专利名称：控制水稻散穗基因pac1及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种来源于普通野生稻的调控水稻穗型的基因PACl及其蛋白，以及在水稻穗型调控中的应用。
背景技术：
水稻是重要的粮食作物，我国杂交水稻在生产上的成功应用大幅度提高了水稻产量，为我国和世界粮食生产的安全做出了巨大贡献。然而，杂交水稻的制种成本，尤其是杂交种的产量较低的现状，是进一步提高水稻杂种优势经济效益的限制因子之一。野生稻中虽然有高产、抗病等基因，但是不利基因的含量也较高，难于直接利用。目前已从野生稻中定位到高产、抗病、抗虫、耐旱、耐冷等有利于水稻品种改良的基因。同时筛选出携带控制株型等基因、表型优良的野生稻渗入系材料，拓宽了水稻种质资源。水稻株型影响产量，最好的先例是著名的半矮杆基因sd-Ι在生产上的利用解决了水稻倒伏难题，从而使水稻单产大幅度提高。穗型是理想株型的重要内容，理想的穗型能显著提高水稻产量。野生稻(0.rufipogon Griff)驯化为栽培稻(0.sativa L)的过程中，许多形态和生理性状发生深刻的改变。其中，生殖方式由野生稻的异花授粉转变成栽培稻的自花授粉，这一转变是由于水稻穗形态和颖花结构的改变引起的。栽培稻与其祖先野生稻相比，穗型由松散变紧凑，花药变小，柱头外露率降低。这些性状降低了花粉散发以及柱头接收花粉的能力，从而降低了异花授粉的几率。然而，这些有利于异花授粉的性状可以用来改良恢复系和不育系，从而提高杂交水稻的制种产量。因此控制这些性状的相关基因的遗传及分子机理研究一直是水稻遗传育种的热点。相关基因的克隆具有重要的应用价值和经济效益。野生稻散穗表型有利于花粉散布，而且遗传基础比较简单。然而，到目前为止，尚未有控制这些性状的基因克隆的报道。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种来源于水稻的PACl (Panicle ArchitectureControl I)蛋白的新用途。本发明所提供的新用途为来源于水稻的PACl蛋白在调控水稻穗型性状中的应用，具体为由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质在调控水稻穗型性状中的应用。PACl蛋白在水稻中高表达，水稻穗型为散穗。本发明的另一个目的是提供一种培育具有散穗性状转基因水稻的方法。该方法包括如下步骤:将由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质的编码基因导入目的水稻中，得到表达所述编码基因的转基因水稻，所述转基因水稻与所述目的水稻相比穗型松散。所述蛋白质的编码基因(PACl)的编码区序列为序列表中序列I。其中， 序列I由1251个核苷酸组成；序列2由416个氨基酸组成。
所述蛋白质的编码基因PACl通过含有所述编码基因PACl的重组表达载体导入所述目的水稻中。所述重组表达载体为将所述编码基因PACl插入植物超表达载体中，得到的表达所述编码基因PACl的重组载体。所述重组表达载体中启动所述编码基因PACl转录的启动子可为Ubi组成型启动子。在本发明的一个实施例中，所述重组表达载体具体为将所述编码基因PACl插入植物表达载体PCAMBIA1301的多克隆位点Kpn I和Spe I之间，得到表达所述编码基因PACl的重组载体(PCAMBIA1301-PAC1)。通常情况下，所述目的水稻为穗型紧凑的水稻，如栽培稻中花17。本发明的另一 个目的是提供一种蛋白质，名称为PACl (Panicle ArchitectureControll),来源于水稻，为下述I)或2):I)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；2)将序列表中序列2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加，且具有调控水稻穗型功能的由I)衍生的蛋白质。编码上述PACl蛋白的基因(PAC1基因)也属于本发明的保护范围。所述PACl基因为如下I)或2)的DNA分子:I)编码序列是序列表中序列I的DNA分子；2)在严格条件下与上述I)所限定的DNA分子杂交，且编码所述PACl蛋白的DNA分子。实验证明，由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质能够使水稻穗型变得松散，利于提高异交结实率，进而提高杂交水稻制种产量。
图1为以云南元江野生稻为供体，栽培稻特青为受体构建得到染色体片段代换系YIL31的结果。其中，A为三种水稻的稻穗的表型，I为云南元江野生稻的稻穗表型(散穗)，2为栽培稻特青的稻穗的表型(紧穗)；3为染色体片段代换系YIL31的稻穗表型(散穗)。B为染色体片段代换系YIL31的基因型图示。图2为PACl基因的精细定位图。其中，A为利用渗入系群体的初步定位结果；B为利用2400个隐性单株对PACl基因进行的定位，目标基因PACl被定位在分子标记76.8和SP33之间大约26kb区间内。图3为实时定量PCR检测穗发育及抽穗时PACl基因在YIL31和特青中的表达量结果。其中，I表示抽穗前10天的检测结果；2表示抽穗当天的检测结果；3表示抽随后10天的检测结果。图4为T1代PACl转基因中花17主茎穗的表型。其中，A为T1转入pCAMBIA1301空载体的中花17(pCAMBIA1301/中花17)的主茎穗表型(紧穗)；B为T1转入pCAMBIA1301_PACl的中花17(pCAMBIA1301-PacI/中花17)的主茎穗表型(散穗)。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实施例1、PACl转基因水稻的获得一、重组表达载体pCAMBIAl301-PACl的构建1、PAC1基因的发现首先构建了以野生稻品系元江普通野生稻为供体，优良栽培稻品种特青为受体的染色体片段代换系。利用该群体定位到4号染色体上的一个位点控制野生稻的散穗(PAC1，panicle architecture control I)性状。然后从中选取编号为HL31 (图1)的具有散穗性状的染色体片段代换系与特青回交构建分离群体，利用含有2400个隐性单株的群体对PACl基因进行精细定位。最终将控制散穗的突变位点定位到26kb的区间(图2)。对该区域内的染色体片段代换系YIL31和特青基因组测序，并与日本晴基因组序列(NC_008397.2)进行序列比对。结果发现，该区域内有一个注释基因0.sSPL8 (L0C_0s04g56170)。利用实时定量PCR检测穗发育及抽穗时0.sSPL8基因在YIL31和特青中的表达，结果发现0.sSPL8基因在穗一次枝梗基部的表达差异明显(图3)，散穗渗入系中的表达量约是栽培稻的3倍，因此将0.sSPL8基因作为控制散穗的候选基因。2、PACl基因的获得取新鲜的野生稻品种云南元江的叶片,剪碎,用液氮研磨成粉状,利用Qiagene公司RNA提取试剂盒获得野生稻云南元江的总RNA,利用Takala公司的反转录试剂盒反转录后得到cDNA，进而用下述引物进行PCR扩增得到上述注释基因0.sSPL8的野生稻等位基因。以上述得到的cDNA为模板，以引物SBP-seF:5’ -RRtaccatRatRaacRttccatc-3’ (下划线处为Kpn I的酶切位点序列,其后的序列对应序列表中序列 I 的第 1-1了位)和 SBP-seR:5，actagtgatcgaagtcgagatc—3，(下划线处为 SpeI的酶切位点序列，其后的序列对应序列表中序列I的第1230-1251位)进行PCR扩增，得到从野生稻中扩增上述注释基因0.sSPL8的野生稻等位基因，对该基因序列进行测序后发现其序列不同于0.sSPL8 (L0C_0s04g56170)。将此序列所示基因命名为PACl基因，其序列如序列表中序列I所不。PACl基因(序列I)编码的蛋白为序列表中序列2所不蛋白，其序列也不同于0.sSPL8 (L0C_0s04g56170)编码蛋白的氨基酸序列。3、重组表达载体pCAMBIA1301-PACl的构建将上述步骤2获得的PACl基因，用Kpn I和Spe I双酶切，并回收酶切片段，将其与经同样双酶切得到的植物表达载体pCAMBIA1301 (Tan Lubin,Xianran Li, Liu Fengxia,Sun Xianyou, Li Chenggang, Zhu Zuofeng, Fu Yongcai， Cai Hongwei， Wang Xiangkun,Xie Daoxin, Sun Chuanqing氺.Control of a key transition from prostrate to erectgrowth in rice domestication.Nature Genetics，2008，40 (11):1360_1364)的骨架片段(大片段)相连，得到重组质粒，对其进行酶切和测序鉴定，证实含有大小为1251bp的PACl基因的阳性重组质粒命名为PCAMBIA1301-PAC1。在pCAMBIA1301_PACl中，PACl基因位于Ubi组成型启动子下游。二、PACl转基因水稻的获得将上述步骤一获得的重组表达载体pCAMBIA1301-PACl利用农杆菌LB4404转化粳稻品种中花 17 (紧穗)(Hiei Y, Ohta S, Komari T & Kumashiro T.Efficienttransformation of rice (Oryza sativa L.)mediated by Agrobacterium and sequenceanalysis of the boundaries of the T-DNA.Plant J.1994,6:271_282)的成熟胚愈伤组织，经预分化、分化得到转基因植株。转基因植株在含有潮霉素的培养基上萌发，筛选到的抗性苗再通过分子生物学实验方法鉴定确认。转基因水稻中花17阳性植株的鉴定:从上述表现出潮霉素抗性的Ttl代转基因水稻中花17的新鲜叶片中提取微量总DNA。采用PCR扩增潮霉素抗性基因(HYG)片段，检测阳性转基因植株。潮霉素抗性基因(HYG)检测引物为:HYG-F:5/ -TACTTCTACACAGCCATC-3'HYG-R 5' -CGTCTGTCGAGAAGTTTC-3'。扩增产物为947bp。将经上述鉴 定证实转入重组表达载体pCAMBIAl301-PACl的Ttl代阳性水稻中花17植株命名为pCAMBIAl301-PacI/中花17。同时将转pCAMBIAl301空载体的转基因水稻中花17 命名为 pCAMBIAl301/ 中花 17。转入重组表达载体pCAMBIAl301-PACl的Ttl代阳性水稻中花17 (pCAMBIAl301-PacI/中花17)自交后得到T1代植株，经上述鉴定方法鉴定阳性的T1代PACl转基因水稻中花17 (pCAMBIAl301-PACl/中花17)的穗型如图4中A所示，为很明显的散穗表型；而转入PCAMBIA1301空载体的转基因水稻中花17 (pCAMBIAl301/中花17)的穗型如图4中B所示，与未转基因的中花17穗型一致，为很明显的紧穗表型。这表明，PACl基因在植物体中的高效表达能够改变水稻植株的穗型，可以使水稻中花17的穗型由紧凑变松散。
权利要求
1.由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质在调控水稻穗型性状中的应用。
2.一种培育具有散穗性状转基因水稻的方法，包括如下步骤:将由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质的编码基因导入目的水稻中，得到表达所述编码基因的转基因水稻 ，所述转基因水稻与所述目的水稻相比穗型松散。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于:所述蛋白质的编码基因的编码区序列为序列表中序列I。
4.根据权利要求2或3所述的方法，其特征在于:所述蛋白质的编码基因通过含有所述编码基因的重组表达载体导入所述目的水稻中。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于:所述重组表达载体为将所述编码基因插入植物表达载体中，得到的表达所述编码基因的重组载体。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于:所述重组表达载体中启动所述编码基因转录的启动子是Ubi组成型启动子。
7.蛋白质，为下述I)或2): 1)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质； 2)将序列表中序列2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添力口，且具有调控水稻穗型功能的由I)衍生的蛋白质。
8.编码权利要求7所述蛋白质的基因。
9.根据权利要求8所述的基因，其特征在于:所述基因为如下I)或2)的DNA分子: 1)编码序列是序列表中序列I的DNA分子； 2)在严格条件下与上述I)所限定的DNA分子杂交，且编码权利要求7所述蛋白质的DNA分子。
全文摘要
本发明公开了一种来源于普通野生稻的调控水稻穗型的基因PAC1及其蛋白，以及在水稻穗型调控中的应用。本发明所提供的应用具体为由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质在调控水稻穗型性状中的应用。本发明还涉及一种培育具有散穗性状转基因水稻的方法，该包括如下步骤将由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质的编码基因导入目的水稻中，得到所述编码基因超表达的转基因水稻，所述转基因水稻与所述目的水稻相比穗型松散。实验证明，由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质能够使水稻穗型变得松散，利于提高异交结实率，进而提高杂交水稻制种产量。
文档编号C07K14/415GK103215303SQ20121004664
公开日2013年7月24日 申请日期2012年2月27日 优先权日2012年2月27日
发明者朱作峰, 孙传清, 付永彩, 李显然, 谭禄宾, 刘凤霞 申请人:中国农业大学