作为过敏症疫苗的肽载体融合蛋白的制作方法
【专利摘要】本发明涉及包含至少3个肽片段的多肽，其中肽片段由至少1个野生型变应原的10至50个连续的氨基酸残基组成，所述野生型变应原融合至嗜肝DNA病毒科病毒表面多肽的N和C端或融合至所述表面多肽的至少1个片段。
【专利说明】作为过敏症疫苗的肽载体融合蛋白
【技术领域】
[0001]本发明涉及新型多肽及其用途。
【背景技术】
[0002]I型过敏症是IgE介导的超敏性疾病，其影响几乎25%的人口。它是基于特异性免疫球蛋白E对无害的空中传播的、昆虫、毒液、食物变应原和接触变应原抗原(源自本身无害的抗原来源，例如花粉、昆虫、霉菌和动物蛋白)的识别。效应细胞结合的IgE抗体的交联引起炎症介质(例如组胺、白细胞三烯(Ieucotrienes))的释放,并因此引起过敏症的即刻症状(例如，鼻结膜炎、哮喘、皮炎、过敏反应)。通过IgE依赖性和IgE非依赖性机制进行的T细胞激活有助于慢性过敏性炎症。
[0003]过敏症治疗的唯一可能致病(causative)形式为变应原特异性免疫疗法，其基于反复施用渐增量的大多数来源的变应原提取物。很多临床研究证明了注射免疫疗法的临床功效，并有这种治疗下的几种免疫机理的证据。由于制备某些变应原来源的高质量变应原提取物的困难，以及向患者施用变应原会引起严重的副作用的事实，只能够向某些患者群和疾病表现来推荐变应原特异性免疫疗法。治疗对几种不同变应原来源共同敏感的患者以及遭受严重疾病表现例如过敏性哮喘的患者是特别困难的。过敏性哮喘是过敏症最严重的表现之一，因为它严重影响日常生活质量，引起高入院率，其表现为严重的、威胁生命的形式，需要对患者的深切关注。
[0004]从天然变应原来源制备的变应原提取物性质上是粗的，不可能通过技术手段影响这种制备物中的个别变应原的质量和量。它们也含有各种不明确的非变应原性成分，几项最近的研究表明了这种提取物的劣质并证明了它们的高异质性。
[0005]在过去的十年中，使用重组DNA技术在分子变应原鉴定领域取得了巨大进步。很大数量的引起疾病的最重要的变应原已被鉴定至分子水平，已经生产出模拟天然变应原提取物表位复杂性的重组变应原。而且，几个研究小组已经使用关于变应原结构的知识开发出确定的新的过敏症疫苗。已经使用遗传工程、合成肽化学和变应原与免疫刺激DNA序列的缀合来减少新疫苗的变应原性活性，并因此减少疗法诱导的副作用率。以这种变应原衍生物进行第一个有前景的临床研究。有趣的是，实际上，虽然可以强烈减少或甚至消除遗传工程化重组变应原和变应原衍生的合成的包含T细胞表位的肽的IgE反应性，但是这些衍生物仍然可以诱导全身性副作用(出现于注射后几小时)。例如，有报道指出，在皮内注射后几个小时，主要猫变应原Fel dl的T细胞表位肽，诱导了哮喘和支气管的高反应性，且有力证据表明，这种效应是T细胞介导的和MHC限制的。
[0006]这些结果表明，除去IgE反应性减少IgE介导的副作用，因为在这些免疫疗法研究的过程中未记录到即刻反应。但是，被保留在重组变应原衍生物以及肽混合物中的变应原特异性T细胞表位是造成延迟的副作用(例如问题严重的或特应性皮炎、慢性T细胞介导的过敏性皮肤表现)的原因。在重组变应原衍生物的情况下引起的副作用相对轻微，在T细胞肽疫苗的情况下可通过足够的剂量来克服副作用。因此这两种新方法似乎对过敏性鼻结膜炎的免疫疗法都是非常有前景的，但当涉及治疗严重形式的过敏性哮喘时，其中肺中的延迟副作用的诱导可能是问题严重的，这两种新方法可能具有局限性。
[0007]为了施用并因此激发针对肽、多肽和蛋白的有效免疫反应，通常使用佐剂和/或载体。例如，完全弗氏佐剂(CFA)，是一种可获得的最有力的佐剂。需要能够诱导针对(源自变应原，当然，以及源自其它抗原的)肽和多肽的强烈免疫反应的疫苗组合物，使用或不使用完全弗氏佐剂。而且，虽然在动物模型中已成功使用BSA作为载体，它可能不适宜用于人类疫苗组合物，因为具有有害反应的风险，例如传播朊病毒病(变异型克雅氏病，(variantCreutzfeldt-Jakob disease))的风险。发展有效的针对变应原的疫苗的进一步挑战是需要能够迅速降低个体或动物中变应原的免疫反应。因此，需要血液中高浓度的变应原特异性抗体，其主要是IgG亚型。在粘膜表面IgA抗体同样重要。
[0008]霍乱毒素，现有技术中已知的载体蛋白，通常也用作佐剂。但是，霍乱毒素增加总的和特异性的IgE抗体水平，并引起IgE相关的炎症反应。
[0009]由于大多数用于疫苗的载体蛋白所激发的副作用，需要能够刺激针对变应原或其它抗原的免疫反应的载体系统，而不使用毒性佐剂，不使用较差耐受的载体蛋白，并且，在一些情况下，不刺激潜在的致病性免疫反应。满足这些特性的新型载体系统可被用于形成适合于治疗或预防如过敏性疾病等疾病的新型缀合物和组合物。
[0010]Bohle B.等人(J.1mmunol.172 (11) (2004):6642-6648)描述了一种包含 S 层蛋白(S-layer protein)半体(moiety)和Bet vl半体的重组融合蛋白。这个分子包含含有Bet vl特异性T细胞表位的天然的Bet vl变应原。
[0011]WO 2004/004761涉及融合至免疫原的病毒样颗粒，可用于免疫。
[0012]在WO 2004/00 3143中公开包含病毒样颗粒和变应原性分子的融合蛋白，其作为免疫原用于接种。
[0013]在WO 2007/140505 中和 Edlmayr 等人(J.1mmunol.182(10) (2009)6298-6306)描述包含几个融合至变应原衍生肽的载体分子的融合蛋白，其用于诱导变应原特异性IgG抗体,但这些构建物并不显示可被视作对过敏患者有利的免疫调节效果,例如IL-10或Thl免疫的诱导。Edlmayr等人的图4显示KLH融合的肽诱导Th2细胞因子IL-5，以及VPl融合蛋白不诱导IL-10或IFN-gamma。
[0014]在Niespodziana 等人(J.Allergy Clin.Tmmunol.127(6) (2011) 1562-1570)描述各包含乙型肝炎-衍生的PreS和源自主要猫变应原Fel dl的两个肽的融合蛋白，其用于诱导变应原特异性IgG抗体。然而，尚无描述适用于人类接种的方案，所述肽包含变应原特异性T细胞表位。
【发明内容】
[0015]本发明的目的是提供药物和载体，其克服前述缺陷并允许具有减少的副作用的变应原接种。
[0016]因此，本发明涉及包含至少3个肽片段的多肽，所述肽片段由至少I个野生型变应原的10至50个连续的氨基酸残基组成，所述野生型变应原融合至嗜肝DNA病毒科(family)病毒表面多肽的N和C端或所述表面多肽的至少I个片段，或者所述多肽包含嗜肝DNA病毒科病毒的表面多肽或其至少I个片段，其N和/或C端融合至源自至少I个野生型变应原的至少3个肽。
[0017]为了激发针对分子特别是针对根据本发明变应原性的或低变应原性的分子的提高的免疫反应，源自至少I个野生型变应原的至少3个肽片段(通过遗传工程)融合至嗜肝DNA病毒科病毒的表面多肽，优选乙型肝炎病毒，更优选乙型肝炎PreS多肽，或其至少I个片段。结果令人惊讶，与常规和通常使用的载体蛋白例如KLH (钥孔戚血蓝素，keyholelimpet hemocyanin)相反,嗜肝DNA病毒科病毒的表面多肽,优选乙型肝炎病毒,更优选乙型肝炎PreS多肽，或其片段引发对其所结合的那些肽的抗体的增强形成。
[0018]而且，结果表明，使用融合至乙型肝炎PreS多肽的3个以上合适选择的变应原衍生肽片段进行免疫所诱导的变应原特异性IgG抗体，更好地聚焦于变应原的IgE表位，然而用野生型变应原进行免疫则产生针对变应原所有部分的IgG，还有针对非IgE反应性的那些的IgG。在标准化IgG滴度的实验中，这引发P reS/肽诱导的IgG，相对于野生型变应原诱导的IgG，更好的阻断能力(图12)。
[0019]同样非常出人意料，结果表明，在融合至乙型肝炎PreS多肽的变应原衍生肽片段的人PBMC融合蛋白的培养物中，强烈诱导细胞因子IL-10和IFN-ga_a，其被归为成功的过敏症免疫疗法的阳性指示因子(indicator)。与之相反，使用野生型变应原、单独使用变应原衍生的肽片段或单独使用PreS时，IL-10和IFN-gamma的诱导显著较低(图10)。
[0020]本文使用的“融合至N和C端”意思是至少I个肽被融合至嗜肝DNA病毒科病毒的表面多肽的N端或所述表面多肽的至少I个片段，以及至少I个肽被融合至嗜肝DNA病毒科病毒的表面多肽的C端或所述表面多肽的至少I个片段。在本发明的最简实施方案中，嗜肝DNA病毒科病毒表面多肽或所述表面多肽的至少I个片段可在N端包含I个肽以及在C端包含2个肽或反之亦然。
[0021]本发明的多肽优选地包含至少4个，更优选至少5个，甚至更优选至少6个，肽片段，优选源自变应原的B细胞结合肽，其中4个肽是最优选的。
[0022]根据本发明的具体优选实施方案，载体蛋白是具有下列氨基酸序列(SEQIDN0.21)的乙型肝炎PreS多肽:
[0023]GGWSSKPRKGMGTNLSVPNPLGFFPDHQLDPAFGANSNNPDWDFNPIKDHWPAANQVGVGAFGPGLTPPHGGILGffSPQAQGILTTVSTIPPPASTNRQSGRQPTPISPPLRDSHPQAMQWNSTAFHQALQDPRVRGLYFPAGGSSSGTVNPAPNIASHISSISARTCDPVTN
[0024]也可使用乙型肝炎PreS多肽的片段乙型肝炎PreSl或乙型肝炎PreS2。乙型肝炎PreS多肽的片段优选包含或者由至少30个，优选至少40个，更优选至少50个，SEQ IDN0.21的连续氨基酸残基组成。
[0025]如本文所用的“低变应原性的”指具有减少的或者没有变应原性潜力的分子(即，本领域已知的在IgE结合测试中确定的IgE反应性)。这样的分子，与这些分子所源自的野生型蛋白相比，在个体中具有降低的激发过敏性反应的能力。
[0026]至少3个，优选至少4个，更优选至少5个，甚至更优选至少6个肽片段融合至嗜肝DNA病毒科病毒的表面多肽的N和C端或者所述表面多肽的至少I个片段，其包含或由至少I个野生型变应原的10至50个连续的氨基酸，更优选15至50个连续的氨基酸，特别是20-50个连续的氨基酸组成，优选地，其与所述肽片段所源自的野生型变应原相比，显示出减少的IgE反应性。优选地，将这些肽片段设计为不包含变应原特异性T细胞表位，其可能引起T细胞介导的副作用。T细胞表位和显示减少的T细胞反应的分子可通过本领域技术人员已知的方法确定和鉴定(例如，Bercovici N.等人Clin Diagn Lab Immunol.(2000)7:859-864)。
[0027]至少3个肽片段包含或由至少I种野生型变应原的10至50个连续的氨基酸，更优选15至50个连续的氨基酸，特别20-50个连续的氨基酸组成，所述肽片段可源自同一变应原。如果两个或更多个片段源自相同变应原，这些两个或更多个片段在野生型变应原上不相邻和/或在本发明的多肽上具有与野生型变应原上的顺序不对应的顺序。
[0028]本文使用的术语“肽片段”意思为源自野生型变应原初级结构的本发明的低变应原性多肽或融合蛋白的部分/片段，并包含或由这个野生型变应原的10至50个连续的氨基酸，更优选15至50个连续的氨基酸，特别20-50个连续的氨基酸组成。 [0029]如本文所用的术语“源自变应原”和“源自至少I个野生型变应原”意思为根据本发明的肽片段通过片段化或截断从变应原直接获得。优选地，这些肽片段的氨基酸序列，与所述肽片段所源自的野生型变应原的氨基酸序列延伸(stretch)，至少80%相同，更优选为至少90%相同，最优选为至少95%相同，特别地为100%相同。但是，与野生型变应原片段并非100%相同的肽需要能够以至少60%，优选为至少70%，更优选为至少80%，最优选为至少90%的力(strength)结合至抗体,优选结合至针对所述野生型变应原片段的IgG抗体。“至少I个野生型变应原”意思为本发明的多肽可包含多于I个，优选2个，更优选3个，不同的野生型变应原(即，来源)的B-细胞结合肽(例如，I个肽源自Bet vl, I个源自Amb al和I个源自Phl pi或者2个肽源自Bet vl以及I个源自Amb al)。
[0030]第一氨基酸序列与第二氨基酸序列的同一性程度可通过使用一定的算法直接比较两条氨基酸序列来确定。这样的算法为例如，嵌合在各种计算机程序中(例如"BLAST2SEQUENCES (blastp) " (Tatusova 等人.(1999) FEMS Microbiol.Lett.174:247-25;Corpet F，Nucl.Acids Res.(1988) 16:10881-10890)。
[0031]根据本发明的多肽可通过重组方法或化学合成以获得。或者，当然也可能通过酶法或化学切割野生型变应原或包含感兴趣分子的多肽/蛋白来获得。
[0032]目前出人意料地发现，通过使用来自嗜肝DNA病毒类/纲(class)的病毒更具体地为人乙型肝炎病毒的表面蛋白可获得具有改善性能的肽载体融合蛋白。I至20个，优选3或4至20个，更优选3或4至15个，甚至更优选3或4至10个(即，3、4、5、6、7、8、9、10)肽片段，优选低变应原性的肽片段，可被融合至嗜肝DNA病毒科病毒表面多肽的C端和N端或所述表面多肽的至少I个片段。因此，本发明优选的实施方案是由至少3至6个低变应原性的肽片段组成的融合蛋白，其中载体蛋白源自人乙型肝炎病毒表面抗原。根据本发明的具体优选实施方案，这样的融合蛋白使用PreS蛋白作为载体。本发明的最优选的实施方案是融合蛋白，其中4个低变应原性的肽片段被融合至preS载体蛋白或其片段。所述(低变应原性的)肽片段可以相同或不同以及可以源自I个或几个变应原性蛋白，以及肽在融合蛋白中的位置位于载体蛋白的C端和N端。可将I至3个(低变应原性的)肽片段融合至C端和N端的每一端，这样，(低变应原性的)肽片段的总数将是，例如3或4至6。术语“融合”(fused)或“融合蛋白”，指本发明优选的实施方案，意思为将非变应原性的载体蛋白和位于载体C和N端的(低变应原性的)肽片段，作为I个单一重组多肽链，予以表达和制备。
[0033]本发明最高度优选的实施方案是乙型肝炎病毒preS蛋白的融合蛋白，其携带源自特异性变应原的(低变应原性的)肽片段，从而I或2个，优选2个肽片段，每个被融合至载体的C端和N端。说明性地，本发明优选的多肽可具有由下列通用结构所代表的通用分子结构:
[0034]结构I优选实施方案的通用结构原则
[0035]
【权利要求】
1.包含至少三个肽片段的多肽，所述肽片段由融合至嗜肝DNA病毒科的病毒的表面多肽的N和C端或所述表面多肽的至少一个片段的至少一个野生型变应原的10至50个连续的氨基酸残基组成。
2.根据权利要求1所述的多肽，其特征在于嗜肝DNA病毒科的病毒是乙型肝炎病毒。
3.根据权利要求1或2所述的多肽，其特征在于嗜肝DNA病毒科的病毒的表面多肽是PreS0
4.根据权利要求3所述的多肽，其特征在于表面多肽的至少一个片段是乙型肝炎PreSl或乙型肝炎PreS2。
5.根据权利要求1至4任一项所述的多肽，其特征在于源自至少一个野生型变应原的至少三个肽片段中的至少一个是B细胞结合肽。
6.根据权利要求1至5任一项所述的多肽，其特征在于与野生型变应原相比，至少三个肽片段表现出无或降低的IgE结合能力。
7.根据权利要求1至6任一项所述的多肽，其特征在于所述至少三个肽片段中的至少一个表现出无或基本上无T细胞反应性。
8.根据权利要求1至7任一项所述的多肽，其特征在于野生型变应原选自:主要桦树花粉变应原，特别是Bet vl、主要牧草花粉变应原，优选Phlpl、Phlp2、Phlp5、Phlp6和Phlp7、主要屋尘螨变应原，优选Der p1、Der p2和Der p23、主要猫变应原Fel dl和Feld2、主要蜂变应原、主要黄蜂变应原、前纤维蛋白，特别是PhIp12、橄榄变应原，优选01 e el、欧蓍草变应原，优选Par j2、豚草变应原,优选Amb al、艾蒿花粉变应原,优选Art vl、和日本雪松花粉变应原，优选Cryjl或Cryj2。``
9.根据权利要求1至8任一项所述的多肽，其特征在于所述肽片段选自Phlpi的151至177、87至117、1至30、43至70或212至241位氨基酸，Phl p2的I至33、8至39、34至`65 或 66 至 96 位氨基酸，Phl p5 的 93 至 128、98 至 128、26 至 53、26 至 58、132 至 162、217至246、252至283或176至212位氨基酸、Phl p6的23至54、56至90、73至114或95至`127位氨基酸、Fel dl链I的I至34或35至70位氨基酸、Fel dl链2的I至34、35至63或64至92位氨基酸、Bet vl的30至59、50至79、75至104、30至74或60至104位氨基酸、Der pi的I至30、52至84或188至222位氨基酸、Der p2的I至33、21至51、42至`73、62 至 103 或 98 至 129 位氨基酸、Der p7 的 I 至 30、20 至 50、50 至 80、90 至 125、125 至`155 或 165 至 198 位氨基酸、Der plO 的 1-35、36-70、71_110、111-145、140-170、175-205、`210-250或250-284位氨基酸、Der p21的I至35、35至72、70至100或90至122位氨基酸，Der p23 的 I 至 32、15 至 48 或 32 至 70、32 至 60、52 至 84、32 至 70 (Cys_>Ser)位氨基酸、Alt al 的 19 至 58、59 至 95、91 至 120 或 121 至 157 位氨基酸，Par J2 的 31 至 60、45至80、60至96或97至133位氨基酸、Ole el的I至40、36至66、63至99、86至120或`107 至 145 位氨基酸、Fel d2 的 25 至 58、99 至 133、154 至 183、277 至 307、334 至 363、373至 402,544 至 573,579 至 608,58 至 99,125 至 165,183 至 224,224 至 261,252 至 289,303至 340、416 至 457、460 至 500 或 501 至 542 位氨基酸、Can f2 的 19 至 58、52 至 91、82 至`119、106 至 144 或 139 至 180 位氨基酸、Can fl 的 19 至 56、51 至 90、78 至 118、106 至 145`或135-174位氨基酸、Art vl的27至70、70至100或92至132位氨基酸、Amb al的31至`70,80 至 120、125 至 155、160 至 200、225 至 263、264 至 300、305 至 350 或 356 至 396 位氨基酸、Alt a6 的 I 至 34、35 至 74、74 至 115、125 至 165、174 至 213、241 至 280、294 至 333、361至400或401至438位氨基酸、Alt a2的I至40、41至80、81至120、121至160位氨基酸或其片段或其序列变体。
10.根据权利要求1至9任一项所述的多肽，其特征在于所述嗜肝DNA病毒科病毒的表面多肽或其至少一个片段，包含融合至其N端的源自至少一个野生型变应原的至少两个肽片段、和融合至其C端的源自至少一个野生型变应原的至少两个肽片段。
11.根据权利要求1至10任一项所述的多肽，其特征在于所述至少三个肽的至少两个是相同的。
12.根据权利要求1至11任一项所述的多肽，其特征在于所述多肽具有选自以下的氨基酸序列:SEQ ID N0.14、SEQ ID N0.15、SEQ ID N0.16、SEQ ID N0.17、SEQ ID N0.18、SEQ ID N0.19、SEQ ID N0.20、SEQ ID N0.149、SEQ ID N0.150、SEQ ID N0.151 和 SEQ IDN0.152。
13.根据权利要求1至12任一项所述的多肽，在治疗或预防人或动物过敏症中用作疫苗。
14.根据权利要求13所述的多肽,其特征在于所述多肽以0.0Olmg/kg体重至5mg/kg体重,优选0.003mg/kg体重至2mg/kg体重的量施用于个体。
15.根据权利要求13或14所述的多肽，其特征在于其诱导IL-10和IFN-gamma的产生。
16.根据权利要求13至15任一项所述的多肽，其特征在于其诱导聚焦于野生型变应原IgE表位的IgG反应。
17.编码根据权利要求1至12任一项所述的多肽的核酸分子。
18.包含根据权利要求17所述的核酸分子的载体。
19.根据权利要求18所述的载体，其特征在于所述载体是表达载体。
20.根据权利要求18或19所述的载体，其特征在于所述载体是细菌、真菌、昆虫、病毒或哺乳动物载体。
21.包含根据权利要求17所述的核酸分子或包含根据权利要求18至20任一项所述的载体的宿主。
22.疫苗制剂，其包含至少一种根据权利要求1至12任一项所述的多肽、根据权利要求17所述的核酸分子或根据权利要求18至20任一项所述的载体。
23.用于治疗或预防草花粉过敏症的疫苗制剂其包含源自草花粉变应原的低变应原性多肽的混合物，其特征在于至少一个所述多肽选自SEQ ID N0.14、SEQ ID N0.15、SEQ IDN0.16 和 SEQ ID N0.17。
24.用于治疗或预防桦树花粉过敏症的疫苗制剂，其包含至少一个选自SEQID N0.18或SEQ ID N0.19的低变应原性多肽。
25.用于治疗或预防屋尘螨过敏症的疫苗制剂，其包含至少一个源自屋尘螨变应原的多肽，其特征在于至少一个多肽选自SEQ ID N0.149,SEQ ID N0.150,SEQ ID N0.151和SEQID N0.152。
26.根据权利要求22至25任一项所述的制剂，其特征在于所述制剂包含IOng至lg，优选IOOng至IOmg,特别地0.5 μ g至200 μ g的所述多肽、核酸分子或载体。
27.根据权利要求22至26任一项所述的制剂，其特征在于所述制剂进一步包括至少一种佐剂、药学上可接受的赋形剂和`/或防腐剂。
【文档编号】C07K14/02GK103687617SQ201280028169
【公开日】2014年3月26日 申请日期:2012年6月11日 优先权日:2011年6月9日
【发明者】K·尼斯波德兹阿纳, M·福克-泰克尔, S·威塔拉, S·班纳吉, K-W·陈, M·韦伯, R·瓦伦察, K·马特 申请人:碧欧美公司