专利名称：一种采用大孔树脂分离制备合欢皮皂苷的方法
技术领域：
本发明涉及一种采用大孔树脂分 离制备合欢皮皂苷的方法。
背景技术：
合欢属Albizzia为豆科含羞草亚科植物,是Albizzia julibrissin Durazz的树皮，是我们常用的传统中药，具有解郁安神、活血消肿之功效，传统上用于治疗心神不安，忧郁失眠，跌打伤痛，肺痈疮肿等。现阶段，人们对合欢皮不同化学组分进行药理学研究，发现合欢皮的多种药理作用①镇静安神作用合欢皮属养心安神药，长期临床使用证明其有显著的宁心安神作用，对精神刺激所致失眠疗效较佳。②抗抑郁作用临床方剂合欢汤具有解郁作用，其作用机理与兴奋大脑皮层有关。③抗生育作用其茎皮的水提物有增强节律和收缩多种动物和人的子宫肌条、抗早孕和终止中期妊娠以及杀伤精子的作用。④抗肿瘤作用其茎皮醇提取液中能有效地抑制Yoshida肿瘤，体外具有较强的肿瘤细胞毒活性。其中，根据文献报道，用乙醇回流方法提取合欢皮，提取物中含大量皂苷类物质，很多药理学实验证明，该方法提取出的提取物(主要成分为皂苷)，具有抑制小鼠实体瘤生长及体外抑制肿瘤细胞生长的作用。本发明在前期实验的基础上，探讨合欢皮乙醇回流提取后大孔吸附树脂分离皂苷的工艺参数，确定合理有效的纯化路线。大孔吸附树脂是一类有机高聚物吸附剂，其特点表现在稳定性好，受pH、温度及其他因素影响小，分离量大，树脂可重复利用，工艺容易放大等方面。大孔吸附树脂分离法在对中药及其复方中对有效部位或有效成分的提取、分离、纯化、富集过程中，显示出独特的作用，已经广泛应用在中药的皂苷类、黄酮类、生物碱类等有效成分或有效部位的制备工艺中。影响大孔吸附树脂分离效率的因素很多，包括树脂型号、树脂用量、树脂预处理方法、树脂柱径高比、吸附方式、PH值、吸附样品的浓度、提取液中被分离化合物极性强弱及分子量大小差异、洗脱液的种类与浓度、洗脱流速等。
发明内容
本发明的目的是提供一种运用大孔树脂色谱法分离制备合欢皮皂苷的方法。本发明的技术方案所述运用大孔树脂分离制备皂苷的方法，制备合欢皮乙醇提取物，经Dltll型号大孔吸附树脂分离，其径高比为I : 5，样品吸附时间为2h，依次采用蒸馏水、30%乙醇、70%乙醇溶液各3倍体积洗脱，洗脱流速为I. 5mL/min,收集70%乙醇洗脱流份，回收乙醇，冷冻干燥即得合欢皮总皂苷冻干粉。
图I是不同型号大孔树脂静态吸附实验结果；图2是不同型号大孔树脂静态洗脱实验结果；图3是静态吸附时间考察结果；图4是动态吸附解析考察结果；图5是乙醇洗脱液体积考察结果；图6是乙醇洗脱剂浓度考察结果；图7是流速考察实验结果；图8是径高比考察实验结果。
具体实施例方式实施例I :合欢皮乙醇提取物的制备称取合欢皮，加入60倍量70%乙醇，加热回流提取2次，每次2. 5h，合并浓缩得合欢皮提取液，冷冻干燥备用。实施例2 :大孔吸附树脂型号的确定称取合欢皮乙醇提取物冻干粉溶于蒸馏水，配制I. 617mg/mL溶液。大孔吸附树脂AB-8、D101, D201, D301四种型号分别用95%乙醇浸泡24h，湿法装柱，95%乙醇淋洗5BV，去离子水淋洗5BV，备用。分别称取2g预处理好的树脂，置于IOOmL三角瓶中，在室温下分别加 入合欢皮乙醇回流提取物冻干粉溶液(I. 617mg/mL)7mL，摇匀使其达到充分吸附，室温下静置。分别于4，8，12，16，20，24h吸取上清液，回收溶剂，重新用蒸馏水溶解，检测各总皂苷含
量。按下式计算树脂吸附率
吸附率(%)-总、辅廳*贿-_垢能韻 ~初始总皂苷质量浓度总皂苷含量的测定等体积无水乙醚萃取三次，合并水相，等体积水饱和正丁醇萃取三次，合并正丁醇相，回收溶剂，甲醇溶解残渣并定容至10mL，4°C保存备用。准确吸取O. ImL溶液于比色管中，加入O. 3mL 5%香草醛-冰醋酸溶液和O. 8mL高氯酸，60°C反应30min,再加冰醋酸定容至5mL，测定溶液0D56(I。齐墩果酸对照品在O. 02 O. 2mg范围内与吸光度呈良好的线性关系，回归方程为y = 8. 9742X+0. 0551，(R2 = O. 9971)，计算各组样品的总阜苷含量。以上样品溶液过滤除去上清液，树脂均用20mL 95 %的乙醇浸泡室温下浸泡2h，每隔5min振摇10s，充分解析后过滤得到上清液，检测其总皂苷含量。按下式计算解吸率
解析率(%)=(解析液总皂苷浓度X解析液体积)x 100%
总皂苷吸附量由图I和2可见，四种树脂都有较高的静态吸附率，12h后均可达到80%左右，而D101大孔吸附树脂吸附4h后解析率达到91.6%。综合考虑价格、应用范围等因素，采用Dltll型大孔吸附树脂进行合欢皮的分离纯化。实施例3 :单因素实验优化Dltll大孔吸附树脂分离总皂苷吸附时间的考察分别准确称取预处理过的Dltll大孔吸附树脂置于6个IOOmL三角瓶中，在室温下分别加入含I. 5mg合欢皮乙醇回流提取物的水溶液，分别静置吸附O. 5h，lh，2h，4h，6h，8h。过滤，回收乙醇溶剂，沉淀用蒸馏水溶解，取上清液，检测总皂苷含量，计算静态吸附率。由图3所示，吸附时间达到2h之前，合欢皮总皂苷的吸附率明显提高，而2h之后则无明显增加，因此吸附时间为2h可在较短时间内达到较高的吸附效率。动态吸附量的考察合欢皮乙醇回流提取物溶液按流速为I. 5mL/min连续滴入到柱体积为50mL预处理过的Dltll大孔吸附树脂柱，每IOmL收集I个流份，回收乙醇溶剂，用蒸馏水重新溶解，检测树脂柱饱和后流出液中总皂苷含量，绘制动态渗漏曲线。由图4可知，随着上样量的增加，流出液中总皂苷的累加量也随之增加，当加样量达到160mL，即25. 638mg时，流出液中总皂苷质量达到稳定，即大孔树脂动态吸附达到饱和，继续上样会导致总皂苷都随流出液流出而损失。但因动态吸附没有考虑静态吸附时间的因素，因此，实际最大上样量会大于动态吸附的最大上样量。洗脱剂用量考察经预处理的Dltll树脂湿法装柱，柱体积为60mL，合欢皮乙醇回流提取物上样量为56. 773mg，吸附时间为2h，用蒸馏水洗脱6BV后，采用70%乙醇溶液洗脱6BV,洗脱流速为I. 5mL/min,收集70%乙醇洗脱流份，每20mL收集一个，检测各合欢皮总皂苷的含量，计算合欢皮总皂苷的洗脱率。由图5可见，合欢皮总皂苷集中在前3个洗脱柱体积中被解析下来，洗脱率达到64. 20%。因此，为提高效率，节省溶剂，选用3BV的70%乙醇进行解析即可达到较高的洗脱效率。
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乙醇洗脱液体积分数对洗脱的考察经预处理的Dltll树脂湿法装柱，柱体积为50mL，合欢皮总皂苷上样量为84. 7mg，吸附时间为2h，依次用蒸馏水，30 %，50 %，70 %，95%乙醇溶液各3BV洗脱，洗脱流速为I. 5mL/min,每30mL收集一个流份，共收集25份，测定各合欢皮总皂苷的含量，并计算其洗脱率。由图6可见，合欢皮总皂苷集中在50%和70%乙醇洗脱液中，因此从节约工业生产成本方面考虑，吸附后首先用蒸馏水、30%乙醇依次洗脱除杂，然后选用70%乙醇直接洗脱，得到总皂苷提取物。洗脱速度考察经预处理的Dltll树脂湿法装柱，柱体积为50mL，合欢皮总皂苷上样量为55. 76mg，吸附时间为2h，依次用蒸馏水和70%乙醇溶液各3BV洗脱，洗脱流速分别为1.5、3、5、7、10mL/min，收集洗脱液，检测各合欢皮总皂苷的含量，并计算其洗脱率。由图7所示，随着洗脱流速的增加，洗脱率有明显的降低，从75. 98%逐渐降低至51. 19%，因此，片面增加流速并不能提高合欢皮总皂苷的洗脱效率，应选择I. 5mL/min较为适宜。D101大孔吸附树脂的径高比考察选取(3cmX30cm)玻璃层析柱，填充预处理的DlOl树脂，使层析柱径高比分别为I : 3，1 5,1 7,1 10，各加入最大上样量，吸附时间为2h，依次用O和70%乙醇溶液各3BV洗脱，洗脱流速为I. 5mL/min,收集O和70%乙醇浓度乙醇洗脱液，并进行合欢皮总皂苷的含量测定,并计算合欢皮总皂苷的洗脱率。由图8所示，在径高比为I : 5时，合欢皮总皂苷解析率明显高于其他各组，达到89. 52%，因此径高比选择I : 5。实施例4:工艺验证按以上工艺优化实验结果，在三天中分别进行不同批次的重复性实验，分离工艺参数为使用D皿型号大孔吸附树脂装柱，径高比为I : 5，柱体积约为60mL，合欢皮乙醇提取物冻干粉的上样量为782mg (含总皂苷32. 4mg)，上样吸附时间为2h，采用蒸馏水、30%乙醇、70%乙醇、95%乙醇溶液各3BV洗脱，洗脱流速为1.5mL/min。收集70%乙醇洗脱流份，进行萃取，干燥，制备冻干粉，进行合欢皮总皂苷的含量测定，并计算合欢皮总皂苷的洗脱率。实验结果如表I所示，三批实验得到的结果相对稳定，70%乙醇洗脱流分中，合欢皮总皂苷的洗脱率平均达到86. 06±5. 14% ;流份中总皂苷含量为63. 18±2. 17%，而上样时仅为4. 14%。表I工艺验证结果(η = 3)
权利要求
1.一种采用大孔树脂分离制备合欢皮皂苷的方法。其特征在于，首先制备合欢皮乙醇粗提物，经Dltll型号大孔吸附树脂分离，其径高比为I : 5，样品吸附时间为2h，依次采用蒸馏水、30%乙醇、70%乙醇溶液各3倍体积洗脱，洗脱流速为I. 5mL/min,收集70%乙醇洗脱流份，回收乙醇，冷冻干燥即得合欢皮总皂苷。
2.根据权利要求I所述，其应用包括合欢皮总皂苷的分离制备及规模化生产。
3.根据权利要求I和2所述，其应用包括用于制备药物制剂，食品和保健品。
全文摘要
本发明涉及一种采用大孔树脂分离制备合欢皮皂苷的方法，其特征是首先制备合欢皮乙醇提取物，经D101型号大孔吸附树脂分离，其径高比为1∶5，样品吸附时间为2h，依次采用蒸馏水、30％乙醇、70％乙醇溶液各3倍体积洗脱，洗脱流速为1.5mL/min，收集70％乙醇洗脱流份，回收乙醇，冷冻干燥即得合欢皮总皂苷冻干粉。本发明为分离纯化合欢皮皂苷的工艺参数，为其规模化生产提供参考。
文档编号C07H1/08GK102940666SQ201210512780
公开日2013年2月27日 申请日期2012年12月5日 优先权日2012年12月5日
发明者邱丽颖, 冯磊, 谭莹, 陈爽 申请人:江南大学