专利名称：多肽PyroGlu-Pro-Arg-pNA·HCl的合成的制作方法
技术领域：
本发明涉及多肽合成领域，特别涉及一种多肽发色底物PyroGlu-Pro-Arg-pNA · HCl 的合成方法。
背景技术：
PyroGlu-Pro-Arg-pNA · HCl (S-2366)的多肽部分的结构为三肽加发色基团，是一种血浆活性蛋白C (简称APC)和凝血因子XI的发色底物，该底物可用于血浆活性蛋白C活性的定量检测，在科研和临床上有着广泛的应用。现有文献未见有关S-2366合成的报道，其他相关发色底物的合成文献中，肽键的缩合通常使用叠氮法、活性酷法、混合酸酐法等方法，反应操作较为复杂，收率不高。
精氨酸的胍基具有强亲核性和碱性，在多肽合成中须加以保护，常用的保护方法有硝基、苄氧甲酰基保护以及现在固相合成中使用较多的苯磺酰基类(如Pbf)保护等。这些保护基团在脱保护后都需要对底物肽进行盐类型的转换，转变为科研及临床上使用的盐酸盐或者醋酸盐的形式。目前转盐一般是通过过离子交換柱的方式，需要价格昂贵的离子交换介质以及很长的过柱时间，尤其是当制备量较大时更是如此。对硝基苯胺(pNA)，由于硝基的强吸电子作用，亲核性非常差，与精氨酸缩合时，一般的酰胺键合成方法效果很差，收率很低。
发明内容
针对现有技术的缺陷,本发明提供了一种高收率的PyroGlu-Pro-Arg-pNA *HC1的合成方法，该方法エ艺简单、成本低，适合大批量生产。为解决上述技术问题，本发明采用了如下方案PyroGlu-Pro-Arg-pNA · HCl的合成方法,包括以下步骤(I)以三氯氧磷为缩合剂，将氨基与胍基均带有保护基的精氨酸与对硝基苯胺缩合；所述精氨酸的胍基保护基为双叔丁氧羰基；(2)脱除步骤(I)所得产物的氨基保护基，获得中间体I ;(3)将焦谷氨酸与羧基带保护基的脯氨酸缩合；(4)脱除步骤(3)所得产物的羧基保护基，获得中间体2 ;(5)将所述中间体I和中间体2进行缩合；(6)以HCl或HCl和こ酸こ酯的混合物为脱保护基试剂，脱除步骤(5)所得产物的胍基保护基，获得 PyroGlu-Pro-Arg-pNA · HCl。上述合成方法中，所述精氨酸的氨基保护基为9-芴甲氧羰基；当以9-芴甲氧羰基为氨基保护基时，步骤(2)所述氨基保护基的脱除试剂为碱。所述脯氨酸的羧基保护基为酷，优选叔丁酯；当以酯(包括叔丁酷)为脯氨酸的羧基保护基时，步骤(4)所述羧基保护基的脱除试剂为酸。上述合成方法中，步骤(I)的反应温度为-10°C 0°C，优选_5°C。
步骤(I)的反应溶剂为碱性有机溶剂，优选反应溶剂为吡啶。上述合成方法中，步骤(3)和步骤(5)所述缩合反应采用碳ニ亚胺为缩合剂，所述碳ニ亚胺选自N，N’-ニ环己基碳ニ亚胺、N，N-ニ异丙基碳ニ亚胺、I-こ基-(3-ニ甲基氨基丙基)碳酰ニ亚胺盐酸盐，优选I-こ基-(3- ニ甲基氨基丙基)碳酰ニ亚胺盐酸盐。当采用I-こ基-(3-ニ甲基氨基丙基)碳酰ニ亚胺盐酸盐为缩合剂时，在反应时加入HOBt,有助于减少副反应的发生,有效提闻缩合效率。本发明的优选实施路线如下
PNA哌啶 沈- F mo 9|Bocip HhAfs(Boc)^pNA
POCl 3.,·嗽啶
Pro-OlBuTFA
I · pGlia-Pro*CMBupOlu*PffrOH
E *HCVW f
EDC.HDi/HOBf
HCI/ElOAc
pG lu-Pro-Ang-pNA. HCl 丨丨丨·............................................................................................. pGlti* Rro Ar-g(Boc)2-pNA本发明所述合成方法，具有以下特点( I)精氨酸与发色基团(对硝基苯胺)的缩合效率高对硝基苯胺，由于硝基的强吸电子作用，亲核性非常差，一般的酰胺键合成方法很难缩合成功。本发明采用三氯氧磷作为缩合剂，在低温下活化精氨酸羧基，然后与对硝基苯胺发生氨解反应，15-30分钟内即能反应完全，收率在80%以上。溶剂吡啶能够催化亲核进攻反应，提高反应效率，同时能够保护酸不稳定基团(如Boc)。(2)肽键缩合效率高本发明的肽键缩合优选碳ニ亚胺型缩合试剂，具有反应条件温和、后处理简单、收率较高的特点。更优选卜こ基-(3-ニ甲基氨基丙基)碳酰ニ亚胺盐酸盐为缩合试剂，其为水溶性，在反应时加入HOBt，能够将副反应控制在很低的范围，有效提高缩合效率。(3)精氨酸胍基保护基的脱保护エ艺简单，成本低本发明采用双叔丁氧羰基(bis-Boc)为精氨酸的胍基保护基团，在反应的最后一步，使用HCl或HCl和こ酸こ酯的混合物进行脱保护，脱保护反应温度较低，发色基团不受影响，产物直接形成底物肽的盐酸盐，省去转盐步骤，节省了制备时间和成本。与现有技术相比，本发明反应条件温和，后处理简单，收率高，终产品收率大于50%,制备成本低,适合大批量制备。
具体实施例方式本发明公开了ー种发色底物PyroGlu-Pro-Arg-pNA *HC1的合成方法,本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进エ艺參数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技木。为了使本领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面结合具体实施例对本发明作进ー步的详细说明。实施例PyroGlu-Pro-Arg-pNA · HCl 的合成(I) Fmoc-Arg (Boc) 2-pNA 的合成往250mL 三ロ烧瓶中加入 25g (41. 9mmoI) Fmoc-Arg(Boc)2-0H>5. 8g (41. Qmmol )对硝基苯胺和125mL吡啶，溶解后降温至-50C ο控制温度T彡(TC，滴加7. Ig (46. 3mmol)POCl3,加完后继续反应15 30min。将反应液转移入500mL冰水中，加入ニ氯甲烷萃取，有机层依次用水、10%柠檬酸、饱和碳酸氢钠、饱和食盐水洗涤，无水Na2SO4干燥，旋干，硅胶柱纯化，得微黄色固体25. 5g，收率85%。
收率计算公式收率=产物Fmoc-Arg(Boc)2_pNA摩尔数/原料Fmoc-Arg(Boc)2-OH摩尔数X 100%。(2) H-Arg(Boc)2-pNA往250mL 烧瓶中加入 25. 5g Fmoc-Arg (Boc) 2_pNA 和 300mL DMF,溶解后加入 25mL哌啶，室温下反应20 30min。往反应液加500mL水，然后用ニ氯甲烷萃取。有机层水洗，至哌唳被洗净，无水Na2SO4干燥,旋干,加入150mL石油醚搅拌2 3h,过滤，固体用石油醚再打浆一次，过滤，得类白色固体15. 4g，收率88%。收率计算公式收率=产物H-Arg (Boc) 2_pNA 摩尔数 / 原料 Fmoc-Arg (Boc) 2_pNA 摩尔数 X 100%。(3) PyroGlu-Pro-OtBu往250mL 三 ロ 烧瓶中加入 IOg (58. 4mmol) Pro-OtBu, 16. Og (123. 9mmol)PyroGlu-0H、8. 7g(64. 3mmol)H0Bt、IOOmL ニ氯甲烷和 11. 3g(87. 4mmol)DIEA,降温至 _5°C。加入15. 6g(81. 4mmol)EDC. HC1，加完后在-5 (TC反应lh，然后自然升至室温，反应过夜。往反应液加饱和食盐水，然后用ニ氯甲烷萃取。有机层依次用10%柠檬酸、饱和碳酸氢钠、饱和食盐水洗涤。无水Na2SO4干燥，旋干，得类白色蜡状固体16g，收率97%。收率计算公式收率=产物PyroGlu-Pro-OtBu 摩尔数 / 原料 Pro-OtBu 摩尔数 X 100%。(4) PyroGlu-Pro-OH往250mL烧瓶中加入16g PyroGlu-Pro-OtBu和40mL ニ氯甲烧,溶解后加入40mL三氟こ酸，室温下反应lh。反应液旋干，得油状物，加入IOOmL甲基叔丁基醚使油状物固化，捣碎后搅拌2 3h，过滤，固体用甲基叔丁基醚再打浆一次，过滤，得白色固体11. 2g，收率87%。收率计算公式收率=产物PyroGlu-Pro-OH 摩尔数 / 原料 PyroGlu-Pro-OtBu 摩尔数 X 100%。(5) PyroGlu-Pro-Arg(Boc)2-pNA往250mL 三ロ烧瓶中加入 15. 4g (31. Immol)H_Arg(Boc)2_pNA、10. 5g (46. 4mmol)PyroGlu-Pro-0H>6. 3g (46. Bmmol ) H0Bt、150mL ニ 氯甲烧和 6g (46. 4mmo1 ) DIEA,降温至-5°C。加入8. 9g (46. 4mmol)EDC.HCl，加完后在-5 (TC反应lh，然后自然升至室温，反应过夜。往反应液加水，然后用ニ氯甲烷萃取。有机层依次用10%柠檬酸、饱和碳酸氢钠、饱和食盐水洗漆。无水Na2SO4干燥,旋干,娃胶柱纯化,得类白色固体18. 4g,收率84%。收率计算公式收率=产物PyroGlu-Pro-Arg (Boc) 2-pNA 摩尔数 / 原料 H-Arg (Boc) 2-pNA 摩尔数 X 100%O(6) PyroGlu-Pro-Arg-pNA. HCl
往SOOmT,单ロ烧瓶中加入 18. 4g PyroGlu-Pro-Arg (Boc) 2_pNA 和 200mL5 6MHCl/こ酸こ酷，室温下反应2 3h。将溶剂旋干，加入200mLこ酸こ酯后过滤，得粗肽Hg。粗肽通过Sephadex G_15纯化,用1%醋酸溶液洗脱,收集组分冻干,得白色固体11. 7g,收率83%,纯度 96%。收率计算公式收率=产物PyroGlu-Pro-Arg-pNA.HCl 摩尔数/原料PyroGlu-Pro-Arg(Boc)2_pNA摩尔数X 100%。总收率的计算公式总收率=终产物PyroGlu-Pro-Arg-pNA.HCl 摩尔数/起始原料Fmoc-Arg(Boc)2_0H摩尔数=51. 8%。以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
权利要求
1.PyroGlu-Pro-Arg-pNA · HCl的合成方法,包括以下步骤 (1)以三氯氧磷为缩合剂，将氨基与胍基均带有保护基的精氨酸与对硝基苯胺缩合；所述精氨酸的胍基保护基为双叔丁氧羰基； (2)脱除步骤(I)所得产物的氨基保护基，获得中间体I; (3)将焦谷氨酸与羧基带保护基的脯氨酸缩合； (4)脱除步骤(3)所得产物的羧基保护基，获得中间体2； (5)将所述中间体I和中间体2进行缩合； (6)以HCl或HCl和こ酸こ酯的混合物为脱保护基试剂，脱除步骤(5)所得产物的胍基保护基，获得 PyroGlu-Pro-Arg-pNA · HCl。
2.如权利要求I所述的合成方法，其特征在于，所述精氨酸的氨基保护基为9-芴甲氧擬基。
3.如权利要求2所述的合成方法，其特征在于，步骤(2)所述氨基保护基的脱除试剂为碱。
4.如权利要求I所述的合成方法，其特征在于，所述脯氨酸的羧基保护基为酷。
5.如权利要求I所述的合成方法，其特征在于，所述脯氨酸的羧基保护基为叔丁酷。
6.如权利要求4或5所述的合成方法，其特征在干，步骤(4)所述羧基保护基的脱除试剂为酸。
7.如权利要求I所述的合成方法，其特征在于，步骤(I)的反应温度为-10°C 0°C。
8.如权利要求I所述的合成方法，其特征在于，步骤(I)的反应温度为_5°C。
9.如权利要求I所述的合成方法，其特征在于，步骤(I)的反应溶剂为碱性有机溶剤。
10.如权利要求I所述的合成方法，其特征在于，步骤(I)的反应溶剂为吡啶。
11.如权利要求I所述的合成方法，其特征在于，步骤(3)和步骤(5)所述缩合反应采用碳ニ亚胺为缩合剤。
12.如权利要求11所述的合成方法，其特征在于，所述碳ニ亚胺选自N，N’-ニ环己基碳ニ亚胺、N，N- ニ异丙基碳ニ亚胺、I-こ基-(3- ニ甲基氨基丙基)碳酰ニ亚胺盐酸盐。
全文摘要
本发明公开了一种发色底物PyroGlu-Pro-Arg-pNA·HCl的合成方法，属于多肽合成领域。本发明合成方法先以三氯氧磷为缩合剂，将对硝基苯胺与胍基受bis-Boc保护的精氨酸缩合；再将另外两个氨基酸缩合成二肽；最后将上述两个合成肽段缩合，并采用HCl或HCl和乙酸乙酯的混合物脱除胍基保护基bis-Boc，形成本发明所述化合物。本发明合成方法，收率高、工艺简单、制备成本低，适于大批量制备。
文档编号C07K5/093GK102690325SQ20121018948
公开日2012年9月26日 申请日期2012年6月8日 优先权日2012年6月8日
发明者谢永华 申请人:上海太阳生物技术有限公司