一种肾靶向药物载体及应用的制作方法

专利名称：一种肾靶向药物载体及应用的制作方法
技术领域：
本发明属于制药领域，具体涉及人血清白蛋白多肽片段这一具有良好肾靶向效率的药物载体及其应用。
背景技术：
肾脏是泌尿系统的组成器官之一，是人体的主要排泄器官。它通过生成和排出尿液，排出体内代谢废物及有害物质，重吸收有用物质，可调节水、渗透压及酸碱平衡维持体内环境的稳定。近年来，随着亚健康生活方式增多和生活节奏加快，急慢性肾病发病率飞速增高。研究报告表明，在发达国家，约有6. 59TlO%的人群患有不同程度的肾脏疾病。而在中国，四十岁以上人群慢性肾脏病的患病率高达8°/Γ9%，比高血压、糖尿病的发病率还高； 门诊中，约有三分之一的病人出现明显的肾功能下降甚至衰竭。目前，临床上治疗慢性肾脏疾病主要以透析和肾移植为主，但治疗费用高昂，治疗周期较长，因此药物治疗更具优势。然而，普通药物治疗均存在不同程度的肾外效应，靶向性不强，这样会导致严重的毒副作用。此外，一些药物在达到肾脏之前就被降解，即使部分药物到达了肾脏，也不一定能被靶细胞摄取而起到治疗作用；特别是当肾脏功能异常时，药物的传递也同样会受到一定程度的影响。因此，为了增加药物的安全性和有效性，研究具有良好肾脏靶向性的药物很有必要。为此，各国科学家已经对肾靶向给药系统进行了较为系统的研究。Suzuki等人报道了烷基糖苷具有肾靶向载体的潜力。他们采用不同糖分子作为载体，通过不同长度的烷基间隔基将载体和模型药物(精氨酸抗利尿激素，AVP)结合，研究了大鼠静注AVP-糖基复合物后的组织摄取情况，发现组织分布特性很大程度上取决于结合物中的糖分子葡萄糖(Glc)、甘露糖(Man)和2d-Glc-C8_AVP都显示出良好的肾脏特异性分布。Glc-S_C8-衍生物具有明显的肾靶向性，说明Glc-S-C8-是良好的肾靶向载体。相关专利是EP0953357。Yamamoto Y等人采用自由基聚合反应制备乙烯基吡咯烷酮/ 二甲基马来酸共聚物(PVD)，并考察分子量和电荷对PVD在小鼠体内分布的影响。分子量为600(Γ8000道尔顿的PVD有很好的肾靶向性，给药剂量80%左右的PVD被肾摄取。在国内，张志荣等人将天然的壳聚糖进行降解和衍生化得到低分子量壳聚糖或其衍生物，证明了其具有良好的肾靶向性，该药物载体通过化学键与抗肿瘤药物或糖皮质激素或免疫抑制剂相连得到前体药物，体内和体外实验研究显示该前体药物能够在体内到达肾脏并释放出活性药物。相关专利是CN200610020991. 5。然而，无论是PVD载体系统还是烷基糖苷载体系统的研究仅仅停留在体内靶向性上，未有任何关于载体在肾脏特异性摄取机理研究、载体本身的安全性研究以及载体为基础的前体药物药效学研究报道；低分子量壳聚糖是一系列聚合度不同的氨基酸组成的混合物，具有一定的血细胞毒性，不可注射使用。所以，寻求新的更加安全的肾靶向药物载体是很必要的，同时只有阐明载体被肾脏特异性摄取的机理，才能为今后发展同类新型载体奠定科学基础。在现已研究的各种肾靶向载体中，低分子量蛋白质(LMWP)较为理想。分子量低于3000道尔顿的LMWP能被肾小球自由滤过并通过近端小管迅速吸收。LMWP被近端小管细胞内吞后，经内吞体迁移至溶酶体。在溶酶体内，LMWP被分解成小肽和单个氨基酸。研究表明约占注射剂量80%的LMWP (如溶菌酶、细胞色素C、抑肽酶等)最终被肾摄取。围绕这方面的专利较多，如US6562371, US200321142, JP2001055343, CN200610020167. X。但低分子量蛋白质如溶菌酶等存在免疫排斥反应，影响血压以及肾脏毒性的问题。人血清白蛋白是人血浆中的蛋白质，因其具有安全无毒、无免疫原性、可生物降解、生物相容性好等优点，在临床上应用广泛，常用于治疗休克与烧伤，补充因手术、意外事故或大出血所致的血液丢失，也可以作为血浆增溶剂。 可见，HAS较溶菌酶具备更多的优势以及临床应用基础，是理想的可注射用药物载体。目前，关于人血清白蛋白的专利较多专利CN01805629.6公开了一种去除人血清白蛋白多聚体的方法；专利CN200610038790.8公开了人β干扰素与人血清白蛋白的融合蛋白的制备方法及产品；专利CN02813703. 5公开了从生产人血清白蛋白的宿主细胞的内源血清白蛋白中纯化人血清白蛋白的方法；专利CN201010561294. 7公开了一种重组人血清白蛋白的分离纯化方法，等等。然而，关于人血清白蛋白或其多肽片段作为一种肾靶向药物载体及应用的专利尚未见报道。

发明内容
本发明的一个目的在于公开一种肾靶向药物载体，它是将人血清白蛋白降解为具有一定氨基酸序列的多肽片段，具有如下通式
Λ
rlIll-Il
其中
A表示多肽片段，
m和η为正整数，I彡m，η彡585，表示多肽片段两端氨基酸在人血清白蛋白序列中的位置。通过不同的降解方法，可将人血清白蛋白降解得到分子量大小在1000-60000之
间的多肽片段；通过体内动物实验结果，优选心123、Α124_298、Α299_585的多肽片段；更优选序列为A
299-585 的多肽片段。本发明的一个目的在于提供一种肾靶向药物载体的制备方法，是将人血清白蛋白经溴化氰降解、葡聚糖凝胶分离纯化得到粗品、羧甲基纤维素进一步分离纯化制备而成。具体地说，包括以下步骤
(O溴化氰降解溴化氰和人血清白蛋白按质量比I: I反应，以70%甲酸水溶液为反应介质，4°C下反应20_24h。(2)葡聚糖凝胶分离纯化以葡聚糖凝胶S^hadex G-100为固定相，甲酸和甲酸铵缓冲系统为流动相，室温下分离步骤(I)的降解产物，得到两个粗品I和II。(3)羧甲基纤维素进一步分离纯化以羧甲基纤维素S^harose FF为固定相，磷酸盐缓冲系统为流动相，以NaCl溶液进行梯度洗脱，室温下将粗品I分离纯化为多肽片段A299_585 ;将粗品II分离纯化为多肽片段Ah23和A
124-298°上述三种多肽片段的分子量分别为A299_585 35000道尔顿；Ai_123 =15000-2000道尔顿；A124_298 =15000-2000 道尔顿。
进一步优选的方法包括
(O溴化氰降解溴化氰和人血清白蛋白按质量比I: I反应，以70%甲酸水溶液为反应介质，4°C下反应20-24h。(2)葡聚糖凝胶分离纯化以葡聚糖凝胶S^hadex G-100为固定相，O. 174 M甲酸和O. 026 M甲酸铵缓冲系统为流动相，pH=2. 86，室温下分离得到两个粗品I和II，分离曲线检测波长为280 nm。分离纯化结果见附图I。(3)羧甲基纤维素进一步分离纯化以羧甲基纤维素为固定相，O. 005 M磷酸盐缓冲系统为流动相，pH=6. 5，以I M NaCl溶液进行梯度洗脱，室温下将粗品I分离纯化为多肽片段A299-585，分离曲线检测波长为280 nm;以羧甲基纤维素为固定相，O. 01 M磷酸盐缓冲系统为流动相，pH=3. 25，以I M NaCl溶液进行梯度洗脱，室温下将粗品II分离纯化为多肽片段八1-123和仏24_298，分离曲线检测波长为230 nm。分离纯化结果见附图2、附图3。分离纯化所得三个多肽片段经透析、冷冻干燥即得。本发明的另一个目的在于证明人血清白蛋白多肽片段能够特异性地蓄积在肾脏，具有良好的肾脏靶向性。具体涉及采用异硫氰酸荧光素(FITC)标记人血清白蛋白多肽片段进行体内实验，通过体内分布证实多肽片段具有良好的肾靶向效率，并优选出肾靶向效果最佳的片段。I.异硫氰酸荧光素(FITC)标记人血清白蛋白多肽片段
取三种多肽片段冻干粉分别溶于碳酸盐缓冲液；另取FITC溶于DMSO溶液中，混匀，滴加FITC溶液于多肽片段溶液中，4°C下避光搅拌反应24 h。透析、冷冻干燥，即得三种标记多肽片段。2.荧光标记的多肽片段的体内分布
取三种FITC标记的多肽片段分别小鼠尾静脉注射后，在15分钟、30分钟、60分钟和120分钟将小鼠处死，取心、肝、脾、肺、肾、脑，称重，制成匀浆，经过生物样品处理后，用荧光分光光度计测定含量，计算出三种多肽片段在小鼠肾脏的蓄积率以及在每种组织中的含量分布，结果见附图4-附图7。说明人血清白蛋白多肽片段具有良好的肾靶向效率，并且片段A299-S85的肾祀向效果最佳。本发明的另一个目的还提供了肾靶向药物载体作为治疗、诊断急慢性肾脏疾病药物的载体的应用。
本发明的有益效果
本发明提供了一种具有良好肾靶向效果的新型多肽片段载体，为肾靶向药物研究提供了新的思路和方向；人血清白蛋白多肽片段无免疫原性，可生物降解，生物相容性好，提高了肾靶向药物的安全性和有效性，为临床上急慢性肾脏疾病提供了新的治疗途径。


图I.葡聚糖凝胶Sephadex G-100分离纯化人血清白蛋白降解粗品的分离曲线图 图2.羧甲基纤维素从粗品I中分离纯化得到多肽片段A299_585的分离曲线图 图3.羧甲基纤维素从粗品II中分离纯化得到多肽片段4_123，A124_298的分离曲线图 图4.三种多肽片段在小鼠肾脏的蓄积率图5.多肽片段Ah23在小鼠各组织中的含量分布图 图6.多肽片段仏24_298在小鼠各组织中的含量分布图 图7.多肽片段‘_585在小鼠各组织中的含量分布图
具体实施例下面再结合实施例进一步描述本发明的肾靶向药物载体，它不限制本发明，本发明的范围要求由权利要求限定。实施例I :
多肽片段的制备
取I. O g人血清白蛋白(Sigma,纯度彡96%, USA)溶解于4 ml纯水中，再加入16 ml70%甲酸，混匀后，加入1.0 g CNBr，在4°C下搅拌反应20-24h。多次纯水透析除去反应溶液中的杂质离子，再使用PEG-6000将溶液浓缩至适当体积。 以葡聚糖凝胶S印hadex G-100为固定相，O. 174 M甲酸和O. 026 M甲酸铵缓冲系统为流动相，pH=2. 86，25°C，流速为O. I ml/min，分离得到两个多肽片段I和II，见附图I ;以羧甲基纤维素为固定相，O. 005 M磷酸盐缓冲系统为流动相，pH=6. 5，以I M NaCl进行梯度洗脱，25°C，流速为1.0 ml/min，洗脱梯度为O M_0. 5 M，将片段I分离纯化为多肽片段A299_585，见附图2 ;以羧甲基纤维素为固定相，O. 01 M磷酸盐缓冲系统为流动相，pH=3. 25，以I M NaCl进行梯度洗脱，25°C，流速为I ml/min，洗脱梯度为O. 45 M-0. 7 M，将片段II分离纯化为多肽片段仏_123和仏24_298，见附图3。分离纯化后得到的三个片段经过多次纯水透析除去溶液中杂质离子，然后分别冷冻干燥，即得三种多肽片段。
实施例2
异硫氰酸荧光素(FITC)标记人血清白蛋白多肽片段的制备方法及体内分布研究精密称取低分子量白蛋白冻干粉20 mg溶于10 ml碳酸盐缓冲液(CBS，0. I Μ,ρΗ=9. 2)，另取20 mg FITC溶于2 ml DMSO溶液中，滴加O. 7 ml FITC溶液于白蛋白溶液中，4°C下避光搅拌反应24 h，透析，冷冻干燥。取昆明种小鼠12只，雄性，重量在25-30 g之间，每3只一组，共4组。按照注射剂量50 mg/kg计算，尾静脉注射FITC标记的多肽片段，分别在15分钟，30分钟，60分钟，120分钟处死小鼠，取心、肝、脾、肺、肾、脑，称重，并制备组织匀浆，经过生物样品处理后，用荧光分光光度计测定含量，计算三种多肽片段在小鼠肾脏的蓄积率以及在各组织中的含量分布，结果见附图4-附图7。结果证明，人血清白蛋白多肽片段是一种具有良好肾靶向性的药物载体，其中，多肽片段A299_585的肾靶向效果最佳。
权利要求
1.一种肾靶向药物载体，其特征是将人血清白蛋白降解为具有一定氨基酸序列的多肽片段，具有如下通式ΛrlIll-Il 其中 A表示多肽片段， m和η为正整数，I彡m，η彡585，表示多肽片段两端氨基酸在人血清白蛋白序列中的位置。
2.根据权利要求I所述的肾靶向药物载体，其特征是分子量大小在1000-60000之间；it3 ^1_123、A124_298、A299-585 的多肽片段；更优选序列为a299_585的多肽片段。
3.根据权利要求1，2所述的肾靶向药物载体，其特征是由人血清白蛋白经溴化氰降解、葡聚糖凝胶分离纯化得到粗品、羧甲基纤维素进一步分离纯化制备而成。
4.根据权利要求f3所述的肾靶向药物载体的制备方法，包括如下步骤 (O溴化氰降解溴化氰和人血清白蛋白按质量比I: I反应，以70%甲酸水溶液为反应介质，4°C下反应20-24h; (2)葡聚糖凝胶分离纯化以葡聚糖凝胶SephadexG-100为固定相，甲酸和甲酸铵缓冲系统为流动相，室温下分离步骤(I)的降解产物，得到两个粗品I和II ; (3)羧甲基纤维素进一步分离纯化以羧甲基纤维素S^haroseFF为固定相，磷酸盐缓冲系统为流动相，以NaCl盐溶液进行梯度洗脱，室温下将粗品I分离纯化为多肽片段A299_585 ;将粗品II分离纯化为多肽片段Ah23和A 124-298 上述三种多肽片段的分子量分别为A299_585 35000道尔顿汸卜123 =15000-2000道尔顿;A124-298 :15000-2000 道尔顿。
5.根据权利要求4所述的肾靶向药物载体的制备方法，其特征是所述的步骤(2)和(3)中分离纯化条件 (O分离得到两个多肽片段I和II的色谱条件中，流动相甲酸和甲酸铵摩尔比为O.174 :0. 026，pH=2. 86，分离曲线检测波长为280 nm ； (2)从多肽片段I中分离得到多肽片段A299_585的色谱条件中，磷酸盐缓冲液浓度为O.005 M，pH=6. 5，NaCl溶液浓度为I M，分离曲线检测波长为280 nm ； (3)从多肽片段II中分离得到多肽片段Aw23和A124_298的色谱条件中，磷酸盐缓冲液浓度为O. 01 M，pH=3. 25，NaCl溶液浓度为I M，分离曲线检测波长为230 nm。
6.上述权利要求任一项所述的肾靶向药物载体可作为治疗、诊断急慢性肾脏疾病药物的载体的应用。
全文摘要
本发明公开了一种肾靶向药物载体及应用，具体涉及人血清白蛋白通过降解、分离纯化得到的多肽片段，通过体内实验研究证明多肽片段具有良好的肾脏靶向性。本发明制法简单，工艺成熟，性能稳定。其应用可作为一种肾靶向药物载体用于治疗、诊断急慢性肾脏疾病领域。
文档编号C07K1/02GK102793928SQ201210325919
公开日2012年11月28日 申请日期2012年9月6日 优先权日2012年9月6日
发明者袁志翔, 徐超群, 何夏凯, 谭镭 申请人:四川省中医药科学院