专利名称：烯啶虫胺半抗原、人工抗原和抗体及其制备方法与应用的制作方法
技术领域：
本发明属于农药小分子化合物(分子量小于1000道尔顿)免疫化学和残留分析技术领域；涉及有机合成，免疫化学，生物化学及物化测试试技术等；特别涉及具有6 —羧乙巯基分子结构的烟碱类农药烯啶虫胺小分子化合物半抗原、人工抗原的设计合成，和免疫动物特异性抗体的制备及其免疫分析方法的建立。
背景技术：
烯啶虫胺又名吡虫胺，是继吡虫啉之后的第二代新烟碱类杀虫剂，是目前最新的烟碱类杀虫剂之一，其杀虫机理与传统的杀虫剂有所不同。烯啶虫胺作用于昆虫神经接合部后膜，通过与乙酰胆碱受体结合使昆虫异常兴奋，全身痉挛，麻痹而死。烯啶虫胺具有高效、低毒、内吸和无交互抗性四大优点，是防治同翅目及半翅目害虫的优良药剂，可广泛应用于粮谷、蔬菜、水果和茶树上防治各种稻飞虱、蚜虫、蓟马、白粉虱、烟粉虱、叶蝉、蓟马等刺吸式口器害虫，对传统杀虫剂已产生抗性的害虫有较好的防治效果，是至今烟碱类农药发展最新产品之一。由于烯啶虫胺在我国使用日益广泛，我国许多农产品中存在烯啶虫胺残留。随着农药使用规模不断扩大，农药残留造成环境影响和对人类健康的慢性和长期效应，日益受到人们关注和担忧。为此，对农药残留的限制也因此越来越严格，并且对分析测定对象、种类、数量、范围、指标等诸方面，都提出新的要求和更高的标准。日本肯定列表对于烯啶虫胺在农产品中的残留量，有较严格的检测标准，最高允许残留量(MRL)为O. 03至O. 5mg kg_l。然而，由于分子量小于lOOOdolton (道尔顿)的小分子有毒化学品，如农药及其代谢产物，其传统的残留分析方法，主要是依靠气相色谱(GC)、液相色谱(HPLC)或质谱等物化分析手段。该传统的理化分析方法，繁琐复杂、成本较高、分析速度慢，难以满足实际分析的需要，因此迫切要求发展简便、快速、灵敏的分析技术。与大分子不同，小分子化合物免疫分析有自身特点(I)小分子化合物〔MW ( lOOOdolton〕一般不具有免疫原性，不能直接免疫动物产生特异性抗体、必须合成突出分子立体结构特异性部位的半抗原，并与大分子载体连接构成接合物，才能免疫动物产生针对这一目标小分子化合物的特异性抗体。这种半抗原与大分子载体的结合物称为人工抗原。人工抗原的制备不是任意的，包括结合位点、结合方式、载体种类、以及半抗原与目标分析物任何结构上的差异如大小、形状、成份、构型、构象、极性、电子云密度等等在内的诸因素，都可能极大地影响着相应抗体的性质，因此它们是决定产生其特异性抗体和建立免疫分析方法的关键。(2)虽然小分子化合物不具有免疫原性，但具有反应原性，即具有与相应抗体发生免疫学反应的能力，并可体外定量进行，遵循质量作用定律。(3)基于抗原抗体免疫反应检测小分子化台物的分析技术，目前多采用酶联免疫分析(ELISA)。利用酶促反应显示抗原抗体的定量结合，操作简单，又具有相当的灵敏度，近年来发展很快。80年代以来发展起来的农药ELISA和简易酶免疫EIA技术，使农药残留分析在方法上获得更大的生命力；对使用快速分析样本基质过于复杂，用普通理化方法难以分析的农药残留，具有相当的应用价值。免疫分析技术被引入农药残留分折领域，成为一种最有发展和应用潜力的报量分析技术之一，受到广泛的重视。第一个农药免疫分析的报道是1967年Centen等人制备的农药马拉硫磷的抗血清。1980年Hammock和Mumma,进一步探讨了农药免疫分析方法的理论和技术之后，使ELISA农药分折技术，进入了一个崭新的阶段。农药小分子化合物(分子量小于1000道尔顿)，依靠免疫学、免疫化学基本原理和生物技术手段。该技术研究的关键是半抗原的分子设计、合成和人工全抗原及抗体的制备。因此，目标分析物分子免疫学特性，以及如何通过化学或生化技术突出和利用这些特性，是该领域重要的研究内容。这一技术目前已成为微量分析研究的一个崭新领域，可与传统分析方法并列作为一项新的分析途径。烯啶虫胺人工抗原和特异性抗体以及以此为基础建立免疫分析方法尚未见报道
发明内容
本发明的目的是通过设计合成具有6 —羧乙巯基分子结构的烟碱类农药烯啶虫胺的半抗原及相应的人工抗原和抗体。本发明的另一个目的是提供烯啶虫胺的半抗原及相应的人工抗原和抗体的制备方法。本发明再一个目的是提供烯啶虫胺的半抗原及相应的人工抗原和抗体的应用。其中纟布Ffe虫胺的人工抗原包括免疫原和包被原。本发明的独特之处在于突出了这类农药分子特异性抗原决定簇，又克服了化学合成的困难，免疫动物诱导产生亲合性很高的特异性抗体；并以此为基础建立了 ELISA方法即快速免疫分析方法，准确检测烟碱类农药烯啶虫胺。本发明设计、合成了小分子目标分析物半抗原，并与载体蛋白质偶联，制备有效人工抗原，免疫动物制备对小分子分析物特异性抗体，利用抗原抗体的特异性免疫学反应，从而定性定量地检测样本中超微量小分子目标分析物，即可用于样本测定。其选择性决定于免疫学反应的特异性，其灵敏度取决于抗体的亲合性和标记物的可检性。因此可以快速准确地分析检测烯啶虫胺在样本中的残用量。该技术研究的关键是半抗原的分子设计、合成和人工全抗原及抗体的制备。人工抗原是合成半抗原与载体蛋白的偶联物，若用于免疫动物，即为免疫原，若用于免疫分析中包被反应板，即为包被原。对于同一种目标分子，免疫原和包被原通常不用同一种偶联物，目的是减少抗体对包被原的非特异性结合，提高分析的特异性和灵敏度。因为人工抗原免疫动物所产生的抗体，不仅能识别半抗原，也能识别载体蛋白。因此，免疫原和包被原所用的载体蛋白一般是不相同的，载体蛋白的结构和分子质量差异越大，非特异性结合反应越弱，分析灵敏度越高。烯啶虫胺的结构如下所示
权利要求
1.一种烯啶虫胺半抗原，其特征在于分子结构式为
2.一种烯啶虫胺免疫原，是由权利要求I所述的烯啶虫胺半抗原与牛血清蛋白相连接合成，其特征在于，所述烯啶虫胺人工抗原分子结构式为
3.一种烯啶虫胺包被原，是由权利要求I所述的烯啶虫胺半抗原与卵清蛋白相连接合成，其特征在于，所述烯啶虫胺包被原分子结构式为
4.一种烯啶虫胺抗体，是能与权利要求2免疫原或权利要求3包被原发生特异性免疫反应的IgG抗体。
5.权利要求I所述的烯啶虫胺半抗原的制备方法，其特征在于包括以下步骤 (1)将烯啶虫胺5.400-5. 500g溶于40ml甲醇，投入三口烧瓶中； (2)加入KOH2. 200-2. 300g，磁力搅拌使其溶解； (3)称取3-巯基丙酸2.100-2. 200g溶于IOml甲醇并转移至50ml恒压滴液漏斗中缓慢滴加到三口烧瓶中，并使油浴缓慢升温至100-105°C，反应完全后撤去油浴，反应液自然冷却至室温后，用旋转蒸发仪蒸干溶剂即得到目标产物。
6.权利要求2所述的烯啶虫胺免疫原的制备方法为活性酯法，其特征在于，所述活性酯法包括以下步骤 (O首先移取ImL的无水二甲基甲酰胺于4mL的小棕瓶中； (2)称取5.100-5. 200mg烯啶虫胺半抗原溶于上述二甲基甲酰胺溶液中并超声5min使其溶解充分，在搅拌的状态下，依次向其中加入15. 600-15. 700mgN, N ; 二环己基碳二亚胺和8. 700-8. 800mgN-N-羟基琥珀酰亚胺，溶解充分以后，室温避光搅拌反应22-24小时； (3)反应后溶液中有沉淀产生，4°C，10000r/min离心5min除去沉淀，将上清液逐滴加入冰浴条件下的4mL含20mg牛血清白蛋白的pH7. 4的O. Olmol Γ1的磷酸盐缓冲液中，室温搅拌1-1. 5小时后，将该溶液置于4°C冰箱搅拌过夜； (4)将步骤(3)反应液吸出装入透析袋，在4°C条件下用ρΗ7·4的O. Olmol Γ1磷酸缓冲液透析三天，每天换四次透析液，最后将透析液取出，得到烯啶虫胺免疫原； (5)精确量取步骤(4)得到烯啶虫胺免疫原溶液的体积，测定浓度和结合比，分装，-20°C保存。
7.权利要求3所述烯啶虫胺包被原的制备方法为混合酸酐法，其特征在于，所述的混合酸酐法包括以下步骤(O首先移取IrnL的无水二甲基甲酰胺于4mL的小棕瓶中； (2)称取5.100-5. 200mg烯啶虫胺半抗原溶于二甲基甲酰胺中并超声5min使其充分溶解，在搅拌的状态下，依次向其中加入2uL氯甲酸异丁酯和4uL正三丁胺，室温避光搅拌反应 1-1. 5h ； (3)反应后将反应液在冰浴条件下逐滴加入含有20mg卵清蛋白的4mL磷酸盐缓冲液，室温搅拌2h后，将该溶液置于4°C冰箱搅拌过夜； (4)将步骤(3)的反应液吸出装入透析袋,在4°C条件下用pH7.4的O. Olmol L-1磷酸盐缓冲液透析三天，每天换四次透析液，最后将透析液取出分装，加入O. 1%的叠氮钠4°C保存。
8.权利要求4所述烯啶虫胺抗体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤 (1)免疫免疫动物选用雌性大白兔，免疫方法采用皮下和肌肉注射法，初免后进行四次加强免疫，具体做法是 初次免疫取Img上述免疫原溶于O. 9%的NaCl溶液和弗氏完全佐剂等体积所配制的溶液中，进行动物免疫； 加强免疫用O. 5mg上述免疫原溶于O. 9%的NaCl溶液和弗氏不完全佐剂等体积所配制的溶液，进行动物免疫；加强免疫分别于初次免疫后2周、4周和6周后免疫三次,此后间隔一个月。第五次免疫后9天时由兔子的耳缘静脉取血，进行效价检测； (2)抗体纯化定时监测动物抗体效价，当抗体对权利要求3所述的烯啶虫胺包被原效价达到1:80000-1:90000时,采集血液,并离心获得抗血清,使用ProteinA-Sepharose 4B蛋白亲和层析柱对抗血清进行纯化，制备得到权利要求4所述的IgG抗体。
9.权利要求4所述烯啶虫胺抗体的应用，其特征在于，所述的烯啶虫胺抗体应用于农药烯啶虫胺含量的免疫检测。
10.根据权利要求9所述的烯啶虫胺抗体的应用，其特征在于包括如下步骤 (1)包被将制备好的包被原溶于50mmol、pH9-10的碳酸缓冲液中，配制成10mg/mL的包被液，酶标条的每个孔加100 μ I包被液包被12-16小时，将包被好酶标板的每个孔，用PBST洗涤三次； (2)封闭每孔加入200μ I含有O. 5%(m/v)脱脂乳粉的pH7. 4的磷酸缓冲液封闭30分钟； (3)加样将待测样品溶于pH7.4的磷酸缓冲液中，加样时每孔加入50 μ I标样； (4)竞争反应将抗体溶于ρΗ7.4的磷酸缓冲液中，加入待测样品或标样后，每孔加入.50 μ I抗体溶液，孵育30分钟后用洗板液洗涤三次； (5)加酶标二抗将羊抗兔酶标二抗用ρΗ7.4的磷酸缓冲液20000倍稀释，每孔加入.100 μ I,室温孵育30分钟后用洗板液洗涤三次； (6)显色显色底物使用四甲基联苯胺，将5mg四甲基联苯胺溶于ImlpH7. 4的磷酸缓冲液中，配制成浓度为O. 1%的底物溶液，显色时每孔加入150 μ I的底物溶液和5 μ I双氧水，显色15分钟后每孔加入50 μ I 5mol/L的硫酸终止；反应液在自动酶标仪上读数。
全文摘要
本发明公开了一种农药烯啶虫胺半抗原、人工抗原和抗体及其制备方法与应用，涉及具有6－羧乙巯基分子结构的烟碱类农药烯啶虫胺小分子化合物人工半抗原、免疫原，包被原和抗体的制备及其免疫分析方法的建立方面。本发明克服了传统的理化分析方法繁琐复杂、成本较高、分析速度慢的问题，提供了简便、快速、灵敏、准确的免疫分析技术。它以(E)-N-(6-羧乙巯基-3-吡啶甲基)-N-乙基-N＇-甲基-2-硝基亚乙基二胺为半抗原，分别与牛血清蛋白和卵清蛋白连接合成免疫原和包被原。人工抗原再经动物免疫、取血、分出抗血清、纯化制得抗体。使用该抗体建立的烯定虫胺免疫检测方法具有良好的特异性和灵敏度，检测限可以稳定达到0.20±0.02ng L-1，且半抗原合成方法简便，具有良好的应用前景。
文档编号C07K1/107GK102942519SQ20121042986
公开日2013年2月27日 申请日期2012年10月31日 优先权日2012年10月31日
发明者王俊平, 生威, 张昕哲, 王硕, 张燕 申请人:天津科技大学