诊断和治疗多发性硬化症的方式和方法
【专利摘要】本发明涉及一种包含SEQ?ID?NO:3中示出的序列的至少8个连续氨基酸残基、或者由SEQ?ID?NO:3中示出的序列的至少8个连续氨基酸残基构成的肽或相应的肽模拟物，条件是所述肽不由SEQ?ID?NO:3中示出的序列构成，其中所述肽或肽模拟物结合至来自患者的样本中包含的抗-KIR4.1抗体，所述患者具有多发性硬化症或对其的易患病体质，其中优选（i）所述至少8个连续氨基酸残基是KIR4.1胞外域的子序列，所述胞外域由SEQ?ID?NO:1或2中示出的序列构成；或（ii）所述肽包含SEQ?ID?NO:1或2的序列或由SEQ?ID?NO:1或2的序列构成。本发明另外涉及一种用于诊断主体中多发性硬化症或对多发性硬化症的易患病体质的方法，所述方法包括测定获自所述主体的样本中抗-KIR4.1抗体的存在，其中所述样本中抗-KIR4.1抗体的存在指示多发性硬化症或对多发性硬化症的易患病体质。还提供了用于多发性硬化症治疗的新方式和方法。
【专利说明】诊断和治疗多发性硬化症的方式和方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种包含SEQ ID NO:3中示出的序列的至少8个连续氨基酸残基、或者由SEQ ID NO: 3中示出的序列的至少8个连续氨基酸残基构成的肽或相应的肽模拟物(peptidomimetic),条件是所述肽不由SEQ ID NO: 3中示出的序列构成，其中所述肽或肽模拟物结合至患者样本中包含的抗-KIR4.1抗体，所述患者患有多发性硬化症或具有多发性硬化症的易患病体质，其中优选(i)所述至少8个连续氨基酸残基是KIR4.1胞外域(胞外结构域，extracellular domain)的子序列(亚序列),所述胞外域由SEQ ID N0:1或2中示出的序列构成；或(^)所述肽包含SEQ ID NO: 1或2的序列或由SEQ ID NO: 1或2的序列构成。本发明另外涉及一种用于诊断主体中多发性硬化症或对多发性硬化症的易患病体质的方法，所述方法包括测定获自所述主体的样本中抗-KIR4.1抗体的存在，其中所述样本中抗-KIR4.1抗体的存在指示多发性硬化症或对多发性硬化症的易患病体质。 【背景技术】
[0002]在本说明书中，引用了许多文献，包括专利公开和制造商的手册。这些文献的公开内容，尽管不考虑对本发明的专利性相关，但都以其全文结合于本文中作为参考。更特别地，引用的所有文件都以相同程度结合于本文中作为参考，就如同每个单独的文献专门而各个指出结合到本文中作为参考。
[0003]多发性硬化症(MS)是导致绝大多数受病患者残疾的最常见的中枢神经系统(CNS)慢性炎症性疾病(1)。MS的病因未知，但流行病学证据表明是遗传和环境因素之间的复杂相互作用(2-4)。各个患者结局的不确定性致病机理、临床异质性和不可预测性增加了这种疾病的复杂性(5)。
[0004]MS发病机理目前正在流行的假说认为，自身反应性T细胞发挥了核心作用(6)。然而，组织病理学的研究已经发现了一部分MS患者在急性脱髓鞘病灶中表现出显著沉积免疫球蛋白和补体激活(7，8)。这些患者对治疗性血浆交换的反应尤其好(9)。此外，治疗性单克隆抗体的B-细胞耗竭在MS中对发炎活性有着突出的影响(10)。所有这些发现都支持的论点是，至少在一部分(subset，亚群)MS患者中B细胞和抗体大大有助于此病的发生和发展(11，12)。尽管存在这样的间接证据，然而MS中临床上相关抗体的直接证据还尚未建立，这是因为MS中体液反应的特异性分子靶标仍未被发现的事实。
[0005]可以看出，在提供诊断和/或治疗多发性硬化症的替代或改进方式(means)和方法中还存在技术问题。
【发明内容】
[0006]本发明在第一方面中提供了一种包含SEQ ID N0:3中示出的序列的至少8个连续氨基酸残基、或者由SEQ ID NO:3中示出的序列的至少8个连续氨基酸残基构成的肽或相应的肽模拟物(peptidomimetic),条件是所述肽不由SEQ ID NO: 3中示出的序列构成，其中所述肽或肽模拟物结合至患者样本中包含的抗-KIR4.1抗体，所述患者患有多发性硬化症或具有多发性硬化症的易患病体质，其中优选(i)所述至少8个连续氨基酸残基是KIR4.1胞外域(胞外结构域)的子序列(亚序列)，所述胞外域由SEQ ID N0:1或2中示出的序列构成；或(ii)所述肽包含SEQ ID NO: 1或2的序列或由SEQ ID N0:1或2的序列构成。因此，也优选对应于根据选项(i)和(ii)的所述肽的肽模拟物。也优选所述肽并不包含SEQ IDNO:3的序列。
[0007]“KIR4.1” 是特异性内向整流钾通道(specific inward rectifying potassiumchannel)的简写名称。优选所述KIR4.1是人源性的。人KIR4.1的序列提供于SEQ ID NO: 3中。术语“人KIR4.1蛋白的序列”和“SEQ ID N0:3的序列”，在本文中用于表征相同的实体(物质，entity)。
[0008]所引述的抗-KIR4.1抗体也称为根据本发明的“自身抗体”。所述自身抗体是天然存在的抗体且优选是IgG抗体。特别地，所述自身抗体是在MS患者和具有发展MS的易患病体质的主体中出现而区别于任何所述患者或主体中未出现的其它抗-KIR4.1抗体的抗KIR4.1抗体以及可以适用于如本文中以下公开的治疗目的的其它抗体。后者类型的抗-KIR4.1抗体并不是天然存在的，且不是所述疾病的指示。所述自身抗体优选结合至KIR4.1的胞外域,所述胞外域由示出于SEQ ID N0:1或2的序列构成。优选所述自身抗体结合至由示出于SEQ ID N0:1的序列构成的胞外域。[0009]序列SEQ ID NO: 1和2的优选子序列分别是SEQ ID NO:4和5的序列。所述序列SEQ ID N0:4和5预期全部是胞外的。因此，也优选所述肽包含SEQ ID N0:4或5的序列或由SEQ ID N0:4或5的序列构成。此外，对应于后者肽的肽模拟物被有意地考虑在内。
[0010]尽管优选具有以下序列，其包含SEQ ID NO: 1、2、4或5任一个的序列或由SEQ IDNO: 1、2、4或5任一个的序列构成，但是还设想进一步的肽序列，其中所述肽序列可能仅仅部分或根本不会与SEQ ID N0:l、2、4和5任何之一的序列重叠。为了进一步解释说明，而正如本领域中所知，T-细胞和B-细胞在给定的抗原中可以具有不同的表位偏好(epitopepreference)。
[0011]术语“肽”是指氨基酸的缩聚物。优选所述氨基酸选自20种天然的氨基酸。根据本发明的肽具有的长度为至少8个氨基酸残基。所述肽长度的优选上限是100、50、40、30、25、20、15、14、13、12、11、10或9个氨基酸残基而以其最广泛的形式，没有长度上限而因此包括任何长度的多肽。优选所述肽的长度经过选择而使之是独特的(unique)。正如下文详述，所述长度优选经过选择而使所述肽能够结合至MHC分子。特别地，MHC I分子已知一般会对能够结合至其上的肽施加一定的尺寸限制。因此，优选的长度和长度范围为8~12、8~10个，而最优选9个氨基酸。在另一方面MHC II分子一般也能够结合更大长度的肽而因此不会对根据本发明的肽长度施加上限。
[0012]术语“肽模拟物”在本领域内是众所周知的。其是指肽的衍生物，所述衍生物另外在以下结构术语中进行定义。“相应的肽模拟物”是结合至所引述抗体的肽模拟物。这样的结合可以通过保持其由之衍生的所述肽的每一组成氨基酸的结构特性而实现，这种亲本肽也结合至所引述的抗体。在一个优选的实施方式中，所述至少8个连续氨基酸残基每一侧链以修饰(改性，modify)或未修饰形式保留于所述相应的肽模拟物中。侧链修饰包括一个或多个氢原子用卤原子，优选F原子取代。进一步优选的侧链修饰包括环化。与其独立的是，一个或多个主链肽键可以独立地用电子等排体或换句话说模拟肽键的官能团取代。优选妝键 _CO_NH 可以用 _NH_CO_、_CH_ (OH) _CH2_、_C0_CH2_、_CH2_NH_、_CH2_0_、_CH2_CH2-、-CH=CH-、-⑶-N(CH3)-和F 02-X-中任意之一取代，X优先选自NH、0和CH2。作为一个实例，在相应的肽模拟物中，亲本肽(parent peptide)的所有肽键可以用反转-变型键(retro-1nverso bonds) (-NH-C0-)替代。
[0013]应理解，所述亲本肽功能上基本上不变的特性对本发明的肽模拟物是固有的。特别地，相应的肽模拟物结合至包含于患有多发性硬化症的患者的样本之中的抗-KIR4.1抗体。这种结合无需再费周折就能使用本文中所述的方式和方法进行评价。
[0014]应理解，本发明的第一方面，一方面涉及一种肽而在替代方案中涉及一种肽模拟物。而具体放弃(disclaimer)从所述肽的定义中去除了由示出于SEQ ID N0:3中的序列所构成的氨基酸序列。换句话说，第一方面涉及(a)—种肽，包含或由示出于SEQ ID NO:3中的序列的至少8个连续氨基酸残基构成，条件是所述肽不由示出于SEQ ID N0:3中的序列构成，或(b )相应的肽模拟物，其中所述肽或肽模拟物结合至包含于患者样本之中的抗-KIR4.1抗体，所述患者患有多发性硬化症或具有对其的易患病体质，其中优选(i)所述至少8个连续氨基酸残基是KIR4.1胞外域的子序列，所述胞外域由示出于SEQ ID N0:1或2的序列构成；或(^)所述肽包含或由SEQ ID NO: 1或2的序列构成。
[0015]根据本发明的肽或肽模拟物结合至抗-KIR4.1抗体，其中所述抗-KIR4.1抗体包含于多发性硬化症(MS)患者或具有发展MS的易患病体质的患者样本之中。正如下文详述，本发明提供了检测MS患者是否携带抗KIR4.1自身抗体以及从MS患者分离出这种抗体的各种方式(装置，means)和方法。所述方式包括本文中统称为“受体”的试剂。根据本发明分离出自身抗体的方法包括使所述受体接触获自主体的样本的步骤，所述样本被怀疑含有抗-KIR4.1抗体。使用获自MS患者的这种抗KIR4.1抗体，技术人员不用再费周折(withoutfurther ado)就能确定包含或由KIR4.1的至少8个连续氨基酸残基构成的肽或相应肽模拟物能否结合至所述抗体。技术人员能够使用的优选方式是ELISA分析。在这种分析中，根据主要实施方式的肽或肽模拟物固定于载体上，MS患者或具有对MS的易患病体质的主体的自身抗体容许结合所述肽或肽模拟物，而所述结合通过继而进行酶联的二级抗体(二抗,secondary antibody)的方式进行检测。所述二级抗体，例如，可以是能够结合Fc片段的抗体，因此将会结合所述自身抗体的Fc部分。
[0016]与上述内容有关的是，本发明另外提供了可获自多发性硬化症患者或具有发展MS的易患病体质的主体的抗-KIR4.1抗体。这是如上文所定义的自身抗体。
[0017]正如在随附的实施例中更详细描述的，至少两个胞外域存在于KIR4.1中。两个胞外域也称为大胞外域和小胞外域。指示多发性硬化症的抗-KIR4.1抗体优选结合至大胞外域、小胞外域或这两者胞外域。KIR4.1大小胞外域的序列分别提供于SEQ ID NO: 1和2中。其严格胞外部分分别提供于SEQ ID N0:4和5中。
[0018]术语“多发性硬化症”是指影响神经系统的炎症性疾病；也参见以上【背景技术】部分中引用的文献。主体或患者是否患有多发性硬化症都可以采用根据本发明的诊断方法进行确定，这是本发明的第二方面，并在以下进一步描述。可替换地或此外，多发性硬化症的诊断能够以确认的临床症状为基础而建立，所述临床症状对于本领域技术人员是已知的。多发性硬化症的临床症状包括视力问题、头晕、眩晕、感觉障碍、无力、协调问题、失去平衡、疲劳、疼痛、神经认知缺陷、心理健康缺陷、膀胱功能障碍、肠道功能障碍、性功能障碍、热敏感。
[0019]虽然在取自患者或主体的样本中检测到抗-KIR4.1自身抗体指示多发性硬化症或对其的易患病体质，但必须理解到，多发性硬化症或对其的易患病体质其特征并不一定在于所述自身抗体存在于所述主体或患者或由其取得的样本中。
[0020]因此，抗-KIR4.1自身抗体的存在限定了具有发展MS的易患病体质的个体的亚群，所述亚群的特征在于其具有所述自身抗体。同样，本文公开了 MS患者的亚群，所述亚群的特征在于其具有所述自身抗体。换句话说，自身抗体的存在限定了多发性硬化症指示之中的子指示(次级指示，sub-1ndication)。据预期，表现出这种MS子指示的患者，当相比于并没有所述自身抗体的MS患者时，对治疗会反应不同。同样，据预期，具有所述自身抗体的主体的风险分布(risk profile)不同于并不具有所述自身抗体的主体的风险分布。因此，不同的治愈性治疗(curative treatment)以及不同的预防性治疗可以分别根据MS患者是否含有自身抗体，和处于发展MS风险之中的主体是否具有所述自身抗体而进行选择。
[0021]术语“子序列”是指取自较大序列的一段连续氨基酸残基。换句话说，如果所述较大序列由η个残基构成，则最大长度的子序列为(η-1)个残基。
[0022]本发明另外提供了一种编码上述根据本发明定义的肽的核酸。所述核酸可以是DNA，如cDNA或基因组DNA，或RNA。另外本发明还提供包含所述核酸的载体。此外，本发明涉及包含根据本发明的核酸和/或载体的宿主细胞。所述宿主细胞可以是任何来源，优选体外，如分离的或培养的。虽然应该指出的是人胚胎干细胞系可由本领域技术人员处理，但是优选这种宿主细胞并不通过使用或破坏人胚胎而获得。此外，优选所述宿主细胞，在一定程度上它是一种胚胎细胞或胚胎干细胞，是非人的。
[0023]在第二方面中，本发明提供了一种用于诊断主体中多发性硬化症或对多发性硬化症的易患病体质的方法，所述方法包括检测获自所述主体的样本中抗-KIR4.1抗体的存在，其中所述样本中抗-KIR4.1抗体的存在指示多发性硬化症或对多发性硬化症的易患病体质。
[0024]这种方法允许诊断多发性硬化症，或在一定程度上多发性硬化症在所述主体中并不显现时，诊断对其的易患病体质。术语“易患病体质(predisposition)”具有本领域内建立的意义而倾向于是指发展疾病的可能性。特别地，所述可能性比正常对照主体高。在正常对照主体中的所述可能性可以表示为群体随机样本中发展MS的平均可能性。
[0025] 检测所述抗-KIR4.1抗体存在的合适试剂，以下将进一步进行描述，特别地是作为关于所公开的诊断组合物和诊断用途的活性试剂进行描述。
[0026]对所述易患病体质进行检测的优选个体组是家族中具有MS病史的个体。
[0027]本发明人是第一个在MS中识别以前怀疑的自身免疫反应的分子靶标的人。值得注意的是，揭示MS中自身抗体的传统策略主要集中于免疫球蛋白的血清学筛选，从而基于其与动物模型中髓磷脂生物学和致脑炎可能性的功能相关性的预选候选靶分子(13)。此外，大肠杆菌表达，噬菌体展示和肽文库都进行筛选而确定MS特异性自身抗体的线性靶标(14-17)。两种策略都还没有产生可能是MS-特异性的或预后的任何潜在的靶标(18，19)。
[0028]本发明人在50.8%的两个独立群组(队列，cohort)的患者血清中检测到高滴度的抗-KIR4.1抗体。因此，本文中所描述的方式和方法允许分别在大约一半的MS病例或处于发展这种疾病的风险之中的主体中诊断MS或对其的易患病体质。特别地，本发明的方法允许早期诊断MS或对其的易患病体质或对不确定的诊断进行确诊。所述抗体测试可以允许无创伤性操作(如脑脊髓液分析)诊断CIS或MS，以及比本【技术领域】已知的诊断方法可能更早地诊断MS、CIS或对MS的易患病体质。“CIS”是指“临床孤立综合症(clinicallyisolated syndrome)”,在下面进一步讨论。众所周知的是,MS疗法在患病期间尽可能早地开始治疗时效果最好。因此，早期诊断可以允许实施CIS、MS或处于发展成这些疾病的风险之中的患者的早期治疗。在处于风险中的一些个体中，治疗甚至可以防止疾病的(进一步)发展。
[0029]正如随附的实施例所示，所述自身抗体可以通过抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)或补体激活作用来耗竭KIR4.1表达神经胶质细胞(图6)。此外，所述抗体可以干扰钾通道的功能导致离子缓冲和神经递质稳态的功能性后果(20，21，22)。这可以导致组织损伤或髓鞘再生受损。
[0030]在根据本发明的方法的优选实施方式中，假使抗-KIR4.1抗体存在于所述样本中，则(i)所述主体中多发性硬化症的至少一种临床症状的存在指示多发性硬化症；和
(ii)多发性硬化症的任何临床症状都不存在则指示对多发性硬化症的所述易患病体质。
[0031]正如上文所公开的，根据本发明的所述方法提供用于诊断多发性硬化症以及用于诊断对其的易患病体质。本优选的实施方式提供了对于所述主体要采集的更多信息，所述进一步的信息辅助疾病诊断和对其易患病体质诊断之间的区分。特别地，所述进一步的信息包含或由多发性硬化症的至少一种临床症状构成。多发性硬化症是具有已确认的(established)临床症状的众所周知的疾病。技术人员对多发性硬化症的特征性或指示性的临床症状非常了解(也进一步参见下文)并能够毫不费力地确定其存在或不存在。
[0032]根据本优选的实施方式，多发性硬化症的任何临床症状都不存在，当伴随抗-KIR4.1抗体的存在一起发生时，就指示对多发性硬化症的易患病体质。换句话说，在已经确立的诊断或预后方法失败的情况下，本发明允许识别出这些表现出在未来某些(时间)点发展多发性硬化症的风险升高的主体。
[0033]另一方面，在存在多发性硬化症的至少一种临床症状的主体中，抗-KIR4.1抗体的检测进一步证实多发性硬化症的诊断。在这些单靠临床参数不容许明确诊断的情况下，本发明辅助进行和证实所述诊断。这特别地适用于多发性硬化症的早期形式。正如在本【技术领域】众所周知的是，多发性硬化症的早期诊断是非常合乎需要的，因为早期阶段通常更顺从于治疗。
[0034]根据进一步的优选实施方式，所述临床症状是选自视力问题、头晕、眩晕、感觉障碍、无力、协调问题、失去平衡、疲劳、疼痛、神经认知缺陷、心理健康缺陷、膀胱功能障碍、肠道功能障碍、性功能障碍、热敏感、脑脊髓液(CSF)中炎症标记物的存在、大脑和/或脊髓中病变的存在中的至少一种。所提到的病变可以在MRT图像中检测。通常情况下，这种病变发生于脑室周围(室周)、近皮层和/或大脑的幕下区域(infratentorial region)。指示MS的炎症标记物在本领域内是众所周知的，而优先选自脑脊液细胞异常增多(在CSF中细胞数异常增加，其中增加的细胞数典型值为5~50个细胞/ μ L或更多)、鞘内IgG合成和CSF中寡克隆IgG区带(oligoclonal IgG bend)的出现。
[0035]根据进一步优选的实施方式，所述主体具有临床孤立综合症(CIS)，或所述至少一种临床症状是CIS。CIS在本领域中通常认为是MS的早期阶段，其中后者的特征性临床参数尚未完全开发。对于CIS的讨论，请参阅，例如，文献Thrower, Neurology68,S12-S15(2007)。根据本发明的方式和方法优点在于它们容许对那些具有CIS的患者进一步收集证据。
[0036]根据进一步优选的实施方式，所述抗-KIR4.1抗体，即，可能出现于MS患者以及处于发展MS风险之中的主体中的抗-KIR4.1抗体，结合至KIR4.1 (SEQ ID N0:3)或由示出于SEQ ID NO: 1、2、4或5任何一个中的序列构成的KIR4.1的胞外域。KIR4.1结构进一步在随之附上的实施例中描述。特别地，它包含(至少)两个胞外域，据估计其由一个跨膜段(transmembrane spanning segment)分离；请参阅图4c。这两个胞外域在本文中也称为大胞外域和小胞外域，并示出于SEQ ID N0:1和2中。在图4 (c)中所示的残基范围分别是SEQ ID N0:4和5的残基范围。 [0037]在进一步优选的实施方式中，所述样本中抗-KIR4.1抗体的检测通过选自由ELISA法、免疫沉淀法、蛋白免疫印迹法、免疫荧光法、免疫组织化学法、流式细胞术、金属免疫分析法(如GLORIA)、荧光共振能量转移(FRET)分析法和质谱法组成的组中的方法完成。这些方法是完善的且可由技术人员实施。例如，在ELISA分析中，也可以使用结合至所述抗-KIR4.1抗体的抗体。类似的考虑也适用于免疫沉淀、蛋白免疫印迹法、免疫荧光法和免疫组化法。如上所述，技术人员，当提供有本发明的教导时，可以不用再费周折地分离和表征抗-KIR4.1抗体。这种表征优选使用质谱。一旦进行表征，质谱就可以用于检测任何给定样本中抗-KIR4.1抗体的存在或不存在。FRET分析可用于，例如，结合(binding assay)测定的情况中，所述结合测定优选利用受体，所述受体在下面进一步定义。这种FRET分析可以如此设计而使所述FRET对的供体和受体之间的可检测转移只发生于受体和抗-KIR4.1抗体紧密的特别接近(close special proximity)的情况下，所述紧密的特别接近指示抗-KIR4.1抗体的存在。
[0038]在进一步优选的实施方式中,所述抗-KIR4.1抗体的存在通过以下步骤检测:(a)将所述样本与结合至所述抗-KIR4.1抗体的受体接触；和(b)检测受体-抗-KIR4.1抗体复合物的形成，其中所述受体优先选自由根据本发明的肽或肽模拟物、KIR4.1蛋白(SEQ ID勵:3)和结合至所述抗-1(11?4.1抗体的抗体组成的组。正如以下进一步的描述，制备抗给定抗体的抗体(包括抗体)的方式和方法可被技术人员利用。
[0039]尽管以前的优选实施方式提供了不同的读出方式(readout scheme),本优选实施方式提供了用于检测抗-KIR4.1抗体的特异性方式，所述特异性方式特征在于结构方面。因此，这些优选的实施方式-以及任何本文中公开的其它实施方式-如果没有另外指出则适合进行组合，任何所述组合都是根据本发明进一步优选的实施方式的主题。在一个优选的分析法中，KIR4.1蛋白表达于细胞中，所述细胞用血清培养，而所述自身抗体结合至KIR4.1蛋白通过流式细胞仪或使用二级抗体的免疫组织化学法的方式进行检测。正如上文所述，所述二级抗体优选结合至所述自身抗体，例如通过结合至其Fc部分。随之附上的实施例中描述了进一步的优选分析方法。
[0040]所引述的受体的优选实施方式是根据本发明的一种肽或肽模拟物和结合至所述抗-KIR4.1抗体的抗体。在这两种情况下，另外优选所述受体对所述抗-KIR4.1抗体是特异性的。能够在对比或竞争试验中检测特异性，其中要检测所述受体一方面对所述抗-KIR4.1抗体，以及对其它蛋白，结合蛋白或抗体的结合。优选所述受体对所述自身抗体的结合常数(Kd)比对其它测试的蛋白低至少一个数量级，优选至少2个、3个、4个、5个或6个数量级。“数量级”是10的指数(factor)。
[0041]本文中所公开的治疗或诊断抗体可以是单克隆或多克隆抗体。另外，特别地在本文中公开的诊断和治疗抗体的上下文中，术语“抗体”另外包括特异性结合至各自的靶标的单链抗体或其片段，以及双特异性抗体、合成抗体，抗体片段如Fab、F (ab2) '、Fv和scFv片段等及其化学修饰的衍生物。
[0042]单克隆抗体能够，例如，通过最初在文献K0h丨er and Milstein,Nature256 (1975)，495，和 Galfre, Meth.Enzymol.73(1981) ,3 中描述的技术进行制备，其包括将小鼠骨髓瘤细胞融合至衍生于含有现有技术开发的修饰的免疫哺乳动物的脾细胞中。另外，对上述肽的抗体或其片段使用，例如，文献Harlow and Lane〃Antibodies, ALaboratory Manual", CSH Press, Cold Spring Harbor, 1988 中描述的方法就能够获得。当所述抗体的衍生物通过该噬菌体展示技术获得时，能够使用BIAcore系统中采用的表面等离子体共振增加结合至本发明的肽或多肽的表位的曬菌体抗体的效率(Schier, HumanAntibodies Hybridomas7(1996), 97-105 ；Malmborg, J.1mmunol.Methodsl83(1995),7-13)。嵌合抗体的制备，例如，描述于W089/09622中。根据本发明要利用的进一步的抗体源就是所谓的异种抗体(异源抗体，xenogenic antibody)。生产异种抗体如小鼠中人抗体的一般原理描述于，例如，W091/10741, W094/02602, W096/34096 和 W096/33735 中。根据本发明要采用的抗体或其相应的免疫球蛋白链能够使用本领域中已知的常规技术，例如，通过使用氨基酸缺失、插入、取代、增加和/或重组和/或现有技术中已知的任何其它单独和/或组合的修饰法进行进一步修饰(改性)。在构成免疫球蛋白链氨基酸序列基础的所述DNA序列中引入这种修饰的方法对于本领域技术人员是众所周知的；参见，例如，文献Sambrook，Molecular Cloning:A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor, NY, 19890
[0043]术语“单克隆”或“多克隆抗体”(参见Harlow and Lane, (1988)，引文同上)也涉及所述保留或基本上保留其结合特异性的抗体的衍生物。尽管所述衍生物特别优选的实施方式将在本文以下进一步进行说明，但是这种抗体的其它优选衍生物是包含例如小鼠或大鼠的可变区和人恒定区的嵌合抗体。
[0044]术语“scFv片段”(单链Fv片段)在本领域内是充分理解的并由于其尺寸小和重组生产这种片段的可能性而是优选的。
[0045]在本发明所述方法尤其优选的实施方式中，所述抗体或抗体结合部分是或源自人抗体或人源化抗体。术语“人源化抗体”是指，按照本发明，非人源的抗体，其中可变区中的至少一个互补决定区(⑶R)如⑶R3而优选所有6个⑶R已被具有所需特异性的人源抗体的CDR取代。可选地，所述抗体的非人恒定区已经被人抗体的恒定区取代。用于生产人源化抗体的方法描述于，例如，EP-A10239400和W090/07861中。
[0046]在进一步优选的实施方式中，所述样本选自血液、血清、血衆、淋巴节、CSF、泪液、尿、痰(唾液，sputum)和脑活检组织(brain biopsy)。
[0047]在第三个方面中，本发明提供了以上定义而适用于治疗多发性硬化症或诊断多发性硬化症或对其的易患病体质的受体。本文中以上定义的受体以及整个KIR4.1蛋白(SP，由示出于SEQ ID N0:3中的序列构成的蛋白)设想适用于这些医药用途。这些试剂的给予适用于减少循环(circulating)抗-KIR4.1抗体的数量。正如将在下面更详细的描述，这些试剂不仅可以向遭受MS的患者或具有或怀疑具有对其的易患病体质的主体给予，而且也可以用于离体(离体回输，ex vivo)方法，所述离体方法提供用于从MS患者，或更特别地，从所述患者或处于发展MS的风险之中的主体的体液中去除自身抗体。
[0048]术语“治疗”是指通过疗法治疗并包括疾病和/或其症状的改善以及完全缓解。另外，术语“治疗”延伸到预防。
[0049]在根据本发明的医药用途的优选实施方式中，一种或多种所引述的试剂是要使用的唯一活性剂。在替代的优选实施方式中，一种或多种所述明确引述的试剂可以结合一种或多种已知对MS患者有益的或辅助MS诊断的试剂一起使用。到现在为止，通过给予以下一种或多种试剂能够预防或缓解MS发展或防止复发:干扰素β、醋酸格拉替雷、那他珠单抗、米托蒽醌、芬戈莫德、硫唑嘌呤。复发采用高剂量的甲基强的松龙和/或血浆置换疗法进行治疗。
[0050]在优选的实施方式，所述受体要接触主体的血液、血清、血浆、淋巴节、CSF、泪液、尿、痰和/或脑活检组织。此实施方式是指要在诊断中使用的优选样本。
[0051]在本发明第三方面的进一步优选的实施方式中，所述第三方面涉及疗法的程度上，受体将给予患者至少两次。多次给予提供高程度的去除，优选完全去除自身抗体而实际上改善或缓解所述疾病。
[0052]在进一步优选的实施方式，所述肽可以如此选择而使其结合至要治疗患者的MHC等位基因。所述MHC分子可以是MHC I类或II类分子。为了确保结合至MHC I类分子，优选所述肽由8~12,优选8~10,最优选9个氨基酸构成。另外,优选存在锚定氨基酸残基，所述锚定氨基酸残基是已知参与MHC结合的残基。选择SEQ ID N0:1和2中合适的肽序列充分属于本领域技术人员的技能范畴。例如，文献Rammensee et al.(Immunogenetics,41:178-228,1995)描述了包括MHC结合肽的锚定氨基酸的特性。在MHC上下文中提出的所述肽在治疗或预防MS中容许靶向其它或替换`的机理。更特别地，它允许驱动KIR4.1特异性的T细胞进入细胞凋亡，从而降低或消除对内源性KIR4.1蛋白的自身免疫反应。在还有进一步的优选实施方式中，提供了适用于治疗多发性硬化症的MHC-肽复合物。特别优选的用途是诸如MHC四聚体的MHC多聚体，其中优选每个MHC分子具有根据本发明结合的一种肽或肽模拟物。优选所述肽或肽模拟物对于所述多聚体或四聚体的所有MHC分子是相同的。正如本领域中是已知的，四聚体的形成可以通过使用生物素化的MHC分子获得。MHC分子的羧基末端是生物素化的优选靶标。当用链霉素培养时，因为链霉素具有四个生物素结合位点而形成四聚体。这种多聚体或四聚体以特别高的亲合力结合抗原特异性T细胞受体。因此，使用多聚体，优选结合MHC分子的肽四聚体容许识别和另外失活KIR4.1-特异性T细胞。
[0053]此外，而不受具体理论的束缚，据设想，给予根据本发明的肽或肽模拟物容许脱敏负责所述疾病的T细胞和B细胞。在这方面，所述肽或肽模拟物的一个或多个位置，所述位置与T细胞受体相互作用，可以为了微调所述肽或肽模拟物的T-细胞受体相互作用的目的而进行改性(修饰)。对其修饰的这种位置和方法在本领域是公知的；参见，例如，文献Kappos et al., Nature Med.6,1176-1182(2000)。
[0054]换句话说，本发明提供了诱导KIR4.1耐受的方式和方法。术语“耐受”具有本领域内所建立的含义，并指免疫系统对给定抗原的非反应性。通常情况下，存在关于自身抗原的耐受性。在缺乏自身抗原的耐受性情况下，可以产生自身抗体并可能出现自身免疫性疾病。这由本发明的公开内容是显而易见的，多发性硬化症具有自身免疫性疾病的特点。为了减少或消除抗KIR4.1蛋白的自身抗体的产生，诱导耐受性或脱敏(desensitisation)是优选的方法之一。所设想的效果是建立关于KIR4.1的自身耐受性。由于耐受性是抗原依赖性的作用，它可以存在于B细胞、T细胞或同时存在于B细胞和T细胞中。耐受性的现象，以及诸如导致B细胞和T细胞耐受性的机理在本领域中是已知的。
[0055]在第四方面中，本发明提供了适用于治疗多发性硬化症而结合至KIR4.1 (SEQ IDN0:3)或KIR4.1胞外域的抗体，所述域由示出于SEQ ID NO: 1或2中的序列构成，而所述抗体干扰包含于患者样本之中的抗-KIR4.1抗体结合至KIR4.1，所述患者患有多发性硬化症或对其的易患病体质。
[0056]优选，所述结合至KIR4.1胞外域的抗体对其是特异性的。检测抗体特异性的方式和方法可以由本领域技术人员使用且如上文所描述的。特别优选的是，在疗法中可以使用的上述抗体能够结合至通过任何自身抗体无法识别的表位(epitope)。在这方面,应该指出，表位作图(表位定位，epitope mapping)的方式和方法可由本领域技术人员使用。通过选择适当的表位，上述提到的功能性要求，即，干扰自身抗体的结合，就可以得到保证。另外优选治疗性抗体的结合没有干扰或没有显著干扰KIR4.1的生化或细胞功能。KIR4.1已知参与中枢神经系统中的水和钾离子的稳态。因此，可以设想维持或重新建立KIR4.1的功能展现对神经元和透明细胞的保护作用。
[0057]这些实施方式提供了干扰自身抗体对其同源靶标的结合从而缓解所述疾病的方式。
[0058]在第五方面中，本发明提供了一种组合物，包含(i) 一种本发明的肽，(ii)以上定义的结合至抗-KIR4.1抗体的抗体(即，结合至自身抗体的抗体),和/或(iii)前述实施方式的抗体，即，干扰自身抗体结合至其靶标的抗体。
[0059]因此，本发明公开内容是指三种不同类型的抗体。首先，公开的是结合至KIR4.1胞外环的自身抗体。这是在大约一半的MS患者中被认为是MS致病和/或对其指示的抗体。其次，本发明提供了一种能够结合至所述自身抗体的抗体。这种第二种类型的抗体适合于本文以上详述的治疗和诊断的目的。最后，本发明提供了一种结合至KIR4.1而同时干扰自身抗体结合至其靶标的抗体。这后者抗体适合用于本文以上所述的治疗目的。
[0060]根据本发明的组合物优选的实施方式涉及一种可选进一步包含药用载体和/或稀释剂的药物组合物，而在一定程度上所述组合物涉及一种结合至抗-KIR4.1抗体的肽或抗体，并涉及诊断组合物。合适的药用载体、赋形剂和/或稀释剂能够由本领域的技术人员毫不费力地进行选择。例如，所述抗体也可以提供于溶液如缓冲溶液中。
[0061]缓冲溶液在本【技术领域】内是众所周知的而这些技术人员根据要分析的物质能够知晓合适的缓冲液。常见的缓冲溶液包括(括号内是？1值)成?04/他4?04 (pKaa=2.12)、甘氨酸34)、乙酸(4.75)、柠檬酸(4.76)、MES (6.15)、二甲胂酸(6.27)、H2C03/NaHC03(pKaa=6.37)、Bis-Tris (6.50), ADA (6.60)、Bis-Tris 丙烷(pKaa=6.80)、PIPES (6.80)、ACES (6.90)、咪唑(7.00)、BES (7.15)、MOPS (7.20)、NaH2P04/Na2HP04 (pKa，2=7.21 )、TES(7.50)、HEPES (7.55)、HEPPS0 (7.80)、三乙醇胺(7.80)、三羟甲基甘氨酸(8.10)、Tris(8.10)、甘氨酰胺(8.20)、N-二 (羟乙基)甘氨酸(8.35)、甘氨酰甘氨酸(pKa.2=8.40),TAPS(8.40), Bis-Tris 丙烷(pKa 2=9.00)、硼酸(H3B03/Na2B407) (9.24), CHES (9.50)、甘氨酸(pKa 2=9.60)、NaHC03/Na2C03 (pKa 2=10.25),CAPS (10.40)和 Na2HP04/Na3P04 (pKa.3=12.67)。
[0062]此外，所述缓冲液的离子强度可以，例如，通过加入氯化钠和/或氯化钾进行调节。优选的氯化钠浓度为0~2M，优选100~200mM。包含氯化钠的缓冲液实例包括10倍原液水溶液(aqueous stock solution)含有 1.37M NaCl、27mM KCl、43mM Na2HP04_7H20 和14mM KH2P04的PBS (磷酸盐缓冲盐水)，调节pH值至7.3 ；20倍原液水溶液含有3M NaCl和0.3M柠檬酸钠的SSC，调节pH至7.0 ;和含有10mM Tris碱、10mM氯化钠和ImM ETA (酸)的STE (盐水Tris EDTA)。可替换地，氯化钠在缓冲液配制中不存在。常见无氯化钠或氯化钾的缓冲液制剂的实例是50倍原液水溶液含2M Tri乙酸盐和0.1M EDTA的TAE (Tris乙酸盐EDTA)，pH8.5 ；10倍原液水溶液含有0.89M Tris碱、0.89M硼酸和0.02M EDTA的TBE (Tri 硼酸盐 EDTA)，pH8.0 ;和含有 10mM Tris 碱和 ImM EDTA (酸)的 TE (Tris EDTA),ρΗ7.5。
[0063]本文中所述的药物组合物能够以合适的剂量向主体给予。给予所述合适的组合物可以通过不同的方式完成，例如，通过静脉内、腹膜内、皮下，以及透皮给予。
[0064]更特别地，这种药物组合物可以按照可选包含常规药用赋形剂的剂量单位制剂口服给予、非肠道给予，如皮下、静脉内、肌肉内、腹膜内、鞘内、透皮、经粘膜、硬膜下、鼻内、经由离子导入的局部(locally)或表面(topically)、舌下、通过吸入喷雾、气溶胶或直肠等给予。
[0065]剂量方案将由主治医师和临床因素确定。如在医疗领域内众所周知的，对任何一个患者的剂量都取决于许多因素，包括患者的大小、体表面积、年龄、要给予的具体化合物、性别、时间和给予途径、总体健康状况和其它同时给予的药物。
[0066]用于肠胃外给予的制剂包括无菌水溶液或非水溶液、悬浮液和乳液。非水性溶剂的实例有丙二醇、聚乙二醇、植物油如橄榄油和可注射的有机酯如油酸乙酯。水性载体包括水、醇/水溶液、乳液或悬浮液，包括盐水和缓冲介质。肠胃外载体包括氯化钠溶液、林格氏(Ringer)葡萄糖、葡萄糖和氯化钠、乳酸化林格氏溶液、或不挥发性油。静脉载体包括流体和营养补充剂、电解质补充剂(例如，基于林格氏葡萄糖的那些)等。防腐剂和其它添加剂也可以存在，诸如，例如，抗菌剂、抗氧化剂、螯合剂和惰性气体等。另外，本文中所述的这种药物组合物可以包含其它试剂，这要取决于所期望的药物组合物用途。
[0067]在制剂中可以使用的药用赋形剂可以包括载体、赋形剂、稀释剂、溶剂如一元醇，如乙醇、异丙醇，和多元醇如二醇，和食用油如大豆油、椰子油、橄榄油、红花油、棉籽油，油酯如油酸乙酯、肉豆蘧酸异丙酯；粘合剂、助剂、增溶剂、增稠剂、稳定剂、崩解剂、助流剂、润滑剂、缓冲剂、乳化剂、润湿剂、悬浮剂、增甜剂、着色剂、调味剂、涂层剂、防腐剂、抗氧化剂、加工剂、药物递送改性剂和促进剂如磷酸钙、硬脂酸镁、滑石、单糖、二糖、淀粉、明胶、纤维素、甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、葡萄糖、羟丙基-β -环糊精、聚乙烯吡咯烷酮、低熔点蜡和/或离子交换树脂。
[0068]其它适宜的药用赋形剂描述于文献Remington' s Pharmaceutical Sciences,第15版，Mack出版公司，新泽西州(1991)中。
[0069]口服给予的剂型 包括片剂、胶囊剂、锭剂、丸剂、糯米纸囊剂(wafer )、颗粒剂、口服液如糖衆、悬浮液、溶液、乳液或重构液(reconstitution)。
[0070]局部/表面给予的剂型包括吹入剂、气溶胶、计量气溶胶、透皮治疗系统、药贴、直肠栓剂和/或阴道栓剂(ovula)。
[0071]对于本发明的目的，所述试剂(药剂，agent)的治疗有效剂量一般为约2.5~lOOmg/天，优选约5~约50mg/天，最优选约10~约30mg/天，其可以按照单剂量或多个剂
量给予。
[0072]然而，应该理解到，本发明的化合物对于任何具体患者的具体剂量水平将取决于多种因素，如年龄、性别、体重、总体(一般，general)健康状况、饮食、要进行治疗的患者的各自反应、给予时间、待治疾病的严重程度、所施用的具体化合物的活性、剂型、施用模式和伴随用药(concomitant medication)。治疗有效量，对于给定的情况,将很容易地通过常规实验确定，而都属于普通临床医生或医师的技能和判断之内。
[0073]在第六方面中，本发明提供了一种适用于治疗患者中的多发性硬化症的选自利妥昔单抗、奥瑞珠单抗、奥法木单抗和F。-结合剂(Fe-binding agent)的试剂,所述患者特征在于血液、血清、血衆、淋巴节、脑脊髓液(CSF)、泪液、尿、痰和脑活检组织(brain biopsy)任意之一中抗-KIR4.1抗体的存在。正如本文以上的解释，预期一方面具有自身抗体的MS患者和另一方面无自身抗体的MS患者对这些试剂的反应不同。
[0074]Fc-结合剂是适合于去除抗体的已知试剂。这种试剂结合至抗体的F。部分，并适于去除或灭活抗体。这种去除过程也称为“免疫吸附”。
[0075]在第七方面中，本发明另外提供了一种筛选药物或先导化合物(lead compound)的方法，所述方法包括:用测试化合物接触包含或由(i)以上定义的抗-KIR4.1抗体(即，自身抗体);和(ii)KIR4.1蛋白或以上定义的肽或肽模拟物构成的复合物，其中所述复合物量的减少指示所述测试化合物是药物或先导化合物。
[0076]鉴于抗-KIR4.1抗体参与多发性硬化症的令人惊奇的发现，本发明另外提供了识别药物和先导化合物的方式和方法，所述药物和先导化合物适用于治疗多发性硬化症或开发适合治疗多发性硬化症的药物。应该理解到，所述接触在维持所述复合物的条件下完成。技术人员知悉这种适合的条件，其包括，例如，包含所述测试化合物的缓冲溶液、抗-KIR4.1抗体和KIR4.1蛋白或根据本发明的肽或肽模拟物。
[0077]优选地，所述方法以高通量形式实施。高通量分析法，独立于生化、细胞或其它分析法，一般可以在微量滴定板的孔中实施，其中每块板可以包含96、384或1536孔。处理这种孔板，包括在不同于环境温度的温度下培养，和使测试化合物接触分析混合物，优选通过一个或多个包括移液装置的计算机控制机器人系统进行实施。假使大的测试化合物文库要进行筛选和/或筛选要在很短的时间之内完成，则可以将例如10、20、30、40、50或100种测试化合物的混合物加入到每个孔中。假使某个孔表现出生物活性，则测试化合物的所述混合物可不费事地识别出所述混合物中产生所述活性的一种或多种测试化合物。
[0078]测试化合物、先导化合物和/或药物优选小分子，更优选有机小分子。分子量优选低于2000，更优选低于1500、1000、900、800、700、600、500或400道尔顿。在筛选中识别出来的任何命中化合物可以进行其药理学性质(包括吸收、分布、代谢和排泄)的优化，从而将所述先导化合物开发成药物。
[0079]筛选中识别出来的化合物(一般简称为先导化合物(lead compound))的药理学性质的优化方法，在本领域中是已知的且包括对识别作为先导化合物的化合物修饰而实现以下方面的方法:(i)改变的作用位点、活性谱、器官特异性，和/或(ii)改善的效力，和/或(iii)降低的毒性(改善的治疗指数)，和/或(iv)降低的副作用，和/或(V)治疗作用生效、作用持续时间改变，和/或(Vi)改变的药动学参数(再吸收、分布、代谢和排泄)，和/或(Vi i )改变的物理化学参数(溶解性、吸湿性、颜色、味道、气味、稳定性、状态)，和/或(viii)改善的一般特异性、器官/组织特异性，和/或(ix)通过以下方式的优化施用形式和途径:(i)羧基酯化，或(ii)羟基用羧酸酯化，或(iii)羟基酯化成，例如磷酸酯、焦磷酸酯或硫酸酯或半琥珀酸酯，或(iv)形成药用盐，或(V)形成药用复合物，或(Vi)合成药学活性聚合物，或(Vii)引入亲水部分，或(viii)引入/交换芳香烃化合物的取代基或侧链，改变取代模式，或(ix)通过引入电子等排体或生物电子等排体部分改性，或(X)同源性化合物的合成，或(xi )引入支化侧链，或(xi i )烷基取代基转化成环状类似物，或(xi i i )羟基衍生成缩酮、缩醛，或(xiv)N-乙酰化成酰胺、苯甲酰胺，或(XV)合成曼尼希碱、亚胺，或(xvi)酮或醛转化成希夫碱、肟、缩醛、缩酮、烯醇酯、噁唑烷、噻唑烷或其组合。
[0080] 以上引述的各种步骤一般在本【技术领域】内是已知的。它们包括或依赖于定量的构效关系(QSAR)分析(Kubinyi, 〃Hausch_Analysis and Related Approaches", VCH Verlag,Weinheim, 1992)、组合生物化学、经典化学等(参见，例如,Holzgrabe and Bechtold,Deutsche Apotheker Zeitungl40 (8)，813-823，2000)。
[0081]本发明，在第八方面中，提供了以上定义的受体用于从血液中去除抗-KIR4.1抗体或血清或减少其量的用途，其中所述用途将会离体(离体回输)实施。
[0082]与之相关的是，本发明提供了从体液如血液或血清中去除抗-KIR4.1抗体或减少其量的离体(离体回输)方法，所述方法包括
[0083](a)将从主体中移出的血液接触以上定义的受体和/或Fc-结合剂；和/或
[0084](b)实施血衆置换术(plasmapheresis)。
[0085]这些方面涉及离体回输应用，所述离体回输应用旨在减少自身抗体量或完全将其耗竭。优选MS患者或携带发展MS的易患病体质的主体的血液或血清经受离体回输治疗。应该理解到，所述使之接触是在允许自身抗体结合至如果存在的所述受体的条件下进行实施。在一个实施方式，所述条件可以通过使血液或血清接触根据本发明的载体或装置而建立，所述载体或装置将在下文中进一步定义。血浆置换术，正如本领域中已知的可以，根据本发明，用于减少循环自身抗体的量。
[0086]在根据本发明的离体回输方法的一个优选实施方式中，血液或血清，在进行接触之后，要返回到同一主体中。
[0087]在根据本发明的离体回输应用或离体回输方法进一步的优选实施方式中，所述蛋白、肽和/或抗体结合至载体。任何载体，包括固体载体，都能够设想。在本领域中常用而包括玻璃、塑料、金和娃的担载体(support)或载体材料对于本发明的目的都能够设想。载体或担载体的合适涂层，如果存在，包括聚-L-赖氨酸-和氨基-硅烷-涂层以及环氧-和醛-活化的表面。在一个优选的实施方式中，所述载体是柱子的基质。合适的基质在本领域内是已知的而可以通过所述受体的连接进行衍生化。
[0088]本发明另外涉及一种具有以上定义的受体固定于其上的载体。
[0089]与之相关的是，还提供了一种用于从血液中去除抗-KIR4.1抗体的装置，所述装置包含以上定义的载体。
[0090]在所述装置的一个优选实施方式中，所述装置还包含进口和/或出口，允许让所述主体的血液或血清流过过滤器和/或使血液或血清返回到同一主体中。
[0091]至于本说明书中，特别地是在权利要求中表征的实施方式，预想在从属权利要求中提及的每一个实施方式将组合每一所述从属权利要求所从属的权利要求(独立的或从属的)的每一实施方式。例如，在一个独立权利要求1引述3种替代方式A、B和C的情况下，一个从属权利要求2引述3种替代方式D、E和F，而权利要求3从属权利要求1和2引述3种替代方式G、Η和I的情况下，应该理解到，除非另外明确指出，所述说明书明确公开对应于组合 A、D、G ;A、D、H ;A、D、I ;A、E、G ;A、E、Η ;A、E、I ;A、F、G ;A、F、H ;A、F、I ;B、D、G ;B、D、H ;B、D、I ;B、E、G ;B、E、H ;B、E、I ;B、F、G ;B、F、H ;B、F、I ;C、D、G ;C、D、H ;C、D、I ;C、E、G ;C、E、H ;C、E、I ;C、F、G ;C、F、H ;C、F、I 的实施方式。[0092]同样，也是在这些独立和/或从属权利要求并未引述替代方式的情况下，应该理解到，如果从属权利要求返回引用多个前述权利要求，则由此涵盖的主题的任何组合都被认为是明确公开的。例如，在一个独立的权利要求1，返回引用权利要求1的从属权利要求2和一个同时返回引用两个权利要求2和1的从属权利要求3的情况下，应该遵循权利要求3和1的所述主题的组合被清楚而明确地公开，如同根据权利要求3、2和1的主题的组合。假使还有一个从属权利要求4存在而引用权利要求1~3任一项，则遵循根据权利要求4和1，根据权利要求4、2和1，根据权利要求4、3和1以及根据权利要求4、3、2和1的所述主题的组合，都清楚而明确地进行公开。
[0093]上述考虑作为必要修正适用于所有所附权利要求。举几个实例而言，根据权利要求6、5、4 (b)、3和2的组合根据所述权利要求结构而清楚明确地设想。这同样适用于根据权利要求6、5、4 (a)、3和2的组合，并且给出几个并非限制性的进一步的实例，权利要求4(a)和2的组合和权利要求5、4 (a)和2的组合。
【专利附图】
【附图说明】
[0094]这些附图示出:
[0095]图1:与CNS膜抗原的MS血清I gG反应性
[0096](a)采用来自如所示患有MS的患者或0ND患者的血清IgG而在大鼠小脑(上图)和人脑部分(下图)上实施的免疫荧光标记的代表性显微照片。比例尺ΙΟΟμπι (上图)和20 μ m (下图)。
[0097](b)采用由大鼠脑组织制备的膜蛋白部分(fraction)的捕获ELISA分析。显示了MS和0ND患者中的血清反应性(0D，光学密度)。
[0098]图2:KIR4.1作为MS中血清IgG靶标的识别
[0099](a)用0ND或MS患者的汇合(pooled)IgG沉淀的人脑裂解物(lysate)的一维SDS凝胶电泳(左)。请注意，IgG重链带(箭头)上面和下面的独特的带(第3泳道)在采用由MS患者纯化的汇合血清IgG免疫沉淀之后获得。在采用MS患者的血清IgG免疫沉淀之后获得的脑抗原二维电泳(右)。包含通过MALD1-MS/MS分析识别的KIR4.1蛋白的斑点用方框标记。箭头标记所述I gG重链斑点。
[0100](b)通过所示各种免疫沉淀中的蛋白质免疫印迹分析的KIR4.1检测。采用0ND或MS患者的血清IgG分别对大鼠肾脏和人脑裂解物的富集膜蛋白部分进行免疫沉淀。
[0101](c)KIR4.1在用0ND或MS患者的血清IgG免疫沉淀体外翻译KIR4.1蛋白中的蛋白免疫印迹分析。
[0102]图3:KIR4.1作为MS患者中血清IgG反应性靶标的验证
[0103](a)显示大鼠脑小脑部分中用单克隆抗-KIR4.1对MS患者血清IgG的共定位的双免疫荧光标记。用0ND患者血清染色显示作为对照物。比例尺200 μ m。
[0104](b)采用MS患者的纯化血清IgG的野生型(左图)和Kir4.Yh小鼠(右图)的小脑部分的免疫突光标记。比例尺100 μ m (上图)和50 μ m (下图)。
[0105](c)小鼠原代星形胶质细胞培养物的免疫荧光双染色。0ND血清IgG (上图)和MS血清IgG (下图)的染色在绿通道中检测。其它GFAP染色(右图)在红通道中检测。
[0106](d)采用MS和0ND患者血清的小鼠原代星形胶质细胞的染色和流式细胞仪分析。
[0107]图4:MS患者亚群中对KIR4.1的高滴度血清反应性
[0108](a)抗-KIR4.1血清反应性的蛋白基ELISA筛选方法。HEK293细胞的纯化重组KIR4.1共价偶联至ELISA孔板的固相。结合至KIR4.1的血清抗体在HD、0ND、MS患者中进行检测。抗体阳性和阴性血清的频率在HD (n=14),0ND (n=71)和MS患者(n=122)之间通过Kruskal-Wallis检验进行对比。抗KIR4.1抗体阳性的阈值(截止0D0.866，超过HD主体的中值0D达5SD)由水平虚线表示。
[0109](b)描绘抗KIR4.1抗体E`LISA试验在两个独立的MS和0ND患者组中的诊断性能的R0C曲线。发现群组(discovery cohort)(实线)对应于(a)中所示的群组。验证群组(validation cohort)(虚线)由132个0ND和147个MS患者组成。R0C曲线下的面积(AUC)，发现群组:0.76 (95%C1:0.69-0.81)，验证群组:0.82 (95%C1:0.76-0.87)。
[0110](c) KIR4.1蛋白基于uniprot数据库的序列注释的二维图形图示说明(http://www.uniprot.0rg/uniprot/P78508)。大小胞外环分别以红色和黄色突出显示。
[0111](d)采用包含KIR4.1的第一胞外环的板(plate)结合肽KIR4.183_12(|的ELISA分析法。在发现群组的HD、0ND患者和MS患者中测定抗KIR4.183_12(|的血清反应性(参见(a))。抗体阳性和阴性血清在HD、0ND和MS患者之间通过Kruskal-Wallis检验进行对比。抗KIR4.1阳性的阈值(截止0D0.7558，超过HD主体中值0D达5SD)通过水平虚线指示。
[0112]图5:KIR4.1-特异性的MS血清IgG抗体对胞外环或KIR4.1 (KIR4.183_120)是特异性的。
[0113](a)通过相对于全长纯化重组His-标记的KIR4.1的KIR4.183_12(| (第一胞外环)或KIR4.1356-375 (C-端域)的亲和纯化抗-KIR4.1血清IgG的竞争结合。抗-KIR4.1血清IgG固定于ELISA板上，并用浓度渐增的肽(浓度范围0.045-150nM)在固定浓度(150nM)的His标记重组KIR4.1蛋白存在下进行培养。KIR4.1蛋白的结合通过抗-His标记检测抗体进行检测。
[0114](b)基于板结合KIR4.1蛋白或KIR4.183_12(|肽的用于量化MS患者样本中的抗-KIR4.1血清反应性的ELISA分析的相关性(n=122)。
[0115](c)细胞基竞争性结合分析。HEK293细胞表达KIR4.1，其采用MS血清IgG在没有竞争(左)或在KIR4.183_120 (中)或KIR4.1356-375 (右)存在下进行免疫标记。代表性的显微照片。[0116]图6:
[0117](a)在P10小鼠小脑切片上进行的免疫荧光标记。用MS血清IgG(左图)和抗GFAP抗体(右图)染色。比例尺50 μ m。
[0118](b)采用MS血清IgG (左图)和抗GFAP抗体免疫标记(右图)在人脑皮层切片上获得的血管周染色模式。方框显示下图中示出的高倍放大的区域。比例尺ΙΟΟμπι (上图)和20 μ m (下图)。
[0119]图7:KIR4.1特异性MS血清IgG抗体诱导KIR4.1染色损失，GFAP纤丝(filament)结构的中断和体内补体激活。
[0120]PBS (第一行)，MS患者血清IgG耗竭KIR4.1特异性抗体的反应性(第二行)，或具有保留抗KIR4.1反应性的血清IgG (第三和第四行)连同人补体注入到C57BL/6小鼠的小脑延髓池。注射后24h处死小鼠，而脑切片通过免疫组织化学法对GFAP (左)，KIR4.1 (中)和C9neo反应性(右)进行评价。比例尺50 μ m和20 μ m (底图)。
[0121]图8:
[0122](a)来自采用KIR4.1表达构建体[PcDNA3.1 (+)/KIR4.1]转染的HEK293细胞的His-标记KIR4.1蛋白的纯化。泳道1:HEK293澄清裂解物(裂解液)；泳道2:流过物(流过液，flow-through);泳道3-5:冲洗部分(wash fraction);泳道6_8:洗脱部分。
[0123](b)MS患者的血清IgG的抗-KIR4.1反应性的耗竭。泳道1:用模拟转染的HEK293细胞裂解物混合的珠粒，而泳道2:用PcDNA3.1 ( + ) /KIR4.1转染的HEK293细胞裂解物混合的珠粒。这些珠粒分别用于产生模拟预吸附柱和预吸附柱。右边的免疫印迹显示由基于珠结合KIR4.1的预吸附柱捕获的血清IgG。
[0124](c)模拟(mock)预吸附柱和预吸附`柱的非浓缩流过液通过重组纯化的KIR4.1ELISA对KIR4.1反应性进行测试。
【具体实施方式】
[0125]这些实施例举例说明本发明:
[0126]实施例1:
[0127]物料和方法
[0128]患者和对照
[0129]患者和对照在慕尼黑工业大学Klinikum rechts der Isar的神经病学系招收。两个独立的群组，MS患者、具有高风险临床孤立综合症的患者纳入研究中。对照组由年龄相匹配的健康供者(HD)或具有其它神经系统疾病的患者(0ND)组成。表1中给出患者和对照的特性。所述大学的伦理委员会批准这项研究。
[0130]
【权利要求】
1.一种包含SEQ ID N0:3中示出的序列的至少8个连续氨基酸残基、或由SEQ ID NO:3中示出的序列的至少8个连续氨基酸残基构成的肽或相应的肽模拟物，条件是所述肽不由SEQ ID N0:3中示出的序列构成,其中所述肽或肽模拟物结合至来自患者的样本中所包含的抗-KIR4.1抗体，所述患者具有多发性硬化症或对其的易患病体质， 其中优选 (i)所述至少8个连续氨基酸残基是KIR4.1的胞外域的子序列，所述胞外域由SEQ IDN0:1或2中示出的序列构成；或 (ii)所述肽包含SEQID NO:1或2的序列或由SEQ ID NO:1或2的序列构成。
2.一种用于诊断主体中的多发性硬化症或对多发性硬化症的易患病体质的方法，所述方法包括测定获自所述主体的样本中抗-KIR4.1抗体的存在，其中所述样本中抗-KIR4.1抗体的存在指示多发性硬化症或对多发性硬化症的易患病体质。
3.根据权利要求2所述的方法，其中，在所述样本中存在抗-KIR4.1抗体的情况下， (i)所述主体中多发性硬化症的至少一种临床症状的存在指示多发性硬化症；而 (ii)多发性硬化症的任何临床症状都不存在则指示所述对多发性硬化症的易患病体质。
4.根据以下权利要求所述的方法 Ca)权利要求2，其中所述主体患有临床孤立综合症(CIS);或 (b)权利要求3，其中至少一种临床症状是CIS。`
5.根据权利要求2~5任一项所述的方法，其中所述抗-KIR4.1抗体结合至KIR4.1(SEQ ID NO:3)或其胞外域，所述胞外域由SEQ ID NO: 1、2、4或5任一个中示出的序列构成。
6.根据权利要求2~5任一项所述的方法，其中所述抗-KIR4.1抗体的存在是通过以下测定 Ca)使所述样本与结合至所述抗-KIR4.1抗体的受体接触；以及 (b)检测受体-抗-KIR4.1抗体复合物的形成， 其中所述受体优先选自由根据权利要求1所述的肽或肽模拟物、KIR4.1蛋白和结合至所述抗-KIR4.1抗体的抗体所组成的组。
7.—种如权利要求6中限定的受体，用于在治疗多发性硬化症或在诊断多发性硬化症或对其的易患病体质中应用。
8.一种结合至KIR4.1 (SEQ ID NO:3)或其胞外域的抗体，用于在治疗多发性硬化症中应用，所述域由SEQ ID NO:1或2中示出的序列构成,且所述抗体干扰来自患者的样本中所包含的抗-KIR4.1抗体结合至KIR4.1，所述患者具有多发性硬化症或对其的易患病体质。
9.一种组合物，包含 (i)权利要求1所述的肽或肽模拟物， (ii)结合至如在权利要求1~5任一项中限定的抗-KIR4.1抗体的抗体，和/或 (iii)权利要求8所述的抗体。
10.一种选自利妥昔单抗、奥瑞珠单抗、奥法木单抗和F。-结合剂的试剂,用于在治疗患者的多发性硬化症中应用，所述患者的特征在于，在血液、血清、血浆、淋巴节、脑脊髓液(CSF)、泪液、尿、痰和脑活检组织任一个中存在抗-KIR4.1抗体。
11.一种筛选药物或先导化合物的方法，所述方法包括: 使包含以下或由以下构成的复合物与测试化合物接触 (i)如在权利要求1~5任一项中限定的抗-KIR4.1抗体；和 (ii)KIR4.1蛋白或如在权利要求1中限定的肽或肽模拟物， 其中所述复合物的量减少指示所述测试化合物是药物或先导化合物。
12.—种如权利要求6中限定的受体用于从血液或血清中去除抗-KIR4.1抗体或减少其量的应用，其中所述应用是离体实施的。
13.—种从 血液或血清中去除抗-KIR4.1抗体或减少其量的离体方法，所述方法包括 (a)使从主体中移出的血液与权利要求6中限定的受体和/或F。-结合剂接触；和/或 (b)实施血浆置换术。
14.一种载体，具有固定于其上的权利要求6中限定的受体。
15.一种用于从血液中去除抗-KIR4.1抗体的装置，所述装置包含权利要求14所述的载体。
【文档编号】C07K16/18GK103687871SQ201280025923
【公开日】2014年3月26日 申请日期:2012年5月23日 优先权日:2011年5月30日
【发明者】伯恩哈德·黑默尔, 拉伊尼什·斯里瓦斯塔瓦 申请人:慕尼黑技术大学伊萨尔分诊所