疫沉淀。B)用pWRG/AND-M，pffRG7077转染COS细胞，或用ANDV转染 VeroE6细胞，然后用阿根廷(抗ANDV的人)的HPS康复期血清对来自COS细胞或Vero E6 细胞的蛋白进行免疫沉淀。C)用pWRG/AND-M (χ) (H)或pWRG/AND(A)转染COS细胞，用指定的HTNV特异的MAbs，HTNV特异的小鼠超免疫腹水(HTN-poly)或阿根廷(AND-poly)的 HPS康复期血清对来自COS细胞的蛋白进行免疫沉淀。+表示Gl或G2被免疫沉淀了，-表示没有蛋白被免疫沉淀了，而*表示Gl和G2都被免疫沉淀了。分子标准(M)在左边表示成kDa大小，而Gl，G2和N的位置表示在右边。图18A，18B和18C 汉坦病毒属病毒DNA疫苗在非人的灵长类动物中的免疫原性。 A)用pWRG/HTN-M(x)，pWRG/AND-M，或阴性对照质粒接种猕猴。在第一次接种之前(P)，以及在第一次，第二次，第三次和第四次接种后3周分别收集血清。进行HTNV-，ANDV-, BCCV-, 以及SNV特异的PRNT，并确定终点50 %和80 %的效价。B)对用pWRG/AND-M接种四次之前(放血前)和之后(接种后)收集的猴子CH69的血清，利用转染了 pWRG/AND-M的细胞放射标记的裂解物，通过RIPA检测其中的Gl和G2特异的抗体。人HPS-患者康复期血清 (抗-ANDV人)被用作抗-ANDV抗体的阳性对照。分子标准(M)在左边表示成kDa大小，而G1，G2和约70kDa(同一性未知)大小的蛋白的位置表示在右边。C)每次接种后和第一次接种(0周)后的指定星期时，确定接种了 pWRG/HTN-M(x)或pWRG/AND_M的猴子的NAb 反应。CH64，CH85和CH69在第0，3，6和12周时接种，而猴子90BD25在第0，3，6和9周接种。HTNV的NAb效价(实线)或ANDV (虚线)通过PRNT进行确定。图19 :pffRG/HA-M质粒的示意图。通过PCR从pWRG/AND-M中扩增一个区域，并将其插入pWRG/HTN-M(x)的XbaI位点，构建成pWRG/HA-M。扩增的区域(利用了能创造XbaI 位点的引物)包括CMV启动子，内含子A，外显子2，外源序列，安地斯病毒M5' -UTR，安地斯病毒M 0RF，安地斯病毒3’ -UTR以及BGH PolyA。对于别的缩写请参考前面的图。详细介绍在本申请中，介绍了用于个体接种防止汉坦病毒属病毒的组合物和方法。该方法包括将编码汉坦病毒属病毒抗原的DNA转移到个体的细胞中，使得抗原在细胞中表达，从而在个体中诱导免疫反应。DNA疫苗接种涉及在体施用编码抗原的多核苷酸，从而在靶细胞中诱导生成正确折叠的抗原。将DNA疫苗导入细胞，将会促使和一种或多种病原菌蛋白相关的结构蛋白决定簇在细胞中表达。加工的结构蛋白将会和正常细胞的主要组织相容性复合物(MHC)抗原共同展示在转染细胞的表面。即便细胞介导的免疫不是防止感染的主要手段，它仍可能对解决已经发生的感染是重要的。此外，转染细胞表达的结构蛋白也可以被抗原呈递细胞获得，从而引发全身性的体液抗体反应。为了获得要寻求的免疫反应，能引起接种个体的转染细胞表达一或多个主要的病毒抗原决定簇的DNA疫苗构建体是必需的。这可以通过如下方式来进行确定病毒基因组中编码病毒糖蛋白或衣壳成分的区域，并将这种编码序列和能在受接种者细胞中表达其的启动子连接起来。此外，病毒基因组本身，或部分基因组也可以使用。在一个实施方案中，本发明涉及到能编码汉坦病毒属病毒抗原的DNA或cDNA。汉坦病毒属病毒的意思是指任何能引起肾综合征出血热(HFRS)的汉坦病毒属病毒，如汉坦病毒(HTNV)，多布拉伐-贝尔格莱德病毒(DOBV)，普马拉病毒(PUUV)和汉城病毒(SEOV) 以及能引起汉坦病毒属病毒肺症候群(HPS)的汉坦病毒属病毒，如辛诺柏病毒(SNV)，黑渠港病毒(BCCV)，长沼病毒(BAYV)，纽约病毒(NYV)，安地斯病毒(ANDV)，Laguna Negra病毒 (LNV)，以及任何别的已知能在人类中引起疾病的汉坦病毒属病毒。更具体一点，编码两种包膜糖蛋白(Gl和G2)的汉坦病毒属病毒基因组M区段 (SEQ ID NO 1),以及编码核壳蛋白的 S 区段(SEQIDN0 2)从 SEOV 菌株 SR-Il (Kitamura, T 等人，1983，Jpn. J. Med. Sci. Biol. 36，17-25)病毒基因组(Arikawa, J 等人，1990， Virologyl76,114-125)中推导出来。M区段(如SEQ ID NO 1中所示)，Genebank登录号是M34882，对应于汉城病毒(SR-Il)M基因2-3602位核苷酸。S区段(在SEQ ID NO 2), Genebank登录号是M34881，对应于汉城病毒(SR-Il)M基因2-1699位核苷酸。汉坦病毒(HTNV)编码G1/G2的M区段对应于汉坦病毒(菌株76-118)的2_3565 位核苷酸，汉坦病毒M序列已经发表，登录号是M14627。安地斯病毒编码G1/G2的M区段对应于安地斯病毒菌株Chile-9717869的2-3671位核苷酸，这个序列的Genebank登录号是 AF291703。本发明也涉及到DNA或多核苷酸序列，它们包括别的汉坦病毒属病毒的M或S基因区段，含有保护性的表位或抗原决定簇。这种表位是具有构象的，包括Gl和/或G2的序列，因为Gl和G2的单克隆抗体表现出能中和病毒，并且在被动保护实验中能保护啮齿类动物。此外，N蛋白的氨基端具有高度的免疫原性，而且已经有人表示，别的用氨基端区域接种的方法能起保护作用(Lundvist, 1996，同上，Ulrich, 1998，同上)。衍生的序列在物理形态上并不必衍生自核苷酸序列本身，而是通过任何方式产生，包括例如化学合成或DNA复制，或逆转录或转录，这些方法都是基于多核苷酸序列衍生区域的碱基序列提供的信息。此外，用本领域已知的方法对对应于标明序列的区域结合进行修饰，从而达到使用的意图。本发明的序列能用在诸如杂交实验和聚合酶链式反应(PCR) 这样的诊断分析中，用来检测汉坦病毒属病毒。通过RT-PCR来克隆SEOV菌株SR-Il的M和S基因组区段，这种方法已经在前面介绍了(Arikawa 等人，1990，Virology 176,114-125)。用 BglII 和 BamHI 将含有汉城病毒(SR-Il)M基因2-3602位核苷酸序列的DNA片段从YMIS/SR11-M中剪切下来(Arikawa, 1990，同上)。这个片段被连接到pWRG7077的BamHI位点，得到pWRG/SEO_M(SEQID NO 3)。 pffRG/SEO-M含有额外的核苷酸，它衍生自克隆载体杆状病毒转移载体YMIS。利用EcoRI 从 pBSK+/SRlI-S(Arikawa，1990，同上)中剪切 DNA 片段，该 DNA 片段含有汉城病毒(SR-Il) S基因2-1699位核苷酸。用Klenow酶将该区段的限制性酶切位点钝化，然后连接到用Klenow钝化的pWRG7077的NotI位点(由Wisconsin，Madison的 Powderject 公司提供)，获得 pWRG/SEO-S (SEQ ID NO 4)。pWRG/SEO-S 中含有衍生自克隆载体pBSKS+的额外的核苷酸。HTNV M DNA疫苗质粒，pffRG/HTN-M(x) (SEQ ID NO :7)基本上是按下列方法构建的。首先，用 BglII 将编码 HTNV G1/G2 的 DNA 从 pTZ19RHTNMm(Schmaljohn 等人，1989，在 负链病毒的遗传学禾口病原性(Genetics and pathogenicity of negative strand virus), D. Kolokofsky 和 B. Mahy 编辑，58-66 页，Elsevier 出版社，Amsterdam)中剪切下来，并和用BamHI剪切的pWRG7077载体连接。这个质粒表达G2，但不表达Gl。我们发现，如果介于载体NotI克隆位点和SEOV M非编码区(图9A)之间的一段长M碱基对(bp)的外源DNA 序列(SEQ IDNO 6)被去掉的话，SEOV M质粒pWRG/SE0_M就不能有效地表达G1，于是我们解决了上面的问题。这段外源DNA是在更早的SEOV基因克隆和亚克隆程序中获得的。去掉了 Mbp序列的SEOV M构建体不能表达Gl，但能表达G2(图9B)。如果将这段Mbp的序列通过基因工程以正向，而不是反向重新连接到构建体体中，G2的表达能恢复(图9B)。 这个结果表明核苷酸序列，而不是核苷酸数目能影响Gl表达。为了绘制能有效表达Gl的序列，我们构建了包括1-12位或13-M位核苷酸外源序列的载体。当1-12位核苷酸，而不是13- 位核苷酸出现在质粒中时，Gl被表达(图9B)。我们注意到DNA 4_10位核苷酸 (TCTGCAG)和内含子A的最后7个核苷酸(即剪切受体位点)完全一样(Menberg等人， 1984，J. Virol. 49，190-199)。将推定的剪切受体二核苷酸AG突变成CC,并不能影响Gl的表达，表明如果该区域参与了剪切，则并不依赖于保持内含子A剪切位点序列的确切性(图 9B)。我们构建了含有外源DNA 1-8位核苷酸的载体，并且发现这能有效地恢复Gl的表达 (图9C)。因此，我们确定位于介于载体NotI位点和SEOV M基因的5'非编码区之间的序列GGATCTGC对于基于pWRG7077的DNA疫苗有效表达Gl是必需的。根据SEOV M中的发现，我们推定，DNA疫苗质粒中包括外源HTNV M基因上游序列使得我们能解决DNA疫苗质粒不能同时表达HTNV Gl和G2的问题。我们构建了一个质粒， 它包括外源HTNV M基因上游序列，而且如果我们这样做的话，我们获得了能表达Gl和G2 的克隆，pffRG/HTN-M(x)(图9D和图10)。当去掉外源序列，不能表达G1，而当恢复这段序列时，Gl又能有效地表达(图9D)。这些数据证实了外源序列不仅对成功表达SEOV Gl是必需的，而且对成功表达HTNV Gl也是必需的。这个序列并不影响来自SEOV或HTNV的G2 的表达(图9)。外源序列影响Gl表达，但不能影响G2表达的机制现在并不明了。为了构建基于 ANDV M 基因的 DNA 疫苗质粒 pWRG/AND-M (SEQ ID NO 8),从 ANDV 感染的Vero E6中分离病毒RNA，进行反转录。在反转录反应中，包括根据已发表的SNV和 PUUV序列分别设计的正向和反向引物。正向引物包括一个NotI限制性位点(下划线)和 M基因非编码区上游的24个核苷酸，这24个核苷酸就是我们以前发现的在pWRG/HTN-M表达Gl时很重要的序列，这在上面已有介绍。纯化cDNA，并在PCR反应中作为模板。用NotI 和BamHI酶切PCR产物，并把酶切产物和用NotI和BamHI酶切的pWRG7077载体连接，得到 pWRG/AND-M。ANDV M基因的序列未知，因此，我们对M基因以及载体/插入连接处进行了测序。菌株Chile-9717869的ANDV全长M基因通过RT-PCR克隆到pWRG7077中，得到pWRG/ AND-M。我们对整个M基因开放阅读框进行了测序。我们克隆的M基因的序列和已经发表的，Genebank登录号为AF291703的ANDVM基因序列几乎完全一样，这种情况并不奇怪，因为病毒分离株来自同一种啮齿类动物(Meisner等人，2002，Virus Res. 89，131-143)。在序列中有两个腺嘌呤取代鸟嘌呤的变化。在位置1504的变化是沉默的，而在位置1840的改变却导致了苏氨酸取代597位的丙氨酸。制备了同时含有汉坦病毒M基因和安地斯病毒M基因的构建体。将汉坦病毒M基因和安地斯病毒M基因克隆到pWRG7077中，得到pWRG/HA-M(SEQ ID NO :9，图19)。每个M 基因的侧翼是巨细胞病毒启动子和内含子A(CMV内含子Α)以及牛生长激素多腺苷酸化位点。整个汉坦病毒和安地斯病毒M基因开放阅读框以及绝大部分5’和3’非编码序列都包括在这个构建体中。此外，24bp序列位于每个汉坦病毒属病毒M序列和它们各自CMV内含子A序列之间。如上面所讨论的那样，我们发现，由于一些不明了的原因，这个24bp的序列 (或者它的一部分)对于Gl糖蛋白的表达是必需的。当pWRG/HA-M被导入哺乳动物细胞时，汉坦病毒和安地斯病毒M基因被表达。表达产物由汉坦病毒Gl和G2糖蛋白以及安地斯病毒Gl和G2糖蛋白组成。在本领域可以理解，基因构建体中所用核苷酸序列上的某些变化对由该构建体编码的蛋白影响很小，或没影响，原因例如是遗传密码具有简并性。这种变化可能是由于沉默的点突变，也可能是点突变编码的不同氨基酸并不能显著改变编码蛋白的行为。也可以理解，去掉一部分编码区域，却不影响构建体体达到所需效果的能力，即诱导抗汉坦病毒属病毒的保护性免疫反应。在本领域可以进一步理解，可以采用一些有利的步骤，如修饰氨基酸组成来增加编码蛋白的抗原性。通过修饰编码这种蛋白的遗传序列，可以将这种变化导入氨基酸组成。值得思考的是汉坦病毒属病毒M和S区段的所有这些修饰和变异在本发明的范围之内都是等同的。编码所需抗原的DNA可以任何合适的形式导入细胞，这些形式包括线性质粒，环形质粒，能复制的质粒，附加体，RNA等。把基因包含在质粒中是优选的。在一个特别优选的实施方案中，质粒是表达载体。能表达遗传物质的单个表达载体可以通过标准的重组技术获得。例如对于一般的克隆方法，请参看=Maniatis等人，1985，分子克隆实验室手册或 DNA 克隆，第 I 和第 II 卷(D. N. Glover，编辑，1985)。因此，在另一实施方案中，本发明涉及重组DNA分子，它包括载体以及上述的DNA 序列。载体可以质粒的形式存在，如pCRIianvitrogen)，或pJW4303(Konishi，Ε.等人， 1992，Virology 188 :714)或任何诸如病毒载体这样的表达载体，如腺病毒或委内瑞拉马脑炎病毒或别的本领域已知的病毒。在靶细胞中优选的是将可操作的启动子序列连接在 DNA序列上。对于哺乳动物系统，已知若干这种启动子，为了使编码蛋白表达，启动子可以连接在编码序列的5’端，或上游。合适的启动子是人巨细胞病毒立即早期启动子。下游转录终止子，或多腺苷酸化序列，如牛生长激素基因的PolyA附加序列也可以加在蛋白编码序列的3’端。用在本发明方法中的合适构建体是图1中的pWRG7077 (4326bp) (Powder Ject Vaccines公司，Madison, WT)。pWRG7077包括人巨细胞病毒(hCMV)立即早期启动子(IE) 以及牛生长激素polyA附加位点。启动子和polyA附加位点之间是内含子A，它在天然情况下和hCMV IE启动子一起出现，当hCMV IE启动子出现在表达质粒中时，能增强转录。内含子A下游，介于内含子A和polyA附加序列之间的是唯一的克隆位点，汉坦病毒属病毒M 或S DNA可克隆到其中。PWRG7077也包括能使细菌宿主细胞对卡那霉素具有抗性的基因。 编码汉坦病毒属病毒Gl和/或G2或核壳蛋白的任何区段都可以通过本领域已知的方法克隆到pWRG7077的一个克隆位点。在进一步的实施方案中，本发明涉及稳定转化或转染了上述重组DNA构建体的宿主细胞。宿主细胞可以是原核细胞如杆状细菌或大肠杆菌，或真核细胞如糖酵母或毕赤酵母，或哺乳动物细胞或昆虫细胞。含有汉坦病毒属病毒序列的载体在细菌中表达，而表达产物用于诊断或作为疫苗。例如对于通用的克隆方法，请参看=Maniatis等人，1985，分子克隆实验室手册或DNA克隆，第I和第II卷(D. N. Glover编辑，1985)。DNA序列可以出现在载体中，可操作地连接到高度纯化的IgG分子，佐剂，载体，或有助于汉坦病毒属病毒蛋白或肽纯化的试剂上。转化或转染的宿主细胞可以作为上述DNA序列的来源。当重组分子是表达系统时，转化或转染细胞可以作为DNA编码蛋白或肽的来源。DNA使用时可以是线形或环形的，或线性化的质粒，只要汉坦病毒属病毒序列可操作地连接在启动子上，而启动子可以在转染细胞中表达。在本申请中，我们介绍了 DNA疫苗针对汉坦病毒属病毒引发保护性免疫。DNA的转移方式可以是通过注射进入受体组织，口服或肺部给药，或者通过粒子轰击(即基因枪)接种。任何一种方法都可以转移DNA，只要DNA能被表达而且细胞能制造所需的抗原。本申请例举了两种方法，这两种方法都能在受接种者中成功地诱导保护性免疫反应。为了通过粒子轰击转移DNA疫苗，我们选用了在1995年7月27日公开的 W095/19799中介绍的PowdererJect-XR 基因枪装置。别的仪器都可以得到，而且本领域的人所熟知。这些仪器利用高速粒子轰击将包被了 DNA的金珠直接转移到表皮细胞，和别的接种同样DNA的非肠道途径相比，它用更少量的DNA，能更有效地诱导体液和细胞介导的免疫反应(Eisenbraun, M 等人，1993，DNA Cell. Biol. , 12 :791 ；Fynan, Ε. F.等人，1993， 美国科学院院刊，90 11478 ；Haynes, J. R.等人，1994，AIDS Res. Hum. Retroviruses 10 Supp 1. 2 :S43 ；Pertmer，T. M 等人，1995，Vaccine 13 :1427)。DNA 候选疫苗进行表皮接种对于在免疫活性组织中的基因表达也有好处，免疫活性组织一般在15-30天脱落，而且它是蜱螫伤后病毒繁殖的重要天然聚集点(Bos, J. D. ,1997, Clin. Exp. Immuno. 107，Supp 1. 1 3 ；Labuda, M 等人，1996，Virology219 357 ；Rambukkana, A 等人，1995，Lab. Invest. 73 521 ；Stingl, G. ,1993, Recent Results Cancer Res. 128 :45)。候选疫苗包括含有M基因组区段的粒子，M基因组区段含有Gl和/或G2，来自一或多个不同的HFRS相关的病毒，如汉城病毒，汉坦病毒，普马拉型病毒和多布拉伐病毒，也来自一或多个HPS相关的病毒，如辛诺柏病毒，黑渠港病毒，长沼病毒，纽约病毒，安地斯病毒和Laguna Negra病毒或这些病毒的组合。来自不同病毒的DNA片段可以在不同的粒子上，也可以在同一粒子上，无论哪种都会导致所需的免疫反应。此外，本发明涉及的疫苗包括一或多个来自不同汉坦病毒属病毒的DNA。这种疫苗被称作多价疫苗。设计这种疫苗来防止由于暴露在一或多个汉坦病毒属病毒中而引起的病变。疫苗也可以和试剂结合，这种试剂能提高疫苗的抗原性，或降低它的副作用。加速粒子基因转移或粒子轰击的技术的基础是将要转移到细胞中的DNA涂在很小的载体粒子上，该粒子比通过这个方法寻求转化的细胞要小。含有所需基因的DNA序列能在一种小的惰性粒子上简单地干燥。粒子可以由任何惰性材料组成，如惰性金属(金， 银，钼，钨等)或惰性塑料(聚苯乙烯，聚丙烯，聚碳酸酯纤维等)。优选的粒子是由金，钼或钨组成。最优选的粒子是由金组成。合适的粒子是球形的，直径是0.5-5微米，优选的是 1-3微米。含有所需基因的DNA序列可以制备成适合基因导入的形式，能简单地在裸露的金或钨粒子上干燥。然而，这种形式的DNA分子具有相对短的稳定期，而且由于和粒子本身的金属或氧化底物的化学反应，DNA分子往往降解得十分迅速。因此，如果载体粒子首先用封装试剂包被，DNA链的稳定性会显著改善，而且即便是在几周的时间内，也不会显著降解。合适的封装试剂是聚赖氨酸(分子量200000)，它在DNA分子使用前用在载体粒子中。包括亚精胺在内的其他封装试剂，聚合的还是非聚合的，可以作为相似的封装试剂使用。聚赖氨酸在粒子中的应用方式是用含0. 02%聚赖氨酸的溶液冲洗金粒子，然后空气干燥或加热干燥，从而将粒子包被。一旦包被了聚赖氨酸的金属离子被合适地干燥，就可以将DNA链负载到粒子中。DNA负载到粒子中的比率是每毫克金珠0. 5-30微克DNA。DNA和金珠的优选比率是每毫克金珠0.5-5.0ygDNA。样品开始用、射线照射(优选的是30kGy)乙烯-四氟乙烯共聚物小管。金粒子在微离心管中称重，加入大约0. 5M亚精氨(游离碱)并混合，然后加入DNA。10%的CaCl2溶液和DNA —起培养大约10分钟，提供细的钙沉淀。沉淀物携带DNA 到金珠上。将微离心管离心，沉淀重悬并用100%乙醇冲洗，终产物重悬在含有0.0025mg/ ml PVP的100%乙醇中。然后把带有DNA的金粒子放在小管中干燥。加速粒子基因转染的通用方法在授权给Sanford的美国专利No4945050中已有介绍。根据这种方法改进版本设计的仪器可以通过商业途径从Wisconsin，Madison的 PowderJect Vaccines公司购买到，这在W095/19799中介绍了。本申请上下文所引用的所有文件都以其全文被引作本发明的参考。简而言之，包被了 DNA的粒子沉积在塑料小管的内表面，塑料小管被切成合适的长度，形成样品夹。将样品夹放在压缩气体的通道上(例如氦气，压力足以将粒子从弹药夹中驱逐出来，如350-400psi)。粒子被气流带走，然后朝着靶组织用足够的力量转移到组织的细胞中。进一步的详细说明可以从已经出版的仪器应用指南上获得。包被的载体粒子通过物理方法加速飞向将要被转化的细胞，致使载体粒子射入靶细胞的里面。这种技术可以在体外细胞中使用，也可以在体内细胞中使用。以前已包被在载体粒子上的DNA以某种频率在靶细胞中表达。基因表达技术已经证明在原核和真核细胞， 从细菌和酵母到高等植物和动物中都能发挥作用。因此，加速粒子的方法提供了一种方便的方法学，它可以将基因转移到范围更广的不同类型的组织细胞中，并提供了一种原位或体内转移基因到细胞中的能力，而不会对处理的个体有不利的影响或副作用。因此，加速粒子的方法也是优选的，因为它使得DNA疫苗能够针对特定的组织和某种组织的特定细胞层诱导免疫反应，只要分别改变转移位点和粒子加速的力量。这种技术因此特别适合将抗原蛋白的基因转移到表皮上。为了在个体中获得所需的抗原反应，利用一种非入侵的方式将DNA疫苗转移到不同类型的易感组织中。最有利的是，基因疫苗可以导入表皮。已经发现，这种转移能产生一种全身性的体液免疫反应。为了从这种技术中获得额外的效果和保证在接种个体中产生粘膜，体液和细胞免疫反应，将基因转移到粘膜组织表面也是需要的。有许多不同的可用的适合转移的位点，包括表皮，外周血细胞以及不同的口腔，上呼吸道，和生殖粘膜表面上任意数目的位点，外周血细胞即淋巴细胞，它们可以在体外处理，然后放回体内。通过基因枪进行DNA免疫能使DNA直接转移到胞内，诱发更高水平的保护性免疫反应，而且比标准接种方法使用的DNA要少大约3个量级。此外，基因枪转移使得在某个给定的表皮位点能精确地控制抗原产物的水平和形式，因为胞内DNA转移能通过系统性地改变转移的粒子数目和每个粒子中DNA的量来控制。 对抗原产物水平和形式的精确控制使得控制产生的免疫反应的属性成为可能。本发明使用的术语“转染”指的是整合了转移的外源DNA疫苗的细胞，而不管使用的转移技术。本发明公开的是在DNA疫苗接种后，在诱导细胞，体液，和保护性免疫反应时，优选的靶细胞是表皮细胞，而不是更深层皮肤，如真皮的细胞。表皮细胞是优选的DNA疫苗的受体，因为这些细胞是身体中最容易进入的细胞，因此，可以非入侵的方式免疫。第二，除了能诱导体液免疫反应，DNA免疫的表皮细胞也能诱导细胞毒性反应，这种反应比表皮下细胞中产生的反应更强烈。向真皮转移也具有侵入少以及转移的细胞最终被身体脱落的优点。尽管通过将遗传物质转移到靶动物中来诱导免疫反应是所需的，但仅仅证明免疫反应并不足以给动物提供保护性好处。重要的是获得一种保护性的免疫反应，这种反应显然和临床的形式有差异。换句话说，一种方法只要在它能降低疾病症状的严重性时才是有效的。在汉坦病毒属病毒攻击免疫种群后，抑制死亡的有效性至少能达到20%的免疫方法是优选的。对免疫种群死亡的抑制能达到50%或更大的有效性的免疫接种方法是更优选的，而最优选70-100%的有效性。本发明显示的免疫接种方法对汉坦病毒属病毒感染的仓鼠模型具有100%的有效性。仓鼠被广泛地用作实验室模型，选用来评估针对汉坦病毒属病毒的保护性免疫反应。相反，由于汉坦病毒属病毒的攻击，没有免疫的动物一律被感染。 我们的结果表明用SEOV M基因组区段接种能防止汉城病毒，汉坦病毒(HTNV)和多布拉伐病毒(DBOV)感染。用HTNV M基因组区段接种能防止汉坦病毒，汉城病毒和多布拉伐病毒感染。用ANDV M基因组区段接种能防止ANDV，辛诺柏病毒和黑渠港病毒感染。用ANDV-M/ HTNV-M区段接种能防止SEOV，HTNV, DBOV, ANDV，辛诺柏病毒以及黑渠港病毒等其他汉坦病毒属病毒的感染。总之，施用的DNA疫苗数量是每剂大约1-8 μ gDNA，而且取决于将要处理的供试者，供试者免疫系统产生所需免疫反应的能力，以及所需保护的程度。将要施用疫苗的精确数量取决于从业者的判断，而对每个供试者和抗原是特殊的。诱导免疫反应的疫苗能防止一或多种病毒，可以单剂量施用，或优选地以多剂量施用，在多剂量规程中，疫苗接种开始进程是1-8次单独剂量，在随后的时间间隔中使用的是其他剂量，时间间隔是保持或增强免疫反应所必需的，例如，在1-4个月是第2剂，而如果需要的话，若干月后，再施用随后的剂量。合适免疫规程的实施例包括(i)0，l和6个月； (ii) 0，7天和1个月；(iii) 0和1个月；(iv) 0和6个月，或别的足以诱导所需免疫反应，按预期那样提供保护性免疫反应，或减少疾病症状，或降低疾病严重性的免疫规程。在另一个实施方案中，本发明提供了用于实施本发明方法的试剂。这种试剂包括含有来自一或多个汉坦病毒属病毒的M或S或两个基因片段的DNA片段，以及小的惰性的密集的粒子。DNA片段和密集的粒子在上面已经介绍了。DNA优选的是冷冻的或冻干的，而小的惰性的密集的粒子是干粉形式。如果使用了包被溶液，包被溶液的干燥成分可以预混合和提前测量，而且可以放在诸如小瓶或密封的包膜这样的容器中。本发明也提供用来实施本发明的试剂盒。本试剂盒含有第一个容器，该容器中含有上述冷冻或冻干的DNA。该试剂盒也包括第二个容器，该容器中含有包被溶液或包被溶液中预混合和提前检测的干燥成分。该试剂盒也包括第三个容器，该容器中包括小的，惰性的，密集的粒子，这些粒子是干粉形式或悬浮在100%的乙醇中。这些容器可以由玻璃，塑料或金属薄片构成，可以是小瓶，瓶子，袋子，管子，包等。该试剂盒也包括书写的信息，如实施本发明的程序，或分析信息，如第一个容器中包含的试剂数量(例如DNA的摩尔数或质量数)。手写的信息可以在第一，第二和/或第三个容器中的任一个中，和/或与第一，第二， 和第三个容器一起，单独放在第四个容器中。例如，第四个容器可以是盒子或包，而且包括第一，第二和第三个容器。在另一个实施方案中，本发明涉及多克隆抗体，它来自接受了上述DNA疫苗的受接种者。术语“抗体”是本领域公知的术语，意思包括能结合已知抗原的分子或分子的活性片段。这些活性片段是通过许多技术从本发明的抗体中衍生而来的。为了进一步介绍分离抗体活性片段的通用技术，请参看Khaw，B. A等人，J. Nucl. Med. 23 1011-1019 (1982)。术语“抗体”也包括双特异和嵌合抗体。下面实施例介绍的多克隆抗体的特征是用诸如ELISA，免疫沉淀，或免疫荧光试验时，能和合适免疫原，即Gl和G2结合的抗体。此外，用噬菌斑降低中和试验(PRNT)检测抗体必须能中和汉坦病毒属病毒。任何保留了这些特征的抗体都和本发明有关。多克隆抗体可以浓缩，照射以及测验中和安地斯病毒和汉坦病毒等其他目的汉坦病毒属病毒的能力。 具有足够高中和抗体效价的血清，即高到转移后足以在受体中检测到反应，可以被汇集。然后将产物冻干用于贮存和复溶。
如实施例中所更详细介绍的那样，本发明人发现，用含有诸如汉坦病毒或安地斯病毒这类汉坦病毒属病毒M区段的DNA疫苗免疫的受接种者的血清含有能中和汉坦病毒属病毒的抗体，并能在体外和体内展示中和汉坦病毒属病毒的性质。有意义的是，抗体的反应性适用于范围更广的不同的汉坦病毒属病毒，无论是HFRS汉坦病毒属病毒还是HPS汉坦病
毒属病毒。鉴于这些结果，本发明的多克隆抗体适合作为治疗用和预防用试剂，这些试剂用来治疗或预防易受汉坦病毒属病毒接触影响的供试者中汉坦病毒属病毒感染或疾病。供试者包括诸如小鼠或豚鼠这样的啮齿类动物，鸟或禽类，以及包括人在类的哺乳类动物。总之，这种方法包括给可能在汉坦病毒属病毒中暴露的供试者或表示出汉坦病毒属病毒症状的供试者施用治疗或预防有效量的本发明多克隆抗体。抗体的任何活性形式都可以施用。本发明的抗体可以在任何系统中产生，包括昆虫细胞，杆状病毒表达系统，小鸡， 兔，山羊，母牛，或植物，如番茄，马铃薯，香蕉或草莓。在这些系统中生产抗体的方法是本领域普通的技术人员所熟知的。优选的是，使用的抗体和受体物种是相容的，致使针对抗体的免疫反应不会在病毒得到控制之前将抗体清除掉，而且供试者中针对抗体诱导的免疫反应不会在供试者中诱导“血清病”。患有汉坦病毒属病毒感染的个体的治疗可包括施用治疗有效量的本发明抗汉坦病毒属病毒的抗体。抗体可以在下面介绍的试剂盒中提供。在给患者提供能结合汉坦病毒属病毒的抗体，或抗体区段，或能防止患者受体感染汉坦病毒属病毒的抗体时，施用试剂的剂量根据患者的因素如年龄，体重，高度，性别，总的医疗情况，以前病史等来变化。总之，给受体提供一剂抗体是所需的，尽管可以施用更低或更高的剂量，但抗体剂量的范围是 lpg/kg-100pg/kg，100pg/kg-500pg/kg，500pg/kg_lng/kg，lng/kg-100ng/ kg,100ng/kg-500ng/kg,500ng/kg_lμ g/kg,1 μ g/kg-100μ g/kg,100 μ g/kg-500μ g/kg, 500 μ g/kg-lmg/kg,lmg/kg_50mg/kg，50mg/kg_100mg/kg，100mg/kg_500mg/kg，500mg/ kg-lg/kg, lg/kg-5g/kg，5g/kg-10g/kg (受体的体重)。把防止汉坦病毒属病毒感染的抗体提供给受体供试者，数量足以减轻汉坦病毒属病毒感染症状。如果试剂的剂量，给药途径等足以影响这种反应，数量被说成足以“影响”感染症状的减轻。对施用抗体的反应可以通过分析供试者的生命征象来检测。如果组合物的施用能被受体患者耐受，则说它是“可药用的”。如果这种试剂施用的数量具有生理意义，则说它是以“治疗有效量”施用的。如果一种试剂的存在能在受体患者中检测到生理变化，则说它具有生理意义。根据已知的方法，可以将本发明的化合物配制成药用组合物，将这些材料，或它们的功能衍生物，和可药用的载体介质结合成混合物。合适的介质，以及它们的制剂，包括其他人蛋白，如人血清白蛋白，都在诸如Remington的《药物科学》(16版)(Osol，A编辑，Mack EastonPa. (1980))这样的出版物中被介绍了。为了形成药用可接受的组合物，适合有效地施用，这种组合物将包含有效量的上述化合物，以及合适数量的载体介质。可以应用别的药用方法去控制作用的持久。通过使用多聚体来复合或吸收化合物来获得控释制剂。为了控制释放，通过选择合适的大分子(例如聚酯，聚氨基酸，聚乙烯，吡咯酮，乙烯-醋酸乙烯共聚物，甲基纤维素，羧甲基纤维素或硫酸鱼精蛋白)和大分子浓度以及掺入的方法可实施受控的转移。另一种由控释制剂控制作用持续时间的可能方法是将本发明的化合物整合到诸如聚酯，聚氨基酸，水凝胶，聚乳酸或乙烯_醋酸乙烯共聚物这样的多聚体材料粒子中。此外，也可以不把这些试剂整合到多聚体粒子中，而把这些试剂包埋在通过诸如界面聚合法制备的微胶囊，如羟甲基纤维素或明胶微胶囊以及聚甲基丙烯酸甲酯微胶囊中，或者胶体药物释放系统如脂质体，白蛋白微球体，微乳剂，纳米微粒，以及纳米囊或巨大乳剂中也是可能的。这些技术在Remington' s Pharmaceutical Sciences—书中(1980)中公开了。可以采用任何合适的方法包括肠道外注射(如腹膜内的，皮下的或肌肉注射)，蛋内(in ovo)注射鸟，口服或局部给药将抗体(典型的是包含在药用制剂中)施用在导气管表面这样的方法施用本发明公开的抗体。将抗体局部施用到导气管表面的实施方法是鼻内给药(例如利用点滴器，药签或吸入器，这些仪器都能在鼻内放置药用制剂)。将抗体局部施用到导气管表面的实施方法也可是吸入给药，如通过制造一种药用制剂的可呼吸粒子 (包括固体和液体粒子)，该药用制剂含有以气溶胶悬浮液形式存在的抗体，然后使得供试者吸入可吸入粒子。药用制剂呼吸粒子给药的方法和仪器是众所周知的，而且任何常规的技术都可以使用。口腔给药的方式可以是可消化的液体或固体形式。治疗可以是单剂量规程，或者优选的是多剂量规程，在多剂量规程中，初始疗程是单独的1-10剂，在随后的时间间隔中使用的是其他剂量，时间间隔是保持或增强免疫反应所必需的，例如，在1-4个月是第2剂，而如果需要的话，若干月后，可以施用随后的剂量。合适的治疗方案实施例包括(i)0，l和6个月；(ii)0，7天和1个月；(iii)0和1个月；(iv)0 和6个月，或别的足以诱导所需免疫反应，按预期那样减少疾病症状，或降低疾病严重性的方案。本发明进一步涉及一种在疑似汉坦病毒属病毒感染样品中检测汉坦病毒属病毒的方法。方法包括，用本发明能结合汉坦病毒属病毒抗原的多克隆抗体接触样品，让抗体结合到汉坦病毒属病毒抗原上形成免疫复合物，检测形成的免疫复合物，并且使免疫复合物存在与否与样品中汉坦病毒属病毒存在与否相联系。样品可以是生物样品，环境样品或食物样品。“检测形成的免疫复合物”这句话的意思包括发现样品中汉坦病毒属病毒抗原存在与否。利用免疫试验可以检测汉坦病毒属病毒抗原存在与否。许多用来检测和/或定量抗原的免疫试验都是本领域普通技术人员所熟知的。参看Harlow和Lane，抗体实验室手册(冷泉港实验室，纽约1988,555-612)。这些免疫试验包括抗体捕捉试验，抗原捕捉试验和双抗体夹心试验。这些试验都是本领域普通技术人员通用的方法。在抗体捕捉试验中， 将抗原吸附到固体支持物上，允许标记的抗体结合。冲洗后，通过检测固体支持物上保留的抗体数量来定量该实验。这个实验的一个变化是竞争性ELISA，在ELISA实验中，抗原结合在固体支持物上，而两种含有能结合抗原的抗体溶液，例如汉坦病毒属病毒受接种者的血清以及本发明的多克隆抗体，都被允许和抗原竞争性地结合。然后检测结合的多克隆抗体的量，然后可以确定血清中是否含有抗汉坦病毒属病毒抗原的抗体。这个竞争性ELISA实验结果可用来表示接种后，受接种者中已知的保护性表位的免疫性。在抗原捕捉实验中，将抗体吸附到固体支持物上，允许标记的抗原结合。通过冲洗去掉未结合的蛋白，通过检测结合抗原的数量来定量该实验。在双抗体夹心试验中，一种抗体吸附到固体支持物上，允许抗原结合该第一种抗体。通过检测可结合抗原的标记第二个抗体的数量来定量该实验。这些免疫试验典型的依赖于检测用的标记的抗原，抗体或第二种试剂。这些蛋白可以用放射活性化合物，酶，生物素或荧光染料标记。其中，放射活性标记几乎可以用在所有类型的实验中，而且有最多的变化。当放射活性必须避免或需要快速的结果时，酶联标记是特别有用的。生物素偶联的试剂通常用标记的链霉亲和素来检测。链霉亲和素能紧密和迅速地结合生物素，并且标记上放射性同位素或酶。荧光染料，尽管在使用时要求昂贵的设备，但它提供了非常灵敏的检测方法。用在这些实验中的抗体包括单克隆抗体，多克隆抗体，以及亲和纯化的多克隆抗体。本领域普通技术人员都知道别的合适的标记，它们可根据本发明来使用。利用本领域普通技术人员共同知道的标准技术可以将这些标记和抗体或抗体区段结合在一起。典型的技术在Kennedy，J. H.等人1976年的Clin. Chim. Acta 70 1-31)和 Schurs，Α. H. W. Μ.等人 1977 年的 Clin. Chim Acta 81 :1-40 中介绍了。在后文中提到的偶联技术是戊二醛方法，高碘酸盐方法，二马来酰亚胺方法以及其他，所有这些方法都被引作本申请的参考。“生物样品”这句话的意思包括生物材料，如细胞，组织，或生物流体。“环境样品” 意思是指诸如土和水这样的样品。食物样品包括罐装品，肉等。本发明另一方面是检测生物样品中汉坦病毒属病毒的试剂盒。试剂盒包括含有一或多个本发明多克隆抗体的容器，本发明多克隆抗体能结合汉坦病毒属病毒抗原，还包括抗体使用说明书，目的是将抗体结合到汉坦病毒属病毒抗原上形成免疫复合物，并且检测免疫复合物的形成，以致将免疫复合物的存在与否和样品中汉坦病毒属病毒的存在与否联系起来。容器的实施例包括多孔培养板，它使得能同时检测多个样品中的汉坦病毒属病毒。所有在整个本申请中引用的参考文献的内容(包括文献参考，发表的专利，出版的专利申请和在审申请)专门在此引作本申请的参考。本发明的其他特征将在下面示范性实施方案的介绍过程中变得更清晰，给出的这些实施方案是为了证明本发明，而不是有意限制本发明。下列材料和方法都在下面实施例中使用了。材料和方法病毒，细胞和培养基HTNV 病毒株 76-118 (Lee 等人，1978，J. Infect. Dis. 137,298-308)，ANDV 病毒株 Chile-9717869 (Hooper 等人，2001, Virology 289,6-14)，BCCV (RolIin 等人，1995，J. Med. Virol. 46,35-39)，和 SNV病毒株CC107(Schmaljohn 等人，1995, Virology 206,963-972)都在 Vero E6 细胞中繁殖(Vero C1008，ATCC CRL 1586)。在 COS 细胞(C0S-7 ；ATTCCRL1651) 中进行瞬时表达实验。两种类型细胞都在37°C，5% CO2培养箱中培养，培养基是含有Earle 氏盐的fegle氏基础培养基(EMEM)，其中含有10%的胎牛血清，IOmM,pH7. 4的HEPES，以及抗生素(青霉素[100U/ml]，链霉素[100μ g/ml]和硫酸庆大霉素[50μ g/ml]) (cEMEM)。HTNV G2 特异的单克隆抗体(MAbs) :MAb-23G10，MAb-llE10，MAb-3D7，MAb_16E6 和 MAb-HC02 ；HTNV Gl 特异的 MAbs :MAb_2D5，MAb_6D4，MAb-8B6, MAb_3D5，以及 MAb-IOFll 都在以前介绍了(Arikawa 等人，1989，J. Gen. Virol. 70，615-24，24)。MAb_HC02 和 MAbE606 由J.McCormick博士提供(亚特兰大，疾病控制中心，Georgia, Ruo等人，1991，Arch. Virol. 119，1-11)。
SEOV M和S裸露DNA质粒的构建通过RT-PCR克隆SEOV病毒株SR-11的M和S 基因组区段这种方法已经在前面介绍了(Arikawa等人，1990，Virology 176，114-125)。将代表每个基因组区段的cDNA亚克隆到以前介绍的裸露DNA载体pWRG7077的NotI或BamHI 位点(Schmaljohn 等人，1997，J. Virol. 64，3162-3170)。根据制造商的说明书，用 Qiagen maxiprep DNA纯化试剂盒(目录号12163，Qiagen)纯化质粒DNA。我们用于接种针肌内接种和表皮基因枪接种的DNA并不是通过无内毒素(endo-free) qiagen DNA试剂盒制备的，因此，该DNA并不是无内毒素的(Qiagen质粒试剂盒，每μ gDNA产生 9. 3内毒素单位 [QIAGEN质粒纯化手册01. 971])。为了控制内毒素可能的免疫刺激效果，我们用制备候选疫苗相同的方法精确地制备了阴性对照质粒DNA。含汉坦病毒属病毒M基因的DNA疫苗质粒的构建。用如下方式构建pWRG/SEO-M的修饰版本。用聚合酶链式反应(PCR)从pWRG/SEO-M扩增SEOV M DNA，使用的正向引物是[引物0，5，-GCGCGCGGCCGCAGTAGTAGACTCCGCAAGAAAC(SEQ IDNO :10)]和反向引物[反向，5' -G CGCGGATCCCGGGTACCGGGCCCCCCCTCG(SEQ ID NO: 11)]。用 NotI 和 BamHI 切割 PCR 产物，然后连接到用NotI-BamHI切割的pWRG7077中，得到pWRG/SE0-M (0)。通过PCR从pWRG/SEO-M(0)中扩增SEOV M DNA，使用的正向引物是[引物1-24, 5’ GGCCGCGGCCGCGGATCTGCAGGAATTCGGCACGAGAGTAGTAGACTCCGCAAGAAACAGCA(SEQ ID NO: 12)]，或[引物 24-1，5，-GGCCGCGGCCGCGAGCACGGCTTAAGGACGTCTAGGAGTAGTAGTCTCCGCAAGAA ACAGCA (SEQ ID NO 13)]，或[引物 1-12，5，_GGCCGCGGCCGCATTCGGCACGAGAGTAGTAGACTCCGCA AGAAACAGCA (SEQ ID NO 14)]，或[引物 13-24，5，-GGCCGCGGCCGCGGATCTGCAGGMGTAGTAGACT CCGCAAGAMCAGCA (SEQ ID NO :15)]，或[引物 1-24*，5，GGCCGCGGCCGCGGATCTGCCCGAATTCGGC ACGAGAGTAGTAGACTCCGCAAGAMCAGCA (SEQ ID NO 16)]，或[引物 1-8，5，GGCCGCGGCCGCGGATC TGCAGTAGTAGACTCCGCAAGAAACAGCA(SEQ ID NO 17)]以及反向引物BACK。用 NotI 和BamHI 切割PCR产物，然后连接到用NotI-BamHI切割的pWRG7077中，分别得到pWRG/SE0-M(1-24)， pWRG/SEO-M(24-1)，pWRG/SEO-M(1-12), pWRG/SEO-M(13-24)，pWRG/SEO-M(1-24*),以及 pWRG/SEO-M(1-8)。为了构建 pWRG/SEO-M (χ)，通过 PCR 从 pWRG/SEO-M 中扩增编码 SEOV G1/G2 蛋白的 DNA,使用引物 1-24 和反向引物[SE0MX，5 ‘ -GCGCGGATCCAGATTGGGAGATAGAAGAGAG (SEQ ID NO :18)]。用NotI和BamHI切割PCR产物，然后连接到用NotI-BamHI切割的pWRG7077中。 通过去掉pWRG7077 BamHI和BglII位点之间不需要的克隆人造DNA(猿免疫缺陷病毒nef 基因大约100个核苷酸)，构建该克隆。去掉该序列对克隆基因的表达没影响(数据没有表示出来)。HTNV M DNA疫苗质粒pWRG/HTN_M的构建基本按如下方法进行。首先，用BglII 将编码HTNV G1/G2的DNA从pTZ19RHTNMm中剪切下来(Schmaljohn等人，1989，同上)，并连接到用BamHI剪切的pWRG7077载体中。该质粒表达G2，但不表达Gl (数据没有表示出来)。第二步，该质粒含有M基因5’末端的NotI-PshAI区段被剪切下来，并用PCR扩增的 DNA(来自质粒pUC18，pUC18中含有全长HTNV M基因，该基因是通过反转录酶PCR从病毒 RNA中克隆来的)取代，PCR使用的引物是1_24(参考上文)和反向引物[M5B，5’_TCAGGAC TCCTGTCATGCAATAAGATCTC(SEQ ID NO: 19)]。反向引物包括HTNV M基因中沉默的核苷酸变化，这种变化创造了一个用于诊断的BglII位点。用NotI和I^shAI切割PCR产物，然后连接到用 NotI-PshAI 切割的 pWRG7077 中，得到 pWRG/HTN_M。利用引物1-24 和反向引物[HTNMX，5，-GCGCGGATCCGTTTGTGGTTAGAAAGCTAC (SEQ ID NO 20)]从 pffRG/HTN-M 中扩增 HTNV M 基因，构建 pffRG/HTN-M(χ)。用 NotI 和 BamHI 切割PCR产物，然后连接到用NotI-BamHI切割的载体pWRG7077中。这个克隆和pWRG/HTN_M 完全一样。然而，该基因3’非翻译区的一部分，以及NotI和BglII之间的载体序列被去掉了。利用引物O和反向引物HTNMX，从pWRG/HTN_M(χ)中PCR扩增HTNV M基因，构建 pffRG/HTN-M(0)。用NotI和BamHI切割PCR产物，然后连接到用NotI-BamHI切割的pWRG7077中。利用引物1-24和反向引物HTNMX，从pWRG/HTN-M(0)中PCR扩增HTNV M基因，构建pWRG/HTN-M(1-24)。用NotI和BamHI切割PCR产物，然后连接到用NotI-BamHI切割的 PWRG7077 中。根据制造商的说明书，用Qiagen maxiprep DNA纯化试剂盒纯化质粒DNA。为了构建含有ANDV M基因的DNA疫苗质粒pWRG/AND_M，根据标准方法，利用 TRIzol (Invitrogen, Carlsbad, Calif.)从 ANDV 感染的 Vero E6 细胞中分离病毒 RNA。利用Superscript〗〗反转录酶(Invitrogen)在50°C将该RNA反转录50分钟，然后在70°C培养15分钟使反转录酶失活。用RNaseH在37°C消化20分钟，去掉RNA。分别根据已经发表的SNV和PUUV序列设计的正向和反向引物包括在反转录反应中正向引物[SN-Fj，5’ -GG CCGCGGCCGCGGATCTGCAGGAATTCGGCACGAGAGTAGTAGACTCCGCACGAAGAAGC(SEQ ID NO :21)]和反向引物[PUUM-R，5，-GCGCGGATCCTAGTAGTATGCTCCGCAGGAAC (SEQ IDNO 22)] 正向引物包括一个NotI限制性位点(下划线)和M基因非编码区上游的M个核苷酸，这M个核苷酸就是我们以前发现的在pWRG/HTN-M (χ)中表达Gl时很重要的序列。反向引物包括一个BamHI限制性位点(下划线)。用PCR纯化试剂盒^jiagen)纯化cDNA，并在PCR反应中作为模板。PCR反应包括SN-Fj和PUUM-R引物，以及Platinum Taq高保真DNA聚合酶 (Invitrogen) -MV，3分钟，一个循环，紧接着是30个循环，每个循化是94°C 30秒，68°C 8 分钟。用NotI和BamHI切割PCR产物，然后连接到用NotI-BamHI切割的pWRG7077中，得到pWRG/AND-M(l. 1)，迄今称作pWRG/AND_M(SEQID NO 8)。根据制造商的说明书，用Qiagen maxiprep DNA纯化试剂盒纯化质粒DNA。在构建这个质粒的时候，ANDV M基因的序列是未知的，因此我们利用引物步移技术和ABI 3100基因分析仪对M基因和载体/插入位点连接处进行了测序。间接荧光抗体实验(IFAT)IFAT 是以前介绍的方法的修改(Kamrud 等人，1995，Exp. Parasitol. 81， 394-403)。根据制造商的说明，利用Fugene6 (Boehringer Mannheim)，将1 μ g质粒DNA转染生长在12孔细胞培养板的15mm玻璃盖玻片上的COS细胞。转染后M小时，用PBS(pH7. 4) 冲洗盖玻片一次，用丙酮在室温下固定10分钟，然后和抗SEOV的多克隆抗血清(兔)或接种动物的血清反应。在含有3%胎牛血清(FBQ的PBS中稀释抗体，然后和转染细胞在37°C 培养30分钟。用PBS冲洗盖玻片三次，并和生物素酰化的猴抗兔抗体在37°C培养30分钟， 紧接着和稀释在含3% FBS的PBS中的链霉亲和素交联的荧光素(Amersham)，或荧光素标记的山羊抗仓鼠抗体反应(Kirkegaard & Perry实验室)。伊文氏蓝(Fisher)包含在二级抗体溶液中，作为复染剂。用PBS冲洗盖玻片三次，并且用去离子水冲洗一遍，然后放在玻片上荧光装片基质(DAKO)液滴中。Axioplan荧光显微镜观察细胞。对于HTNV，仓鼠血清用含有3% FBS的PBS按1 200稀释，然后和转染细胞在 37°C培养1小时。用PBS冲洗盖玻片三次，并和荧光素标记的山羊抗仓鼠IgG抗体在37°C 培养30分钟(Kirkegaard & Perry实验室)。赫斯特染色剂(1 μ g/ml)包含在二级抗体溶液中，作为复染剂。用PBS冲洗盖玻片三次，并且用去离子水冲洗一遍，然后放在玻片上荧光装片基质(DAKO)液滴中。用Nikon E600荧光显微镜观察细胞。免疫沉淀培养在T-25细胞培养瓶中的COS细胞经Fugene6 (Boehringer Mannhein)介导， 用5-8 μ g质粒DNA转染。24小时后，表达产物用ft~0mix([35S]-甲硫氨酸和[35S]-半胱氨酸，Amersham)进行放射性标记，然后根据前面介绍的方法进行免疫沉淀(Schmaljohn 等人，1997，Emerg. Infect. Dis. 3，95-104)。还原的样品在 200V 常压下，4-12% Bis-Tris SDSPAGE梯度胶上电泳，3-(N-吗啉代)丙磺酸(MOPS)做电泳缓冲液(Nu Page) 0用基因枪接种根据前面介绍的方法制备基因枪的弹夹(Eisenbraun等人，1993，DNA Cell Biol. 12,791-797 ；Schmal john 等人，1997，同上)。简而言之，将 1. 5 μ gDNA 沉淀到 0. 5mg 的约2μπι直径的金珠上(Degussa)。DNA包被的金珠被用来包被Tefzel小管的内表面 (McMaster-Carr)。弹夹的制作方法是将DNA-金-包被的Tefzel小管切成约0. 5英寸的小块，每一块含有 0. 5mg的金，包被着 0. 75 μ g的DNA (根据洗脱和荧光分析确定的结合在金珠上的沉淀DNA的 50% )。为了接种动物，用大剪刀去掉腹部的毛，根据以前介绍的方法(Pertmer 等人，1995，Vaccine 13，1427-1430)，利用基因枪(Powderject-XRR 移装置，Powderject Vaccine公司)将DNA包被的金珠施用到腹部表皮的不相重叠的部位。BALB/c小鼠(National Cancer Institute (国家癌症研究所))和远交的叙利亚仓鼠(Charles River)分别用2或4个弹夹在400p. s. i的氦气压下接种。这些研究根据 Guide for the Care and Use ofLaboratory Animals (实验室动物管理及使用指南)上介绍的方法进行(国家卫生研究院，1996)。这些设施已经被American Association for Accreditation of Laboratory Animal Care (美国实验室动物管理授权协会)充分授权了。对于HTNV，制备基因枪弹夹( 0. 5 μ g质粒DNA包被0. 5mg金珠)，并且如上所述用基因枪接种远交的金黄色叙利亚仓鼠。仓鼠每隔3周接种3次。猕猴用接种仓鼠同样的弹夹和基因枪条件接种，然而，猴子每接种一次得给药8次，而不是4次。根据第II期临床试验接种人的方法(McClain等人，2000，同上)，猕猴用重组的痘苗病毒rVV/HTN-M+S接种。用26G3/8英寸的针将疫苗(0. 5ml PBS中有3. 4 X IO7PFU)皮下注射到右侧上臂。42天后，猴子左臂接受了完全一样的加强接种。对于ANDV，质粒DNA沉淀在金珠上(每毫克金珠是3 μ g DNA)，然后将DNA包被的金珠包被在小管上。制备由包被在0. 5mg金珠上的 0. 75 μ g质粒DNA的基因枪弹夹，并将其贮存在4°C，使变干，直到使用时。在400p. s. i氦气压的情况下在刮剃的腹部表皮的非重叠部位叙利亚仓鼠用Powderject XRl粒子介导的表皮转移装置(基因枪)(Powerject
2Vaccines公司，Madison，Wis.)接种，每次接种要给药四次。猕猴用接种仓鼠同样的弹夹和基因枪条件接种，然而，猴子每接种一次得给药8次G次在腹部，而4次在腹股沟淋巴结)。 在不痛苦的基因枪接种过程中，仓鼠和猴子都得麻醉。唯一可见到的效果是在接种部位有轻微的红斑。接种针肌内接种用28. 5号针头将悬浮在50 μ 1 PBS (ρΗ7. 4)中的质粒DNA (25 μ g)注射到麻醉了的小鼠腓肠肌中。ELISA。为了检测SEOV Gl和G2，将SEOV感染的Vero E6细胞裂解液(Xo照射 (3000000拉德)失活的病毒)用碳酸盐缓冲液(pH9.6)稀释，4°C过夜，然后涂在酶标板 (Costar)上。用PBS，3%脱脂奶，0. 05% Tween-20 (封闭溶液)在37°C封闭酶标板1小时， 然后用PBS，0. 05% Tween-20 (冲洗溶液)冲洗一遍。小鼠或仓鼠血清在封闭溶液中稀释， 加到孔中，然后用前面的方法培养酶标板。用冲洗溶液冲洗酶标板4次，然后和在封闭溶液中稀释了 1000倍的辣根过氧化物酶(HRP)交联的山羊抗小鼠抗体(目录号A-4416，Sigma) 或稀释了 2000倍的辣根过氧化物酶标记的山羊抗仓鼠抗体(目录号14-22-06，Kirkegaard & Perry实验室)培养1小时。同前面一样冲洗酶标板，然后和四甲基联苯胺底物(TMB，目录号50-76-04，Kirkegaard & Perry实验室)在室温共培养10分钟。加入终止溶液(目录号50-85-04，Kirkegaard & Perry实验室)终止呈色反应，并且确定450nm处的光密度 (OD)。检测SEOV N特异抗体的方法是从以前介绍的技术中改编而来的(Elgh等人，1997， J. Clin. Microbiol. 35，1122-1130)。利用 pRSET质粒(Invitrogen)将 SEOV (病毒株 SR-11) 核壳蛋白的1-117位氨基酸在大肠杆菌BL21(DE!3) (Novagen公司)中表达成组氨酸标签的融合蛋白，并在Ni-NTA柱Oiiagen)上通过亲和层析进行纯化。用碳酸盐缓冲液(pH9. 6) 稀释抗原，并将其加入96孔的微升板上(Maxisorp ；NUNC)(每个孔中100 μ 1缓冲液，含有 0. 2 μ g抗原)，然后在4°C培养过夜。用去离子水冲洗酶标板，并在室温下和封闭溶液培养 30分钟。用去离子水冲洗酶标板后，将100 μ 1血清(在封闭缓冲液中稀释，封闭缓冲液含有大肠杆菌抗原提取物
)加入完全相同的孔。酶标板在37°C培养1小时，然后又用以前的方法冲洗。加入HRP 二级抗体，用上面介绍的方法，对SEOV G1-G2 ELISA进行呈色检测。终点效价被确定为最高的稀释度，这时的OD比阴性对照质粒(pWRG7077)接种的动物血清的平均OD加上3个标准差要大。用SEOV N抗原检测HTNV N特异的抗体，而用 PUUV N来检测ANDV N特异的抗体。噬菌斑减少中和试验(PRNT)。中和试验基本上是按以前介绍的方法进行(Chu等人，1995，J. Virol. 69，6417-6423)。血清样品在cEMEM中稀释，然后和等量的含有 75PFU SEOV的cEMEM(lll μ 1)结合。这种血清病毒混合物在4°C培养过夜，然后以200 μ 1/孔的量加入6孔酶标板中，酶标板中含有3-7天大的Vero Ε6单层细胞。在37°C吸收1小时后， 在每个孔中加入3ml含10% FBS的覆盖培养基(Earl氏基础培养基(EBME)，IOmM HEPEs, 0. 6%琼脂糖[Sea Kem ME琼脂糖]，8mML_谷氨酰胺，抗生素)和IX非必需氨基酸(GIBC0 BRL)。酶标板在37°C培养7天，然后通过添加aiil/孔的含5 % FBS和5 %中性红溶液(GIBC0 BRL)的覆盖培养基进行染色。酶标板在37°C培养2天后计数噬菌斑。实验前将血清样品加热灭活(56°C，30分钟)。在使用补体的实验中，血清和病毒在存在5%豚鼠补体(目录号 ACL-4051,Accurate Chemical and Scientific Corporation)的情况下培养过夜。HTNV，SEOV, ANDV,以及BCCV PRNT在1周后用中性红染色，而PUUV，DOBV,以及SNV PRNT在9天后染色。染色后2-3天(37°C )计数噬菌斑。用SEOV攻击。将稀释在0. 2ml灭菌PBS (pH7. 4)中的IO3PFU的SEOV用25号针通过肌内(近尾股)注射到仓鼠。IO3PFU剂量是根据以前发表的文章来定的，该文章报道用这样的剂量和途径攻击后，仓鼠会100%感染(Schmaljohn等人，1990，同上，Chu等人，1995， 同上)。攻击后观天，将仓鼠麻醉，通过心脏穿刺进行抽血。通过IFAT，ELISA和PRNT评估攻击后血清中抗SEOV抗体的存在与否。攻击后病毒蛋白，而不是免疫原的抗体效价显著上升说明仓鼠被SEOV感染了。对于HTNV和ANDV，通过ELISA评估攻击前和攻击后血清中N特异抗体的存在，并且通过PRNT评估中和抗体的存在。检测攻击后N特异抗体表明仓鼠被攻击的病毒感染。HTNV的攻击剂量是2000PFU，这时大约IOOOLD5tl (未发表的数据)。ANDV的攻击剂量是2000PFU，这时大约250LD5(1。在生物安全4级(BSL-4)实验室做了一些涉及感染了 ANDV的仓鼠的实验。在生物安全3级(BSL-3)实验室做了涉及感染了 HTNV的仓鼠的实验， 这时要戴着3M-RACAL兜帽，穿着TYVEK衣服。利用一种逻辑回归模型评估疫苗对残存结果的作用。利用 SAS8. 2 版本(SAS Insitute Inc. SASOnlineDoc, Version 8，Cary, NC2000) 进行分析。所有的动物研究都是根据实验室动物管理与使用指南中介绍的方法进行的(国家卫生研究所，Bethesda，MD，1996)。这种设施是由美国实验室动物管理授权委员会充分授权的。交叉保护实验。用pWRG/SEO-M或阴性对照质粒(pWRG7707)接种仓鼠，每组仓鼠 4-5只。在3周的间隔中，用基因枪给药(每次给药约1.5yg DNA)接种了 4次。最后一次接种后3周，获得攻击前的血清样品，然后用1000PFU的汉坦病毒，1000PFU的多布拉伐病毒或1000-2000PFU的普马拉病毒攻击仓鼠。攻击后观天，获得攻击后血清样品。对攻击前和攻击后的血清样品进行评估，方法是通过抗N ELISA检测核壳的抗体，通过汉坦病毒，多布拉伐病毒或普马拉病毒噬菌斑降低中和测验(PRNT)检测攻击病毒依赖的切除的中和抗体。抗体注射。把人类HPS患者的恢复期的血浆冻干，重悬在水中，在使用前加入CaCl2 至0. 1M，在37°C培养4小时，然后在4°C过夜，最后在_20°C放置1小时进行重新钙化。将处理过的血浆解冻，在10000XG下离心20分钟，收集上清夜。将接种了 DNA疫苗的猴血清和人血清(PEL-FREEZ，Biologies, Rogers, Ariz)加热灭活(56°C，30 分钟)。用带 25 号， 5/8英寸针头的Iml注射器将Iml血清或血浆以腹膜内(i. p.)给药的方式注射到仓鼠中。实施例1汉坦病毒属病毒基因的瞬时表达表示SEOV病毒株SR-IIM(SEQID N0:1)或S(SEQ ID NO :2)基因区段的cDNA被亚克隆到裸露的DNA表达载体pWRG7077巨细胞病毒立即早期启动子的下游，分别得到pWRG/ SEO-M(SEQ ID NO 3)和 pffRG/SE0-S (SEQ ID NO :4)(图 1)。为了检测 M 禾口 S 构建体的表达，将这些质粒转染到COS细胞中，并对表达蛋白进行免疫染色或免疫沉淀。在和抗SEOV 的多克隆血清一起培养的转染单层细胞中，出现了染色的细胞，表明pWRG/SEO-M和pWRG/ SEO-S都表达了 SEOV反应蛋白(图2A)。放射性标记的表达产物用抗SEOV的多克隆抗血清进行免疫沉淀，并用SDS-PAGE分析(图2B)。免疫沉淀的蛋白具有G1，G2和N所预计的表观分子量(80kDa, 56kDa,以及 48kDa) (Elliot 等人，1984，J. Gen. Virol. 65，1285-1293 ； khmaljohn 等人，1986，Virology 155,633-643)。其他表观分子量是约 37kDa 和约 ^kDa 的蛋白条带和N蛋白共沉淀。这些多肽被N蛋白氨基端特异的单克隆抗体免疫沉淀，并且用Western印迹能检测出来，表明它们是截短形式的N蛋白(数据未表示)。实施例2用pWRG/SEO-M或pWRG/SEO-S免疫接种小鼠。为了确定是M构建体还是S构建体在小鼠中诱导抗体反应，用pWRG/SEO-M，pffRG/SEO-S或阴性对照质粒(pWRG7077)对10组 6-8周大小的BALB/c小鼠免疫接种，采用了两种不同的接种方式用基因枪接种表皮或用针注射腓肠肌。对小鼠进行初次接种，然后在4周的间隔中加强2次。每次接种前收集血样品，并且在最后一次加强后3周，用ELISA筛选SEOV特异的抗体反应。M构建体和S构建体用两种DNA给药途径都能诱导SEOV特异的抗体反应(图幻。用基因枪接种了 SEOV S 基因的大多数小鼠仅在一次接种后表示出特异的抗体，而在随后的免疫接种后抗体反应增加(图3B)。为了比较相对抗体反应，对终了血样品确定终点ELISA效价(表1)。与肌内接种任一构建体比较，基因枪接种导致较高的血清转化频率和几何平均效价(GMT)。表1 在接种有SEOV裸露的DNA疫苗的小鼠中的ELISA效价
权利要求
1.一种组合物，包括惰性粒子，以及包被在惰性粒子上形成核酸包被的粒子的核酸，所述核酸由能在哺乳动物细胞中操作的启动子、SEQ ID NO 6和编码来自ANDV的Gl和G2蛋白的多核苷酸M区段组成。
2.根据权利要求1所述的组合物，其中所述核酸是如SEQIDN0:8中所示的pWRG/ AND-M(x)。
3.一种重组DNA构建体，其组成为 i)载体， )编码来自ANDV的Gl和G2蛋白的多核苷酸M区段，以及 iii)SEQ ID NO :6所示的核酸片段。
4.一种组合物，含有一群受接种者的多克隆抗体，受接种者接种了 DNA疫苗，该疫苗含有 pWRG/AND-M。
5.权利要求1或2的组合物在制备用于在哺乳动物中诱导抗ANDV感染的保护性免疫反应的药物中的应用。
全文摘要
本发明涉及抗汉坦病毒属病毒感染的DNA疫苗。本发明介绍的是抗HFRS-和HPS-相关汉坦病毒的保护性DNA疫苗。疫苗的构建是将表示中间(M)序列(编码G1和G2糖蛋白)的cDNA亚克隆到DNA表达载体pWRG7077中。接种有M构建体的动物产生中和抗体反应。被动转移试验显示，攻击后4或5天注射接种动物的血清可以保护动物免受致命疾病的伤害。
文档编号C07K14/175GK102441174SQ20111030457
公开日2012年5月9日 申请日期2003年3月21日 优先权日2002年3月22日
发明者康尼·S·施马尔约翰, 杰伊·W·胡珀, 马克斯·卡斯特 申请人:美国传染性疾病军医研究所