专利名称：一种更加稳定的人源蛋白酶体激活因子突变体的构建方法
技术领域：
本发明属于分子生物学及结构生物学领域，涉及到一种更加稳定的人源蛋白酶体激活因子的构建方法以及其晶体结构的解析。
背景技术：
蛋白酶体系统在真核细胞蛋白质蛋白质降解中起着重要作用，在细胞周期的调控，转录，信号转导，凋亡以及免疫应答方面都起着关键的作用。蛋白酶体主要通过泛素依赖和非泛素依赖的俩种途径对蛋白质进行降解。20S蛋白酶体是降解蛋白质的核心部分，由不同的亚单位组成的环状柱形结构，俩外环由7种不同的α亚单位组成，俩内环有7种不 通的β亚单位组成，其中蛋白酶活性位于β亚单位上。蛋白酶的活性需要由蛋白酶体激活因子来激活。目前报道发现的蛋白酶体激活因子主要有ΡΑ700，ΡΑ28和ΡΑ200.对于ΡΑ200的研究目前还不是很清楚，ΡΑ700是一类依赖于泛素化，具有ATPase活性的激活因子，它可以与20S蛋白酶体相结合，形成26S复合物，来降解细胞内的绝大部分需要降解的蛋白质。另外一种蛋白酶体激活因子是ΡΑ28，也称为REG，是一种不依赖于泛素化和不具有ATPase活性的蛋白酶体激活因子。REGgamma已经被证明能够激活蛋白酶体来促进一些蛋白质的降解，目前研究表明，REGgamma能够介导一些细胞内重要蛋白质的蛋白酶体途径的降解，包括SRC-3，依赖于细胞周期蛋白的蛋白激酶的抑制子Ρ21，Ρ16，Ρ19。而且研究表明REGy可以通过促进MDM2介导的P53的泛素化来降解肿瘤抑制因子P53的降解。同时REGgamma也是一种细胞周期调控因子，其敲除REGgamma基因的小鼠在体型生长方面明显受到抑制,REGgamma能够减少细胞增殖，促进细胞凋亡，从而暗示其在癌症的发生中也可能起着重要的作用。同时REGgamma还可以介导HCV核心蛋白的降解,从而说明在病毒感染及清除方面，REGgamma也起着重要的作用。目前通过传统的方法无法获得该蛋白酶体激活因子的晶体，因此，我们通过分子克隆手段构建了一种新的突变体，通过该方法构建的突变体，能够很容易的得到其晶体，并且解析了其结构。
发明内容
本发明的目的在于通过分子克隆的手段，构建一种更加稳定的人源蛋白酶体激活因子突变体REGgammaLinker，并且解析该突变体的晶体结构。为以后对该激活因子的功能研究提供结构基础，从而为进一步研究该激活因子对于癌症研究，以及药物开发提供理论基础。本发明提供的不依赖泛素及ATP的人源蛋白酶体激活因子突变体REGgammaLinker的构建方法经如下步骤得到第I、根据REGgamma的核苷酸序列以及人工设计加入的Linker氨基酸序列，设计两对引物，分别为
FPl :GCGAATTCATGGCCTCGTTGCTGAAGTTGGAT, SEQ ID No. 2 和RPl:GCCTCGAGTCAGTACAGAGCTTCTGCATTGCT, SEQ ID No. 3 ;及linkerl:GGAGCCGTGAGCGCAGGCCTGAAAAGCAACCAGCAG, SEQ ID No. 4Iinker2:GCCTGCGCTCACGGCTCCGTGGATCTGAGTTAGGTC, SEQ ID No. 5以REGgamma的全长核苷酸序列为模板，分别利用两对引物进行PCR反应，扩增取代氨基酸前端片段和后端片段，两个PCR反应中使用的引物分别为FPl/linker2，RPl/linkerl ;通过两个PCR反应’已经将linker前后的核苷酸序列分别克隆完成；利用FP1/RP1 —对引物，以前面反应得到的产物作为模板进行PCR，得到linker取代60到107位氨基酸的REGgamma的全长核苷酸序列；第2、将上步反应中得到的linker取代的PCR产物利用EcoRI和XhoI进行双酶切反应，同时载体质粒pGEX-6p-l也利用相同的酶进行双酶切反应，以使PCR产物和质粒形成相同的黏性末端；在了4连接酶的作用下，将酶切后的目的基因片段连接到pGEX-6p-l的质粒载体中，形成重组质粒pGEX-REGgammaLinker ；第3、通过酶切鉴定该突变体基因已经连接到表达载体以后，并送测序公司进行测序以确定构建成功。本发明在突变体REGgammaLinker的构建基础上，进一步提供了突变体蛋白REGgammaLinker的原核表达纯化、晶体筛选以及结构解析方法，该方法的具体步骤如下第I、将以上构建的重组质粒pGEX-REGgammaL inker转化到表达菌株E. col iBL21DE3 中；第2、挑取单克隆,接种到5ml经过灭菌且添加100mg/l Ampicllin抗生素的LB 液体培养基中，在37°C摇床中过夜培养12个小时后，转接到IL经过灭菌且添加IOOmg/IAmp i c 11 in抗生素的LB液体培养基中，在37 °C摇床中培养约4个小时后，测其OD约为O. 7，加入终浓度为O. 5mM的异丙基硫代半乳糖苷IPTG使目的蛋白进行诱导表达，16°C下诱导18个小时后离心5000rpm离心20min收集菌体，收集到的菌体用PBS缓冲液重新悬浮，PBS缓冲液组成是137mMNaCl,2. 7mM KCl，4· 3mM Na2HP04,1. 4mM KH2P04 ；第3、悬浮好的菌液经超声波破碎并利用高速离心18000rpm 45min进行离心，离心后的上清液利用GST亲和层析柱进行初步纯化,而后利用PreScission在柱上进行酶切从而除去GST标签；酶切洗脱下的目的蛋白浓缩后利用AKTA蛋白质纯化仪，经过阴离子交换柱Resource Q和分子筛凝胶色谱柱Superdex20010/300GL进行纯化,得到经过电泳检测纯的目的蛋白；第4、通过以上纯化步骤获得电泳纯的REGgammaLinker突变体蛋白样品，将此蛋白溶液加入Amicon超滤浓缩管中于4000rpm的转速下离心浓缩浓缩过程中将蛋白酶溶液中的150mM NaCl利用不含NaCl但其他组分相同的缓冲液进行稀释，降低蛋白酶溶液中的离子浓度，使NaCl浓度低于IOmM ;利用紫外吸收法测定蛋白质的浓度；将测定浓度后的蛋白酶溶液利用缓冲液稀释至10mg/ml后，利用悬滴结晶法于O. lMTrisU9%PEG3350w/v, O. 2M Li2SO4, 15%Glycerol, 5% 异丙醇，ρΗ8· 5 的结晶条件下获得REGgammaLinker突变体蛋白的晶体；第5、REGgammaLinker突变体蛋白晶体的X射线衍射数据收集步骤如下第5. I、首先使用Hampton Research公司的尼龙晶体环，从脱水以后的晶体浸泡液中获取适宜X射线衍射的单一晶体，并迅速使用Oxford Cyrosystem公司的冷却系统产生的低温氮气流中冷冻至零下150-180°C ;使X射线通过晶体，利用旋进法收集X射线衍射数据；第5. 2、收集到晶体的X射线衍射数据后，按照以下步骤进行相应的数据处理及结构解析
首先使用HKL2000软 件对上一步骤中收集得到的衍射数据进行处理，获得完整的数据文件；其次，使用CCP4程序包中的Phaser，利用分子置换方法，以其同源的人源蛋白酶体激活因子REG α为置换模型TOB code :1AV0进行分子置换以确定其相位；通过PHENIX，COOT等软件来解析REGgammaLinker突变体蛋白的结构；其晶体参数如下Parameters REGgammaLinkerData collection statistics Unit cell parameters a=89. 0 b=89. 0 c=438. I a = β = γ =90Space group P43212Wavelength (A) 0. 97915Resolution range (A) 50 - 3. 00 (3. 11 - 3. 00)Completeness (%) 86. 2 (85. 6)Redundancy 7. 9 (8. 0)Average I/ σ (I) 35.5(2.8)Rmerge (%) 5. 0 (76. I)Rwork/Rfree (%) 23.4/28.5r. m. s. d. bonds (A) 0. 009r. m. s. d. angles (° ) I. 160Ramachandran plot (%)Most favored 95. 8 ；第6、通过荧光短肽的酶活实验来检测突变体蛋白对蛋白酶体的激活实验；进行野生型REGgamma和突变体蛋白REGgammaLinker酶活性检测，酶活实验的方法参考JunLij Martin Rechsteiner等人2001年在the EMBO Journal上发表的文章《Lysinel88substitutions convert the pattern of proteasome activation by REG γ tothat of REGs a and β》中所述的REG对蛋白酶体的激活实验中的方法并稍加改进后进行。酶活实验步骤具体如下空白对照加入40ul assay buffer (50mMTrisPH7. 5, 25mMKClIOmMNaCl IMgCl2);负对照加入 30ul assay buffer，IOul 蛋白酶体(IOug/ml);正对照加入 20ul assaybuffer，IOul REG a (lOOug/ml)，IOul 蛋白酶体；样品 I 号组加A 20ul assay buffer, IOul REGgamma Native (lOOug/ml)，IOul 蛋白酶体；样品 2 号组加A 20ul assay buffer, IOul REGgammaLinker 突变体(100ug/ml)，IOul 蛋白酶体将其上诉各个成分于30度混合lOmin，而后分别加入俩种不同的带有荧光基团的底物=Suc-LLVY-MCA(10ul375um) ;Boc-LRR-MCA(IOul 375um)震荡2min，而后利用酶标仪来监测荧光产物随时间的变化(激发波长是360mn，吸收波长是460mn)每隔6min读一次数值，一个小时结束实验。
实验结果如附图2所示其中REGa可以激活蛋白酶体的俩种酶活性(trypsin-1ike, chymotrypsin-like)。而 REGgamma 只能激活蛋白酶体的 trypsin-like active site ；同样REGgammaLinker突变体对蛋白酶体酶活性的激活与REGgamma Native基本上完全一致，从而可说明我们该实验设计的用6个短肽Linker取代了 REGgamma Native 60到107位氨基酸以后，不影响其对蛋白酶体的激活效应。本发明的优点和积极效果本发明通过分子克隆手段建立了一种构建REGgammaLinker突变体(用6肽取代60位到107位的氨基酸残基)的方法，并通过X-射线衍射的方法解析了该突变蛋白的晶体结构，使得该激活因子在结构上更加稳定，对蛋白酶体的激活作用与母体蛋白完全相同。并通过对蛋白酶体的激活实验以及细胞定位实验进行了重要的功能研究。(母体蛋白主要定位在细胞核中，突变体蛋白主要定位在细胞质中)，这样就为我们在以后的理论研究以及在相关的治疗癌症的药物开发上提供了一定的理论基础。·
图I为本发明构建的REGgammaLinker突变体的结构示意图，由图可见,其中每个不对称单位里有一个七聚体分子。图2为该REGgammaLinker突变体与母体蛋白对蛋白酶体激活实验结果图,其中，A用荧光底物Suc-LLVY-MCA进行的酶活实验，B用荧光底物Boc-LRR-MCA进行的酶活实验。
具体实施例方式下述实施例仅仅是用于解释本发明，而不应当理解为以任何方式限制本发明范围。实施例I、不依赖泛素及ATP的人源蛋白酶体激活因子突变体REGgammaLinker的构建I.含有蛋白酶体激活因子突变体REGgammaLinker的分子克隆I)以REGgamma母体蛋白的核苷酸序列为模板，分别利用FPl/linker2, RPl/linkerl这两对引物(SEQ ID No. 2至SEQ ID No. 5)进行PCR反应，扩增替换位点前边的端
片段和后边的端片段。反应体系如下
Template (REGganmia native； I μ LTemplate (REGgamma native) IuL
FP II [iLR PIΙμΙ^
Linker2IpLLinkerlIpL
dNTPs5liLdNTPs5μ
Hifi0 5^iLHifi0 5μ
IOiiiBuffer Il5μ 10*Bufferl丨5fuL
ddH2036.5μ ddH2036.5μ 2) PCR反应程序预变性 94 °C5min lcycle
变性 94 °CImin
退火 58 30S
延伸 72 °CImin 35cycles
72'CIOmin
4 °Cforever2.突变体REGgammaLinker基因序列PCR产物的回收
PCR结束后，产物利用1%的琼脂糖凝胶电泳切胶回收600bp左右的目的片段。具体步骤如下I)琼脂糖凝胶电泳结束后，在紫外灯下观察跑胶结果，切取目的片段放入1.5ml灭菌的EP管中；2)在EP管中加入300 μ L溶胶液，将EP管放入65°C水浴锅中加热，使胶块溶解；3)将溶胶液加入树脂柱中，冰上静置2min，室温下于离心机中IOOOOrpm离心lmin。将管中液体倒回树脂柱中重新结合一次，冰上静置2min，室温下于离心机中IOOOOrpm离心lmin,弃去收集管中的液体；4)树脂柱中加入600 μ L洗涤液，于离心机中12000rpm离心lmin，弃去收集管中
液体；重复此步骤一次；5)室温下于离心机中12000rpm离心3min，使树脂柱中酒精尽量减少；将树脂柱转移到1.5ml灭菌的EP管中；6)在树脂柱上加入20yL65°C预热的TE溶液，室温静置3min，于离心机中12000rpm离心2min ;重复此步骤一次。得到40 μ L REGgammaLinker 突变体基因。3. REGgammaLinker突变体基因序列PCR产物与载体的双酶切将3中回收的目的片段PCR产物与载体质粒pGEX-6p_l同时进行双酶切，酶切体系如下10*H 5 μ LEcoRI:I μ LXhoI:I μ LddH20:18 μ LpGEX_6p_l: IOOOng目的片段酶切体系与载体质粒酶切体系相同，不同之处在于体系中添加的目的片段量为600ng。将反应物全部加入灭菌后的EP管中，柔和混匀，于37°C水浴中进行酶切，反应18个小时以上。4. REGgammaLinker突变体基因序列PCR产物与载体的酶切产物的回收、连接酶切后的目的片段和载体质粒进行切胶回收，回收步骤同3。回收结束后，进行目的片段与载体质粒的连接。连接反应体系如下Solution I: 5 μ L
载体质粒 O. 5 μ L目的基因片段4.5yL反应于18°C条件下进行6小时。5.连接产物转化 E.coli trans5 αa.从_80°C冰箱中取出100 μ L感受态细胞悬液放在冰上解冻；b.将感受态细胞50 μ L加入到5中的连接产物中，冰浴30min ；c.冰浴结束后，将b中的反应体系放入42°C水浴中热激90s，热激结束后，迅速转入冰中冰浴5min ；·
d.冰浴结束后，在反应体系中加入800yL LB培养基，于37°C摇床中振荡培养90min ；e.振荡培养结束后，将培养物取出，于离心机中4500rpm离心IOmin ；f.离心后，用移液枪将大部分上清吸去，剩余液体量200 μ L，再用移液枪将管底的菌体吹吸悬浮起来之后，转移到含有100mg/l Ampicillin抗生素的LB平板上，用推子推匀，37 °C培养14个小时。6.重组质粒的酶切鉴定1)6中平板培养14个小时之后，平板表面会长出许多菌落，挑取单克隆菌落于5ml经高温灭菌且添加了 100mg/l Ampicillin抗生素的LB液体培养基中，一共挑去4个单克隆，于37°C振荡培养12小时；2)取3ml菌液提取质粒，进行质粒的酶切鉴定。质粒提取步骤按照博大泰克试剂盒说明书进行操作。质粒酶切体系如下EcoRI:O. 5 μ LXhoI:O. 5 μ L10*Buffer H IuLddH20:3μ Lrecombinant plasmid: 5 μ L37°C水浴反应4个小时后利用琼脂糖凝胶电泳进行检测，电泳中含有两段DNA片段，大小分别为600bp和4. 9kb左右，表明目的片段连接到了载体质粒中，将质粒送往测序公司进行测序。测序结果如SEQ ID No. I。实施例2、突变体蛋白REGgammaLinker的原核表达纯化，晶体筛选以及结构解析；I.将带有REGgammaLinker突变体全长基因的重组质粒转化E. coli BL21转化步骤与6中连接产物转化入E. coli trans5 α步骤相同，只不过在体系中加入LB培养基后37°C振荡培养时间为lh。菌液涂布在含有100mg/l Ampicillin抗生素的平板上，于37 °C倒置培养12h。2. IPTG诱导REGgammaLinker突变体蛋白的异源表达a.挑取平板上含有重组质粒的单菌落接种于5ml的经高温灭菌、添加了 IOOmg/IAmpicillin抗生素的LB液体培养基中，37°C振荡培养过夜；b.按1%接种量转接添加了 100mg/l Ampicillin抗生素的液体LB培养基，37°C、200rpm 培养 4h，加入 O. 5mM IPTG 后于 16°C诱导 18h。
3. REGgammaLinker突变体蛋白的纯化I)菌体收集a.将8中的培养液于5000rpm离心20min收集菌体；b.按 IL发酵液用 30ml 的 PBS 缓冲液(137mMNaCl 2. 7mM KCl 4. 3mM Na2HP041. 4mMKH2P04 pH8. 0)的比例将菌体重悬；2)利用超声波破碎提取菌液将悬浮好的菌液放置于冰上，利用40%频率的超声波，超声4s后停6s的条件下， 破碎10分钟，然后进行三个循环，直到重悬液完全清亮为止；将破碎后的菌液于18000rpm4度离心40min，离心后收集上清；3)粗提液过亲和层析柱a.利用GST亲和层析柱；b.用 1*PBS 缓冲液(137mMNaCl 2. 7mM KCl 4. 3mM Na2HP041. 4mMKH2P04 pH8. 0)缓冲液平衡亲和层析柱；c.将2)中得到的粗提液加入到平衡好的GST亲和柱中使目的蛋白结合到GST介质上边；重复三次；d.用 1*PBS 低盐缓冲液(137mMNaCl 2. 7mM KCl 4. 3mM Na2HP04 I. 4mMKH2P04pH8. 0)与 1*PBS 高盐缓冲液(500mMNaCl 2. 7mM KCl 4. 3mM Na2HP041. 4mM KH2P04 pH8. 0)交替冲洗柱子，每次10ml，将其他杂蛋白除去；e.加入60ul 3mg/ml的PreScission蛋白酶在4度进行酶切过夜用来除去GST标签；f.次日，将酶切以后的蛋白用1*PBS低盐缓冲液(137mMNaCl 2. 7mM KC14. 3mMNa2HP041. 4mM KH2P04 pH8. 0)洗脱下来；4 )洗脱的目的蛋白的缓冲液的替换将收集的蛋白质洗脱液加入到30kD浓缩管中，4°C条件下于离心机中4000rpm浓缩至500ul，而后加入IOml 20mM Tris-HCl (pH8. O)缓冲液来替换目的蛋白溶液中的PBS，
重复一次；5)利用阴离子交换层析柱(Resource Q)进一步纯化目的蛋白a.用20mM Tris-HCl (pH8. O)缓冲液平衡阴离子交换柱，直到电导率、UV值不再变化为止；b.浓缩好的样品转移到I. 5ml EP管中，于4°C离心机中13300rpm离心lOmin，以除去目的蛋白质溶液中可能存在的沉淀物及气泡；c.通过六通阀进行上样，然后用20mM Tris-HCl缓冲液(pH8. O)以lml/min的流速平衡柱子2个柱体积；d.待冲洗完层析柱，进行梯度洗脱。洗脱条件为60min内使盐浓度从O逐渐升到700mM 洗脱缓冲液(20mM Tris-HCl, IM NaCl, pH8. 0)，流速为 lml/min，同时根据 A280 的监测收集洗脱峰；e.使用13%的SDS-PAGE电泳进行目的蛋白纯度的检测，收集纯度较高的部分浓缩；6)分子筛凝胶色谱柱 Superdex 20010/300GL
a.用 20mM Tris-HCl, 150mM NaCl (pH8. 0)缓冲液平衡 Superdex 20010/300GL 分
子筛凝胶色谱柱至电导率保持不变；b.将样品浓缩至500ul而后转移到I. 5ml EP管中，于4°C离心机中13300rpm离心IOmin,以除去蛋白质溶液中可能存在沉淀和气泡；c.通过六通阀进行上样，然后在20mM Tris-HCl, 150mM NaCl (pH8. 0)缓冲液条件下以流速O. 5ml/min洗脱。根据A280监测的变化来收集洗脱峰；d.使用13%的SDS-PAGE电泳检测蛋白纯度，收集纯度较高的部分浓缩；e.蛋白样品浓缩稀释好后，利用紫外吸收法测定目的蛋白的浓度。
4. REGgammaLinker突变体蛋白的晶体筛选,数据收集以及结构解析I)将得到的性质以及纯度都非常好的REGgammaLinker突变体蛋白进行晶体的筛选，一周以后得到外观很好的晶体，从而进行晶体的优化。我们利用上海的同步辐射收集了一套REGgammaLinker突变体的晶体数据。2)通过HKL2000进行数据处理以后获得了较好的数据文件，通过ccp4软件中的Phaser进行相位的确定,而后通过phenix,以及COOT软件的修正,获得了 REGgammaLinker突变体的结构。REGgammaLinker突变体蛋白晶体属于P43212空间群。表2晶体衍射数据的收集和修正Parameters REGgammaLinkerData collection statisticsUnit cell parameters a=89. 0 b=89. 0 c=438. I a = β = γ =90Space group P43212Wavelength (A) 0. 97915Resolution range (A) 50 - 3. 00(3. 11 - 3. 00)Completeness (%) 86. 2 (85. 6)Redundancy 7. 9 (8. 0)Average I/ σ (1)35.5(2.8)Rmerge (%) 5. 0 (76. I)Rwork/Rfree (%) 23. 4/28. 5r. m. s. d. bonds (A) 0. 009r. m. s. d. angles (° ) I. 160Ramachandran plot (%)Most favored 95. 8实施例3、REGgamma native与REGgammaLinker突变体对蛋白酶体的激活实验酶活实验的方法参考JunLi，Martin Rechsteiner 等人 2001 年在 the EMBOJournal 上发表的文章〈〈Lysine 188substi tut ions convert the pattern of proteasomeactivation by REG γ to that of REGs a and β》中所述的REG对蛋白酶体的激活实验中的方法并稍加改进后进行。具体实验步骤如下a.空白对照加入 40ul assay buffer (50mMTris ΡΗ7· 5，25mMKClIOmMNaCl IMgCl2)。b.负对照加入 30ul assaybuffer, IOul 蛋白酶体(lOug/ml)；c.正对照加入 20ul assay buffer, IOul REG a (lOOug/ml), IOul 蛋白酶体；d.样品 I 号组加入 20ul assay buffer, IOul REGgamma Native (lOOug/ml), IOul蛋白酶体；e.样品 2 号组加入 20ul assay buffer, IOul REGgammaLinker 突变体(IOOug/ml) , IOul蛋白酶体f.将其上诉各个成分于30度混合lOmin，而后分别加入俩种不同的带有荧光基团的底物Suc-LLVY-MCA(IOul 375um) ;Boc-LRR-MCA(IOul 375um)
震荡2min，而后利用酶标仪来监测荧光产物随时间的变化(激发波长是360nm，吸收波长是460nm)每隔6min读一次数值,一个小时结束实验。蛋白酶体系统在真核细胞蛋白质蛋白质降解中起着重要作用，在细胞周期的调控，转录，信号转导，凋亡以及免疫应答方面都起着关键的作用。而本发明的人源蛋白酶体激活因子REGgamma Native是一种不依赖于泛素化及ATP的激活因子，在细胞凋亡，癌症发生方面起着重要的作用。本发明通过分子克隆的手段构建了一种全新的REGgammaLinker突变体,通过该方法得到的突变体蛋白容易进行晶体的生长，从而可以解析其结构，如附图I所示，该突变体为7聚体，含有7个REGgammaLinker突变体单体,从而为研究REGgamma母体的结构提供了理论指导。我们通过对突变体与母体的功能实验研究表明，如图2所示，该突变体与母体蛋白一样同样可以激活蛋白酶体的激活蛋白酶体的trypsin-like蛋白酶活性。因此为我们在相关的治疗癌症的药物开发上提供了一定的理论基础。本发明中所涉及的各种实验试剂耗材及用品(包括但不限于化学试剂、生物制品、细胞、、仪器等)之中，对于那些特殊的或不易获得的，文中均已注明了制造商、参考文献或详细的制备方法；未经特别说明的，均为常规实验用品。可以通过各种方式(例如购买、自行制备等)很方便的获得。
权利要求
1.一种不依赖泛素及ATP的人源蛋白酶体激活因子突变体REGgammaLinker的构建方法，经如下步骤得到 第I、根据 REGgamma的核苷酸序列及欲取代氨基酸后加入的linker,设计两对引物,分别为FPl:GCGAATTCATGGCCTCGTTGCTGAAGTTGGAT, SEQ ID No.2RPl:GCCTCGAGTCAGTACAGAGCTTCTGCATTGCT, SEQ ID No. 3 ;及I inkerI:GGAGCCGTGAGCGCAGGCCTGAAAAGCAACCAGCAG, SEQ ID No.4Iinker2:GCCTGCGCTCACGGCTCCGTGGATCTGAGTTAGGTC, SEQ ID No.5 ； 以REGgamma的全长核苷酸序列为模板，分别利用两对引物进行PCR反应，扩增取代氨基酸前端片段和后端片段，两个PCR反应中使用的引物分别为FPl/linker2，RPl/Iinkerl ;通过两个PCR反应’已经将linker前后的核苷酸序列分别克隆完成； 利用FP1/RP1 —对引物，以前面反应得到的产物作为模板进行PCR，得到linker取代60到107位氨基酸的REGgamma的全长核苷酸序列； 第2、将上步反应中得到的linker取代的PCR产物利用EcoRI和XhoI进行双酶切反应，同时载体质粒pGEX-6p-l也利用相同的酶进行双酶切反应，以使PCR产物和质粒形成相同的黏性末端；在了4连接酶的作用下，将酶切后的目的基因片段连接到pGEX-6p-l的质粒载体中，形成重组质粒pGEX-REGgammaLinker ； 第3、通过酶切鉴定该突变体基因已经连接到表达载体以后，并送测序公司进行测序以确定构建成功。
2.根据权利要求I所述的方法，其特征在于所构建的突变体REGgammaLinker进行原核表达纯化、晶体筛选以及结构解析的方法如下 第I、将权利要求I构建的重组质粒pGEX-REGgammaL inker转化到表达菌株E. coliBL21DE3 中； 第2、挑取单克隆，接种到5ml经过灭菌且添加lOOmg/lAmpicllin抗生素的LB液体培养基中，在37°C摇床中过夜培养12个小时后，转接到IL经过灭菌且添加IOOmg/IAmpicllin抗生素的LB液体培养基中，在37°C摇床中培养约4个小时后，测其OD约为O. 7，加入终浓度为O. 5mM的异丙基硫代半乳糖苷IPTG使目的蛋白进行诱导表达，16°C下诱导18个小时后离心5000rpm离心20min收集菌体，收集到的菌体用PBS缓冲液重新悬浮，PBS缓冲液组成是137mMNaCl,2. 7mM KCl，4· 3mM Na2HP04,1. 4mM KH2P04 ； 第3、悬浮好的菌液经超声波破碎并利用高速离心18000rpm 45min进行离心,离心后的上清液利用GST亲和层析柱进行初步纯化,而后利用PreScission在柱上进行酶切从而除去GST标签；酶切洗脱下的目的蛋白浓缩后利用AKTA蛋白质纯化仪，经过阴离子交换柱Resource Q和分子筛凝胶色谱柱Superdex20010/300GL进行纯化,得到经过电泳检测纯的目的蛋白； 第4、通过以上纯化步骤获得电泳纯的REGgammaLinker突变体蛋白样品，将此蛋白溶液加入Amicon超滤浓缩管中于4000rpm的转速下离心浓缩浓缩过程中将蛋白酶溶液中的150mM NaCl利用不含NaCl但其他组分相同的缓冲液进行稀释，降低蛋白酶溶液中的离子浓度，使NaCl浓度低于10mM。利用紫外吸收法测定蛋白质的浓度； 将测定浓度后的蛋白溶液利用缓冲液稀释至10mg/ml后，利用悬滴结晶法于O.lMTris、19%PEG3350w/v，0. 2M Li2SO4, 15%Glycerol, 5%, pH8. 5 异丙醇的结晶条件下获得REGgammaLinker突变体蛋白的晶体； 第5、REGgammaLinker突变体蛋白晶体的X射线衍射数据收集步骤如下 第5. I、首先使用Hampton Research公司的尼龙晶体环,从脱水以后的晶体浸泡液中获取适宜X射线衍射的单一晶体，并迅速使用Oxford Cyrosystem公司的冷却系统产生的低温氮气流中冷冻至零下150-180°C ;使X射线通过晶体，利用旋进法收集X射线衍射数据； 第5. 2、收集到晶体的X射线衍射数据后，按照以下步骤进行相应的数据处理及结构解析 首先使用HKL2000软件对上一步骤中收集得到的衍射数据进行处理，获得完整的数据文件；其次，使用CCP4程序包中的Phaser,利用分子置换(Molecular Replacement)方法，以其同源的人源蛋白酶体激活因子REG α为置换模型(PDB code: 1AV0)进行分子置换以确定其相位；通过PHENIX, COOT软件来解析REGgammaLinker突变体蛋白的结构； 第6、通过荧光短肽的酶活实验来检测突变体蛋白对蛋白酶体的激活实验。
3.根据权利要求2所述的方法,其特征在于所获得的REGgammaLinker突变体蛋白的晶体参数如下Parameters REGgammaLinkerData collection statisticsUnit cell parameters a=89. 0 b=89. 0 c=438. I a = β = γ =90Space group P43212Wavelength (A) 0. 97915 Resolution range (A) 50 - 3. 00 (3. 11 - 3. 00)Completeness (%) 86. 2 (85. 6)Redundancy 7. 9 (8. 0)Average I/ σ (I) 35. 5(2. 8) Rmerge (%) 5. 0 (76. I)Rwork/Rfree (%) 23. 4/28. 5r. m. s. d. bondi ( \i 0. 009r. m. s. d. angles ()1. 160Ramachandran plot (%)Most favored 95.8。
全文摘要
本发明内容为人源非依赖于泛素化及ATP的一种结构上更加稳定的蛋白酶体激活因子REGgamma突变体REGgammaLinker的构建方法。该方法主要通过分子克隆的手段，分别进行俩次不同的PCR，将原有的REGgamma的60位到107位的氨基酸用六肽Linker(GAVSAG)来取代，从而得到一种更加稳定的突变体。并且对该突变体蛋白进行了原核表达，纯化以及晶体筛选以及结构解析。通过与母体蛋白结构与功能上的实验分析，证明通过该本发明的方法可以获得结构稳定，对蛋白酶体的激活功能没有影响，从而对以后对REGgamma蛋白在生物学上的研究，以及药物开发等方面提供了理论依据。
文档编号C07K14/47GK102899329SQ201210439608
公开日2013年1月30日 申请日期2012年11月7日 优先权日2012年11月7日
发明者马克·巴特兰姆, 饶子和, 李平, 李鑫, 王莹莹 申请人:南开大学