专利名称：人抗表皮生长因子受体抗体的制作方法
技术领域：
本发明关系到表皮生长因子受体(EGFR)特异的单克隆抗体。这些抗体可以用于治疗含肿瘤性疾病和过度增生性疾病在内的疾病。
背景技术：
正常细胞的增生是通过生长因子酪氨酸激酶(RTKs)被其各自的配体激活所致，该过程是高度受控的。虽然肿瘤细胞的增生也是通过生长因子受体激活达成，但却失去了对正常增生的精确控制。许多因素可以导致这种失控，如生长因子和/或受体的过度表达，生长因子所调节的生物化学通道的自主激活。涉及到肿瘤生成的RTKs的例子有表皮生长因子受体(EGFR)、血小板源性生长因子(TOGFR)、胰岛素样生长因子(IGEF)、神经生长因子(NGEF)和成纤维细胞生长因子(FGF)。这些生长因子与其细胞表面的受体的结合导致受体被激活，从而激活并改变信号传导通路，引起细胞增生和分化。表皮生长因子(EGF)受体家族成员为特别重要的与表皮细胞的肿瘤化有关的生长因子受体酪氨酸激酶。最早发现的EGF受体家族成员为在许多类型的肿瘤细胞上都有表达的EGFR。EGFR被发现涉及到调节肿瘤细胞的分裂、生长、修复、存活、血管生成、浸润和转移。EGFR是一个170kD的跨膜糖蛋白，有一个细胞外配体结合功能域、穿膜区段和一个细胞内蛋白酪氨酸激酶功能域。刺激EGFR的配体包括表皮生长因子(EGF)、转化生长因子(TGF-α )、肝素结合生长因子(HBGF)、β -cellulin和Cripto-1。配体的特异性结合引起EGFR自主磷酸化，从而活化细胞内酪氨酸激酶功能域并启动调节肿瘤生长和存活的多种信号传导通路。EGFR通路也影响肿瘤内其他血管生成因子，如VEGF和碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)的产生。激活EGFR的生长因子被认为也在肿瘤血管生长中发挥重要作用。血管生成指从胚胎和成年生物体已有的血管上形成毛细血管，是已知的肿瘤生长、存活和转移的关键因素。有报道称EGFR介导的肿瘤细胞刺激导致血管生成因子，血管内皮生长因子(VEGF)、白介素-8(IL-8)和碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)的表达增强，从而引起肿瘤相关的血管内皮细胞的活化。肿瘤相关的血管内皮细胞的刺激也可通过肿瘤产生的生长因子，如TGF- a和EGF激活自身的EGF受体引起。已有人体肿瘤表达和过量表达EGFR的报道，EGFR的表达与不良预后、低存活率和/或高转移率成相关关系。EGFR，由于涉及到肿瘤形成，已经成为抗肿瘤治疗的特异性靶目标。这些治疗主要包括阻断配体结合到受体细胞外功能域的单克隆抗体或直接作用于细胞内区段以防止信号传导的合成的酪氨酸激酶抑制剂。例如,Cetuximab Mab(.ERB丨TUX )为一种能够与人EGFR细胞外功能域特异性结合的重组人/鼠嵌合的单克隆抗体，Cetuximab是一种阻断配体与EGFR结合、防止受体活化，从而抑制表达EGFR的肿瘤细胞生长的EGFR拮抗剂。西妥昔单抗(Cetuximab)已被批准与依立替康联合或单独用药以治疗表达表皮生长因子受体的、对基于依立替康的化疗无效或不耐受的转移结肠直肠癌患者。西妥昔单抗也已显示出其对银屑病的效果。
发明内容
本发明提供特异于EGFR、优选特异于包括选自含有SEQ ID NO :2、SEQ ID NO :4、SEQ ID NO 6, SEQ ID NO 10, SEQ ID NO 12, SEQ ID NO : 14 的一组序列的 EGFR 细胞外区的从I到6的互补决定区的任何区域的单克隆抗体或其片段。优选抗体为人源性抗体，更优选的是本发明中的抗体或其片段含有SEQ ID NO 2, SEQ ID NO :4、SEQ ID NO :6。可选但也是优选的是本发明中的抗体或其片段含有SEQ ID NO 10, SEQ ID NO 12, SEQ ID NO:
14。更为优选的是本发明中的抗体或其片段含有SEQ ID NO :8重链可变区和SEQ IDNO : 16轻链可变区。本发明中的这些抗体或其片段具有多种特性，包括中和EGFR及防止EGFR的 配体与其受体的结合的能力。此外，本发明提供编码本抗体及其片段的分离的多核苷酸，同时也提供含有被操作性地连接到表达序列上的这些多核苷酸序列的表达载体。本发明也提供含有表达载体或其子代的重组宿主细胞，该细胞表达本发明中的抗体或其片段。本发明还提供生产这些抗体或其片段的方法，包括在一定条件下培养细胞以使抗体或其片段得以表达，然后从细胞或细胞培养基中纯化获得抗体或其片段。同时，本发明提供在哺乳动物体内治疗肿瘤生长的方法，包括给予哺乳动物有效剂量的本抗体。本抗体也可同与其他PTKs结合的抗体一起给药。本方法也包括给予哺乳动物抗肿瘤药物或抗肿瘤治疗，包括例如某种化疗药物和/或放射治疗。在某些实施方案中，肿瘤生长受到抑制。在优选实施方案中，治疗引起肿瘤消退。本发明还提供治疗哺乳动物非癌性增生性疾病，即银屑病的方法，包括给予哺乳动物有效剂量的本抗体。
图1A和图1B :表达免疫球蛋白的克隆载体pDFC和pEE12. 1L。图1C :含有全长单链人抗EGFR抗体基因的载体质粒pGS-11F8.图2 pGS-llF8的酶切图谱。DNA大小标记以kb为单位指示在DNA梯上。图3 =ELISA法测定MC-C11F8和MC-C225与EGFR在体外的结合。图4 IMC-11F8和MC-C225与125I标记的EGF在体外与EGFR竞争结合的结果。图5 IMC-11F8和MC-C225对BxPC3细胞内的EGFR磷酸化的效应，所用对照抗体为 IMC-1CIIo图6 IMC-11F8 和 MC-C225 抑制 A431 细胞中 EGFR 磷酸化。图7 :显示抑制A431细胞内EGFR的磷酸化。在未刺激的对照细胞(I道)、EGF (2道)、MC-C225(3道)、MC-11F8(4道)和对照抗体(5道)存在下的EGFR的磷酸化的Western blot分析。图7A :用抗磷酸化酪氨酸抗体显示的磷酸化的EGFR。图7B :被刺激细胞内的总EGFR。
图8 :各种浓度的MC-11F8抑制EGF刺激的EGFR磷酸化。图8A显示用抗磷酸化酪氨酸抗体对未刺激对照细胞(I道)、未用MC-11F8抗体处理的刺激细胞(2道)、15 μ g/ml (3 道)、3 μ g/ml (4 道)和 O. 6 μ g/ml (3 道)IMC-11F8 中的 EGFR 进行的 western blot 分析。图8B显示的是总EGFR。图9 :通过MTT试验检测MC-11F8UMC-C225和对照抗体对DiFi细胞增生的抑制。图10 :用MC-11F8或MC-C225 (ERBITUX )处理的51Cr标记的DiFi细胞的特异
性裂解。图11 :A431肿瘤细胞在用MC-11F8或頂C-C225 (西妥昔单抗(Cetuximab))治疗的鼠体内的生长。未处理过的鼠用作肿瘤生长的对照。
图12 BxPC3肿瘤细胞在用MC-11F8或MC-C225 (西妥昔单抗(Cetuximab))治疗的鼠体内的生长。未处理过的鼠用作肿瘤生长的对照。图13 :用生理盐水或MC-11F8治疗的异种移植人源肿瘤的裸鼠的免疫组化染色。图A和B:生理盐水或頂C-11F8治疗的A431异种移植的裸鼠；；图(和0:生理盐水或MC-11F8治疗的BxPC3异种移植的裸鼠；图E和F :Ki_67染色的生理盐水(E)或IMC-11F8 (F)治疗的A431异种移植的裸鼠。图14 IMC-11F8联合CPT-1l抑制裸鼠体内异种移植的人结肠直肠癌。人直肠癌GEO (图A)、DLD-1 (图B)、或HT-29 (图C)异种移植的裸鼠，用生理盐水或O. 3mg或1. Omg的IMC-11F8腹膜内注射，一周两次单独给药，或与IOOmg/公斤、一周一次的CPT-1l联合给药。每周两次测定肿瘤的大小。数据为各组10只动物肿瘤测定的平均值土标准差。(D)经MC-11F8单独给药或联合CPT-1l给药处理的肿瘤的消退。各处理组含10只载瘤动物。
具体实施例方式本发明提供特异于EGFR的单克隆抗体和其片段，同时提供编码该抗体的分离的或纯化的多核苷酸序列。本发明的抗体优选人抗体并能用于肿瘤性疾病，包括实体或非实体肿瘤的治疗以及过度增生性疾病的治疗。典型的天然抗体具有两条相同的重链和两条相同的轻链，两条轻链通过一个链间二硫键联接到重链上，两条重链进一步通过多个二硫键相互被联接到一起。各条链能够折叠成具有相似大小(110-125氨基酸)和结构但功能各异的功能域。轻链可含有一个可变区(\)和/或一个恒定区(CJ。重链也可含有一个可变区和/或根据抗体的组或型的不同，含有三个或四个恒定区((^、(^、(^和^)。在人体，抗体有IgA、IgD、IgE、IgG和IgM型，IgA和IgG进一步分为亚组或亚型(IgAp2和IgG1J。通常，可变区的氨基酸序列在不同抗体间有很大变化，尤其是抗原结合区。各'和Vh上有三个被称为超变区或互补决定区(CDRs)，由序列变化较小的被称为骨架区的可变区域支撑。抗体上组成为\和Vh区的部分被称为Fv (可变片段)并构成抗原结合位点，单链Fv(ScFv)为在一条多肽链上含有'和Vh的抗体片段，其中一个区的N端与另一个区的C端通过一个柔性接头(flexible linker)相连(参见,例。美国专利号4946778 (Ladner等)；W088/09344, (Huston 等)；W092/01047 (Mccafferty 等)描述了将 scFv 片段展示在可溶性重组基因展示包装如噬菌体表面上。
用于产生单链抗体的肽接头可以是柔性肽，选来确保'和Vh的正确的三维折叠能够形成。接头通常为10到15个氨基酸残基，优选为10到30个氨基酸残基，更优选的为12到30个氨基酸残基，最优选的接头为15到25个氨基酸残基，这些接头肽的一个例子包括(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)3(SEQ ID NO: 19)。单链抗体缺乏作为它们来源的全抗体的所有或部分恒定区，这样，它们就能避免全抗体使用时出现的某些问题。例如，单链抗体一般没有某些重链恒定区与其他生物分子之间的不期望发生的相互作用。此外，单链抗体比全抗体小很多，比全抗体更易于渗透，因而能够更有效地定位并结合到靶抗原结合位点上去。再者，单链抗体相对小的体积使它们与全抗体相比不易在受试者体内引起不必要的免疫反应。
多单链抗体，通过第一个肽接头将一个\和Vh区共价相连的各单链，可以通过至少一个或多个肽接头共价连接形成多价单链抗体，它可以是单特异性或多特异性的。多价单链抗体的各链包括一个可变轻链片段和一个可变重链片段，通过一个肽接头连接到至少一个其他链上。肽接头至少含有15个氨基酸残基，氨基酸残基最多为100左右。两个单链抗体可以结合形成一个双抗体，也被称为二价二聚体。双抗体有两条链和两个结合位点，可以是多特异性的或双特异性的。双抗体的各链包括一个连接到一个\区的Vh区。这些功能区通过很短的接头连接以避免同一条链上的功能区发生配对，这样，促使不同链上的互补区发生配对形成两个抗原结合位点。三个单链抗体可结合形成三抗体，被称为三价三聚体。三抗体通过将一个\区或Vh区的氨基端直接连接到一个\区或Vh区的羧基端构成，即没有任何接头序列。三抗体有三个Fv头，多肽以环状、头尾融合模式排列。一种可能的三抗体构型为一个平面，三个结合位点在该平面上相互间成120°的角度。三抗体可以是单特异性、双特异性或三特异性的。Fab (抗原结合片段(Fragment, antigen binding))指组成为 \、Cl> Vh 和 ChI 区的抗体片段。那些经过木瓜蛋白酶水解产生的片段被称为Fab，它们不含重链绞链区。经胃蛋白酶水解后，形成含有重链绞链区的Fabs。那些带有完整链间二硫键的双价片段被称为F(ab’ )2,当二硫键未能保留时形成单价的Fab’。F(ab’ )2较Fab’对抗原有更高的亲合力。Fe(可结晶段(Fragment crystallization))是指含有配对的重链恒定区的抗体部分或片段。对IgG抗体来说，例如，Fe段含Ch2和Ch3区，IgA和IgM的Fe段进一步含有Ch4区。Fe段关系到与Fe受体的结合，激活补体介导的细胞毒性和抗体依赖的细胞毒性反应(ADCC)。IgA和IgM这样的抗体，是多个IgG样蛋白的复合物，复合物的形成需要Fe段的恒定区。最后，绞链区将抗体的Fab和Fe段分开，并赋予Fabs与Fabs之间和Fabs与Fe之间的活动性，同时含有将两条重链连接起来的多个二硫键。这样，本发明的抗体包括，但不限于与抗原特异性结合的天然抗体、二价片段如F(ab’)2、单价片段如Fab、单链抗体、单链Fv(scFv)、单功能区抗体、多价单链抗体、双抗体、三抗体及其他与抗原特异性结合的类似物。本发明中的抗体或其片段特异于EGFR。抗体特异性指抗体选择性地识别一个特殊的抗原表位。本发明中的抗体或其片段，例如，可以是单一特异性的或双特异性的。双特异性抗体(BsAbs)为有两种不同的抗原结合特异性或位点的抗体。当抗体具有一个以上的特异性时，被识别的表位可以涉及到单个抗原或一个以上的抗原。因此，本发明提供能结合到两个不同的抗原，其中至少一个为EGFR特异的双特异性抗体或其片段。本发明中的抗体或其片段对EGFR的特异性可以根据其亲和力(affinity)和/或亲合力(avidity)来确定。代表一种抗原和一种抗体的离解平衡常数的亲和力(affinity)测定的是抗原决定簇与抗体结合位点之间的结合强度。亲合力测定的是抗体与其抗原间的结合强度。亲合力(Avidity)既关系到一个表位与其抗体上的抗原结合位点的亲和力(affinity),又关系到抗体的价位，即针对一个特殊表位的抗原结合位点的数量。抗体结合的典型离解常数(Kd)为10_5到10_n升/mol。任何离解常数小于10_4的结合通常被认为是非特异性结合。Kd值越小，抗原决定簇与抗体结合位点间的结合强度越强。这里所使用的“抗体”和“抗体片段”包括保留了对EGF受体特异性的经过修饰的产物。这些修饰产物包括但不限于与一个效应分子，如化学治疗药物(如顺钼、taxol、阿霉素)或细胞毒素(如一种蛋白或非蛋白的有机化学治疗药物)的结合。抗体还可以通过与可检测的报告分子连接进行修饰。另外修饰也包括对抗体的非结合特性，如半衰期的修改。
蛋白和非蛋白药物可以通过本领域所知的方法连接到抗体上。连接方法包括直接连接、通过共价连接接头连接和配对特异性连接(如亲和素-生物素)。这些方法包括Greenfield等在Cancer Research50,6600-6667 (1990)所描述的连接阿霉素的方法和 Arnon 等在 Adv. Exp. Med. Biol. 303，79-90 (1991)、Kiseleva 等在 Mol. Biol. (USSR) 25，508-514(1991)上所描述的连接钼化合物的方法。本发明中的抗体或其片段的同类物也包括其氨基酸序列与这里公开的全长抗EGFR抗体的可变或超变区的氨基酸序列基本相同的多肽。基本相同的氨基酸序列这里被定义为至少70%、优选80%、更优选为90%的同源性，正如按照Pearson和Lipman(Proc.Natl. Acad. Sc1. USA85, 2444-8)的方法通过FASTA搜寻确定的包括至少70 %、优选至少80%、更优选为至少90%的相同的序列。这些抗体具有与本发明的含有SEQ ID NO 8和SEQ ID NO 16的抗体相同的或相似的结合、配体阻断和受体中和活性，特别是其中具有保守氨基酸取代。保守氨基酸取代被定义为通过在肽、多肽或蛋白或其片段上改变一个或多个氨基酸而引起的氨基酸组成的改变，取代物通常为具有相似特性(例如酸性、碱性、芳香族、大小、正电或负电、极性、非极性)的氨基酸以使取代不会在本质上改变相关的肽、多肽或蛋白的特性(如电荷、等电点、亲和力、亲合力、构型、溶解性)或活性。典型的保守取代物在同组氨基酸内选择，这些组包括但不限于(I)疏水氨基酸甲硫氨酸(M)、丙氨酸(A)、缬氨酸(V)、亮氨酸(L)、异亮氨酸(I)(2)亲水氨基酸胱氨酸(C)、丝氨酸⑶、苏氨酸⑴、天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)(3)酸性氨基酸天冬氨酸⑶、谷氨酸(E)(4)碱性氨基酸组氨酸⑶、赖氨酸⑷、精氨酸(R)(5)芳香族氨基酸苯丙氨酸(F)、酪氨酸⑴、色氨酸(W)(6)影响链方向的残基gly、pro。本发明的抗体进一步包括那些通过直接突变、亲和力成熟、噬菌体展示或链改组方法改进了结合特性的抗体。通过CDRs突变和筛选具有期望特性的抗原结合位点可以改变或改进亲和力和特异性(参见，例如，yang等，J. Mol. Biol.，254 :392-403 (1995)。许多方法可使CDRs突变，一个方法是随机化单个残基或残基的组合，以使在一组其它都相同的抗原结合位点上，所有20个氨基酸在特殊的位置出现。或者，突变可以通过易错PCR法导入各种 CDR 残基(参见，例如，Hawkins 等，J. Mol. Biol, 226 :889-896 (1992))。例如，含有重链和轻链可变区基因的噬菌体展示载体可以在大肠杆菌的突变株中扩增(参见，例如，Low等，J. Mol. Biol, 250 =359-368 (1992))。这些致突变方法是对本领域技术人员所知的许多方法的说明。本发明的抗体的各功能区可以是完整的免疫球蛋白功能区(例如，重链或轻链可变区或恒定区)，或者是天然功能区的功能性等同物或突变体或衍生体，或者是，例如，用W093/11236 (Griffiths等)中描述的技术在体外构建合成的功能区。例如，将对应于抗体可变区的、其中至少有一个氨基酸缺失的各功能区连接在一起是可能的。抗体的特征性本质是有抗原结合位点。术语可变重链和轻链片段不应该被理解为不包括那些在特异性上没有实际影响的变异体。本发明中的抗体或其片段为人抗体，有一、二、三、四、五和/或六个互补决定区(CDRs)，选自一组由 SEQ ID NO :2、SEQ ID NO :4、SEQ ID NO :6、SEQ ID NO 10, SEQ ID NO:12,SEQ ID NO :14组成的序列。优选本发明的抗体(或其片段)的⑶Rs为SEQ ID NO :2、SEQ IDNO :4、SEQ ID NO 6序列，可选但也优选的，本抗体或其片段的CDRs为SEQ ID NO 10、SEQ ID NO :12、SEQ ID NO 14序列。这些CDRs的氨基酸序列列在表I中。表I
权利要求
1.治疗有效量的分离的、与人EGFR特异结合的人抗体或其Fab片段在制备用于在哺乳动物中抑制肿瘤生长的药物中的用途，其中，所述的肿瘤选自结肠直肠肿瘤、头颈部肿瘤、胰腺肿瘤、肺肿瘤，其中所述抗体或其Fab片段含有以下的互补决定区如序列SEQ IDNO: 2所示的CDRHl，如序列SEQ ID NO: 4所示的CDRH2，如序列SEQ ID NO: 6所示的CDRH3，如序列SEQ ID NO: 10所示的CDRLl，如序列SEQ ID NO: 12所示的CDRL2和如序列SEQ IDNO: 14 所示的 CDRL3。
2.权利要求1所述的用途，其中所述抗体或其Fab片段与抗肿瘤药物联合用药。
3.权利要求2所述的用途，其中抗肿瘤药物为化疗药物。
4.权利要求2所述的用途，其中抗肿瘤药物为依立替康CPT-1I。
5.权利要求2所述的用途，其中抗肿瘤药物为放射线。
全文摘要
本发明涉及人抗表皮生长因子受体抗体。具体地，本发明提供了全长人抗体，其与人EGFR的结合亲和力高于IMC-C225，并能中和EGFR活性。该抗体包括完整免疫球蛋白、单价Fab和单链抗体、多价单链抗体、双抗体、三抗体和单区域抗体。本发明还提供编码并表达这些抗体的核酸、宿主细胞和动物。本发明进一步提供单用或与其它药物联用该抗体中和EGFR活性、治疗哺乳动物肿瘤生长和非癌性过度增生疾病的方法。
文档编号C07K16/28GK103007279SQ20121050999
公开日2013年4月3日 申请日期2005年3月21日 优先权日2004年3月19日
发明者M.刘, Z.朱 申请人:英克隆有限责任公司