专利名称：Ⅰ型人胶原蛋白和表皮生长因子双表达载体及其表达纯化方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，具体涉及到同时表达两种蛋白的重组载体。
背景技术：
胶原蛋白(collagen)是广泛分布于动物结缔组织的一组蛋白质家族,也是体内含量最多的一种蛋白质，约占蛋白质总量的25% 33%，其对维护细胞、组织、器官的正常生理功能和损伤修复有重要作用。胶原蛋白作为天然的生物资源，具有合成高分子材料无法比拟的生物相容性和生物可降解性，可广泛应用在医药、化妆品等工业中。目前，胶原蛋白已经成功地在多种宿主细胞中得到表达，包括哺乳动物细胞、昆虫细胞、酵母、大肠杆菌、转基因烟草、小鼠和蚕等，尤其在毕赤酵母中胶原蛋白有极高的分泌表达特性，最高达14. 8g/L。 本公司2011年研究表明I型与III型胶原蛋白在毕赤酵母中融合表达，表达量达10g/L以上，并成功申报专利，专利申请号为201010527766. 7。表皮生长因子(epidermal growth factor, EGF)是在1962年由Cohen从小鼠颌下腺分离得到，人表皮生长因子又称抑胃素，是存在于人体内的一种具有广泛的生物学功能的多肽生长因子，且具有难透析、耐热、不被胰蛋白酶、糜蛋白酶和胃蛋白酶消化的理化特性。表皮生长因子是由53个氨基酸组成的单链多肽，活性中心位于48-53个氨基酸残基之间，一级结构不含丙氨酸、苯丙氨酸和赖氨酸，二级结构排列紧秘，稳定性强，相对分子量为604 a，等电点PI为4. 6，含3个链内二硫键，二硫键为其生物活性所必需。表皮生长因子具有促有丝分裂和非促有丝分裂二重活性，能刺激外胚层、中胚层和内胚层细胞增殖和分化，促进组织生长、发育和成熟。表皮细胞上有丰富的表皮生长因子受体(EGFR)，表皮生长因子与细胞膜上的受体结合后，通过受体的自磷酸化，激活蛋白G和磷酸脂酶C等一系列生化反应，改变细胞内的钙离子浓度，从而向核内传递增殖信号，诱导核内基因表达加强，促进糖酵解及蛋白质、RNA和DNA的合成，从而促使细胞分裂和增殖。实验研究表明，外源性表皮生长因子对多种组织来源的上皮及表皮细胞有较强的促有丝分裂活性。表皮生长因子能刺激角膜上皮和内皮增殖，促进角膜内皮细胞迁移、滴眼给药可明显加快角膜创伤的愈合。表皮生长因子也能刺激皮肤表皮细胞、成纤维细胞、血管内皮细胞、血管平滑肌细胞等的增殖，促进各种皮肤创伤的愈合和修复，加速移植皮肤的生长和愈合。表皮生长因子还能抑制胃酸分泌，促进胃、十二指肠溃疡的愈合，防治胃溃疡及胃酸分泌过多症。随着对表皮生长因子研究的不断深入和在临床上应用的日益广泛，市场对表皮生长因子的需求量越来越高，目前，最适合大规模生产表皮生长因子的方法是利用基因重组技术转化大肠杆菌、酵母等，但由于生产困难及产量较低使表皮生长因子的价格居高不下，1992年，中科院上海生化所构建E. coli碱性磷酸酶启动子及信号肽序列表皮生长因子基因的pAE-8质粒，转化该酶缺失的E. coli变异株K539，得表达菌株EEB，表皮生长因子产量I. 5mg/L ; 1993年，人们利用OmpA构建出了 pETacECF质粒，使表皮生长因子分泌至胞外，最高产量可达300mg/L和391mg/L。
发明内容
本发明所要解决的一个技术问题在于克服上述基因重组人表皮生长因子表达量低的缺点，提供一种I型人胶原蛋白和表皮生长因子双表达载体。本发明所要解决的另一个技术问题在于提供一种简单、有效的I型人胶原蛋白和表皮生长因子双表达载体的构建方法。解决上述技术问题采用的技术方案是该I型人胶原蛋白和表皮生长因子双表达载体插入的外源序列氮端为I型人胶原蛋白的600个氨基酸，碳端为表皮生长因子的53个氨基酸，在I型人胶原蛋白上游添加PPIC9K载体自身a信号肽切割位点和用于连接载体的亮氨酸和谷氨酸，在表皮生长因子上游添加PPIC9K载体自身a信号肽切割位点和用于连接I型人胶原蛋白的谷氨酸和苯丙氨酸，该I型人胶原蛋白和表皮生长因子双表达载体的氨基酸序列如下I LEKREAGVAG PKGPAGERGS PGPAGPKGSP GEAGRPGEAG LPGAKGLTGS PGSPGPDGKT61 GPPGPAGQDG RPGPPGPPGA RGQAGVMGFP GPKGAAGEPG KAGERGVPGP PGAVGPAGKD121 GEAGAQGPPG PAGPAGERGE QGPAGSPGFQ GLPGPAGPPG EAGKPGEQGV P⑶LGAPGPS181 GARGERGFPG ERGVQGPPGP AGPRGANGAP GNDGAKGDAG APGAPGSQGA PGLQGMPGER241 GAAGLPGPKG DRGDAGPKGA DGSPGKDGVR GLTGPIGPPG PAGAP⑶KGE SGPSGPAGPT301 GARGAP⑶RG EPGPPGPAGF AGPPGADGQP GAKGEPGDAG AKGDAGPPGP AGPAGPPGPI361 GNVGAPGAKG ARGSAGPPGA TGFPGAAGRV GPPGPSGNAG PPGPPGPAGK EGGKGPRGET421 GPAGRPGEVG PPGPPGPAGE KGSPGADGPA GAPGTPGPQG IAGQRGVVGL PGQRGERGFP481 GLPGPSGEPG KQGPSGASGE RGPPGPMGPP GLAGPPGESG REGAPGAEGS PGRDGSPGAK541 ⑶RGETGPAG PPGAPGAPGA PGPVGPAGKS ⑶RGETGPAG PAGPVGPVGA RGPAGPQGPR601 GDKGETEFKR EANSDSECPL SHDGYCLHDG VCMYIEALDK YACNCVVGYI GERCQYRDLK661 WffELR本发明的pPIC9K载体自身a信号肽切割位点氨基酸序列为LyS-Arg-Glu_Ala。本发明的表皮生长因子的核苷酸序列为I AATTCTGATT CTGAATGTCC TTTGTCCCAC GATGGTTACT GCTTGCATGA TGGTGTCTGC61 ATGTATATTG AAGCATTGGA TAAGTATGCT TGTAACTGTG TTGTTGGCTA CATCGGTGAG121 AGATGTCAGT ACAGAGACTT GAAGTGGTGG GAATTGAGAT AA上述的I型人胶原蛋白和表皮生长因子双表达载体的表达纯化方法由下述步骤组成I、基因的获得从离体的人胎盘中提取总RNA，反转录获得cDNA，设计I型人胶原蛋白(COLl)基因PCR扩增引物，引入限制性酶切位点Xho I ,EcoR I和pPIC9K载体自身a信号肽切割位点序列AAACGAGAAGCT，引物序列为F: CGCTCGAGAAACGAGAAGCTGGTGTTGCTGGTCCCA、
R: CGGAATTCTGTCTCACCCTTGTCACCACG采用PCR方法扩增获得I型人胶原蛋白基因。
重新设计并合成表皮生长因子核苷酸序列，添加限制性内切酶酶切位点EcoR I、Not I和pPIC9K载体自身a信号肽切割位点序列AAACGAGAAGCT，表皮生长因子(EGF)核苷酸序列如下I GAATTCAAAC GAGAAGCTAA TTCTGATTCT GAATGTCCTT TGTCCCACGA TGGTTACTGC61 TTGCATGATG GTGTCTGCAT GTATATTGAA GCATTGGATA AGTATGCTTG TAACTGTGTT121 GTTGGCTACA TCGGTGAGAG ATGTCAGTAC AGAGACTTGA AGTGGTGGGA ATTGAGATAA181 GCGGCCGC2、载体pPIC9K与I型人胶原蛋白、表皮生长因子的连接对pPIC9K及I型人胶原蛋白进行Xho I和EcoR I双酶切，回收酶切产物，用DNA 连接酶连接，并转化大肠杆菌，提取质粒，命名为PPIC9K-C0L1 ;对pPIC9K-C0Ll质粒与表皮生长因子分别进行EcoR I及Not I双酶切，回收酶切产物，用DNA连接酶连接，转化大肠杆菌，提取质粒，命名为pPIC9K-C0Ll-EGF。pPIC9K载体购置于Invitrogen公司。该重组DNA序列如下I CTCGAGMAC GAGAAGCTGG TGTTGCTGGT CCCAAGGGTC CCGCTGGTGA ACGTGGTTCT61 CCTGGCCCTG CTGGCCCCAA AGGATCTCCT GGTGMGCTG GTCGTCCCGG TGAAGCTGGT121 CTGCCTGGTG CCAAGGGTCT GACTGGAAGC CCTGGCAGCC CTGGTCCTGA TGGCAAMCT181 GGCCCCCCTG GTCCCGCCGG TCAAGATGGT CGCCCCGGAC CCCCAGGCCC ACCTGGTGCC241 CGTGGTCAGG CTGGTGTGAT GGGATTCCCT GGACCTAAAG GTGCTGCTGG AGAGCCCGGC301 AAGGCTGGAG AGCGAGGTGT TCCCGGACCC CCTGGCGCTG TCGGTCCTGC TGGCAAAGAT361 GGAGAGGCTG GAGCTCAGGG ACCCCCTGGC CCTGCTGGTC CCGCTGGCGA GAGAGGTGM421 CMGGCCCTG CTGGCTCCCC CGGATTCCAG GGTCTCCCTG GTCCTGCTGG TCCTCCAGGT481 GMGCAGGCA MCCTGGTGA ACAGGGTGTT CCTGGAGACC TTGGCGCCCC TGGCCCCTCT541 GGAGCAAGAG GCGAGAGAGG TTTCCCTGGC GAGCGTGGTG TGCAAGGTCC CCCTGGTCCT601 GCTGGTCCCC GAGGGGCCAA CGGTGCTCCC GGCAACGATG GTGCTAAGGG TGATGCTGGT661 GCCCCTGGAG CTCCCGGTAG CCAGGGCGCC CCTGGCCTTC AGGGMTGCC TGGTGAACGT721 GGTGCAGCTG GTCTTCCAGG GCCTAAGGGT GACAGAGGTG ATGCTGGTCC CAAAGGTGCT781 GATGGCTCTC CTGGCAMGA TGGCGTCCGT GGTCTGACTG GCCCCATTGG TCCTCCTGGC841 CCTGCTGGTG CCCCTGGTGA CAAGGGTGAA AGTGGTCCCA GCGGCCCTGC TGGTCCCACT901 GGAGCTCGTG GTGCCCCCGG AGACCGTGGT GAGCCTGGTC CCCCCGGCCC TGCTGGCTTT961 GCTGGCCCCC CTGGTGCTGA CGGCCMCCT GGTGCTAAAG GCGAACCTGG TGATGCTGGT1021 GCTAAAGGCG ATGCTGGTCC CCCTGGCCCT GCCGGACCCG CTGGACCCCC TGGCCCCATT1081 GGTAATGTTG GTGCTCCTGG AGCCAAAGGT GCTCGCGGCA GCGCTGGTCC CCCTGGTGCT1141 ACTGGTTTCC CTGGTGCTGC TGGCCGAGTC GGTCCTCCTG GCCCCTCTGG AAATGCTGGA1201 CCCCCTGGCC CTCCTGGTCC TGCTGGCAAA GAAGGCGGCA AAGGTCCCCG TGGTGAGACT1261 GGCCCTGCTG GACGTCCTGG TGAAGTTGGT CCCCCTGGTC CCCCTGGCCC TGCTGGCGAG1321 AMGGATCCC CTGGTGCTGA TGGTCCTGCT GGTGCTCCTG GTACTCCCGG GCCTCAAGGT1381 ATTGCTGGAC AGCGTGGTGT GGTCGGCCTG CCTGGTCAGA GAGGAGAGAG AGGCTTCCCT1441 GGTCTTCCTG GCCCCTCTGG TGAACCTGGC AAACMGGTC CCTCTGGAGC AAGTGGTGM1501 CGTGGTCCCC CTGGTCCCAT GGGCCCCCCT GGATTGGCTG GACCCCCTGG TGAATCTGGA
1561 CGTGAGGGGG CTCCTGGTGC CGAAGGTTCC CCTGGACGAG ACGGTTCTCC TGGCGCCAAG1621 GGTGACCGTG GTGAGACCGG CCCCGCTGGA CCCCCTGGTG CTCCTGGTGC TCCTGGTGCC1681 CCTGGCCCCG TTGGCCCTGC TGGCAAGAGT GGTGATCGTG GTGAGACTGG TCCTGCTGGT1741 CCCGCCGGTC CTGTCGGCCC TGTTGGCGCC CGTGGCCCCG CCGGACCCCA AGGCCCCCGT1801 GGTGACMGG GTGAGACAGA ATTCAMCGA GAAGCTAATT CTGATTCTGA ATGTCCTTTG1861 TCCCACGATG GTTACTGCTT GCATGATGGT GTCTGCATGT ATATTGAAGC ATTGGATAAG1921 TATGCTTGTA ACTGTGTTGT TGGCTACATC GGTGAGAGAT GTCAGTACAG AGACTTGAAG1981 TGGTGGGAAT TGAGATAAGC GGCCGC3、毕赤酵母电转化将10 ii g经Sal I内切酶线性化的PPIC9K-C0L1-EGF质粒，与80 ii L毕赤酵母GS115感受态细胞混匀，转至0. 2cm冰预冷的电转化杯中，电击4 10毫秒，加入ImL冰预冷的lmol/L的山梨醇溶液将菌体混匀，涂布MD培养基平板，30 1倒置培养2 3天，在MD培养基平板上长出菌落。毕赤酵母GS115购买于西安依科西安依科生物技术有限公司。4、多拷贝插入重组子的筛选将MD培养基平板上长出的菌落用无菌牙签对应接种到G418浓度分别为0. 5g/L、lg/L、2g/L、3g/L、4g/L、5g/L的YPD平板上，30°C培养，筛选获得转化子，G418购买于西安依科生物技术有限公司。5、I型人胶原蛋白和表皮生长因子的发酵表达将筛选到的转化子接种于400ml BMGY培养基中，30 1振荡培养24小时，作为一级种子转接于装有4L FBS培养基的5L发酵罐中，温度设定为30 °C，pH值为5.0，培养16 20小时，作为二级种子转接入装有FBS培养基的150L大罐发酵，生长温度30°C，诱导温度29°C，pH值为5. 5，溶氧控制在20% 30%，流加质量浓度为75%的含12 mL/L PTMl微量元素的甲醇水溶液，FBS培养基与质量浓度为75%的含12 mL/L PTMl微量元素的甲醇水溶液的体积比为1:0. 25，诱导发酵36 42小时。在发酵分泌表达出胞外的过程中，切割a信号肽切割位点，切割出I型人胶原蛋白、表皮生长因子两种蛋白。6、I型人胶原蛋白和表皮生长因子的纯化发酵结束后，发酵液离心分离，取上清液，用孔径为0. I 中空纤维微滤系统进行微滤，收集滤过液，用分子量为1000D的卷式超滤膜超滤，收集浓缩液，获得表皮生长因子与I型人胶原蛋白混合浓缩液，用分子筛层析分离，分别收集表皮生长因子与I型人胶原蛋白，获得表皮生长因子粗蛋白液及I型人胶原蛋白粗蛋白液；表皮生长因子粗蛋白液用阴离子交换层析，获得表皮生长因子；I型人胶原蛋白粗蛋白液，用阳离子交换层析，获得I型人胶原蛋白。6、I型人胶原蛋白和表皮生长因子进行检测鉴定将发酵液上清及纯化后的I型人胶原蛋白和表皮生长因子使用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳检测方法进行检测，用Western Blot蛋白免疫印迹法进行鉴定。本发明的技术优点 I、本发明采用I型人胶原蛋白在毕赤酵母中的高表达特性，引导表皮生长因子产生高表达，同时引入PPIC9K载体自身a信号肽切割位点，在分泌表达过程中切割获得两种单体蛋白，建产一种外源蛋白与胶原蛋白毕赤酵母双表达体系，丰富和增强人类通过基因工程技术表达、纯化重组目标产物的手段和能力。2、本发明采用的宿主菌是毕赤酵母，毕赤酵母为单细胞真核生物，生长快，易于分子遗传操作，同时毕赤酵母的醇氧化酶基因的启动子具有强诱导性和强启动性，适于外源基因的高水平表达。
图I是实施例I中重组双表达载体PPIC9K-C0L1-EGF的质粒图谱；图2是实施例中I型人胶原蛋白基因的PCR产物电泳图；图3是实施例中pPIC9K-C0Ll-EGF质粒双酶切鉴定电泳图； 图4是实施例中双表达融合蛋白的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳5是实施例中I型人胶原蛋白的Western Blot鉴定6是实施例中表皮生长因子的Western Blot鉴定图
具体实施例方式下面结合附图和实施例对本发明进一步详细说明，但本发明不限于这些实施例。实施例I本实施例的I型人胶原蛋白和表皮生长因子双表达载体插入外源序列的氮端为I型人胶原蛋白的600个氨基酸，碳端为表皮生长因子的53个氨基酸，该表皮生长因子的核苷酸序列如下I AATTCTGATT CTGAATGTCC TTTGTCCCAC GATGGTTACT GCTTGCATGA TGGTGTCTGC61 ATGTATATTG AAGCATTGGA TAAGTATGCT TGTAACTGTG TTGTTGGCTA CATCGGTGAG121 AGATGTCAGT ACAGAGACTT GAAGTGGTGG GAATTGAGAT AA在I型人胶原蛋白上游添加氨基酸序列为Lys-Arg-Glu-Ala以及用于连接载体的亮氨酸和谷氨酸，在表皮生长因子上游添加氨基酸序列为Lys-Arg-Glu-Ala以及用于连接I型人胶原蛋白的谷氨酸和苯丙氨酸，该I型人胶原蛋白-表皮生长因子的氨基酸序列如下I LEKREAGVAG PKGPAGERGS PGPAGPKGSP GEAGRPGEAG LPGAKGLTGS PGSPGPDGKT61 GPPGPAGQDG RPGPPGPPGA RGQAGVMGFP GPKGAAGEPG KAGERGVPGP PGAVGPAGKD121 GEAGAQGPPG PAGPAGERGE QGPAGSPGFQ GLPGPAGPPG EAGKPGEQGV P⑶LGAPGPS181 GARGERGFPG ERGVQGPPGP AGPRGANGAP GNDGAKGDAG APGAPGSQGA PGLQGMPGER241 GAAGLPGPKG DRGDAGPKGA DGSPGKDGVR GLTGPIGPPG PAGAPGDKGE SGPSGPAGPT301 GARGAPGDRG EPGPPGPAGF AGPPGADGQP GAKGEPGDAG AKGDAGPPGP AGPAGPPGPI361 GNVGAPGAKG ARGSAGPPGA TGFPGAAGRV GPPGPSGNAG PPGPPGPAGK EGGKGPRGET421 GPAGRPGEVG PPGPPGPAGE KGSPGADGPA GAPGTPGPQG IAGQRGVVGL PGQRGERGFP481 GLPGPSGEPG KQGPSGASGE RGPPGPMGPP GLAGPPGESG REGAPGAEGS PGRDGSPGAK541 ⑶RGETGPAG PPGAPGAPGA PGPVGPAGKS ⑶RGETGPAG PAGPVGPVGA RGPAGPQGPR601 GDKGETEFKR EANSDSECPL SHDGYCLHDG VCMYIEALDK YACNCVVGYI GERCQYRDLK661 WffELR上述的I型人胶原蛋白和表皮生长因子双表达载体的表达纯化方法由下述步骤组成I、基因的犾得从离体的人胎盘中提取总RNA,米用GeneCopoeiaFirst-Strand cDNA synthesisKit试剂盒按说明书的使用方法进行反转录,获得cDNA, GeneCopoeia First-Strand cDNAsynthesis Kit试剂盒由西安依科生物技术有限公司销售。设计I型人胶原蛋白(COLl)基因PCR扩增引物，引入限制性酶切位点Xho I ,EcoR I、pPIC9K载体自身a信号肽切割位点序列AAACGAGAAGCT，引物序列为 F: CGCTCGAGAAACGAGAAGCTGGTGTTGCTGGTCCCAR: CGGAATTCTGTCTCACCCTTGTCACCACG采用PCR方法扩增获得I型人胶原蛋白基因25 ii L反应体系中含有13. 3 ii L灭菌的二次蒸馏水、2. 5 ii L IOXPCR buffer, 3. 5 ii L 2 m mol/L dNTP Mix,2. 5u L MgCl2,IuL 10 u mol/L Primer F, I u L 10 u mol/L Primer R, 0. 2 u L 0. 5 U/ u L Taq 酶，I u LcDNA 模板；95 °C 5 分钟，94 V 30 秒，56°C 30 秒，72 V 60 秒，30 个循环，72 V 10 分钟，4 V 10分钟，利用PCR仪进行扩增，获得I型人胶原蛋白基因，I型人胶原蛋白的PCR扩增结果见图2，基因序列如下I CTCGAGMAC GAGAAGCTGG TGTTGCTGGT CCCAAGGGTC CCGCTGGTGA ACGTGGTTCT61 CCTGGCCCTG CTGGCCCCAA AGGATCTCCT GGTGMGCTG GTCGTCCCGG TGAAGCTGGT121 CTGCCTGGTG CCAAGGGTCT GACTGGAAGC CCTGGCAGCC CTGGTCCTGA TGGCAAAACT181 GGCCCCCCTG GTCCCGCCGG TCAAGATGGT CGCCCCGGAC CCCCAGGCCC ACCTGGTGCC241 CGTGGTCAGG CTGGTGTGAT GGGATTCCCT GGACCTAAAG GTGCTGCTGG AGAGCCCGGC301 AAGGCTGGAG AGCGAGGTGT TCCCGGACCC CCTGGCGCTG TCGGTCCTGC TGGCAAAGAT361 GGAGAGGCTG GAGCTCAGGG ACCCCCTGGC CCTGCTGGTC CCGCTGGCGA GAGAGGTGM421 CMGGCCCTG CTGGCTCCCC CGGATTCCAG GGTCTCCCTG GTCCTGCTGG TCCTCCAGGT481 GMGCAGGCA MCCTGGTGA ACAGGGTGTT CCTGGAGACC TTGGCGCCCC TGGCCCCTCT541 GGAGCAAGAG GCGAGAGAGG TTTCCCTGGC GAGCGTGGTG TGCAAGGTCC CCCTGGTCCT601 GCTGGTCCCC GAGGGGCCAA CGGTGCTCCC GGCAACGATG GTGCTAAGGG TGATGCTGGT661 GCCCCTGGAG CTCCCGGTAG CCAGGGCGCC CCTGGCCTTC AGGGMTGCC TGGTGAACGT721 GGTGCAGCTG GTCTTCCAGG GCCTAAGGGT GACAGAGGTG ATGCTGGTCC CAAAGGTGCT781 GATGGCTCTC CTGGCAMGA TGGCGTCCGT GGTCTGACTG GCCCCATTGG TCCTCCTGGC841 CCTGCTGGTG CCCCTGGTGA CAAGGGTGAA AGTGGTCCCA GCGGCCCTGC TGGTCCCACT901 GGAGCTCGTG GTGCCCCCGG AGACCGTGGT GAGCCTGGTC CCCCCGGCCC TGCTGGCTTT961 GCTGGCCCCC CTGGTGCTGA CGGCCMCCT GGTGCTAAAG GCGAACCTGG TGATGCTGGT1021 GCTAAAGGCG ATGCTGGTCC CCCTGGCCCT GCCGGACCCG CTGGACCCCC TGGCCCCATT1081 GGTAATGTTG GTGCTCCTGG AGCCAAAGGT GCTCGCGGCA GCGCTGGTCC CCCTGGTGCT1141 ACTGGTTTCC CTGGTGCTGC TGGCCGAGTC GGTCCTCCTG GCCCCTCTGG AAATGCTGGA1201 CCCCCTGGCC CTCCTGGTCC TGCTGGCAAA GAAGGCGGCA AAGGTCCCCG TGGTGAGACT1261 GGCCCTGCTG GACGTCCTGG TGAAGTTGGT CCCCCTGGTC CCCCTGGCCC TGCTGGCGAG1321 AMGGATCCC CTGGTGCTGA TGGTCCTGCT GGTGCTCCTG GTACTCCCGG GCCTCAAGGT1381 ATTGCTGGAC AGCGTGGTGT GGTCGGCCTG CCTGGTCAGA GAGGAGAGAG AGGCTTCCCT
1441 GGTCTTCCTG GCCCCTCTGG TGAACCTGGC AAACMGGTC CCTCTGGAGC AAGTGGTGM1501 CGTGGTCCCC CTGGTCCCAT GGGCCCCCCT GGATTGGCTG GACCCCCTGG TGAATCTGGA1561 CGTGAGGGGG CTCCTGGTGC CGAAGGTTCC CCTGGACGAG ACGGTTCTCC TGGCGCCAAG1621 GGTGACCGTG GTGAGACCGG CCCCGCTGGA CCCCCTGGTG CTCCTGGTGC TCCTGGTGCC1681 CCTGGCCCCG TTGGCCCTGC TGGCAAGAGT GGTGATCGTG GTGAGACTGG TCCTGCTGGT1741 CCCGCCGGTC CTGTCGGCCC TGTTGGCGCC CGTGGCCCCG CCGGACCCCA AGGCCCCCGT1801 GGTGACAAGG GTGAGACAGA ATTC
根据毕赤酵母密码子偏好性，重新设计表皮生长因子的核苷酸序列，并由生工生物工程(上海)有限公司全基因合成表皮生长因子，同时添加限制性内切酶酶切位点EcoRI及Not I和pPIC9K载体自身a信号肽切割位点序列AAACGAGAAGCT，表皮生长因子(EGF)核苷酸序列如下I GAATTCAAAC GAGAAGCTAA TTCTGATTCT GAATGTCCTT TGTCCCACGA TGGTTACTGC61 TTGCATGATG GTGTCTGCAT GTATATTGAA GCATTGGATA AGTATGCTTG TAACTGTGTT121 GTTGGCTACA TCGGTGAGAG ATGTCAGTAC AGAGACTTGA AGTGGTGGGA ATTGAGATAA181 GCGGCCGC2、载体pPIC9K与I型人胶原蛋白、表皮生长因子的连接对pPIC9K及I型人胶原蛋白进行Xho I和EcoR I双酶切，回收酶切产物，用DNA连接酶连接，并转化大肠杆菌，提取质粒，命名为PPIC9K-C0L1 ;对pPIC9K-C0Ll质粒与表皮生长因子分别进行EcoR I及Not I双酶切，回收酶切产物，用DNA连接酶连接，转化大肠杆菌，提取质粒，命名为PPIC9K-C0L1-EGF。(I)载体pPIC9K及I型人胶原蛋白的双酶切对pPIC9K及I型人胶原蛋白PCR产物用Xho I和EcoR I内切酶进行双酶切，pPIC9K购置于Invitrogen公司。双酶切体系如下
一次蒸if水150 p L
IOXburfer20 P L-
pPIC9K(200ng/pL)20 P L,,
Xho I5 P L
EcoR I5 P- L
总体系200 P L
:次蒸馏水MOyi,
r n IOXbuffer20 P L
CO!,! (laOng/P L)30 P L
Xho I5pL
EcoR I5 p L总体系 )0pL
上述试剂加好后，混匀，37°C水浴消化2小时，用DNA纯化试剂盒，按产品说明书，从质量百分浓度为I. 5%的琼脂糖凝胶上回收特异性条带。(2)载体pPIC9K与I型人胶原蛋白的连接利用T4 DNA连接酶对pPIC9K与COLl进行连接，反应体系如下
权利要求
1.一种I型人胶原蛋白和表皮生长因子双表达载体，其特征在于插入的外源序列氮端为I型人胶原蛋白的600个氨基酸，碳端为表皮生长因子的53个氨基酸，在I型人胶原蛋白上游添加PPIC9K载体自身a信号肽切割位点和用于连接载体的亮氨酸和谷氨酸，在表皮生长因子上游添加PPIC9K载体自身a信号肽切割位点以及用于连接I型人胶原蛋白的谷氨酸和苯丙氨酸，该I型人胶原蛋白-表皮生长因子的氨基酸序列如下 ILEKREAGVAG PKGPAGERGS PGPAGPKGSP GEAGRPGEAG LPGAKGLTGS PGSPGPDGKT 61GPPGPAGQDG RPGPPGPPGA RGQAGVMGFP GPKGAAGEPG KAGERGVPGP PGAVGPAGKD 121 GEAGAQGPPG PAGPAGERGE QGPAGSPGFQ GLPGPAGPPG EAGKPGEQGV PGDLGAPGPS 181 GARGERGFPG ERGVQGPPGP AGPRGANGAP GNDGAKGDAG APGAPGSQGA PGLQGMPGER 241 GAAGLPGPKG DRGDAGPKGA DGSPGKDGVR GLTGPIGPPG PAGAPGDKGE SGPSGPAGPT 301 GARGAPGDRG EPGPPGPAGF AGPPGADGQP GAKGEPGDAG AKGDAGPPGP AGPAGPPGPI 361 GNVGAPGAKG ARGSAGPPGA TGFPGAAGRV GPPGPSGNAG PPGPPGPAGK EGGKGPRGET 421 GPAGRPGEVG PPGPPGPAGE KGSPGADGPA GAPGTPGPQG IAGQRGVVGL PGQRGERGFP 481 GLPG PSGEPG KQGPSGASGE RGPPGPMGPP GLAGPPGESG REGAPGAEGS PGRDGSPGAK 541 ⑶RGETGPAG PPGAPGAPGA PGPVGPAGKS ⑶RGETGPAG PAGPVGPVGA RGPAGPQGPR 601 GDKGETEFKR EANSDSECPL SHDGYCLHDG VCMYIEALDK YACNCVVGYI GERCQYRDLK 661 WffELR
2.根据权利要求I所述的I型人胶原蛋白和表皮生长因子双表达载体，其特征在于所述的PPIC9K载体自身a信号肽切割位点氨基酸序列为Lys-Arg-Glu-Ala。
3.根据权利要求I所述的I型人胶原蛋白和表皮生长因子双表达载体，其特征在于所述的表皮生长因子的核苷酸序列为 IAATTCTGATT CTGAATGTCC TTTGTCCCAC GATGGTTACT GCTTGCATGA TGGTGTCTGC 61 ATGTATATTG AAGCATTGGA TAAGTATGCT TGTAACTGTG TTGTTGGCTA CATCGGTGAG 121 AGATGTCAGT ACAGAGACTT GAAGTGGTGG GAATTGAGAT AA
4.一种权利要求I所述的I型人胶原蛋白和表皮生长因子双表达载体的表达纯化方法，其特征在于它包括下述步骤 (I)基因的获得 从离体的人胎盘中提取总RNA，反转录获得cDNA，设计I型人胶原蛋白基因PCR扩增引物，引入限制性酶切位点Xho I , EcoR I和PPIC9K载体自身a信号肽切割位点序列AAACGAGAAGCT，引物序列为F: CGCTCGAGAAACGAGAAGCTGGTGTTGCTGGTCCCAR: CGGAATTCTGTCTCACCCTTGTCACCACG采用PCR方法扩增获得I型人胶原蛋白基因； 重新设计并合成表皮生长因子的核苷酸序列，添加限制性内切酶酶切位点EcoR I及Not I和pPIC9K载体自身a信号肽切割位点序列AAACGAGAAGCT，表皮生长因子的核苷酸序列如下 IGAATTCMAC GAGAAGCTAA TTCTGATTCT GAATGTCCTT TGTCCCACGA TGGTTACTGC 、 61TTGCATGATG GTGTCTGCAT GTATATTGM GCATTGGATA AGTATGCTTG TMCTGTGTT 、 121 GTTGGCTACA TCGGTGAGAG ATGTCAGTAC AGAGACTTGA AGTGGTGGGA ATTGAGATAA、181GCGGCCGC (2)载体pPIC9K与I型人胶原蛋白、表皮生长因子的连接 对PPIC9K及I型人胶原蛋白进行Xho I和EcoR I双酶切，回收酶切产物，用DNA连接酶连接，并转化大肠杆菌，提取质粒，命名为PPIC9K-C0L1 ;对pPIC9K-C0Ll质粒与表皮生长因子分别进行EcoR I及Not I双酶切，回收酶切产物，用DNA连接酶连接，转化大肠杆菌，提取质粒，命名为PPIC9K-C0L1-EGF ； 该重组DNA序列如下 ICTCGAGAMC GAGAAGCTGG TGTTGCTGGT CCCAAGGGTC CCGCTGGTGA ACGTGGTTCT 61CCTGGCCCTG CTGGCCCCAA AGGATCTCCT GGTGMGCTG GTCGTCCCGG TGAAGCTGGT121CTGCCTGGTG CCAAGGGTCT GACTGGMGC CCTGGCAGCC CTGGTCCTGA TGGCMAACT 181GGCCCCCCTG GTCCCGCCGG TCAAGATGGT CGCCCCGGAC CCCCAGGCCC ACCTGGTGCC 241CGTGGTCAGG CTGGTGTGAT GGGATTCCCT GGACCTAAAG GTGCTGCTGG AGAGCCCGGC 301AAGGCTGGAG AGCGAGGTGT TCCCGGACCC CCTGGCGCTG TCGGTCCTGC TGGCAAAGAT 361GGAGAGGCTG GAGCTCAGGG ACCCCCTGGC CCTGCTGGTC CCGCTGGCGA GAGAGGTGAA 421CAAGGCCCTG CTGGCTCCCC CGGATTCCAG GGTCTCCCTG GTCCTGCTGG TCCTCCAGGT 481GAAGCAGGCA AACCTGGTGA ACAGGGTGTT CCTGGAGACC TTGGCGCCCC TGGCCCCTCT 541GGAGCAAGAG GCGAGAGAGG TTTCCCTGGC GAGCGTGGTG TGCAAGGTCC CCCTGGTCCT 601GCTGGTCCCC GAGGGGCCAA CGGTGCTCCC GGCAACGATG GTGCTAAGGG TGATGCTGGT 661GCCCCTGGAG CTCCCGGTAG CCAGGGCGCC CCTGGCCTTC AGGGAATGCC TGGTGAACGT 721GGTGCAGCTG GTCTTCCAGG GCCTAAGGGT GACAGAGGTG ATGCTGGTCC CMAGGTGCT 781GATGGCTCTC CTGGCMAGA TGGCGTCCGT GGTCTGACTG GCCCCATTGG TCCTCCTGGC 841CCTGCTGGTG CCCCTGGTGA CAAGGGTGAA AGTGGTCCCA GCGGCCCTGC TGGTCCCACT 901GGAGCTCGTG GTGCCCCCGG AGACCGTGGT GAGCCTGGTC CCCCCGGCCC TGCTGGCTTT 961GCTGGCCCCC CTGGTGCTGA CGGCCAACCT GGTGCTMAG GCGAACCTGG TGATGCTGGT1021GCTAAAGGCG ATGCTGGTCC CCCTGGCCCT GCCGGACCCG CTGGACCCCC TGGCCCCATT1081GGTAATGTTG GTGCTCCTGG AGCCMAGGT GCTCGC GGCA GCGCTGGTCC CCCTGGTGCT1141ACTGGTTTCC CTGGTGCTGC TGGCCGAGTC GGTCCTCCTG GCCCCTCTGG AAATGCTGGA1201CCCCCTGGCC CTCCTGGTCC TGCTGGCAAA GAAGGCGGCA AAGGTCCCCG TGGTGAGACT1261GGCCCTGCTG GACGTCCTGG TGAAGTTGGT CCCCCTGGTC CCCCTGGCCC TGCTGGCGAG1321AAAGGATCCC CTGGTGCTGA TGGTCCTGCT GGTGCTCCTG GTACTCCCGG GCCTCAAGGT1381ATTGCTGGAC AGCGTGGTGT GGTCGGCCTG CCTGGTCAGA GAGGAGAGAG AGGCTTCCCT1441GGTCTTCCTG GCCCCTCTGG TGAACCTGGC AAACAAGGTC CCTCTGGAGC AAGTGGTGAA1501CGTGGTCCCC CTGGTCCCAT GGGCCCCCCT GGATTGGCTG GACCCCCTGG TGAATCTGGA1561CGTGAGGGGG CTCCTGGTGC CGAAGGTTCC CCTGGACGAG ACGGTTCTCC TGGCGCCAAG1621GGTGACCGTG GTGAGACCGG CCCCGCTGGA CCCCCTGGTG CTCCTGGTGC TCCTGGTGCC 1681CCTGGCCCCG TTGGCCCTGC TGGCMGAGT GGTGATCGTG GTGAGACTGG TCCTGCTGGT 1741CCCGCCGGTC CTGTCGGCCC TGTTGGCGCC CGTGGCCCCG CCGGACCCCA AGGCCCCCGT 1801GGTGACMGG GTGAGACAGA ATTCAMCGA GAAGCTAATT CTGATTCTGA ATGTCCTTTG 1861TCCCACGATG GTTACTGCTT GCATGATGGT GTCTGCATGT ATATTGAAGC ATTGGATMG. 1921 TATGCTTGTA ACTGTGTTGT TGGCTACATC GGTGAGAGAT GTCAGTACAG AGACTTGAAG .1981 TGGTGGGAAT TGAGATAAGC GGCCGC (3)毕赤酵母电转化 将10 ii g经Sal I内切酶线性化的PPIC9K-COL1-EGF质粒，与80 y L毕赤酵母感受态细胞混匀，转至0. 2cm冰预冷的电转化杯中，电击4 10毫秒，加入ImL冰预冷的lmol/L的山梨醇溶液将菌体混匀，涂布MD培养基平板，30 1倒置培养2 3天，在MD培养基平板上长出菌落； (4)多拷贝插入重组子的筛选将MD培养基平板上长出的菌落用无菌牙签对应接种到G418浓度分别为0. 5g/L、lg/L、2g/L、3g/L、4g/L、5g/L的YPD平板上，30°C培养，筛选获得转化子；(5)I型人胶原蛋白-表皮生长因子的发酵表达 将筛选到的转化子接种于400ml BMGY培养基中，30 1振荡培养24小时，作为一级种子转接于装有4L FBS培养基的5L发酵罐中，温度设定为30 °C，pH值为5.0，培养16 .20小时，作为二级种子转接入装有FBS培养基的150L大罐发酵，生长温度30°C，诱导温度.29°C, pH值为5. 5，溶氧控制在20% 30%，流加质量浓度为75%的含12 mL/L PTMl微量元素的甲醇水溶液，FBS培养基与质量浓度为75%的含12 mL/L PTMl微量元素的甲醇水溶液的体积比为1:0. 25,诱导发酵36 42小时,在发酵分泌表达出胞外的过程中，切割a信号肽切割位点，切割出I型人胶原蛋白、表皮生长因子两种蛋白； (6)I型人胶原蛋白和表皮生长因子的纯化 发酵结束后，发酵液离心分离，取上清液，用孔径为0. I y m中空纤维微滤系统进行微滤，收集滤过液，用分子量为1000D的卷式超滤膜超滤，收集浓缩液，获得表皮生长因子与I型人胶原蛋白混合浓缩液，用分子筛层析分离，分别收集表皮生长因子与I型人胶原蛋白，获得表皮生长因子粗蛋白液及I型人胶原蛋白粗蛋白液；表皮生长因子粗蛋白液用阴离子交换层析，获得表皮生长因子；I型人胶原蛋白粗蛋白液，用阳离子交换层析，获得I型人胶原蛋白。
全文摘要
一种Ⅰ型人胶原蛋白和表皮生长因子双表达载体，N-端为Ⅰ型人胶原蛋白编码序列，C-端为人表皮生长因子编码序列，两段肽段之间用α信号肽切割位点Lys-Arg-Glu-Ala连接，建立人表皮生长因子和胶原蛋白双表达体系。表达纯化方法包括基因的获得、载体pPIC9K与Ⅰ型人胶原蛋白和表皮生长因子的连接、毕赤酵母电转化、多拷贝插入重组子的筛选、Ⅰ型人胶原蛋白-表皮生长因子的发酵表达、Ⅰ型人胶原蛋白和表皮生长因子的纯化步骤。本发明利用胶原蛋白在毕赤酵母的高表达特性，引导融合人表皮生长因子的高表达，在蛋白酶作用下，切割成两个独立的单体蛋白，通过纯化，获得基因重组人表皮生长因子及Ⅰ型人胶原蛋白。
文档编号C07K1/36GK102747097SQ201210139088
公开日2012年10月24日 申请日期2012年5月7日 优先权日2012年5月7日
发明者侯增淼, 李哲, 赵真虎, 赵金礼, 高恩 申请人:陕西东大生化科技有限责任公司