使用具有对水解酶抗性的衣壳的vlp的方法

使用具有对水解酶抗性的衣壳的vlp的方法
【专利摘要】本发明描述了新方法和组合物，其使用对水解酶抗性的病毒衣壳蛋白质，以制备病毒样颗粒，以便封入目的靶标货物分子并且随后分离且纯化目的靶标货物分子，所述目的靶标货物分子包括核酸例如siRNA和shRNA以及小肽。
【专利说明】使用具有对水解酶抗性的衣壳的VLP的方法
[0001] 与相关申请的夺叉参考
[0002] 本专利申请要求于2011年12月21日提交的美国临时申请号61/578, 706、于2012 年3月7日提交的美国临时申请号61/607, 900和于2012年6月19日提交的美国临时申 请号61/661，688的优先权，所述美国临时申请的完整公开内容以引用的方式在此并入。
[0003] 序列表的并入
[0004] "序列表"的纸件拷贝和在软盘上的计算机可读形式的序列表的完整内容以引用 的方式并入本文，所述软盘含有命名为450061_SequenceListing_ST25. txt的文件，所述 文件大小为77千字节并于2012年12月20日创建。

【技术领域】
[0005] 本发明涉及病毒样颗粒，且特别涉及使用病毒衣壳作为纳米容器的方法和组合 物，所述纳米容器用于产生、分离且纯化异源核酸和蛋白质。

【背景技术】
[0006] 病毒样颗粒（VLP)是通过某些病毒结构蛋白质的表达而部分源自病毒的颗粒，所 述病毒结构蛋白质构成病毒包膜和/或衣壳，但VLP不含病毒基因组并是非感染性的。VLP 已例如源自乙型肝炎病毒和某些其他病毒，并且已用于研究病毒装配和疫苗开发中。
[0007] 病毒衣壳由至少一种蛋白质组成，所述蛋白质的几个拷贝装配形成衣壳。在一些 病毒中，病毒衣壳由病毒包膜覆盖。此类病毒包膜由病毒糖蛋白和受感染宿主的细胞膜的 部分组成，并且使病毒衣壳与否则与其相互作用的大分子屏蔽。衣壳通常被说成使核酸壳 体化，所述核酸编码病毒基因组，有时还编码病毒在天然环境中的持续所需的蛋白质。为了 病毒的病毒基因组进入新宿主，衣壳必须被拆卸。此类拆卸在通常由宿主用于降解其自身 以及外源组分的条件下发生，并且最通常涉及蛋白酶解。病毒利用正常宿主过程例如蛋白 酶解降解以激活其周期的关键部分，即衣壳拆卸和基因组释放。
[0008] 因此并不令人惊讶的是，文献先前未描述对作用于肽键的水解酶抗性的衣壳。其 为较大蛋白质的一部分的非常有限数目的某些特异性肽序列已知略微对某些蛋白酶是抗 性的，但绝大多数的肽序列则不是。抵抗蛋白酶解的病毒已得到报道，但这些均为有包膜病 毒，其中衣壳由病毒包膜屏蔽。在此类病毒中，衣壳不与所述蛋白酶接触，即它们被屏蔽免 遭所述蛋白酶作用。因此，病毒衣壳在此类情况下的蛋白酶解稳定性的作用（如果存在的 话）是未知的。
[0009] 在重组分子例如蛋白质的大规模制造中，超滤通常在纯化步骤中用于去除小于靶 蛋白质的分子，从而导致其分离。纯化方法也通常涉及沉淀、溶剂萃取和结晶技术。这些 分离技术固有地是简单和低成本的，因为与色谱法形成对比，它们不是基于表面相互作用， 而是基于本体相互作用。然而，这些技术通常限制于对简单系统的应用，并且需要指定用于 每种蛋白质和表达系统的不同条件组。另外每种靶标重组蛋白质呈现独特的结合相互作用 组，由此使得它的分离过程是独特和复杂的。使用这些简单分离过程对于重组蛋白质的分 离效率因此很低。
[0010] 核酸包括siRNA和miRNA大部分已使用化学合成方法制造。由于所需的大量步 骤和倾向于技术困难的反应的复杂性以及制造系统的成本，这些方法一般是复杂和高成本 的。另外，涉及的合成试剂是昂贵的，并且因此规模经济不容易通过简单增加分批大小来获 得。


【发明内容】

[0011] 在一个方面，本公开内容提供了病毒样颗粒（VLP)，其包含封入至少一种异源货物 (cargo)分子和包装序列的衣壳。VLP还可包含由衣壳封入的至少一种核酶。异源货物分 子可包含寡核苷酸或寡核糖核苷酸。VLP可包含一种或多种核酶，并且核酶的侧翼可以是 包装序列和寡核糖核苷酸，以形成核酸构建体。VLP可包含多个核酸构建体。在包含寡核 糖核苷酸的VLP中，寡核糖核苷酸可以是选自siRNA、shRNA、sshRNA、IshRNA和miRNA的短 RNA。VLP可包含至少两种核酶，其中每种核酶选择为切割短RNA的一个末端。VLP还可包 含由至少1-100个核苷酸组成的接头，该接头包含至少40%的A或至少40%的U，其中该接 头连接寡核糖核苷酸和包装序列、或寡核糖核苷酸和核酶。核酶可选自例如锤头状核酶和 丁型肝炎病毒核酶。锤头状核酶可以是具有与寡核糖核苷酸的至少6个连续核苷酸互补的 连续核苷酸组的锤头状核酶变体。作为另外一种选择，核酶可以是能够切割其与寡核糖核 苷酸的连接的突变型丁型肝炎病毒核酶，其速率为野生型丁型肝炎病毒核酶速率的至多约 50%。此类突变型HDV核酶可具有例如选自SEQ ID No :10-18的核酸序列。
[0012] 根据本公开内容的VLP可包括包含野生型病毒衣壳或衣壳蛋白质的衣壳，所述 野生型病毒衣壳对由肽键水解酶类别EC 3. 4催化的水解是抗性的，所述衣壳蛋白质与野 生型肠杆菌噬菌体MS2衣壳（SEQ ID N0:3)的氨基酸序列具有至少15%、至少16%、至少 21 %、至少40%、至少41 %、至少45%、至少52%、至少53%、至少56%、至少59%或至少 86%序列同一性，并且对由肽键水解酶类别EC 3. 4催化的水解是抗性的。该衣壳可包含具 有SEQ ID N0:3的氨基酸序列的野生型肠杆菌噬菌体MS2衣壳蛋白质。
[0013] 根据本公开内容的VLP可包含包括肽或多肽的异源货物分子。VLP还可包含偶 联异源货物肽或多肽分子和病毒衣壳的寡核苷酸接头。寡核苷酸接头可以是包含核酶序 列的寡核糖核苷酸。作为另外一种选择，异源货物分子可包括包含双功能多核苷酸的双 分子货物分子，所述双功能多核苷酸包含第一适体序列和第二适体序列，所述第一适体序 列特异性结合具有约l，500Da或更少的分子量的生物活性小分子，所述第二适体序列用 于结合衣壳的包装序列。VLP还可包含与第一适体序列结合的生物活性小分子。生物活 性小分子可包含除草剂或杀虫剂，所述除草剂或杀虫剂可选自例如莠去津、啶虫脒甲拌磷 (acetamipridphorate)、丙溴磷、水胺硫磷和氧乐果（omethoateas)。
[0014] 在另一个方面，本公开内容提供了包含核苷酸序列的核酸构建体，所述核苷酸序 列编码短RNA、核酶和包装序列。短RNA可以例如是siRNA或shRNA。核酸构建体还可包含 4-100个核苷酸的连接核苷酸序列，所述核苷酸中至少40 %是A或至少40 %是T，其中该连 接核苷酸序列的侧翼为包装编码序列和短RNA编码序列。核酸构建体还可包含4-100个核 苷酸的连接核苷酸序列，所述核苷酸中至少40%是A或至少40%是U，其中该连接核苷酸 序列的侧翼为核酶和短RNA编码序列。核酶序列的侧翼可以为短RNA和包装序列。本公开 内容还包括包含任何此类核酸构建体的载体，和包含此类载体的宿主细胞，以及由此类载 体稳定转化的宿主细胞。宿主细胞可以是细菌细胞，例如但不限于大肠杆菌（Escherichia coli)细胞、植物细胞、哺乳动物细胞、昆虫细胞、真菌细胞或酵母细胞。宿主细胞还可由第 二载体稳定转染，所述第二载体包含编码病毒衣壳的第二核酸序列，所述病毒衣壳对由肽 键水解酶类别EC 3. 4催化的水解是抗性的。第二核酸序列可编码例如编码病毒衣壳的病 毒蛋白质，所述病毒衣壳与野生型肠杆菌噬菌体MS2衣壳蛋白质（SEQ ID NO: 3)的氨基酸 序列具有至少40%序列同一性，并且对由肽键水解酶类别EC 3. 4催化的水解是抗性的。如 本文描述的核酸构建体还可编码野生型肠杆菌噬菌体MS2衣壳蛋白质（SEQ ID NO: 3)。此 类核酸构建体中的核酶可以是例如锤头状核酶、具有与短RNA的至少6个连续核苷酸互补 的连续核苷酸组的锤头状核酶变体、丁型肝炎病毒核酶、或能够切割其与短RNA的连接的 突变型丁型肝炎病毒核酶，其速率为野生型丁型肝炎病毒核酶速率的至多50%。非限制性 但示例性突变型HDV核酶具有选自SEQ ID No: 10-18的核酸序列。本公开内容还包含经 转化以含有本文描述的核酸构建体的植物或植物组织，和此类植物或植物组织的种子或后 代，其中该种子或后代包含核酸构建体。
[0015] 在另一个方面，本公开内容提供了包含下述的组合物：a)各自包含封入至少一种 异源货物分子的病毒衣壳的多个病毒样颗粒；和b)对于组合物中存在的每100克衣壳以小 于4克的量存在的一种或多种细胞裂解产物，其中该细胞裂解产物选自蛋白质、多肽、肽及 其任何组合。在该组合物中，衣壳例如对由肽键水解酶类别EC 3. 4催化的水解是抗性的。 衣壳可包含这样的衣壳蛋白质，其与野生型肠杆菌噬菌体MS2衣壳（SEQ ID N0:3)的氨基 酸序列具有至少15%、至少16%、至少21%、至少40%、至少41%、至少45%、至少52%、 至少53%、至少56%、至少59%或至少86%序列同一性，并且对由肽键水解酶类别EC 3. 4 催化的水解是抗性的。该衣壳可包含野生型肠杆菌噬菌体MS2衣壳蛋白质（SEQ ID N0:3)。 在该组合物中，异源货物分子可包含其可以是寡核糖核苷酸的寡核苷酸。寡核糖核苷酸可 例如选自siRNA、shRNA、sshRNA、IshRNA和miRNA。在该组合物中，每个病毒样颗粒还可包 含至少一种核酶，其中该核酶的侧翼为包装序列和寡核糖核苷酸，以形成核酸构建体，并且 每个病毒样颗粒可包含多个核酸构建体。在此类组合物的VLP中，核酶可以是例如锤头状 核酶、具有与短RNA的至少6个连续核苷酸互补的连续核苷酸组的锤头状核酶变体、丁型肝 炎病毒核酶、或能够切割其与短RNA的连接的突变型丁型肝炎病毒核酶，其速率为野生型 丁型肝炎病毒核酶速率的至多50%。非限制性但示例性突变型HDV核酶具有选自SEQ ID No: 10-18的核酸序列。此类组合物中的VLP还可包含4-100个核苷酸的连接核苷酸序列， 所述核苷酸中至少40%是A或至少40%是T，其中该连接核苷酸序列的侧翼为包装编码序 列和短RNA编码序列，或4-100个核苷酸的连接核苷酸序列，所述核苷酸中至少40 %是A或 至少40%是U，其中该连接核苷酸序列的侧翼为核酶和短RNA编码序列。核酶序列的侧翼 可以为短RNA和包装序列。此类组合物中的VLP可包含包括肽或多肽的异源货物分子。组 合物中的此类VLP还可包含偶联异源货物分子和病毒衣壳的寡核苷酸接头。寡核苷酸接头 可以是包含核酶序列的寡核糖核苷酸。在此类组合物中，细胞裂解产物可以小于0.5克、小 于0. 2克或小于0. 1克的量存在。
[0016] 在另一个方面，本公开内容提供了用于分离和纯化靶标货物分子的方法，该方法 包括：(a)获得包含多个病毒样颗粒（VLP)的全细胞裂解物，所述病毒样颗粒各自包含封入 至少一种靶标货物分子的衣壳，其中该衣壳对由肽键水解酶类别EC 3. 4催化的水解是抗 性的；(b)对VLP实施使用肽键水解酶类别EC 3. 4的水解，其时间和条件足以切割全细胞 裂解物中存在的但未由衣壳封入的每100个个别多肽中的至少60、至少70、至少80或至少 90个，同时在此类水解前全细胞裂解物中存在的每100个衣壳中的至少60、至少70、至少 80或至少90个在水解后保持完整。在该方法中，衣壳可各自包含这样的病毒衣壳蛋白质， 其与野生型肠杆菌噬菌体MS2衣壳蛋白质（SEQ ID NO:3)的氨基酸序列具有至少15%、至 少16%、至少21 %、至少40%、至少41 %、至少45%、至少52%、至少53%、至少56%、至少 59%或至少86%序列同一性，并且对由肽键水解酶类别EC 3. 4催化的水解是抗性的。该 衣壳可各自包含野生型肠杆菌噬菌体MS2衣壳蛋白质（SEQ ID NO:3)。在该方法中，异源 货物分子可包含其可以是寡核糖核苷酸的寡核苷酸、或肽或多肽。寡核糖核苷酸可例如选 自siRNA、shRNA、sshRNA、lshRNA和miRNA。在该方法中，每个病毒样颗粒还可包含核酶，其 中该核酶的侧翼为包装序列和寡核糖核苷酸，以形成核酸构建体。该方法还可包括在水解 后纯化衣壳。纯化可包括液-液萃取步骤、结晶步骤、分级沉淀步骤和超滤步骤中的至少一 个。本公开内容还包含由此类方法产生的组合物。
[0017] 在另一个方面，本公开内容提供了在宿主细胞中的细胞内生产靶分子后，用于保 护全细胞裂解物中的靶分子不受水解的方法，该方法包括：(a)选择对由肽键水解酶类别 EC 3. 4催化的水解是抗性的病毒衣壳；(b)用第一载体和第二载体稳定转染宿主细胞，所 述第一载体包含编码形成病毒衣壳的病毒蛋白质的核酸序列，所述第二载体包括包含核酶 的核酸序列，所述核酶的侧翼为包装序列和siRNA序列；和（c)使细胞维持在足以使经转 化的细胞表达且装配壳体化核酶的衣壳的时间和条件下，所述核酶的侧翼为包装序列和 siRNA序列。在该方法中，衣壳可各自包含这样的病毒衣壳蛋白质，其与野生型肠杆菌噬菌 体MS2衣壳蛋白质（SEQ ID N0:3)的氨基酸序列具有至少15%、至少16%、至少21 %、至少 40%、至少41 %、至少45%、至少52%、至少53%、至少56%、至少59%或至少86%序列同 一性，并且对由肽键水解酶类别EC 3. 4催化的水解是抗性的。
[0018] 在另一个方面，本公开内容提供了用于纯化封入至少一种异源货物分子的VLP的 方法，该方法包括：(a)获得包含多个VLP的细胞裂解物；(b)使细胞裂解物与蛋白酶接触 足以水解除VLP外的细胞裂解产物的时间和条件，以形成水解产物；和（c)从水解产物中分 离VLP。步骤（c)可包括（i)执行使用硫酸铵的第一沉淀，随后为第一离心，以获得第一沉 淀物和第一上清液；和（ii)对第一上清液执行使用硫酸铵的第二沉淀，随后为第二离心， 以获得第二沉淀物，其中该第二沉淀物包含按重量计至少约70%、80%或90%的VLP。步骤 (c)可包括（i)执行使用乙醇的第一沉淀，随后为第一离心，以获得第一沉淀物和第一上清 液；和（ii)对第一上清液执行使用硫酸铵的第二沉淀，随后为第二离心，以获得第二沉淀 物，其中该第二沉淀物包含按重量计至少约70%、80%或90%的VLP。步骤（c)可包括使水 解产物超离心，以获得包含按重量计至少约70%、80%或90%的VLP的沉淀物。在该方法 中，VLP可各自包含对由肽键水解酶类别EC 3. 4催化的水解是抗性的衣壳，所述衣壳可包 含这样的衣壳蛋白质，其与野生型肠杆菌噬菌体MS2衣壳（SEQ ID N0:3)的氨基酸序列具 有至少15 %、至少16 %、至少21 %、至少40 %、至少41 %、至少45 %、至少52 %、至少53 %、 至少56%、至少59 %或至少86 %序列同一性，并且对由肽键水解酶类别EC 3. 4催化的水解 是抗性的。VLP可各自包含野生型肠杆菌噬菌体MS2衣壳蛋白质（SEQ ID N0:3)。在该方 法中，步骤（b)可在约37°C下执行至少约30分钟。该过程还可包括在步骤（b)前，使细胞 裂解物与核酸酶、淀粉酶和脂肪酶（lypase)中的至少一种在约37°C下接触至少约30分钟。 在该方法中，蛋白酶可以例如是肽键水解酶类别EC 3. 4,其可选自例如蛋白酶K、来自灰色 链霉菌（Streptomyces griseus)的蛋白酶、来自地衣芽抱杆菌（Bacillus lichenformis) 的蛋白酶、胃蛋白酶和木瓜蛋白酶。在该方法中，由VLP封入的异源货物分子可包含其可以 是寡核糖核苷酸的寡核苷酸、或肽或多肽。寡核糖核苷酸可例如选自siRNA、shRNA、 SShRNA、 IshRNA和miRNA。在该方法中，VLP各自还可包含如本文描述的核酶，其侧翼为包装序列和 寡核糖核苷酸，以形成核酸构建体。寡核糖核苷酸和包装序列可由接头序列连接，所述接头 序列具有至少1-100个核苷酸，并且包含超过40%的A、超过40%的U或超过40%的T。该 方法还可包括在步骤（a)前通过下述制备细胞裂解物：在细胞中表达VLP后离心细胞；重 悬浮细胞；裂解细胞且离心细胞裂解物，以获得上清液，其中该上清液用作步骤（a)的细胞 裂解物。
[0019] 在另一个方面，本公开内容提供了 VLP，所述VLP包含封入至少一种异源货物分子 和包装序列的衣壳，其中该衣壳包含其为野生型肠杆菌噬菌体MS2衣壳（SEQ ID N0:3)的 变体的衣壳蛋白质。衣壳蛋白质可以是这样的衣壳蛋白质，其具有野生型肠杆菌噬菌体MS2 衣壳（SEQ ID N0:3)的氨基酸序列，除了在第1位处的A残基被缺失，并且对由肽键水解酶 类别EC 3.4催化的水解是抗性的之外。衣壳蛋白质可以是这样的衣壳蛋白质，其具有野生 型肠杆菌噬菌体MS2衣壳（SEQ ID N0:3)的氨基酸序列，除了在第1位处的A残基被缺失和 在第2位处的S残基被缺失，并且对由肽键水解酶类别EC 3. 4催化的水解是抗性的之外。 衣壳蛋白质可以是这样的衣壳蛋白质，其具有野生型肠杆菌噬菌体MS2衣壳（SEQ ID N0:3) 的氨基酸序列，除了在第1位处的A残基被缺失、在第2位处的S残基被缺失和在第3位处 的N残基被缺失，并且对由肽键水解酶类别EC 3. 4催化的水解是抗性的之外。衣壳蛋白质 可以是这样的衣壳蛋白质，其具有野生型肠杆菌噬菌体MS2衣壳（SEQ ID N0:3)的氨基酸 序列，除了在第129位处的Y残基被缺失，并且对由肽键水解酶类别EC 3. 4催化的水解是 抗性的之外。衣壳蛋白质可以是这样的衣壳蛋白质，其具有野生型肠杆菌噬菌体MS2衣壳 (SEQ ID NO:3)的氨基酸序列，但具有在112-117区段中的单个（1个）氨基酸缺失，并且对 由肽键水解酶类别EC 3. 4催化的水解是抗性的。衣壳蛋白质可以是这样的衣壳蛋白质，其 具有野生型肠杆菌噬菌体MS2衣壳（SEQ ID N0:3)的氨基酸序列，但具有在112-117区段 中的单个（1个）氨基酸缺失，并且对由肽键水解酶类别EC 3. 4催化的水解是抗性的。衣 壳蛋白质可以是这样的衣壳蛋白质，其具有野生型肠杆菌噬菌体MS2衣壳（SEQ ID N0:3) 的氨基酸序列，但具有在65-83区段中的1-2个残基插入，并且对由肽键水解酶类别EC 3. 4 催化的水解是抗性的。衣壳蛋白质可以是这样的衣壳蛋白质，其具有野生型肠杆菌噬菌体 MS2衣壳（SEQ ID N0:3)的氨基酸序列，但具有在44-55区段中的1-2个残基插入，并且对 由肽键水解酶类别EC 3. 4催化的水解是抗性的。衣壳蛋白质可以是这样的衣壳蛋白质，其 具有野生型肠杆菌噬菌体MS2衣壳（SEQ ID N0:3)的氨基酸序列，但具有在33-43区段中 的单个（1个）残基插入，并且对由肽键水解酶类别EC 3. 4催化的水解是抗性的。衣壳蛋 白质可以是这样的衣壳蛋白质，其具有野生型肠杆菌噬菌体MS2衣壳（SEQ ID N0:3)的氨 基酸序列，但具有在24-30区段中的1-2个残基插入，并且对由肽键水解酶类别EC 3. 4催 化的水解是抗性的。衣壳蛋白质可以是这样的衣壳蛋白质，其具有野生型肠杆菌噬菌体MS2 衣壳（SEQ ID N0:3)的氨基酸序列，但具有在10-18区段中的单个（1个）残基插入，并且对 由肽键水解酶类别EC 3. 4催化的水解是抗性的。衣壳可包含与第二衣壳单体序列串联的 衣壳蛋白质单体序列，所述衣壳蛋白质单体序列装配成对由肽键水解酶类别EC 3. 4催化 的水解是抗性的衣壳。该衣壳可包含其C末端由0-6残基接头区段延伸的衣壳蛋白质单体 序列，所述接头区段的C末端与第二衣壳单体序列串联，所有这些装配成对由肽键水解酶 类别EC 3. 4催化的水解是抗性的衣壳。接头区段可具有序列例如-(Gly)x，其中X = 0-6， 包括-Gly- ;-Gly_Gly-;和-Gly-Gly-Gly-。接头区段可以是选自-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-、 -Gly-Gly-Ser和-Gly-Ser-Gly-的Gly-Ser接头。该衣壳可包含与第三衣壳单体序列串 联的衣壳蛋白质，所述衣壳蛋白质装配成对由肽键水解酶类别EC 3. 4催化的水解是抗性 的衣壳。该衣壳可包含其中C末端由0-6残基接头区段延伸的衣壳蛋白质，所述接头区段 的C末端与第三衣壳单体序列串联，所有这些装配成对由肽键水解酶类别EC 3. 4催化的水 解是抗性的衣壳。该衣壳可包含衣壳蛋白质，其中该衣壳包含衣壳蛋白质，其中一个或两个 接头序列是 _(Gly)x，其中 X = 0-6,包括-Gly- ;-Gly_Gly-;和-Gly-Gly-Gly-。接头区段 可以是选自-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-、-Gly-Gly-Ser 和-Gly-Ser-Gly-的 Gly-Ser 接头。
[0020] 此类衣壳蛋白质例如装配成对由肽键水解酶类别EC 3. 4催化的水解是抗性的衣 壳。例如，该衣壳可包含其中一个或两个接头序列是-(Gly)x-，X = 1的衣壳蛋白质，所述 衣壳蛋白质装配成对由肽键水解酶类别EC 3. 4催化的水解是抗性的衣壳。该衣壳可包含 其中一个或两个接头序列是-(Gly)X-，X = 2的衣壳蛋白质，所述衣壳蛋白质装配成对由 肽键水解酶类别EC 3. 4催化的水解是抗性的衣壳。该衣壳可包含其中一个或两个接头序 列是-(Gly)x-，X = 3的衣壳蛋白质，所述衣壳蛋白质装配成对由肽键水解酶类别EC 3. 4 催化的水解是抗性的衣壳。该衣壳可包含其N末端截短1-3个残基的一种或多种外壳蛋白 质序列，并且如本文描述的接头区段延长缺失的残基数目，并且其对由肽键水解酶类别EC 3. 4催化的水解是抗性的。该衣壳可包含其C末端截短1个残基的一种或多种外壳蛋白质 序列，并且如本文描述的接头区段延长一个残基，其中所述衣壳对由肽键水解酶类别EC3. 4 催化的水解是抗性的。该衣壳可包含在串联二聚体中其C末端截短1个残基的第一外壳蛋 白质序列，和延长一个残基的接头区段，或其中在串联三聚体中的第一和/或第二外壳蛋 白质序列C末端截短1个残基，并且对由肽键水解酶类别EC 3. 4催化的水解是抗性的。衣 壳可包含这样的衣壳蛋白质，其具有N末端和C末端截短，并且对由肽键水解酶类别EC 3. 4 催化的水解是抗性的。
[0021] 对彩图的提及
[0022] 申请文件含有至少一张彩色照片。具有彩色照片的本专利申请公开的拷贝将在请 求和支付必要费用由专利局提供。

【专利附图】

【附图说明】
[0023] 图1是随着时间过去的光密度（0D ;实心菱形）和pH(空心正方形）的图，显示野 生型MS2细菌噬菌体（ATCC编号15597-B1，来自美国典型培养物中心，Rockville, MD)在其 大肠杆菌宿主（ATCC编号15669)中的繁殖。
[0024] 图2是显示在大肠杆菌中繁殖且使用蛋白酶K和超滤纯化后获得的MS2细菌噬菌 体样品的SDS-PAGE分析结果的凝胶，显示蛋白酶K纯化获得纯化至高于99 %的噬菌体（在 14kDa处的条带对应于MS2细菌噬菌体外壳蛋白质）。
[0025] 图3是显示部分纯化的MS2的SDS-PAGE分析结果的凝胶，显示噬菌体的完全降解 和在裂解物的lx或2x超滤后获得的结果（泳道4和6)。
[0026] 图4是显示使用超滤和蛋白酶K处理纯化的MS2样品的SDS-PAGE分析结果的凝 胶。
[0027] 图5是显示MS2样品的SDS-PAGE分析结果的凝胶，所述MS2样品使用蛋白酶K处 理、在酸性条件下沉淀、在碱性和酸性条件下使用乙醇沉淀和超滤进行纯化。
[0028] 图6是显示MS2样品的UV光谱的图，所述MS2样品使用蛋白酶K处理、在酸性条 件下沉淀、在碱性和酸性条件下使用乙醇沉淀和超滤进行纯化。
[0029] 图7是在对于图5和6描述的纯化后，在用溴化乙啶染色的1.5%琼脂糖 凝胶中进行色谱的得自MS2样品的PCR产物的色谱图（1.2kbp对于泳道1中的引物 F1201_1223-R1979_2001，800bp 对于泳道 2 中的引物 F1201_1223-R1979_2001，和 304bp 对 于泳道3中的引物F1401_1426-R1680_1705)，显示与完整MS2细菌噬菌体基因组的一致性。
[0030] 图8是在对于图5和6描述的纯化后，用对照样品（空心菱形）和MS2样品获得的 随着时间过去的光密度（0D;实心菱形）图，显示纯化的样品含有保留高感染性的噬菌体。
[0031] 图9是显示在壳体化RNA的MS2衣壳表达后，MS2样品的SDS-PAGE分析结果的凝 胶，所述RNA编码附着至外壳特异性19聚体RNA发夹的外壳蛋白质。
[0032] 图10是在纯化后，在用溴化乙啶染色的2%琼脂糖凝胶中进行色谱的（泳道1中 的304bp ;最左边的泳道对应于lkb加上来自Life Technologies的梯），来自就MS2衣壳 部分的存在或不存在的MS2样品的PCR查询的PCR产物色谱图，显示与完整MS2外壳基因 的一致性。
[0033] 图11是显示对于MS2病毒样颗粒（VLP)的纯化，在用乙醇简单沉淀后，MS2样品 的SDS-PAGE分析结果的凝胶。
[0034] 图12是显示对于MS2 VLP的纯化，在使用蛋白酶K(PK)和用乙醇简单沉淀后，MS2 样品的SDS-PAGE分析结果的凝胶。
[0035] 图13是显示对于MS2 VLP的纯化，在使用组成性水解酶（CH)、用乙醇分级沉淀和 超滤后，MS2样品的SDS-PAGE分析结果的凝胶。
[0036] 图14是显示对于MS2 VLP的纯化，在使用多种水解酶和用硫酸铵分级沉淀后，MS2 样品的SDS-PAGE分析结果的凝胶。
[0037] 图15是显示得自在MS2衣壳中壳体化的RNA的RNA的PAGE分析结果的凝胶。
[0038] 图16是显示在使用丁型肝炎病毒（HDV)核酶体外转录后产生的RNA产物的PAGE 分析结果的凝胶。
[0039] 图17是显示在使用长侧翼锤头状核酶的体外转录过程中获得的siRNA产物的 PAGE分析结果的凝胶。
[0040] 图18是显示在VLP纯化和从VLP中分离RNA后，得自在VLP中壳体化的RNA的 RNA产物的PAGE分析结果的凝胶。
[0041] 图19是显不在VLP纯化和悬浮，以及暴露于多种蛋白酶1小时和4小时温育后， 包含MS2衣壳的VLP的SDS-PAGE分析结果的一系列凝胶。
[0042] 图20是所选肠杆菌噬菌体MS2衣壳蛋白质的比对。
[0043] 图21是从UniProt数据库中检索，并使用其BLAST多重比对伴随加权阵列选择、 缺口罚分等的缺省值比对的，完全光滑病毒科（leviviridae)病毒外壳蛋白质序列的比 对。
[0044] 图22是1AQ3链B(光滑病毒科外壳蛋白质单体）与1QBE链C(alloleviridae外 壳蛋白质单体）的主链叠加的图示说明。
[0045] 图23是图22中所示的1AQ3链B(光滑病毒科外壳蛋白质单体）与1QBE链 C(alloleviridae外壳蛋白质单体）的主链叠加的可替代视图的图示说明。
[0046] 图24是图22中所示的1AQ3链B(光滑病毒科外壳蛋白质单体）与1QBE链 C(alloleviridae外壳蛋白质单体）的主链叠加的另一个可替代视图的图示说明。
[0047] 图25是图22中所示的1AQ3链B(光滑病毒科外壳蛋白质单体）与1QBE链 C(alloleviridae外壳蛋白质单体）的主链叠加的另一个可替代视图的图示说明。
[0048] 图26是使用jFATCAT刚性的1AQ3、2VTU和1QBE的结构序列比对。
[0049] 图27是从UniProt数据库中检索，并使用其BLAST多重比对伴随加权阵列选择、 缺口罚分等的缺省值比对的，完全alloleviviridae病毒外壳蛋白质序列的比对。
[0050] 图28是显不形成二十面体（isosahedral)光滑病毒科和alloleviviridae衣壳 的180个单体中的另外60个的图示说明。每个单体的主链由不同颜色的色带表示。主链 氢键由青色线表示。二十面体三重轴在该图的中心。单体-单体接触不填充由连接柔性环 67-81的尖端的氢键描绘轮廓的中心圆圈。
[0051] 图29是显示由与二十面体衣壳（色带代表为褐色和藏青色的单体主链）接 触的单体围绕的2个MS2单体（色带代表颜色为黑色和淡蓝色的主链）的图示说明。 alloleviviridaeQP具有就光滑病毒科而言在残基72和73之间（红色，底部中心）的两 残基缺失。中心空隙紧在该缺失位点下（图5)。缺失引起它轻微扩展。在126处的Qi3缺 失（红色，中心左侧）去除来自区段的偏移，而是在基本上使单体容纳在原位的邻近单体片 层之间的广泛接触。使用MS2序列编号。
[0052] 图30是由与二十面体衣壳（色带代表为褐色和藏青色的单体主链）接触 的单体围绕的2个MS2单体（色带代表颜色为黑色和淡蓝色的主链）的图示说明。 alloleviviridae 具有就光滑病毒科而言在残基12和13之间（黄色，左上中心）的一 残基插入，从外衣壳表面延伸到溶剂内的柔性环；在延伸到内部货物内的链连接末端处，在 残基53和54之间（黄色，左下中心）的两残基插入；在残基27和28之间的一残基插入也 在延伸到衣壳货物空间内的β折叠股（beta-strand)连接体末端处。这些插入无一需要 在单体折叠中或邻居之间的移动。
[0053] 图31是由与二十面体衣壳（色带代表为褐色和藏青色的单体主链）接触 的单体围绕的2个MS2单体（色带代表颜色为黑色和淡蓝色的主链）的图示说明。 alloleviviridae 具有就光滑病毒科而言在残基36和37之间（黄色，中心右侧）的一 残基插入。环针对邻近螺旋的末端压紧，但插入的残基可延伸到紧下方的柔性环上方的中 心空间内。
[0054] 图32是在装配的衣壳中在对称点周围压紧的3个非共价肠杆菌噬菌体MS2非共 价二聚体的主链色带的图示说明，其中所有Ν末端颜色为绿色，C末端颜色为红色。

【具体实施方式】
[0055] 如本章节和本文整个公开内容中使用的章节标题不预期是限制性的。
[0056] A.定义
[0057] 如本文使用的，除非上下文另有明确说明，否则单数形式"一个"、"一种"和"该/ 所述"包括复数所指对象。对于本文数目范围的叙述，明确考虑具有相同精确度的两者之 间的每个插入数目。例如，对于范围6-9,考虑除6和9之外的数目7和8,并且对于范围 6. 0-7. 0,明确考虑数目 6· 0、6· 1、6· 2、6· 3、6· 4、6· 5、6· 6、6· 7、6· 8、6· 9 和 7. 0。
[0058] 除非另有说明，否则"或"的使用意指"和/或"。此外，术语"包括"以及其他形式 的使用不是限制性的。
[0059] 除非本文另有定义，否则与本公开内容结合使用的科学和技术术语应具有由本领 域普通技术人员通常理解的含义。例如，与本文描述的动物和细胞解剖学、细胞和组织培 养、生物化学、分子生物学、免疫学和微生物学结合使用的任何命名法和技术是本领域众所 周知和通常使用的那些。术语的含义和范围应是明确的；然而，在任何潜在歧义的情况下， 本文提供的定义优先于任何字典或外部定义。另外，除非上下文另有要求，否则单数术语应 包括复数，并且复数术语应包括单数。
[0060] 被采用并可用于实践本文描述的方法和组合物的化学、生物化学、分子生物学和 免疫学中的广泛范围的常规技术和工具，在本领域普通技术人员的能力内，并且在文献中 充分描述。此类技术和工具包括用于生成和纯化VLP的技术和工具，该VLP包括具有野生 型或重组衣壳连同一种或多种货物分子的VLP，以及用于转化宿主生物和表达如本文描述 的重组蛋白质和核酸的技术和工具。参见例如，MOLECULAR CLONING, A LABORATORY MANUAL 第 2 版·1989 (Sambrook 等人，Cold Spring Harbor Laboratory Press);和 CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY(Ausubel 等人编辑，GreenePubl. Assoc.，Wiley-Inter science，NY) 1995。所述参考文献各自的公开内容以引用的方式并入本文。
[0061] 如本文使用的，术语"货物分子"指由衣壳封入或可由衣壳封入的寡核苷酸、多肽 或肽分子。
[0062] 如本文使用的，术语"寡核苷酸"指由磷酸二酯键连接的至少两个和不超过约70 个核苷酸、优选不超过约55个核苷酸的短聚合物。寡核苷酸可以是寡脱氧核苷酸（DNA)或 寡核糖核苷酸（RNA)，并且包含短RNA分子例如但不限于siRNA、shRNA、sshRNA和miRNA。
[0063] 如本文使用的，术语"肽"指聚合物分子，其最低限度包括由肽键连接的至少两个 氨基酸单体，并且优选具有由肽键连接的至少约10、和更优选至少约20个氨基酸单体，且 不超过约60个氨基酸单体、优选不超过约50个氨基酸单体。例如，该术语包含具有约10、 约20、约30、约40、约50或约60个氨基酸残基的聚合物。
[0064] 如本文使用的，术语"多肽"指包括由肽键连接的至少一条氨基酸单体链的聚合物 分子，其中该链包括至少约70个氨基酸残基、优选至少约80、更优选至少约90、且再更优选 至少约100个氨基酸残基。如本文使用的，该术语包含蛋白质，其可包括一条或多条连接的 多肽链，所述多肽链还可与辅因子或其他蛋白质结合或不结合。如本文使用的术语"蛋白 质"与术语"多肽"可互换使用。
[0065] 如本文使用的，术语就分子而言的"变体"是与天然或野生型分子的序列基本上类 似的序列。就核苷酸序列而言，变体包括这样的序列，其可关于一个或多个碱基改变，但由 于遗传密码的简并性，仍编码天然蛋白质的相同氨基酸序列。变体包括天然存在的等位基 因，以及使用分子生物学中众所周知的技术例如定点诱变改造并且编码天然蛋白质的核苷 酸序列，以及编码具有氨基酸置换的多肽的序列。一般地，本发明的核苷酸序列变体与天然 (内源）核苷酸序列具有至少40%、至少50%、至少60%、至少70%或至少80%序列同一 性。本公开内容还包含具有至少约85 %序列同一性，至少约90 %序列同一性，至少约85%、 86%、87%、88%、89%、90% 91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 的核苷酸 序列变体。
[0066] 如本文就给定核苷酸序列而言使用的，术语"保守变体"指编码与参考序列的氨基 酸序列相同或基本上相同的氨基酸序列的核苷酸序列。由于遗传密码的简并性，由此几乎 始终超过一个密码子可编码每个氨基酸，编码非常紧密相关的蛋白质的核苷酸序列可不共 享高水平的序列同一性。此外，不同生物具有用于许多氨基酸的优选密码子，并且不同生 物或甚至相同生物的不同菌株例如大肠杆菌菌株，可具有用于相同氨基酸的不同优选密码 子。因此，编码与第二核苷酸序列基本上相同的多肽的第一核苷酸序列视为与第二核苷酸 序列基本上相同，即使它们不共享最低限度百分比的序列同一性，或在严格条件下将不彼 此杂交。另外，应当理解在通常为甲硫氨酸的唯一密码子的ATG的有限例外情况下，任何序 列均可通过标准技术进行修饰，以获得功能上相同的分子，并且此类修饰由本公开内容包 含。如本文下文描述的，本公开内容特别考虑天然蛋白质的蛋白质变体，其具有氨基酸序 列，所述氨基酸序列与天然核苷酸序列具有至少15%、至少16%、至少21%、至少40%、至 少41%、至少52%、至少53%、至少56%、至少59%或至少86%序列同一性。
[0067] 在分子的限定区域内或跨越全长序列的氨基酸序列或核苷酸序列的序列同一性， 可使用本领域已知和如本文描述的常规工具和方法容易地测定。例如，两个氨基酸序列或 两个核苷酸序列的序列同一性程度使用比对工具容易地测定，所述比对工具例如NCBI基 本局部比对搜索工具（Basic Local Alignment Search Tool) (BLAST) (Altschul 等人， 1990)，其可容易地得自多个在线源。最佳序列比对的算法是本领域众所周知且描述的，包 括例如在 Smith 和 Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482 (1981) ;Pearson和 Lipman Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.)85 :2444(1988)中。序列分析的算法也在程序例如blastp、blastn、 blastx、tblastn和tblastx中可容易获得。为了本公开内容的目的，当两个核苷酸序列在 严格条件下彼此杂交时，它们也可视为"基本上相同的"。严格条件包括高杂交温度和杂交 缓冲液中的低盐，其仅允许在高度相似的核酸序列之间的杂交。严格条件是序列依赖性的， 并且在不同环境下将是不同的，但通常包括至少约60°C的温度，其比在限定离子强度和pH 下对于特定序列的热解链温度（Tm)低约10°C至约15°C。盐浓度通常为在pH7下约0. 02 摩尔。
[0068] 两个氨基酸序列之间的序列同一性程度可使用Karlin和Altschul (Proc. Natl. Acad. Sci.USA87:2264-2268, 1993)的BLASTp算法进行测定。序列同一性百分比通过在 比较窗上比较两个最佳比对的序列进行测定，其中为了两个序列的最佳比对，与参考序列 (其不包含添加或缺失）相比较，在比较窗中的氨基酸序列部分可包含添加或缺失（即缺 口）。百分比通过下述进行计算：测定在该处相同氨基酸在两个序列中存在的位置数目，以 获得匹配位置数目，将匹配位置数目除以比较窗中的总位置数目，并且将结果乘以100,以 获得序列同一性百分比。
[0069] 本领域技术人员将认识到多肽可以是"基本上相似的"，因为氨基酸可由相似氨基 酸残基置换，而不影响成熟蛋白质的功能。其为"基本上相似的"多肽序列共享如上所述的 序列，除了并非相同的残基位置可具有保守氨基酸改变之外。保守氨基酸置换指具有相似 侧链的残基的可互换性。例如，具有脂肪族侧链的一组氨基酸是甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮 氨酸和异亮氨酸；具有脂肪族-羟基侧链的一组氨基酸是丝氨酸和苏氨酸；具有含酰胺侧 链的一组氨基酸是天冬酰胺和谷氨酰胺；具有芳香族侧链的一组氨基酸是苯丙氨酸、酪氨 酸和色氨酸；具有碱性侧链的一组氨基酸是赖氨酸、精氨酸和组氨酸；和具有含硫侧链的 一组氨基酸是半胱氨酸和甲硫氨酸。优选的保守氨基酸置换组包括：缬氨酸-赖氨酸-异 亮氨酸、苯丙氨酸-酪氨酸、赖氨酸-精氨酸、丙氨酸-缬氨酸、和天冬酰胺-谷氨酰胺。
[0070] 编码肽、多肽或蛋白质的核酸可通过使用给定蛋白质的推导氨基酸序列筛选所选 cDNA或基因组文库来获得。使用如例如Sambrook等人中所述的引物延伸操作的常规操作 可用于检测前体和加工中间产物。
[0071] 由封入货物分子的衣壳组成的病毒样颗粒（VLP)
[0072] 本文描述的方法和组合物是下述理解的部分的结果：某些病毒衣壳可在新制造和 纯化方法中制备和/或使用，以改善核酸的商业化操作。本文描述的方法使用对可容易获 得的水解酶抗性的重组病毒衣壳，以封入异源货物分子例如核酸、肽或多肽包括蛋白质。
[0073] 衣壳可以是野生型衣壳或源自野生型衣壳的突变型衣壳，条件是当衣壳与作用于 肽键的至少一种水解酶接触时，衣壳显示出对由水解酶催化的水解的抗性。如本文可互换 使用的，短语"对水解抗性"和"水解抗性的"指任何衣壳，其当存在于也含有多肽（所述多 肽是细胞裂解产物且不封入衣壳中）的全细胞裂解物中时，并且实施使用肽键水解酶类别 EC 3.4的水解，其时间和条件足以切割裂解物（其为细胞裂解产物且不封入衣壳中）中存 在的每100个个别多肽中的至少60、至少70、至少80或至少90个（即所有个别未封入多 肽的至少60%、至少70%、至少80%或至少90%被切割），然而在此类水解前存在的每100 个衣壳中的至少60、至少70、至少80或至少90个在水解后保持完整。水解可进行这样的 时间段和条件，其足以使水解后来自细胞系的剩余细胞蛋白质的平均分子量是水解进行前 的细胞蛋白质的平均分子量的小于约三分之二、小于约一半、小于约三分之一、小于约四分 之一、或小于约五分之一。方法还可包括纯化水解后剩余的完整衣壳，并且测量衣壳的重量 以及在水解和纯化前和后的总干细胞物质的重量，其中衣壳重量除以在水解和纯化后的总 干细胞物质的重量是衣壳重量除以在水解和纯化前测量的总干细胞物质的重量的至少两 倍。衣壳重量除以在水解和纯化后的总干细胞物质的重量是衣壳重量除以在此类水解和纯 化前测量的总干细胞物质的重量的超过至少10倍、优选超过100倍、更优选超过1，〇〇〇倍、 且最优选超过10, 〇〇〇倍。
[0074] 水解酶是由欧洲委员会（European Commission)分类在身份号EC 3下的催化水 解反应的酶。例如，催化酯键水解的酶具有以EC 3.1开始的身份号。催化糖苷键水解的酶 具有以EC 3. 2开始的身份号。催化肽键水解的酶具有以EC 3. 4开始的身份号。其为催化 蛋白质水解的酶的蛋白酶使用以EC 3. 4开始的身份号进行分类，包括但不限于蛋白酶K和 枯草杆菌蛋白酶。例如，蛋白酶K具有身份号EC 3.4. 21.64。本公开内容包含其为（在非 限制性例子中）蛋白酶K、来自灰色链霉菌的蛋白酶、来自地衣芽孢杆菌的蛋白酶、胃蛋白 酶和木瓜蛋白酶抗性的VLP，以及使用此类VLP的方法和过程。
[0075] 国际生物化学与分子生物学联盟命名委员会（Nomenclature Committee of the International Union of biochemistry and Molecular Biology)还推荐通过酶催化的反 应的酶命名和分类。它们的完全推荐是可免费和广泛获得的，并且例如尤其可在http:// enzyme, expasy. org 和 www. chem. qmul. ac. uk/iubmb/enzyme/ 处在线访问。IUBMB 开发用 于描述每种酶针对其为活性的哪些位点的速记法。无区别切割的酶被称为广泛特异性的。 其他酶的切割模式描述为Xaa|Yaa，其中|代表切割位点，Xaa= {:在切割的N末端侧上由 酶偏好的残基集合}，并且Yaa= {:在切割的C末端侧上由酶偏好的残基集合}。一些酶具 有比这更多的结合需求，使得描述可变得更复杂。对于催化非常特异性的反应的酶，例如将 凝血酶原加工为活性凝血酶的酶，则该活性是切割描述的基础。在某些情况下，酶的精确活 性可能是不明确的，并且在此类情况下，报道针对标准测试蛋白质如B链胰岛素的切割结 果。作为使用具有以EC 3. 4开始的身份号的催化肽键水解的酶的替代物，可使用广泛特异 性酶，其具有Xaa | Yaa优先，其中该酶已报道P1袋结合优先Xaa，但对结合ΡΓ袋Yaa无优 先，并且相反地，其中该酶已报道P1'袋结合优先Yaa，但对结合P1袋Xaa无优先。
[0076] 衣壳还可这样选择和/或制备，使得它们可使用简单的分离和纯化操作进行分离 且纯化，如本文进一步详细描述的。例如，衣壳可选择或遗传修饰为具有比如本文描述的周 围基质显著更高的疏水性，以便选择性分隔到它们简单提取到其内的非极性与水不混溶的 相内。作为另外一种选择，衣壳可就由溶液选择性结晶的改善能力进行选择或遗传修饰。
[0077] 使用衣壳的简单有效纯化方法的使用通过下述成为可能：选择某些野生型衣壳， 或对包含野生型衣壳的蛋白质的氨基酸序列的修饰，使得衣壳显示出对如本文上文描述的 由作用于肽键的至少一种水解酶催化的水解的抗性。此类野生型衣壳例如野生型MS2衣壳 可用于纯化方法中，其中某些廉价酶例如蛋白酶K或枯草杆菌蛋白酶用于蛋白酶解。非限 制性例子是肠杆菌噬菌体MS2(SEQ ID N0:1，完整MS2野生型基因组；SEQ ID N0:2，MS2野 生型外壳蛋白质，DNA序列；和SEQ ID N0:3，MS2野生型外壳蛋白质，氨基酸序列。
[0078] (SEQ. ID NO :1)完整MS2基因组，野生型，以粗体表示的外壳蛋白质：
[0079] GGGTGGGACCCCTTTCGGGGTCCTGCTCAACTTCCTGTCGAGCTAATGCCATTTTTAATGTCTTTAGCG AGACGCTACCATGGCTATCGCTGTAGGTAGCCGGAATTCCATTCCTAGGAGGTTTGACCTGTGCGAGCTTTTAGTAC CCTTGATAGGGAGAACGAGACCTTCGTCCCCTCCGTTCGCGTTTACGCGGACGGTGAGACTGAAGATAACTCATTCT CTTTAAAATATCGTTCGAACTGGACTCCCGGTCGTTTTAACTCGACTGGGGCCAAAACGAAACAGTGGCACTACCCC TCTCCGTATTCACGGGGGGCGTTAAGTGTCACATCGATAGATCAAGGTGCCTACAAGCGAAGTGGGTCATCGTGGGG TCGCCCGTACGAGGAGAAAGCCGGTTTCGGCTTCTCCCTCGACGCACGCTCCTGCTACAGCCTCTTCCCTGTAAGCC AAAACTTGACTTACATCGAAGTGCCGCAGAACGTTGCGAACCGGGCGTCGACCGAAGTCCTGCAAAAGGTCACCCAG GGTAATTTTAACCTTGGTGTTGCTTTAGCAGAGGCCAGGTCGACAGCCTCACAACTCGCGACGCAAACCATTGCGCT CGTGAAGGCGTACACTGCCGCTCGTCGCGGTAATTGGCGCCAGGCGCTCCGCTACCTTGCCCTAAACGAAGATCGAA AGTTTCGATCAAAACACGTGGCCGGCAGGTGGTTGGAGTTGCAGTTCGGTTGGTTACCACTAATGAGTGATATCCAG GGTGCATATGAGATGCTTACGAAGGTTCACCTTCAAGAGTTTCTTCCTATGAGAGCCGTACGTCAGGTCGGTACTAA CATCAAGTTAGATGGCCGTCTGTCGTATCCAGCTGCAAACTTCCAGACAACGTGCAACATATCGCGACGTATCGTGA TATGGTTTTACATAAACGATGCACGTTTGGCATGGTTGTCGTCTCTAGGTATCTTGAACCCACTAGGTATAGTGTGG GAAAAGGTGCCTTTCTCATTCGTTGTCGACTGGCTCCTACCTGTAGGTAACATGCTCGAGGGCCTTACGGCCCCCGT GGGATGCTCCTACATGTCAGGAACAGTTACTGACGTAATAACGGGTGAGTCCATCATAAGCGTTGACGCTCCCTACG GGTGGACTGTGGAGAGACAGGGCACTGCTAAGGCCCAAATCTCAGCCATGCATCGAGGGGTACAATCCGTATGGCCA ACAACTGGCGCGTACGTAAAGTCTCCTTTCTCGATGGTCCATACCTTAGATGCGTTAGCATTAATCAGGCAACGGCT CTCTAGATAGAGCCCTCAACCGGAGTTTGAAGCATGGCTTCTAACTTTACTCAGTTCGTTCTCGTCGACAATGGCGG AACTGGCGACGTGACTGTCGCCCCAAGCAACTTCGCTAACGGGGTCGCTGAATGGATCAGCTCTAACTCGCGTTCAC AGGCTTACAAAGTAACCTGTAGCGTTCGTCAGAGCTCTGCGCAGAATCGCAAATACACCATCAAAGTCGAGGTGCCT AAAGTGGCAACCCAGACTGTTGGTGGTGTAGAGCTTCCTGTAGCCGCATGGCGTTCGTACTTAAATATGGAACTAAC CATTCCAATTTTCGCTACGAATTCCGACTGCGAGCTTATTGTTAAGGCAATGCAAGGTCTCCTAAAAGATGGAAACC CGATTCCCTCAGCAATCGCAGCAAACTCCGGCATCTACTAATAGACGCCGGCCATTCAAACATGAGGATTACCCATG TCGAAGACAACAAAGAAGTTCAACTCTTTATGTATTGATCTTCCTCGCGATCTTTCTCTCGAAATTTACCAATCAAT TGCTTCTGTCGCTACTGGAAGCGGTGATCCGCACAGTGACGACTTTACAGCAATTGCTTACTTAAGGGACGAATTGC TCACAAAGCATCCGACCTTAGGTTCTGGTAATGACGAGGCGACCCGTCGTACCTTAGCTATCGCTAAGCTACGGGAG GCGAATGGTGATCGCGGTCAGATAAATAGAGAAGGTTTCTTACATGACAAATCCTTGTCATGGGATCCGGATGTTTT ACAAACCAGCATCCGTAGCCTTATTGGCAACCTCCTCTCTGGCTACCGATCGTCGTTGTTTGGGCAATGCACGTTCT CCAACGGTGCTCCTATGGGGCACAAGTTGCAGGATGCAGCGCCTTACAAGAAGTTCGCTGAACAAGCAACCGTTACC CCCCGCGCTCTGAGAGCGGCTCTATTGGTCCGAGACCAATGTGCGCCGTGGATCAGACACGCGGTCCGCTATAACGA GTCATATGAATTTAGGCTCGTTGTAGGGAACGGAGTGTTTACAGTTCCGAAGAATAATAAAATAGATCGGGCTGCCT GTAAGGAGCCTGATATGAATATGTACCTCCAGAAAGGGGTCGGTGCTTTCATCAGACGCCGGCTCAAATCCGTTGGT ATAGACCTGAATGATCAATCGATCAACCAGCGTCTGGCTCAGCAGGGCAGCGTAGATGGTTCGCTTGCGACGATAGA CTTATCGTCTGCATCCGATTCCATCTCCGATCGCCTGGTGTGGAGTTTTCTCCCACCAGAGCTATATTCATATCTCG ATCGTATCCGCTCACACTACGGAATCGTAGATGGCGAGACGATACGATGGGAACTATTTTCCACAATGGGAAATGGG TTCACATTTGAGCTAGAGTCCATGATATTCTGGGCAATAGTCAAAGCGACCCAAATCCATTTTGGTAACGCCGGAAC CATAGGCATCTACGGGGACGATATTATATGTCCCAGTGAGATTGCACCCCGTGTGCTAGAGGCACTTGCCTACTACG GTTTTAAACCGAATCTTCGTAAAACGTTCGTGTCCGGGCTCTTTCGCGAGAGCTGCGGCGCGCACTTTTACCGTGGT GTCGATGTCAAACCGTTTTACATCAAGAAACCTGTTGACAATCTCTTCGCCCTGATGCTGATATTAAATCGGCTAC GGGGTTGGGGAGTTGTCGGAGGTATGTCAGATCCACGCCTCTATAAGGTGTGGGTACGGCTCTCCTCCCAGGTGCCT TCGATGTTCTTCGGTGGGACGGACCTCGCTGCCGACTACTACGTAGTCAGCCCGCCTACGGCAGTCTCGGTATACAC CAAGACTCCGTACGGGCGGCTGCTCGCGGATACCCGTACCTCGGGTTTCCGTCTTGCTCGTATCGCTCGAGAACGCA AGTTCTTCAGCGAAAAGCACGACAGTGGTCGCTACATAGCGTGGTTCCATACTGGAGGTGAAATCACCGACAGCATG AAGTCCGCCGGCGTGCGCGTTATACGCACTTCGGAGTGGCTAACGCCGGTTCCCACATTCCCTCAGGAGTGTGGGCC AGCGAGCTCTCCTCGGTAGCTGACCGAGGGACCCCCGTAAACGGGGTGGGTGTGCTCGAAAGAGCACGGGTGCGAAA GCGGTCCGGCTCCACCGAAAGGTGGGCGGGCTTCGGCCCAGGGACCTCCCCCTAAAGAGAGGACCCGGGATTCTCCC GATTTGGTAACTAGCTGCTTGGCTAGTTACCACCCA
[0080] (SEQ, IDNO: 2)MS2夕卜壳蛋白质DNA序列，野生型： ATGGCTTCTAACTTTACTCAGTTCGTTCTCGTCGACAATGGCGGAA CTGGCGACGTGACTGTCGCCCCAAGCAACTTCGCTAACGGGGTCGCTG AATGGATCAGCTCTAACTCGCGTTCACAGGCTTACAAAGTAACCTGTA GCGTTCGTCAGAGCTCTGCGCAGAATCGCAAATACACCATCAAAGTCG AGGTGCCTAAAGTGGCAACCCAGACTGTTGGTGGTGTAGAGCTTCCTG TAGCCGCATGGCGTTCCiTACTTAAATATGCfAACTAACCATTCCAATTTTC GCTACGAATTCCGACTGCGAGCTTATTGTTAAGGCAATGCAAGGTCTCC TAAAAGATGGAAACCCGATTCCCTCAGCAATCGCAGCAAACTCCGGCA TCTACTAATAG (SEQ.IDNO: 3)MS2野生型夕卜壳蛋白质，氨基酸序列： MASNFTQFVLVDNGGTGDVTVAPSNFANGVAEWISSNSRSQAYKVT CSVRQSSAQNRKYTIKVEVPKVATQTVGGVELPVAAWRSYLNMELTIPIFA TNSDCELIVKAMQGLLKDGNPIPSAIAANSGIY
[0081] 令人惊讶的是，尽管缺乏包膜，但未经修饰的野生型MS2衣壳对多种类别EC 3. 4 水解酶是抗性的，包括但不限于蛋白酶K和枯草杆菌蛋白酶，使得可由全细胞裂解物制备 可含有货物分子的高度纯化的衣壳组合物。相应地，本公开内容提供了包含病毒衣壳的 VLP，所述病毒衣壳包含野生型MS2衣壳蛋白质、和/或与野生型MS2衣壳蛋白质共享同源 性的衣壳蛋白质，所述病毒衣壳壳体化货物分子。货物分子可包括一种或多种异源核酸、 肽、多肽或蛋白质。随后可使用类别EC3. 4水解酶，在水解步骤后从全细胞裂解物中分离且 纯化这些VLP，以产生高纯度的VLP组合物，例如按重量计至少60%、至少70%、至少80% 或至少85%的VLP。明确考虑具有按VLP重量计至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、 96%、97 %和98 %纯度的组合物。
[0082] 本公开内容包括包含下述的组合物：a)多个病毒样颗粒，其各自包含野生型病毒 衣壳和封入野生型病毒衣壳中的至少一种靶标异源货物分子；和b)对于组合物中存在的 每100克衣壳，以小于40克、小于30克、小于20克、小于15克、小于10克，且优选小于9、 8、7、6、5、4、3,更优选小于2克，且再更优选小于1克的量存在的一种或多种细胞裂解产物， 其中该细胞裂解产物选自蛋白质、多肽、肽及其任何组合。随后，货物分子可从衣壳中容易 地收获。相应地，此类组合物对于其中需要高纯度和/或高生产效率的所有应用均为高度 希望的。
[0083] 如本文描述的水解酶抗性衣壳可用于封入不同类型的货物分子，以形成病毒样颗 粒。货物分子可以是但不限于任何一种或多种寡核苷酸或寡核糖核苷酸（DNA、RNA、LNA、 PNA、siRNA、shRNA、sshRNA、IshRNA或miRNA，或包含任何类型的非天然存在的核酸的任何 寡核苷酸）、任何肽、多肽或蛋白质。其为寡核苷酸或寡核糖核苷酸的货物分子可封入衣壳 中，伴随或不伴随接头的使用。例如可触发衣壳，以在核苷酸货物例如寡核糖核苷酸的存在 下，由衣壳蛋白质自装配。在非限制性例子中，如本文描述的衣壳可封入靶标异源RNA链， 例如含有总共1，800-2, 248个核糖核苷酸的靶标异源RNA链，包括来自肠杆菌噬菌体MS2 的19聚体包装位点（packsite)，此类RNA链由与编码衣壳蛋白质的质粒分离的质粒转录， 如由 Wei, Y.等人（2008) J. Clin. Microbiol. 46:1734-1740 描述的。
[0084] RNA干扰（RNAi)是由短RNA分子例如siRNA分子介导的现象，所述短RNA分子可 用于靶标目的基因的选择性抑制，并且具有在生物技术和医学中的多重应用。例如，短RNA 分子可用于靶向生物中的特定目的基因，以获得希望表型。然而，短RNA分子包括siRNA通 过称为RNA酶的遍在酶容易地降解。衣壳例如本文描述的衣壳保护壳体化RNA不受酶促降 解。然而，如本文描述的衣壳可封入含有一种或多种核酶的RNA链，所述核酶是自切割核酶 (顺式作用），或在某些情况下，能够切割其他RNA中的键（反式作用）。例如可包括一种或 多种核酶，以特异性切割一种或多种RNA序列，以产生特别定制的RNA分子，例如但不限于 siRNA分子。例如，锤头状和丁型肝炎病毒核酶的变体是已知的，并且可用于切割长RNA序 列。本公开内容描述了包含衣壳的新VLP，所述衣壳壳体化附着至如上所述的包装序列的一 种或多种核酶（即对衣壳的内壁具有强亲和力的RNA序列），和用于从附着至核酶的包装序 列切割短RNA序列的核酶。
[0085] 本公开内容因此还包含核酶从用于壳体化其的一种或多种包装序列中分离短或 小RNA序列（例如siRNA、shRNA、sshRNA和miRNA序列）的新用途。应当理解，除非上下文 另有说明，否则术语短RNA包含具有双链茎和单链环或发夹的短单链和短发夹（茎环）RNA 序列。短RNA是具有不超过30个核苷酸、优选不超过25个核苷酸和更优选不超过22个核 苷酸的任何RNA单链；或具有在茎中不超过30个核苷酸碱基对、优选不超过25个核苷酸碱 基对和更优选不超过22个核苷酸碱基对的茎的发夹RNA。
[0086] 在使用对从包装序列中分离此类短RNA序列为高度活性的核酶中的挑战是核酶 可如此快速工作，以便在实现RNA壳体化前，从包装序列中释放短RNA。另外，已发现短RNA 例如siRNA或发夹包装序列的三维结构可干扰核酶的适当功能。这些问题可通过下述克 服：1)使用证实更慢活性速率的核酶突变体，以避免在实现短RNA壳体化前，从包装序列中 释放短RNA，和/或2)增加核酶中与短RNA形成沃森-克里克对的核苷酸数目。另外，反式 作用核酶可有利地用于增加作为短RNA壳体化到VLP内的RNA百分比，如果一种或多种短 RNA序列的侧翼不是完全核酶，而是其为反式作用核酶靶标的更短序列，所述更短的序列也 壳体化到相同VLP内。
[0087] 一种或多种短RNA序列还可壳体化到或野生型或遗传修饰的病毒衣壳内，所述病 毒衣壳已进行修饰，以插入外部肽标签，以将蛋白质或药物分子递送至特定种类的细胞。野 生型衣壳还可遗传修饰，以插入充当某些表面蛋白质细胞受体的配体的外部肽序列，可有 利地用于壳体化旨在诱导特定靶细胞中的RNAi的短RNA序列。此类组合物比目前的短RNA 递送的替代方案简单得多、更便宜和更可靠制造。
[0088] 可制备的有用VLP的非限制性例子包括封入RNA链的衣壳，所述RNA链包含：
[0089] ⑴至少一个包装序列和侧翼为一个单链（非杂交）RNA间隔物的1-100个相同或 不同siRNA，其中每一个单链RNA间隔物具有4-40个核苷酸（SEQ ID N0:30);
[0090] (ii) 一个（1个）核酶和一个单链（非杂交）RNA序列/siRNA,其中每一个单链 RNA序列具有4-40个核苷酸（SEQ ID N0:28;HDV核酶）；
[0091] (iii)两个（2 个）核酶 /siRNA ;
[0092] (iv) -个（1个）T7起始位点、一个（1个）核酶、一个（1个）包装位点和一个（1 个）转录终止位点；或
[0093] (ν) -个⑴Τ7起始位点、一个（1个）包装位点和一个（1个）转录终止位点。
[0094] (vi)四个（4 个）核酶/siRNA(SEQ ID Ν0:29)。
[0095] 在包括一种或多种核酶的VLP中，本公开内容还考虑在核酶已切割RNA后含有 所得的产物的VLP。包括转录终止子的VLP可使用例如如下述中所述的T7转录终止子： Studier FW，Moffatt BA. (1986) J.MolBiol.May5; 189 (1):113-30 ;和 R Sousa，D Patra，EM Lafer (1992) J. Mol. Biol. 224:319-334。例如，下述两种序列是T7RNA聚合酶的合适转录终 止子：
[0096] CTAGCATAACCCCTTGGGGCCTCTAAACGGGTCTTG(SEQ ID NO :4)
[0097] 或
[0098] TAGCATAACCCCTTGGGGCCTCTAAACGGGTCTTGAGGGGTTTTTTG(SEQ ID N0:5)。
[0099] 如本文描述的VLP可替代地可封入至少一种靶标肽、多肽或蛋白质。当靶标异源 货物分子是肽、多肽或蛋白质时，寡核苷酸接头可用于偶联靶标异源货物分子和病毒衣壳。 其为肽、多肽或蛋白质的货物分子优选使用接头在衣壳中包装。包装过程通过由短RNA适 体序列组成的接头促进，所述短RNA适体序列形成在外壳蛋白质和融合至靶标货物分子的 肤标签之间的连接。（参见Fiedler, J.等人，RNA-Directed Packaging of Enzymes within Virus-like Particles, Angew. Chem. Int. Ed. 49 :9648 - 9651 (2010))。寡核苷酸接头可由 DNA、RNA、LNA、PNA等等组成。接头是例如50至100聚体，具有在第一末端处对于衣壳外壳 内部具有结合特异性的例如长约20ng的短序列，和在第二相对末端处对于货物肽、多肽或 蛋白质具有结合特异性的例如长约70nt的另一序列。另外，缓慢核酶可掺入由RNA组成的 接头内。例如，缓慢核酶可掺入包装序列（与外壳蛋白质结合）和适体（与靶标蛋白质的 标签结合）之间。在活化后，核酶使外壳蛋白质与靶标蛋白质分离。作为另外一种选择，如 本文描述的衣壳可封入在N末端由肽标记的至少一种靶标蛋白质，所述肽能够与含适体和 衣壳包装序列的RNA链非共价结合，例如如由Fiedler，J.等人（2010)描述的N末端标签 以及含适体和包装序列的RNA链。
[0100] 货物分子可以是双分子货物分子，并且本文描述的衣壳还可壳体化双分子货物分 子，其可包括或不包括一种或多种核酶。双分子货物分子可包含连接至双功能多核苷酸的 适体。适体可具有使用SELEX特异性选择的序列，以显示出与生物活性小分子的特异性结 合，所述生物活性小分子即具有优选低于1，500Da的低分子量的分子。双功能多核苷酸具 有用于结合低分子量生物活性货物分子的第一适体活性，和用于结合衣壳的包装序列的第 二适体活性两者。连接至生物活性货物分子的双功能多核苷酸形成随后可连接至货物的双 分子货物分子。此类货物分子可用于结合生物活性小分子，并且因此使VLP装载有小分子。 本公开内容因此还包括包含连接至此类合成双分子货物分子的衣壳的VLP。可通过与RNA 适体结合而装载到VLP内的低分子量生物活性剂的例子包括：莠去津（除草剂）、啶虫脒 甲拌磷、丙溴磷、水胺硫磷和氧乐果（杀昆虫剂），如由Sett等人（2012)0pen Journal of Applied Biosensor, 1:第 9-19 页描述的。
[0101] 可通过与RNA适体结合而装载到VLP内的低分子量生物活性剂的例子包括除 草剂例如2,4-0(2,4-0二氯苯氧乙酸）、麦草畏（(3,6-二氯-2-甲氧基苯甲酸）、百草 枯（N，N'_二甲基-4, 4'-联吡啶鎗二氯化物）、氨磺乐灵（4-(二丙基氨基）-3,5-二 硝基苯磺酰胺）、DCMU (3- (3, 4-二氯苯基）-1，1-二甲基脲）、氟乐灵（2, 6-二硝 基-N，N-二丙基-4-(三氟甲基）苯胺）、甲基咪草烟（-甲基-2-[4-甲基-5-氧 代-4-(丙-2-基）-4, 5-二氢-1H-咪唑-2-基]批陡-3-羧酸）、氯氨批陡（Aminopyralid) (4-氨基-3, 6-二氯吡啶-2-羧酸）、二氯吡啶酸（3, 6-二氯-2-吡啶羧酸）、异丙甲草 胺（(RS) -2-氯-N- (2-乙基-6-甲基-苯基）-N- (1-甲氧基丙-2-基）乙酰胺）、二甲戊 灵（3, 4-二甲基-2, 6-二硝基-N-戊-3-基-苯胺）、氨氯吡啶酸（4-氨基-3, 5, 6-三 氯-2-批陡羧酸）、敌稗（N-(3, 4-二氯苯基）丙酰胺）、绿草定（[(3, 5, 6-二氯-2-批陡 基）氧基]乙酸）、和莠去津（2-氯-4-(乙氨基）-6-(异丙基氨基）-s-三嗪），尤其是例 如由 Roberts 等人（1998)Metabolic Pathways of Agrochemicals :Partl :Herbicides and Plant Growth Regulators. Royal Society of Chemistry (Great Britain)(出版） ISBN978-1-84755-138-2列出的。例如，结合莠去津的RNA适体由Sinha等人（2010)Nature Chemical Biology, 6:ρ· 464-470 描述。
[0102] RNA适体还可以用于结合杀昆虫剂例如快螨特（2-(4-叔丁基苯氧基）环己基 丙-2-炔-1-磺酸盐）、毒死蜱（0, 0-二乙基0-3, 5, 6-三氯吡啶-2-基硫代磷酸酯）、氯氰 菊酯、亚胺硫磷（2-二甲氧基硫膦基硫代甲基）异吲哚啉-1，3-二酮）、氯菊酯（3-苯氧基苄 基（1RS)-顺，反-3-(2, 2-二氯乙烯基）_2, 2-二甲基环丙烧羧酸酯）、二嗪磷（0, 〇-二乙基 0- [4-甲基-6-(丙-2-基）嘧啶-2-基]硫代磷酸酯）、甲基对硫磷（(0, 0-二甲基0- (4-硝 基苯基）硫代磷酸酯）、和啶虫脒（N- [ (6-氯-3-吡啶基）甲基]-Ν' -氰基-N-甲基-乙脒）， 和杀真菌剂例如百菌清（2, 4, 5, 6-四氯间苯二甲腈）、克菌丹（(3aR，7aS)-2-[(三氯甲基） 硫烧基]_3a, 4, 7, 7a_四氢-1H-异卩引哚-1，3 (2H)-二酮）、陡醜菌胺（2-氯-N- (4' -氯联 苯-2-基）烟酰胺）、异菌脲（3- (3, 5-二氯苯基）-N-异丙基-2, 4-二氧代咪唑烷-1-甲酰 胺）、啼菌酯（(2E) _2_ (2-{[6-(2-氰基苯氧基）啼陡_4_基]氧基}苯基）_3_甲氧基丙烯 酸甲酯）、唑菌胺酯（2-[1-(4-氯苯基）吡唑-3-基氧基甲基]-N-甲氧基苯氨甲酸甲酯）、 嘧菌环胺（4-环丙基-6-甲基-N-苯基嘧啶-2-胺），尤其是例如由Roberts等人（1999) Metabolic Pathways of Agrochemicals ：Part2 ：Insecticides and Fungicides. Royal Society of Chemistry(GreatBritain)(出版）ISBN978-l-84755-137_5 列出的。例如，已 描述了结合啶虫脒、甲拌磷、丙溴磷、水胺硫磷和氧乐果的适体，如由Sett等人（2012)0pen Journal of Applied Biosensor, 1:第9-19页例不的，使用SELEX构建使用以与RNA适体 相似的方式构建的DNA适体。
[0103] 这些除草剂、杀昆虫剂或杀真菌剂是生物活性小分子，即具有优选低于1，500Da 的低分子量的分子。由于其小尺寸，它们可渗透形成本公开内容的VLP的衣壳，如由mi 等人(2005)Delivery of antisense oligonucleotides to leukemia cells by RNA bacteriophage capsids, Nanomedicine ：Nanotechnology, Biology and Medicine, 1:第 67-76页例示的。在此类VLP已形成后，在纯化前或后，将这些小生物活性分子加入本公开 内容的VLP中，所述VLP壳体化使用SELEX设计的适体，以结合小生物活性分子。例如通 过将其加入VLP溶液中，且例如在室温下温育30分钟至10小时的时间，来完成这些小生 物活性分子的添加。这些小生物活性分子通过经由在颗粒对称轴上的孔扩散而进入VLP， 并且由于其与封入适体的结合而保留在内部。用于将小生物活性分子装载到VLP内的 合适溶剂范围从极性的例如水和水-乙醇掺和物到非极性的例如异辛烷、甲苯、二氯甲烷 或氯仿。使用非极性溶剂用于VLP溶解例如如由Johnson等人（2006)，Solubilization and stabilization of bacteriophage MS2 in organic solvents, Biotechnology and bioengineering，2007. 97 (2):第224-34页描述的完成，其借助于表面活性剂如气溶胶0T。 非极性溶剂用于装载小生物活性分子的用途是优选的，因为其在极性溶剂中的溶解度在大 多数情况下很弱。
[0104] 壳体化siRNA和小生物活性分子两者的VLP在其中在两种生物活性成分之间实 现协同效应的应用中是优选的，例如在其中靶向植物、昆虫或真菌对小生物活性分子是抗 性的情况下。在此类情况下，siRNA设计为靶向对植物、昆虫或真菌赋予小生物活性分子抗 性的生物途径，如由 Sammons 等人，Polynucleotide molecules for gene regulation in plants, US2011/0296556 例示的。
[0105] 作为另外一种选择，双功能多核苷酸可编码至少一种siRNA、shRNA、sshRNA、 IshRNA或miRNA，并且货物分子可以是小（低分子量）蛋白质或肽。相应地，双分子货物分 子可以能够结合低分子生物活性蛋白质或肽。此类双分子货物分子可包含生物活性蛋白质 或肽，其偶联至编码至少一种miRNA的siRNA或shRNA或sshRNA或IshRNA的多核苷酸，并 且具有用于结合生物活性蛋白质或肽货物分子的第一适体活性，和用于结合衣壳的包装序 列的第二适体活性。多核苷酸连接至蛋白质或肽货物分子，并且能够连接至衣壳的包装序 列。
[0106] 如上所述的双功能多核苷酸可任选包括一种或多种核酶序列。包括双分子货物分 子包括如上所述的双功能多核苷酸的VLP可任选包括一种或多种核酶。在至少一种核酶已 与双分子货物分子反应以将货物分子切割成组成性成分部分包括适体后，本公开内容还包 括包含衣壳和双分子货物分子的反应产物的VLP。
[0107] 如本文描述的VLP可通过任何一种或多种可用方法装配，所述方法产生具有装配 的、水解酶抗性的衣壳的VLP，所述衣壳壳体化一种或多种货物分子、和任选的任何接头、包 装序列、一种或多种核酶或标签。例如，衣壳和货物分子可在任何表达系统中共表达。通过 经由可用于将此类载体引入特定细胞内的任何操作用一种或多种表达载体转染，并且稳定 转染细胞以获得表达一种或多种重组序列的细胞，编码一种或多种衣壳蛋白质、一种或多 种货物分子和任选的任何接头、包装序列、一种或多种核酶或标签的重组DNA可容易地引 入宿主细胞内，例如细菌细胞、植物细胞、酵母细胞、真菌细胞和动物细胞（包括昆虫和哺 乳动物）。
[0108] 宿主细胞优选具有真核起源，例如植物、哺乳动物、昆虫、酵母或真菌源，但也可使 用非真核宿主细胞。合适的表达系统包括但不限于用含有VLP元件的编码序列的重组细菌 噬菌体DNA、质粒DNA或粘粒DNA表达载体转化的微生物例如细菌（例如大肠杆菌）。在非 限制性例子中，对于使用MS2衣壳蛋白质的VLP，在大肠杆菌中的表达是合适的表达系统。
[0109] 本公开内容明确考虑这样的植物细胞，其已使用如本文描述的核酸构建体转化， 并且表达衣壳外壳蛋白质、货物分子和任选的任何接头、包装序列、一种或多种核酶或标 签。用于转化细胞包括植物细胞和制备转基因细胞的方法是本领域众所周知的。载体、质 粒、粘粒、YAC(酵母人工染色体）和DNA区段可用于转化细胞，并且如一般公认的将包括启 动子、增强子和/或多接头。具体考虑的转基因细胞包括转基因植物细胞，包括但不限于得 自玉米、大豆、小麦、蔬菜、谷物、豆类、果树等等的细胞，或将获益于如本文描述的VLP引入 的任何植物。还考虑的是得自如本文描述的转化细胞的植物、植物组织，和该植物或植物组 织的种子或后代。
[0110] 装配的VLP的表达可例如通过构建至少一种表达载体来获得，所述表达载体包括 编码VLP的所有元件的序列。有时使用两种载体，包括编码一种或多种货物分子和任选的 任何接头、包装序列、一种或多种核酶或标签的序列的第一种；和包括编码衣壳蛋白质的序 列的第二载体。在用于生成示例性VLP包括siRNA的示例性方法中，两种载体可在宿主细 胞中共表达，用于生成VLP，如实例中进一步详述的。用于构建此类表达载体的方法和工具 是本领域众所周知的，所述表达载体含有编码序列以及转录和翻译控制序列。一旦构建，一 种或多种载体就还使用本领域众所周知的技术转移至宿主细胞，并且细胞随后维持在培养 条件下足以使VLP表达和装配发生的时间，这均使用常规技术。本公开内容因此包含含有 任何此类载体的宿主细胞，和已通过此类载体转化的细胞，以及含有VLP的细胞。
[0111] 当VLP已在宿主细胞中表达且装配时，它们可使用本领域已知用于病毒纯化的任 何方法进行分离且纯化。例如，细胞可使用常规细胞裂解技术和试剂进行裂解，并且对细胞 裂解物实施使用至少一种肽键水解酶类别EC 3. 4的水解，所述水解酶例如但不限于蛋白 酶K或枯草杆菌蛋白酶。在水解后保留在细胞裂解物中的完整衣壳可使用常规蛋白质分离 技术取出且纯化。
[0112] 衣壳、VLP或蛋白质的纯化还可包括本领域一般已知的方法。例如，在衣壳表达和 细胞裂解后，可对所得的裂解物实施一个或多个分离或纯化步骤。此类步骤可包括例如酶 促脂解、DNA水解和蛋白酶解步骤。蛋白酶解步骤可例如使用内切蛋白酶和外切蛋白酶的 掺和物进行。例如，在细胞裂解和大多数细胞组分的水解拆卸后，通过例如萃取到合适的非 极性与水不混溶的溶剂内，或通过由合适溶剂结晶，此类衣壳与其货物分子可与周围基质 分离。例如，水解和/或蛋白酶解步骤将包含在裂解基质中的来自衣壳的污染物转化成小 的水溶性分子。疏水性衣壳随后可萃取到有机相例如1，3_双（三氟甲基）苯内。衣壳、 VLP或蛋白质的纯化可包括例如至少一个液-液萃取步骤、至少一个分级沉淀步骤、至少一 个超滤步骤或至少一个结晶步骤。液-液萃取可包括使用例如不混溶的非水非极性溶剂， 例如但不限于苯、甲苯、己烷、庚烷、辛烷、氯仿、二氯甲烷或四氯化碳。纯化可包括至少一 个结晶步骤。一个或多个水解步骤且尤其是一个或多个蛋白酶解步骤的使用，消除用目前 用于货物分子的分离方法观察到的某些问题，其主要起因于大量和不同程度的结合相互作 用，所述结合相互作用在货物分子和源自它们在其中生产的细胞培养的组分之间发生。本 文描述的衣壳这样抵抗水解步骤，使得在水解后产生的基质包括安全分隔任何货物分子与 周围基质的完整衣壳，由此中断干扰目前纯化方法的麻烦的结合相互作用。
[0113] 在纯化后，衣壳可打开，以获得货物分子，其可以是如本文描述的蛋白质或多肽、 肽或核酸分子。衣壳可使用本领域已知的几种可能操作中的任何一种打开，包括例如在超 过50°C的水溶液中加热；反复冻融；与变性剂例如甲酰胺一起温育；与一种或多种蛋白酶 一起温育；或这些操作中的任一种的组合。
[0114] 对水解酶抗性且可用于根据本公开内容的VLP和方法中的衣壳蛋白质也可以是 野生型MS2衣壳蛋白质的变体，或源自野生型MS2衣壳蛋白质。衣壳蛋白质可包含例如相 对于野生型MS2衣壳氨基酸序列的至少一个氨基酸残基置换、缺失或插入。此类衣壳蛋白 质可以是天然存在的变体，或可以通过使用常规技术遗传修饰MS2衣壳蛋白质来获得，条 件是变体或经修饰的衣壳蛋白质形成无包膜的衣壳，其如本文描述的对由肽键水解酶类别 EC3. 4催化的水解是抗性的。
[0115] 通过根据物理化学和生物化学中的常规和众所周知的原理在氨基酸序列中作出 所选修饰，可改造可装配成如本文描述的对水解抗性的衣壳的遗传修饰的MS2衣壳蛋白 质，以产生如本文和本文下文实例中描述的保持对水解抗性的蛋白质。
[0116] 例如功能蛋白质的形状或总体折叠由蛋白质的氨基酸序列决定，并且折叠限定 蛋白质的功能，这是常识。总体折叠由一个或多个折叠结构域组成。当超过一个折叠结 构域存在于总体折叠中时，结构域一般沿结构域界面松散或紧密地结合在一起。结构域 折叠可分解成紧密包装的、定义明确的二级结构元件的折叠核心，所述二级结构元件主要 负责结构域的形状以及一般由转角和环组成的更易移动的外层，所述转角和环的构象受 与折叠核心的相互作用以及与附近结构域及其他分子包括溶剂及其他蛋白质的相互作用 影响。蛋白质折叠的广泛公开域数据库，公众域中的解决的蛋白质结构的蛋白质结构分 类（Structural Classification of Proteins) (SC0P)数据库（Alexey G Murzin，Curr Opin Struct Biol (1996)6, 386-394)在线维持在 http://scop, berkeley.edu 处，并且随 着新的解决结构进入公众域（蛋白质数据库（Protein Data Bank) (F.C.Bernstein，T. F. Koetzle, G. J. Williams, E. E. Meyerjr. , M. D. Brice, J. R. Rodgers, 0. Kennard, T. Shimanouchi，M. Tasumi，"The Protein Data Bank ：A Computer-based Archival File For Macromolecular Structures, ^J. of. Mol. Biol. , 112(1977) ：535), http://www. rcsb.org)数据库而定期扩展。进化上遥远的、仍具有相同形状和非常相似的功能的家 族成员通常保留在拓扑学和/或功能上等价的位置处少至30%的相同残基。在一些家 族中，遥远成员的序列具有就彼此而言未改变的少至20 %的其残基，例如光滑病毒科 和alloleviviridae衣壳蛋白质。此外，蛋白质的折叠和功能显著地对经由定向或随机 突变改变是耐受的，即使是核心残基（PeterO. 01 il1S:j:，S. Christopher Bauer，Sarah Braford-Goldberg，Kris Sterbenz,Joseph 0. Polazzi,Maire H. Caparon, Barbara K.Klein,AlanM. Easton, Kumnan Paik，Jon A.Klover,BarrettR. Thiele 和 John P.McKearn (1995)J Biol Chem 270,23754-23760 ;Yiqing Feng，Barbara K.Klein 和 Charles A. Me Wherter(1996)，J Mol Biol 259, 524-541 ;Dale Rennel1，Suzanne E.Bouvier，Larry W. Hardy 和 Anthony R.Poteetel (1991) J Mol Biol222, 67-87)，一个或 多个残基的插入/缺失（Yiqing Feng，Barbara Κ· Klein和Charles A. Me Wherter(1996)，J Mol Biol 259,524-541)，序列的排列（Multi-functional chimeric hematopoietic fusion proteins between sequence rearranged c-mpl receptor agonists and other hematopoietic factors，US6066318)，经由N或C末端或两者的串联（与其自身的拷贝 或其他月太或蛋白质）（Multi-functional chimeric hematopoietic fusion proteins between sequence rearranged g-csf receptor agonists and other hematopoietic factors，US20040171115 ;Plevka，P.，Tars，K.，Liljas，L· (2008)ProteinSci. 17 :173)或 共价修饰，例如糖基化、聚乙二醇化、SUMO化或者肽基或非肽基亲和标签的添加，只要对维 持折叠和/或功能关键的残基是多余的。
[0117] 根据本公开内容以及如方法和过程的任一种中使用的VLP因此包括包含衣壳蛋 白质的VLP，所述衣壳蛋白质与野生型肠杆菌噬菌体MS2衣壳蛋白质（SEQ ID N0:3)的氨 基酸序列具有至少15%、16%、21%、40%、41%、52%、53%、56%、59%或至少86%序列同 一性，并且对由肽键水解酶类别EC 3. 4催化的水解是抗性的。此类VLP包括例如包含衣壳 蛋白质的VLP，所述衣壳蛋白质与如上所述的SEQ ID N0:3)具有至少52%序列同一性。还 包括的是包含衣壳蛋白质的VLP，所述衣壳蛋白质与SEQ ID N0:3具有至少53%序列同一 性，其可基本上如上所述获得，但玉忽略FR衣壳序列，代表与野生型肠杆菌噬菌体MS2衣 壳蛋白质（SEQ ID N0:3)的53%序列同一性。还包括的是包含衣壳蛋白质的VLP，所述衣 壳蛋白质与SEQ ID N0:3具有至少56%序列同一性，这被认为是当结构鉴定为lAQ3(van den Worm, S. Η. , Stonehouse, N. J. , Valegard, K. , Murray, J. B. , Walton, C. , Fridborg, K., Stockley, P. G. ,Liljas, L· (1998)Nucleic Acids Res. 26 ： 1345-1351) UGAV(Tars, K. , Bu ndule, M.，Fridborg, K.，Liljas, L. (1997) J. Mol. Biol. 271 :759-773)、IFRS (Liljas, L.，F ridborg，K.，Valegard, K.，Bundule，M.，Pumpens，P. (1994) J. Mol. Biol. 244 :279-290)和 2VTU(Plevka，P.，Tars, K.，Liljas, L. (2008)ProteinSci. 17 :1731)(上文描述的蛋白质数 据库标识符）时，当所有三种序列一起考虑时，仅56%的序列位置具有就主链重叠而言的 相同序列和拓扑学等价的位置。还包括的是包含衣壳蛋白质的VLP，所述衣壳蛋白质与SEQ ID N0:3具有至少59 %序列同一性，这被认为是与GA病毒衣壳蛋白质的序列相比较，MS2病 毒衣壳蛋白质的序列是59%。还包括的是包含衣壳蛋白质的VLP，所述衣壳蛋白质与SEQ ID N0:3具有至少86%序列同一性，这被认为是与FR衣壳蛋白质的序列相比较，MS2病毒 衣壳蛋白质的序列是86%。根据本公开内容的VLP因此包括包含衣壳蛋白质的VLP，基于 有效的结构锚定比对，所述衣壳蛋白质与野生型肠杆菌噬菌体MS2衣壳（SEQ ID N0:3)的 氨基酸序列具有至少15 %、16 %或21 %序列同一性，并且对由肽键水解酶类别EC 3. 4催化 的水解是抗性的。
[0118] VLP因此可包含如本文描述的MS2衣壳蛋白质变体中的任一种。与本文描述的衣 壳蛋白质一致的遗传修饰的衣壳蛋白质可例如通过下述来产生：构建编码至少一种衣壳蛋 白质的至少一种DNA质粒，相对于野生型MS2衣壳蛋白质的氨基酸序列，所述衣壳蛋白质具 有至少一个氨基酸置换、缺失或插入，制备每种质粒的多个拷贝，用质粒转化细胞系；将细 胞维持在足以使转化的细胞表达且装配壳体化核酸的衣壳的时间和条件下；裂解细胞以形 成细胞裂解物；对细胞裂解物实施使用至少一种肽键水解酶，类别EC 3. 4的水解；且取出 在水解后保留在细胞裂解物中的完整衣壳，以获得相对于野生型衣壳蛋白质对至少一种水 解酶具有增加的抗性的衣壳。在所得的完整衣壳纯化后，可根据本领域已知的方法测定每 种衣壳蛋白质的氨基酸序列。
[0119] 本文描述的专门衣壳可用于研究和开发以及工业制造设施中，以提供改善的得 率，因为在两种背景下使用的纯化方法具有相同的基质组成。具有此类相同组成主要取决 于在研究和开发以及制造方法中使用相同细胞系。然而，在研究和开发以及制造阶段中使 用的蛋白酶解步骤后，由于使用不同细胞系在基质组成中的差异极大减少。该特点允许在 两个阶段中使用不同细胞系，伴随最低限度的制造得率惩罚。
[0120] 实例
[0121] 包括下述非限制性实例以示出本公开内容的多个方面。本领域技术人员应当理 解：在下述实例中公开的技术代表由 申请人:发现在本发明的实践中良好起作用的技术，并 且因此可视为构成用于其实践的优选方式。然而，依照本公开内容，本领域技术人员应当理 解可在所述具体实例中作出许多改变，同时仍获得相同或相似结果，而不背离本发明的范 围。因此，实例仅是示例性的，并且不应解释为以任何方式限制本发明。在允许且描述本发 明必需的程度，引用的所有参考文献均以引用的方式并入本文。
[0122] 实例A :MS2细菌噬菌体的繁殖
[0123] MS2细菌噬菌体（ATCC编号15597-B1，来自美国典型培养物中心， Rockville, MD)及其大肠杆菌宿主（ATCC编号15669)得自ATCC，并且使用由Strauss和 Sinsheimer (1963) J. Mol. Biol7:43-54J. Mol. Biol7:43-54 描述的操作进行繁殖。结果在图 1中标绘。在反应过程中跟踪在600nm下的光密度（0D)和pH。ODi代表紧在用宿主接种后 的0D。感染在2. 3小时完成。Ln (0D/0Di)在左轴上标绘（实心菱形），并且pH在右轴上标 绘（空心正方形）。该实验在用宿主接种后5. 3小时结束。获得的裂解物以2, 000g离心， 并且通过0. 2 μ m膜过滤，以消除剩余细菌和细菌碎片。
[0124] 实例B :使用蛋白酶K和超滤的MS2细菌噬菌体纯化
[0125] MS2细菌噬菌体的纯化如下进行。在纯化过程中获得样品，并且对样品运行SDS PAGE分析。获得的结果显示于图2中。
[0126] 在实例A结束时获得的8mL裂解物（图2,泳道1中的样品）通过300kDa膜 (Vivaspin2,来自 Sartorius Stedim, Bohemia, NY)过滤，并且滤液通过 100kDa 膜过滤，由 其获得lmL渗余物（图2,泳道2中的样品）。将该渗余物分成两个等份。向一个半份（对 照）中，加入以pH = 7.5的206 μ L20mM CaCl2水溶液。向第二个半份（蛋白酶）中，加入 以口!1 = 7.5的溶解于 206 4 1^2〇111]\?^(：12水溶液中的0.1511^蛋白酶1((5丨81^41(11^(*，5七· L〇uis，M0)。两个管均在37°C下温育，并且在1小时后，将它们置于冰水浴中。随后获得样 品并分析：在图2,泳道3中的对照样品，和在图2,泳道5中的蛋白酶样品。随后用去离子 (DI)水将每种产物稀释至2mL，并且通过100kDa膜过滤。用DI水将每种渗余物（150 μ L) 稀释至2mL，并且再次通过相同膜过滤。稀释和超滤对每种产物再重复一次。随后获得每 种渗余物的样品并分析：在图2,泳道4中的对照样品，和在图2,泳道6中的蛋白酶样品。 在14kDa处的条带对应于MS2细菌噬菌体的外壳蛋白质。在30kDa处的条带对应于蛋白酶 K。来自对照实验的产物获得高度不纯的噬菌体。来自蛋白酶实验的产物获得含有具有高 于99%纯度的噬菌体的产物。
[0127] 实例C:MS2细菌噬菌体的降解
[0128] MS2细菌噬菌体的处理如下进行。在处理过程中获得样品，并且对样品运行SDS PAGE分析。获得的结果显不于图3中。如由Strauss & Sinsheimer (1963) J. Mol. Biol 7:43-54描述的，通过使用硫酸铵的沉淀和使用三氯氟甲烷（氟利昂11)的萃取，部分纯化 在实例A结束时获得的4mL裂解物。获得在用氟利昂11萃取后的水溶液样品并分析（图 3,泳道1中的样品）。向部分纯化的噬菌体溶液（130μ L)中，加入370μ L20mM CaCl2水溶 液。使混合物在37°C下温育，并且在1小时后，将其置于冰水浴中。随后获得样品并分析： 在图3,泳道2中的样品。用去离子（DI)水将温育产物稀释至2mL，并且通过100kDa膜过 滤。用DI水将渗余物（150 μ L)稀释至2mL，并且再次通过相同膜过滤。渗余物的稀释和超 滤再重复一次。随后获得渗余物的样品并分析：在图3,泳道3中的样品。仅观察到在低于 lOkDa处的弱条带，指示噬菌体的完全降解。
[0129] 实例D :使用超滤的MS2细菌噬菌体纯化。
[0130] MS2细菌噬菌体的纯化如下进行。在纯化过程中获得样品，并且对样品运行 SDS PAGE分析。获得的结果显示于图3中。如由Strauss & Sinsheimer(1963)J.Mol. Bi〇17:43-54描述的，通过使用硫酸铵的沉淀和使用三氯氟甲烷（氟利昂11)的萃取，部分 纯化在实例A结束时获得的4mL裂解物。用去离子水将含有部分纯化的噬菌体的水溶液稀 释至2mL，通过300kDa膜过滤，并且滤液通过lOOkDa膜过滤，由其获得150 μ L渗余物。随 后用去离子（DI)水将渗余物稀释至2mL，并且通过相同lOOkDa膜过滤。渗余物（150μυ 的稀释和超滤再重复一次。获得渗余物样品并分析：图3,泳道4中的样品。将370 μ L20mM CaCl2水溶液加入渗余物（130yL)中。使混合物在37°C下温育，并且在1小时后，将其置于 冰水浴中。随后获得样品并分析：在图3,泳道5中的样品。随后用去离子（DI)水将产物 稀释至2mL，并且通过100kDa膜过滤。用DI水将渗余物（150 μ L)稀释至2mL，并且再次通 过相同膜过滤。渗余物的稀释和超滤再重复一次。随后获得渗余物的样品并分析：在图3， 泳道6中的样品。由具有小于100kDa分子量的蛋白质渗透其的膜保留的14kDa的MS2外 壳蛋白质是明确可见的，指不完整MS2衣壳的存在。获得的广物含有具有1?于99 %纯度的 噬菌体。
[0131] 实例E :使用蛋白酶K和超滤的MS2细菌噬菌体纯化
[0132] MS2细菌噬菌体的纯化如下进行。在纯化过程中获得样品，并且对样品运行SDS PAGE分析。获得的结果显示于图4中。
[0133] 如由 Strauss & Sinsheimer (1963) J. Mol. Biol7:43-54 描述的，通过使用硫酸铵 的沉淀和使用三氯氟甲烷（氟利昂11)的萃取，部分纯化在实例A结束时获得的4mL裂解 物。用去离子水将含有部分纯化的噬菌体的水溶液稀释至2mL，通过100kDa膜过滤，由其获 得150 μ L渗余物。随后用去离子（DI)水将渗余物稀释至2mL，并且通过相同100kDa膜过 滤。渗余物（150 μ L)的稀释和超滤再重复一次。获得渗余物样品并分析：图4,泳道1中 的样品。将溶解于370μ?20πιΜΜη2水溶液中的0. 15mg蛋白酶Κ加入渗余物（130μυ中。 使混合物在37°C下温育，并且在1小时后，将其置于冰水浴中。随后获得样品并分析：在图 4,泳道2中的样品。随后用去离子（DI)水将产物稀释至2mL，并且通过100kDa膜过滤。用 DI水将渗余物（150 μ L)稀释至2mL，并且再次通过相同膜过滤。渗余物的稀释和超滤再重 复一次。随后获得渗余物的样品并分析：在图4,泳道3中的样品。获得的产物含有具有高 于99 %纯度的噬菌体。
[0134] 实例F :使用蛋白酶K，在酸性条件下沉淀，在碱性和酸性条件下使用乙醇沉淀和 超滤的MS2细菌噬菌体纯化
[0135] MS2细菌噬菌体的纯化如下进行。在纯化过程中获得样品，并且对样品运行 SDS PAGE分析。获得的结果显示于图5中。如由Strauss & Sinsheimer(1963)J.Mol. Bi〇17:43-54描述的，通过使用硫酸铵的沉淀和使用三氯氟甲烷（氟利昂11)的萃取， 部分纯化在实例A结束时获得的50mL裂解物。获得在用氟利昂11萃取后的水溶液样 品并分析（图5,泳道1中的样品）。向部分纯化的噬菌体溶液（1.2mL)中，加入溶解于 1. 24mL20mMCaCl2水溶液中的0. 9mg蛋白酶K。使混合物在37°C下温育，并且在1小时后， 加入60 μ L0.2M苯甲磺酰氟（PMSF)的乙醇溶液，以灭活蛋白酶K。随后将混合物置于冰水 浴中。获得样品并分析：在图5,泳道2中的样品。伴随剧烈搅动，将0.68mL0.1%磷酸水溶 液缓慢加入冰/水浴中，以使液体的pH达到4。使液体在0°C下保持30分钟，并且在4°C 下以16, 000g离心30分钟。允许上清液达到室温，并且加入130 μ L1 % NaOH，以使液体的 pH达到8。伴随剧烈搅动，缓慢加入0. 81mL在室温下的乙醇，以使液体中的乙醇浓度达到 20%。使液体在室温下保持30分钟，并且在室温下以16, 000g离心30分钟。将上清液置 于冰/水浴中15分钟，并且伴随剧烈搅动，缓慢加入1. 3mL在0°C下的1 %乙酸，以使液体 的pH达到4。伴随剧烈搅动，缓慢加入1. 5mL在0°C下的乙醇，以使液体中的乙醇浓度达到 34%。使液体在0°C下保持30分钟，并且在4°C下以16, 000g离心30分钟。将团块重悬浮 于200 μ L DI水中，并且获得20 μ L样品并分析：图5,泳道3。用DI水将剩余物（180 μ L) 稀释至2mL，并且通过100kDa膜过滤。用DI水将渗余物（150 μ L)稀释至2mL，并且再次 通过相同膜过滤。渗余物的稀释和超滤再重复一次。随后获得渗余物的样品并通过SDS PAGE分析：在图5,泳道4中的样品。由具有小于100kDa分子量的蛋白质渗透其的膜保留的 14kDa的MS2外壳蛋白质是明确可见的，与完整MS2衣壳的存在一致。图6中显示了关于相 同渗余物的 UV 光谱，这与由 G. F. Rohrmann 和 R. G. Krueger, (1970) J. Virol.，6 (3) : 26 对于 纯MS2噬菌体公开的结果一致。使用以pH7. 4的Tris缓冲盐水和150mMNaCl，对相同渗余 物运行Superdex 200 (GE Healthcare, Piscataway，NJ)尺寸排阻色谱法。它显示仅在柱的 空体积处的280nm吸光度。对于600kD至2kD的蛋白质，在洗脱体积中不存在吸光度。该 测试与完整噬菌体颗粒一致。使用 QIAamp Viral RNA Mini Kit (Qiagen, Valencia, CA)和 无 DNA试剂盒（Life Technologies, Grand Island, NY),从相同渗余物的另一份样品中分离 RNA,并且使用 High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit (Life Technologies)逆 转录。随后在PCR实验中查询MS2基因组的三个不同区段的存在或不存在。使用下述引物 对，每种引物由其分别在正向（F)和反向（R)在MS2基因组中的第一个和最后一个碱基的 位置而命名：F1001_1021-R2180_2201、F1201_1223-R1979_2001、F1401_1426-R1680_1705。 Platinum Taq DNA Polymerase High Fidelity(Life Technologies)用于扩增。如图 9 中所示（1.2kbp对于泳道1中的引物F1201_1223-R1979_2001，800bp对于泳道2中的引 物 F1201_1223-R1979_2001，和 304bp 对于泳道 3 中的引物 F1401_1426-R1680_1705)，在用 溴化乙啶染色的1. 5%琼脂糖凝胶上进行色谱的PCR产物与完整MS2细菌噬菌体基因组一 致。感染性测试也如下对相同渗余物运行。在细菌培养物达到0W600nm) =0.22的点时， 5 μ L渗余物用于感染如实例A中所述的lmL细菌培养物。如图7中所示，0D(600nm)在感 染后1小时是〇. 621，并且在另外2小时后降至0. 21，与此同时，对照样品在感染后1小时 获得0. 82的OD ^00nm)，并且在另外2小时后获得1. 2的OD ^00nm)。该测试显示在渗余 物中高感染性的噬菌体，并且因此证实用于分离其的纯化方法不损害其完整性。总之，获得 的产物含有具有高于99%纯度的MS2细菌噬菌体。
[0136] 实例G :使用不同外源性蛋白酶和超滤的MS2细菌噬菌体纯化
[0137] 基本上如实例E中所述尝试使用不同外源性蛋白酶的MS2细菌噬菌体纯化，除 了使用与蛋白酶K不同的蛋白酶以外。在通过来自地衣芽孢杆菌的蛋白酶（P5380, Sigma Aldrich)促进的蛋白酶解后，成功纯化MS2细菌噬菌体。然而，在pH6下使用来自猪胃粘膜 的胃蛋白酶（P6887, Sigma Aldrich)的蛋白酶解反应发现显著降解MS2细菌噬菌体。另一 方面，在pH6下使用来自木瓜乳的木瓜蛋白酶（P3125, Sigma Aldrich)的蛋白酶解反应未 广泛降解MS2细菌噬菌体。
[0138] 实例Η :壳体化RNA的MS2衣壳的生产，所述RNA编码其附着至其特异性19聚体 RNA发夹的外壳蛋白质
[0139] 如下进行MS2衣壳的生产。在表达过程期间获得样品，并且对样品运行SDS PAGE 分析，以监控衣壳生产。获得的结果显示于图8中。将编码MS2的外壳蛋白质及其特异性 RNA 19聚体PAC位点的下述DNA序列克隆到pDEST14_A252质粒（LifeTechnologies)内：
[0140] ACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTAAGAAGGAGATATACATATGGCTTCTAACTTTACTCAGTTCGTT CTCGTCGACAATGGCGGAACTGGCGACGTGACTGTCGCCCCAAGCAACTTCGCTAACGGGGTCGCTGAATGGATCAG CTCTAACTCGCGTTCACAGGCTTACAAAGTAACCTGTAGCGTTCGTCAGAGCTCTGCGCAGAATCGCAAATACACCA TCAAAGTCGAGGTGCCTAAAGTGGCAACCCAGACTGTTGGTGGTGTAGAGCTTCCTGTAGCCGCATGGCGTTCGTAC TTAAATATGGAACTAACCATTCCAATTTTCGCTACGAATTCCGACTGCGAGCTTATTGTTAAGGCAATGCAAGGTCT CCTAAAAGATGGAAACCCGATTCCCTCAGCAATCGCAGCAAACTCCGGCATCTACTAATAGACGCCGGCCATTCAAA CATGAGGATTACCCATGTACCCAGCT(SEQ ID NO:6)
[0141] 使用此类质粒转化One Shot BL21 (DE3)化学感受态大肠杆菌（Life Technologies)细胞。含有该质粒的BL21(DE3)在750mL含有氨苄青霉素的LB培养基中在 37°C下生长至0D(600nm)等于0.8。随后获得诱导前样品并分析：在图8,泳道1中的样品。 随后加入异丙基β-D-l-硫代半乳批喃糖苷（Sigma-Aldrich)至ImM的终浓度。诱导后四 小时，通过在3, 000g和4°C下离心40分钟收获细胞。随后获得样品并分析：在图8,泳道2 中的样品。
[0142] 实例I :壳体化RNA的MS2衣壳的纯化和表征，所述RNA编码其附着至其特异性19 聚体RNA发夹的外壳蛋白质
[0143] MS2衣壳的纯化如下进行。在纯化过程中获得样品，并且对样品运行SDS PAGE分 析。获得的结果显示于图8中。将等价于115mL培养物的来自实例Η的团块级分重悬浮于含 有10mM MgC12的20mM Tris-HCl，pH7.5中，并且超声处理以裂解细胞。通过以16,000g离 心去除细胞碎片。如由Strauss & Sinsheimer (1963) J. Mol. Biol7:43_54描述的，通过使用 硫酸铵的沉淀和使用三氯氟甲烷（氟利昂11)的萃取，部分纯化获得的细胞裂解物。向部分 纯化的MS2衣壳溶液（1. 05mL)中，加入溶解于1. 05mL20mM CaC12水溶液中的0. 3mg蛋白酶 K。使混合物在37°C下温育，并且在2. 5小时后，将其置于冰水浴中。随后获得样品并分析： 在图8,泳道3中的样品。十五分钟后，伴随剧烈搅动，将0. 14mLl %磷酸水溶液缓慢加入冰 /水浴中，以使液体的pH达到4. 1。使液体在0°C下保持30分钟，并且在4°C下以16, 000g 离心20分钟。向保持在0°C下的上清液中，加入100 μ L1 % NaOH，以使液体的pH达到7. 9。 随后伴随剧烈搅动，缓慢加入0. 5mL在0°C下的乙醇，以使液体中的乙醇浓度达到20%。使 液体在〇°C下保持30分钟，并且在4°C下以16, 000g离心20分钟。在加入1 %乙酸将溶液 的pH调整至7后，通过Vivaspin2 (Sartorius) 300kDa膜过滤上清液，并且通过100kDa膜 过滤滤液，由其获得150 μ L渗余物。用磷酸盐缓冲盐水将渗余物稀释至2mL，并且通过相同 100kDa膜过滤。渗余物（150 μ L)的稀释和超滤再重复四次。随后获得渗余物的样品并通 过SDS PAGE分析：在图8,泳道4中的样品。由具有小于100kDa分子量的蛋白质渗透其的 膜保留的14kDa的MS2外壳蛋白质是明确可见的，与完整MS2衣壳的存在一致。使用QIAamp Viral RNA Mini Kit (Qiagen, Valencia, CA)和无 DNA 试剂盒（Life Technologies, Grand Island, NY)，从相同渗余物的另一份样品中分离RNA，并且使用High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit (Life Technologies)逆转录。随后在 PCR 实验中查询 MS2 衣 壳区段的存在或不存在。使用下述引物对，每种引物由其分别在正向（F)和反向（R)在MS2 基因组中的第一个和最后一个碱基的位置而命名：F1401_1426-R1680_1705。Platinum Taq DNA Polymerase High Fidelity (Life Technologies)用于扩增。如图 10 中所不（泳道 1 中的304bp ;最左边的泳道对应于来自Life Technologies的lkb plus梯），在用溴化乙陡 染色的2%琼脂糖凝胶上进行色谱的PCR产物与完整MS2外壳基因一致。总之，获得的产物 含有具有高于99 %纯度的MS2衣壳。
[0144] 实例J :使用乙醇的简单沉淀用于纯化MS2病毒样颗粒（VLP)
[0145] MS2 VLP的纯化如下进行。在纯化过程中获得样品，并且对样品运行SDS PAGE分 析。获得的结果显示于图11中。将得自与实例Η相同的实验的六分之一团块重悬浮于含 有10mM MgCl2的20mM Tris-HCl，pH7. 5中，并且超声处理以裂解细胞。通过以16,000g离 心去除细胞碎片。如由Strauss & Sinsheimer (1963) J. Mol. Biol7:43_54描述的，通过使用 硫酸铵的沉淀和使用三氯氟甲烷（氟利昂11)的萃取，部分纯化获得的细胞裂解物。获得 样品并分析：在图11，泳道1中的样品。发现在约14kDa处的强条带，与MS2噬菌体的外壳 蛋白质一致。大多数具有更高分子量的其他条带-杂质代表约27%的样品质量。向部分 纯化的MS2 VLP溶液（1.35mL)中，加入1.36mL20mM CaC12水溶液，并置于冰水浴中。十五 分钟后，加入50μ L10%乙酸水溶液，以使液体的pH达到4. 1。随后，在相同温度下且伴随 剧烈搅动，缓慢加入1. 44mL乙醇。使液体在0°C下保持30分钟，并且在4°C下以16, 000g 离心20分钟。将团块悬浮于调整至ρΗ7· 5的由20mM Tris-HCl和10mM MgCl2组成的2mL 水缓冲液中。获得样品并通过SDS PAGE分析：在图11，泳道2中的样品。该样品中的杂质 代表约24%的样品重量。通过Vivaspin 2(Sartorius)100kDa膜过滤稀释样品，由其获得 200 μ L渗余物。随后用相同缓冲液将渗余物稀释至2mL，并且通过相同100kDa膜过滤。渗 余物（200 μ L)的稀释和超滤再重复四次。随后获得渗余物的样品并通过SDS PAGE分析： 在图11，泳道3中的样品。该样品中的杂质代表约9.7%的样品重量。总之，获得的产物含 有具有高于99%纯度的MS2 VLP。
[0146] 实例K :使用蛋白酶K(PK)和使用乙醇的简单沉淀用于纯化MS2VLP。
[0147] MS2 VLP的纯化如下进行。在纯化过程中获得样品，并且对样品运行SDS PAGE分 析。获得的结果显示于图12中。将得自与实例Η相同的实验的六分之一团块重悬浮于含 有10mM MgCl2的20mM Tris-HCl，pH7. 5中，并且超声处理以裂解细胞。通过以16,000g离 心去除细胞碎片。如由Strauss & Sinsheimer (1963) J. Mol. Biol7:43_54描述的，通过使 用硫酸铵的沉淀和使用三氯氟甲烷（氟利昂11)的萃取，部分纯化获得的细胞裂解物。获 得样品并分析：在图12,泳道1中的样品。发现在约14kDa处的强条带，与MS2噬菌体的外 壳蛋白质一致。大多数具有更高分子量的其他条带-杂质代表约26%的样品质量。向部 分纯化的MS2 VLP溶液（L 35mL)中，加入溶解于L 36mL20mM CaC12水溶液中的0· 6mg蛋 白酶K。使混合物在37°C下温育，并且在2. 5小时后，置于冰水浴中。获得样品并通过SDS PAGE分析：在图12,泳道2中的样品。该样品中的杂质代表约14%的样品重量。十五分钟 后，在冰/水浴中加入约50μ?10%乙酸水溶液，以使液体的pH达到4. 1。随后，在相同温 度下且伴随剧烈搅动，缓慢加入1. 54mL乙醇。使液体在0°C下保持30分钟，并且在4°C下 以16, OOOg离心20分钟。将团块悬浮于调整至ρΗ7· 5的由20mM Tris-HCl和lOmM MgCl2 组成的2mL水缓冲液中。获得样品并通过SDS PAGE分析：在图12,泳道3中的样品。该样 品中的杂质代表约10%的样品重量。通过^；^38口；[112(531'1：01'；[118)1001^^膜过滤稀释的样 品，由其获得200 μ L渗余物。随后用相同缓冲液将渗余物稀释至2mL，并且通过相同lOOkDa 膜过滤。渗余物（200 μ L)的稀释和超滤再重复四次。随后获得渗余物的样品并通过SDS PAGE分析：在图12,泳道4中的样品。该样品中的杂质代表约5.1%的样品重量。总之，获 得的产物含有具有约95%纯度的1^2乂1^。
[0148] 实例L :使用组成性水解酶（CH)、用乙醇分级沉淀和超滤用于纯化MS2VLP。
[0149] MS2 VLP的纯化如下进行。在纯化过程中获得样品，并且对样品运行SDS PAGE分 析。获得的结果显示于图13中。将得自与实例Η相同的实验的六分之一团块重悬浮于含 有10禮1%(：1 2的2011111'1^-!1(：1，？!17.5中，并且超声处理以裂解细胞。通过以16,00(^离 心去除细胞碎片。如由Strauss & Sinsheimer(1963)J.Mol.Biol7:43_54描述的，通过使 用硫酸铵的沉淀和使用三氯氟甲烷（氟利昂11)的萃取，部分纯化获得的细胞裂解物。向 部分纯化的MS2 VLP溶液（1.35mL)中，加入1.36mL20mM CaClyK溶液。使混合物在37°C 下在2. 5小时过程中（以允许组成性水解酶作用）温育，其后置于冰水浴中。获得样品并 通过SDS PAGE分析：在图13,泳道1中的样品。该样品中的杂质代表约12%的样品重量。 十五分钟后，在冰/水浴中加入约120 μ L1 %氢氧化钠水溶液，以使液体的pH达到7. 86。随 后，在相同温度下且伴随剧烈搅动，缓慢加入0. 81mL乙醇。使液体在0°C下保持30分钟， 并且在4°C下以16, 000g离心20分钟。伴随在冰/水浴中的剧烈搅动，向上清液中缓慢加 入约100μ L10%乙酸水溶液，以使液体的pH达到4. 01。随后，在相同温度下且伴随剧烈搅 动，缓慢加入1. 3mL乙醇。使液体在0°C下保持30分钟，并且在4°C下以16, 000g离心20 分钟。将团块悬浮于调整至PH7. 5的由20mMTris-HCl和10mMMgCl2组成的2mL水缓冲液 中。通过Vivaspin2(Sartorius)100kDa膜过滤稀释的样品，由其获得200yL渗余物。随 后用相同缓冲液将渗余物稀释至2mL，并且通过相同100kDa膜过滤。渗余物（200yL)的稀 释和超滤再重复四次。随后获得渗余物的样品并通过SDS PAGE分析：在图13,泳道3中的 样品。该样品中的杂质代表约4. 7%的样品重量。总之，获得的产物含有具有高于约95% 纯度的MS2 VLP。
[0150] 实例Μ :使用蛋白酶K(PK)、用乙醇分级沉淀和超滤用于纯化MS2VLP。
[0151] MS2 VLP的纯化如下进行。在纯化过程中获得样品，并且对样品运行SDS PAGE分 析。获得的结果显示于图13中。将得自与实例Η相同的实验的六分之一团块重悬浮于含有 10禮1%(：1 2的20111]\11^8-!1(：1，？!17.5中，并且超声处理以裂解细胞。通过以16,00(^离心去 除细胞碎片。如由Strauss & Sinsheimer (1963) J. Mol. Biol7:43_54描述的，通过使用硫酸 铵的沉淀和使用三氯氟甲烷（氟利昂11)的萃取，部分纯化获得的细胞裂解物。向部分纯化 的MS2 VLP溶液（L 35mL)中，加入溶解于L 36mL20mM CaCl2水溶液中的0· 3mg蛋白酶K。 使混合物在37°C下在2. 5小时过程中温育，其后置于冰水浴中。获得样品并通过SDS PAGE 分析：在图13,泳道2中的样品。该样品中的杂质代表约8.1%的样品重量。十五分钟后， 在冰/水浴中加入约120μ L1%氢氧化钠水溶液，以使液体的pH达到7. 86。随后，在相同温 度下且伴随剧烈搅动，缓慢加入0. 81mL乙醇。使液体在0°C下保持30分钟，并且在4°C下 以16, 000g离心20分钟。在冰/水浴中向上清液中加入约100 μ L10%乙酸水溶液，以使液 体的pH达到4.01。随后，在相同温度下且伴随剧烈搅动，缓慢加入1.3mL乙醇。使液体在 〇°C下保持30分钟，并且在4°C下以16, 000g离心20分钟。将团块悬浮于调整至pH7. 5的由 20mM Tris-HCl 和 10mM MgCl^lL成的 2mL 水缓冲液中。通过 Vivaspin2(Sartorius)100kDa 膜过滤稀释的样品，由其获得200 μ L渗余物。随后用相同缓冲液将渗余物稀释至2mL，并且 通过相同lOOkDa膜过滤。渗余物（200 μ L)的稀释和超滤再重复四次。随后获得渗余物的 样品并通过SDS PAGE分析：在图13,泳道4中的样品。该样品中的杂质代表约0.9%的样 品重量。总之，获得的产物含有具有高于约99%纯度的MS2 VLP。
[0152] 实例N :使用多种水解酶、和用硫酸铵的分级沉淀用于纯化MS2VLP。
[0153] MS2 VLP的纯化如下进行。在纯化过程中获得样品，并且对样品运行SDS PAGE分 析。获得的结果显示于图14中。将得自与实例Η相同的实验的六分之一团块重悬浮于含 有10mM MgC12的20mM Tris-HCl，pH7.5中，并且超声处理以裂解细胞。通过以16,000g离 心去除细胞碎片。获得上清液样品并通过SDS PAGE分析：在图14,泳道1中的样品。该样 品中的杂质代表约70%的样品重量。以相同方式加工得自与实例Η相同的此类实验的四个 其他相同的团块级分。
[0154] 获得的体积各3. 7mL的五个离心的细胞裂解物如下以五种不同方式进行加工。第 一离心的细胞裂解物置于冰水浴中15分钟，并且加入0. 1克硫酸铵。将混合物涡旋直至 实现硫酸铵的完全溶解。使液体在〇°C下保持2小时，并且在4°C下以16, 000g离心30分 钟。将0.4克硫酸铵加入上清液中，并且涡旋直至实现硫酸铵的完全溶解。使液体在0°C下 保持2小时，并且在4°C下以16, 000g离心30分钟。将纯化的MS2VLP团块悬浮于调整至 pH 7. 5的由20mM Tris-HCl和10mM MgC12组成的0· 2mL水缓冲液中。第二离心的细胞裂 解物在37°C下温育五小时，置于冰水浴中与第一离心的细胞裂解物相同的时间量，并且随 后以与第一离心的细胞裂解物相同的方式加工。将〇. 15mg蛋白酶K(Sigma Aldrich，St. Louis，M0)加入第三离心的细胞裂解物。随后使它在37°C下温育五小时，置于冰水浴中与 第一离心的细胞裂解物相同的时间量，并且随后以与第一离心的细胞裂解物相同的方式加 工。使第四离心的细胞裂解物在37°C下温育两小时，随后加入0. 15mg PK。使它在37°C下 温育另外三小时，置于冰水浴中与第一离心的细胞裂解物相同的时间量，并且随后以与第 一离心的细胞裂解物相同的方式加工。
[0155] 将 500 单位 Benzonase?:核酸酶（Sigma Aldrich, St. Louis, M0)和 35 单位来 自皱裙假丝酵母（Candida rugosa)的脂肪酶（Sigma Aldrich, St. Louis, M0)加入第五 离心的细胞裂解物，并且在37°C下温育一小时。随后加入15单位来自芽孢杆菌属物种 (Bacillus sp.)的 α -淀粉酶（Sigma Aldrich, St. Louis, M0)，并且在 37°C下温育另外一 小时。随后加入〇. 15mgPK。使混合物在37°C下温育另外三小时，置于冰水浴中与第一离心 的细胞裂解物相同的时间量，并且随后以与第一离心的细胞裂解物相同的方式加工。
[0156] 在其5小时温育后获得第二离心的细胞裂解物的样品，并通过SDS PAGE分析：在 图14,泳道2中的样品。在其5小时温育后获得第三离心的细胞裂解物的样品，并通过SDS PAGE分析：在图14,泳道3中的样品。在其5小时温育后获得第四离心的细胞裂解物的样 品，并通过SDS PAGE分析：在图14,泳道4中的样品。在其5小时温育后获得第五离心的 细胞裂解物的样品，并通过SDS PAGE分析：在图14,泳道5中的样品。
[0157] 对于第一离心的细胞裂解物获得纯化的MS2 VLP悬浮液的样品，并通过SDS PAGE 分析：在图14,泳道6中的样品。获得的产物含有具有约88%纯度的MS2VLP。该样品的蛋 白质浓度（Pierce? BCA Protein Assay Kit, Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL) 为18. 5mg/mL。该样品的200:1稀释度在260nm处在lcm小室中测量的光密度（0D-260nm) 为0. 553,并且0D-280nm为0. 303。这些测量与约9mg/升培养物的RNA得率一致。
[0158] 对于第二离心的细胞裂解物获得纯化的MS2 VLP悬浮液的样品，并通过SDS PAGE 分析：在图14,泳道7中的样品。获得的产物含有具有约75%纯度的MS2 VLP。该样品的 蛋白质浓度为25. 4mg/mL。该样品的200:1稀释度在260nm处在lcm小室中测量的光密度 (0D-260nm)为0· 784,并且0D-280nm为0· 453。这些测量与约llmg/升培养物的RNA得率 一致。
[0159] 对于第三离心的细胞裂解物获得纯化的MS2 VLP悬浮液的样品，并通过SDS PAGE 分析：在图14,泳道8中的样品。获得的产物含有具有约94. 3%纯度的MS2 VLP。该样品 的蛋白质浓度为21. Omg/mL。该样品的200:1稀释度在260nm处在lcm小室中测量的光密 度（0D-260nm)为(λ 632,并且0D-280nm为(λ 321。这些测量与约10mg/升培养物的RNA得 率一致。
[0160] 对于第四离心的细胞裂解物获得纯化的MS2 VLP悬浮液的样品，并通过SDS PAGE 分析：在图14,泳道9中的样品。获得的产物含有具有约95. 6%纯度的MS2 VLP。该样品 的蛋白质浓度为19. 4mg/mL。该样品的200:1稀释度在260nm处在lcm小室中测量的光密 度（0D-260nm)为0. 666,并且0D-280nm为0. 353。这些测量与约llmg/升培养物的RNA得 率一致。
[0161] 对于第五离心的细胞裂解物获得纯化的MS2 VLP悬浮液的样品，并通过SDS PAGE 分析：在图14,泳道10中的样品。获得的产物含有具有约96%纯度的MS2 VLP。该样品的 蛋白质浓度为19. 8mg/mL。该样品的200:1稀释度在260nm处在lcm小室中测量的光密度 (0D-260nm)为0. 661，并且0D-280nm为0. 354。这些测量与约llmg/升培养物的RNA得率 一致。
[0162] 实例0 :壳体化shRNA的MS2衣壳的生产，所述shRNA靶向绿色荧光蛋白（GFP)和 附着至MS219聚体RNA发夹的HDV核酶。
[0163] 如下进行MS2衣壳的生产。将编码MS2的外壳蛋白质的下述DNA序列，序列A(SEQ ID N0:7)克隆到 pDEST14(Life Technologies)质粒内：
[0164] ACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTAAGAAGGAGATATACATATGGCTTCTAACTTTACTCAGTTCGT TCTCGTCGACAATGGCGGAACTGGCGACGTGACTGTCGCCCCAAGCAACTTCGCTAACGGGGTCGCTGAATGGATC AGCTCTAACTCGCGTTCACAGGCTTACAAAGTAACCTGTAGCGTTCGTCAGAGCTCTGCGCAGAATCGCAAATACAC CATCAAAGTCGAGGTGCCTAAAGTGGCAACCCAGACTGTTGGTGGTGTAGAGCTTCCTGTAGCCGCATGGCGTTCGT ACTTAAATATGGAACTAACCATTCCAATTTTCGCTACGAATTCCGACTGCGAGCTTATTGTTAAGGCAATGCAAGG TCTCCTAAAAGATGGAAACCCGATTCCCTCAGCAATCGCAGCAAACTCCGGCATCTACTAATAG 序列 A(SEQ ID NO :7)
[0165] 将下述DNA序列，序列B(SEQ ID N0:8)克隆到质粒pACYC184内。还将转录终止 子克隆到序列B(SEQ ID N0:8)的3'末端处（未示出）。序列B(SEQ ID N0:8)编码shRNA 发夹，设计为切割siRNA发夹的3'末端的丁型肝炎病毒（HDV)核酶，并且将MS2的特异性 RNA 19聚体克隆到质粒pACYC184内：
[0166] 序列 T7_Rz6
[0167] GGATCCTAATACGACTCACTATAGGCAAGCTGACCCTGAAGTTCTCAAGAGGAACTTCAGGGTCAGCTT GCCAAGGCCGGCATGGTCCCAGCCTCCTCGCTGGCGCCGGCTGGGCAACATTCGTGGCGAATGGGACCACGCTTCAA ACATGAGGATTACCCATGTCGAAGCGACCATGG(SEQ ID N0:8)。
[0168] 使用各含有序列A(SEQ ID NO: 104)和序列B(SEQ ID NO: 105)的2种质粒转化One Shot BL21(DE3)化学感受态大肠杆菌（Life Technologies)细胞，选择氯霉素和氨节青霉 素抗性转化体。对于衣壳生产，使这些转化体在37°C下在32mL含有氨苄青霉素和氯霉素两 者的LB培养基中生长。当培养物密度达到0D (600nm) = 0. 8时，随后加入异丙基β-D-1-硫 代半乳批喃糖苷（Sigma-Aldrich)至ImM的终浓度。诱导后4小时，通过在3, 000g和4°C 下离心40分钟收获细胞。如实例Z所述从纯化的VLP中提取RNA，并且如实例AA中所述分 析。如图16中的泳道shRNA中观察到的，观察到如对于编码的shRNA预期的相同分子量的 条带。
[0169] 实例P :使用编码siGFP的转录物生产MS2衣壳，所述siGFP在其5'末端上的侧 翼为长锤头状核酶，并且在其3'末端上的侧翼为附着至MS219聚体RNA发夹的HDV核酶和 第二HDV核酶。
[0170] 如下进行MS2衣壳的生产。将编码MS2的外壳蛋白质的下述DNA序列，序列A(SEQ ID N0:7)克隆到 pDEST14(Life Technologies)质粒内：
[0171] ACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTAAGAAGGAGATATACATATGGCTTCTAACTTTACTCAGTTCGT TCTCGTCGACAATGGCGGAACTGGCGACGTGACTGTCGCCCCAAGCAACTTCGCTAACGGGGTCGCTGAATGGATC AGCTCTAACTCGCGTTCACAGGCTTACAAAGTAACCTGTAGCGTTCGTCAGAGCTCTGCGCAGAATCGCAAATACAC CATCAAAGTCGAGGTGCCTAAAGTGGCAACCCAGACTGTTGGTGGTGTAGAGCTTCCTGTAGCCGCATGGCGTTCGT ACTTAAATATGGAACTAACCATTCCAATTTTCGCTACGAATTCCGACTGCGAGCTTATTGTTAAGGCAATGCAAGG TCTCCTAAAAGATGGAAACCCGATTCCCTCAGCAATCGCAGCAAACTCCGGCATCTACTAATAG 序列 A(SEQ ID NO :7)
[0172] 将下述DNA序列，序列C(SEQ ID N0:9)克隆到质粒pACYC184内。还将转录终止 子克隆到序列C(SEQ ID N0:9)的3'末端处（未示出）。序列C(SEQ ID N0:9)编码T7启 动子、设计为切割siRNA发夹的5'末端的锤头状核酶、siRNA发夹、设计为切割siRNA发夹 的3'末端的丁型肝炎病毒（HDV)核酶、和MS2的特异性RNA19聚体，并且将另一种HDV核 酶克隆到质粒PACYC184内：
[0173] 序列 T7_Rzl2
[0174] GGATCCTAATACGACTCACTATAGGGAGATAAATAAATAAATTTGAATGAACTTCAGGGTCAGCTTGCT GATGAGGCGCTTCGGCGCCGAAACACCCAGTGGTGTCCAAGCTGACCCTGAAGTTCATTCAAGAGATGAACTTCAGG GTCAGCTTGTCGGCCGGCATGGTCCCAGCCTCCTCGCTGGCGCCGGCTGGGCAACATTCGTGGCGAATGGGACCACG CTTCAAACATGAGGATTACCCATGTCGAAGCGAATTTATTTATTTAATTATTATTATTATTATTGGCCGGCATGGTC CCAGCCTCCTCGCTGGCGCCGGCTGGGCAACACCTTCGGGTGGCGAATGGGACCAAAAAAAAATAATAATAATAATA ATCCATGG(SEQ ID NO :9)
[0175] 使用各含有序列A(SEQ ID NO: 104)和序列C(SEQ ID NO: 106)的2种质粒转化One Shot BL21(DE3)化学感受态大肠杆菌（Life Technologies)细胞，选择氯霉素和氨节青霉 素抗性转化体。对于衣壳生产，使这些转化体在37°C下在32mL含有氨苄青霉素和氯霉素两 者的LB培养基中生长。当培养物密度达到OD (600nm) = 0. 8时，随后加入异丙基β-D-1-硫 代半乳批喃糖苷（Sigma-Aldrich)至ImM的终浓度。诱导后4小时，通过在3, 000g和4°C 下离心40分钟收获细胞。
[0176] 实例Q :使用转录物生产MS2衣壳，所述转录物编码shRNA和附着至MS2 19聚体 RNA发夹的缓慢HDV核酶。
[0177] 如实例0中所述进行生产MS2衣壳的几个实验，所述MS2衣壳各自壳体化不同货 物。然而，代替在序列B(SEQ ID N0:8)中包括的HDV核酶序列，在每个实验中使用以更缓 慢的反应速率常数切割siRNA的3'末端的突变体。对于每个实验，使用含有更缓慢HDV核 酶的下述序列代替序列B :
[0178] 序列 G76U:
[0179] TAATACGACTCACTATAGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATCAAGAGT GAACTTCAGGGTCAGCTTGTC GGCCGGCATGGTCCCAGCCTCCTCGCTGGCGCCGGCTGGGCAA CATTCGTGGCTAATGGGACCATATATATATACATGAGGATTACCCATGTCCATGG(SEQ ID NO:10)
[0180] 序列 G40U:
[0181] TAATACGACTCACTATAGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATCAAGAGT GAACTTCAGGGTCAGCTTGTC (i(iCC(.GCATGGTCCCAGCCTCCTCGCTGGCGCCGGCTGGTCAA CATTCGTGGCGAATGGGACCATATATATATACATGAGGATTACCCATGTCCATGG(SEQ ID NO:11)
[0182] 序列 A16G:
[0183] TAATACGACTCACTATAGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATCAAGAGTGAACTTCAGGGTCAGCTTGTCG GCCGGCATGGTCCCGGCCTCCTCGCTGGCGCCGGCTGGGCAACATTCGTGGCGAATGGGACCATATATATATACAT GAGGATTACCCATGTCCATGG(SEQ ID NO:12)
[0184] 序列 G39U:
[0185] TAATACGACTCACTATAGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATCAAGAGTGAACTTCAGGGTCAGCTTGTCG GCCGGCATGGTCCCAGCCTCCTCGCTGGCGCCGGCTGTGCAACATTCGTGGCGAATGGGACCATATATATATACAT GAGGATTACCCATGTCCATGG(SEQ ID NO:13)
[0186] 序列 A78G:
[0187] TAATACGACTCACTATAGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATCAAGAGTGAACTTCAGGGTCAGCTTGTCG GCCGGCATGGTCCCAGCCTCCTCGCTGGCGCCGGCTGGGCAACATTCGTGGCGAGTGGGACCATATATATATACAT GAGGATTACCCATGTCCATGG(SEQ ID NO:14)
[0188] 序列 C21U:
[0189] TAATACGACTCACTATAGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATCAAGAGTGAACTTCAGGGTCAGCTTGTCG GCCGGCATGGTCCCAGCCTTCTCGCTGGCGCCGGCTGGGCAACATTCGTGGCGAATGGGACCATATATATATACAT GAGGATTACCCATGTCCATGG(SEQ ID NO:15)
[0190] 序列 G25A:
[0191] TAATACGACTCACTATAGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATCAAGAGTGAACTTCAGGGTCAGCTTGTCG GCCGGCATGGTCCCAGCCTCCTCACTGGCGCCGGCTGGGCAACATTCGTGGCGAATGGGACCATATATATATACAT GAGGATTACCCATGTCCATGG(SEQ ID NO:16)
[0192] 序列 A78U:
[0193] TAATACGACTCACTATAGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATCAAGAGTGAACTTCAGGGTCAGCTTGTCG GCCGGCATGGTCCCAGCCTCCTCGCTGGCGCCGGCTGGGCAACATTCGTGGCGATTGGGACCATATATATATACAT GAGGATTACCCATGTCCATGG(SEQ ID NO:17)
[0194] 序列 G74C:
[0195] TAATACGACTCACTATAGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATCAAGAGTGAACTTCAGGGTCAGCTTGTCG GCCGGCATGGTCCCAGCCTCCTCGCTGGCGCCGGCTGGGCAACATTCGTGCCGAATGGGACCATATATATATACAT GAGGATTACCCATGTCCATGG(SEQ ID NO:18)
[0196] 实例R :使用编码shGFP的转录物生产MS2衣壳，所述shGFP在其5'末端上的侧 翼为一种长锤头状核酶，并且在其3'末端上的侧翼为附着至MS219聚体RNA发夹的另一种 长锤头状核酶和HDV核酶。
[0197] 如下进行MS2衣壳的生产。将编码MS2的外壳蛋白质的下述DNA序列，序列A(SEQ ID N0:7)克隆到 pDEST14(Life Technologies)质粒内：
[0198] ACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTAAGAAGGAGATATACATATGGCTTCTAACTTTACTCAGTTCGTT CTCGTCGACAATGGCGGAACTGGCGACGTGACTGTCGCCCCAAGCAACTTCGCTAACGGGGTCGCTGAATGGATCAG CTCTAACTCGCGTTCACAGGCTTACAAAGTAACCTGTAGCGTTCGTCAGAGCTCTGCGCAGAATCGCAAATACACCA TCAAAGTCGAGGTGCCTAAAGTGGCAACCCAGACTGTTGGTGGTGTAGAGCTTCCTGTAGCCGCATGGCGTTCGTAC TTAAATATGGAACTAACCATTCCAATTTTCGCTACGAATTCCGACTGCGAGCTTATTGTTAAGGCAATGCAAGGTCT CCTAAAAGATGGAAACCCGATTCCCTCAGCAATCGCAGCAAACTCCGGCATCTACTAATAG
[0199] 将下述DNA序列，序列D (SEQ ID NO: 19)克隆到质粒pACYC184内。还将转录终止 子克隆到序列D(SEQ ID NO: 19)的3'末端处（未示出）。序列D(SEQ ID NO: 19)编码T7 启动子、设计为切割siRNA发夹的5'末端的锤头状核酶、siRNA发夹、设计为切割siRNA发 夹的3'末端的锤头状核酶、MS2的特异性RNA19聚体和HDV核酶：
[0200] 序列 T7-Rzl5:
[0201] GGATCCTAATACGACTCACTATAGGGAGACGTTCACGTTGAATGAACTTCAGGGTCAGCTTGCTGATGA GGCGCTTCGGCGCCGAAACACCCAGTGGTGTCCAAGCTGACCCTGAAGTTCATTCAAGAGATGAACTTCAGGGTCAG CTTGTCACCGGATGTGCTCTCCGGTCTGATGAGTCCGTGAGGACGAAACAAGCTGACCCTGAAGTTCATCCGTGAAC GACGCTTCAAACATGAGGATTACCCATGTCGAAGCGAATATATATATATAGGCCGGCATGGTCCCAGCCTCCTCGCT GGCGCCGGCTGGGCAACACCTTCGGGTGGCGAATGGGACCAAAAAAATATATATATATACCATGG(SEQIDN0:19)
[0202] 使用各含有序列A (SEQ ID N0:7)和序列D(SEQ ID N0:19)的2种质粒转化One Shot BL21(DE3)化学感受态大肠杆菌（Life Technologies)细胞，选择氯霉素和氨节青 霉素抗性转化体。对于衣壳生产，使这些转化体在37°C下在750mL含有氨苄青霉素和氯 霉素两者的LB培养基中生长。当培养物密度达到0W600nm) =0.8时，随后加入异丙基 β-D-l-硫代半乳批喃糖苷（Sigma-Aldrich)至ImM的终浓度。诱导后4小时，通过在 3, 000g和4°C下离心40分钟收获细胞。在诱导前和在收获时获得样品用于分析。
[0203] 实例S :使用转录物生产MS2衣壳，所述转录物编码shRNA和附着至MS2 19聚体 RNA发夹的长锤头状核酶
[0204] 如实例0中所述进行生产MS2衣壳的几个实验，所述MS2衣壳各自壳体化不同货 物。然而，代替在序列B(SEQ ID N0:8)中包括的HDV核酶序列，在每个实验中使用长锤头 状核酶序列，其与siRNA的3'末端杂交且设计为切割其。对于每个实验，使用含有长锤头 状核酶的下述序列代替序列B(SEQ ID N0:8):
[0205] 序列10MNT (未良好切割）：
[0206] TAATACGACTCACTATAGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATCAAGAGT GAACTTCAGGGTCAGCTTGTCACCGGATGTGCTCTCCGGTCTGATGAG TCCGTGAGGACGAAACAAGCTGACC, ATATATATATACATGAGGATTACC CATGTCCATGG(SEQ ID NO:20)
[0207] 序列15MNT (未良好切割）：
[0208] TAATACGACTCACTATAGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATCAAGAGT GAACTTCAGGGTCAGCTTGTCACCGGATGTGCTCTCCGGTCTGATGAG TCCGTGAGGACGAAACAAGCTGACCCTGAA ATATATATAT ACATGAGGA ITACCCATGT'CCATCiCKSI'Q ID NO:21)
[0209] 序列20MNT (良好切割）：
[0210] TAATACGACTCACTATAGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATCAAGAGT GAACTTCAGGGTCAGCTTGTCACCGGATGTGCTCTCCGGTCTGATGAG TCCGTGAGGACGAAACAAGCTGACCCTGAAGTTCA. ATATATATAT ACAT id \〇:22)
[0211] 序列22MNT (良好切割）：
[0212] TAATACGACTCACTATAGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATCAAGAGT GAACTTCAGGGTCAGCTTGTCACCGGATGTGCTCTCCGGTCTGATGAG TCCGTGAGGACGAAACAAGCTGACCCTGAAGTTCACT. ATATATATAT AC ATQAQ-OAITAGQGAT-QT ccatgg (seq id no : 23)
[0213] 序列25MNT (良好切割）：
[0214] TAATACGACTCACTATAGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATCAAGAGT GAACTTCAGGGTCAGCTTGTCACCGGATGTGCTCTCCGGTCTGATGAG TCCGTGAGGACGAAACAAGCTGACCCTGAAGTTCACTCTT. ATATATATA T ACATGMj.GATTACCCATGT; CCATGG (SEQ ID NO :24)
[0215] 序列27MNT (良好切割）：
[0216] TAATACGACTCACTATAGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATCAAGy\GT GAACTTCAGGGTCAGCTTGTCACCGGATGTGCTCTCCGGTCTGATGAG TCCGTGAGGACGAAACAAGCTGACCCTGAAGTTCACTCTTGA Λ 丨 Λ 丨 Λ 丨 Λ ?'Λ?'ACATGAGGATTACCCATGT CCAI'GG (SI-；Q II) NO:25)
[0217] 该实例中所述的实验数据支持下述结论：根据本公开内容良好切割的RNA链是包 括锤头状核酶序列的RNA链，对于所述锤头状核酶序列，核酶序列的适当折叠动力学有利 超过整条链的shRNA("发夹"）区段的折叠。计算上述序列各自的热力学参数，以测定哪些 序列良好切割，并且哪些序列不是。
[0218] 实例T :使用编码siRNA的转录物生产MS2衣壳，所述siRNA在其5'末端上的侧 翼为长锤头状核酶，并且在其3'末端处的侧翼为附着至MS219聚体RNA发夹的反式作用的 HDV核酶。
[0219] 如下进行MS2衣壳的生产。将编码MS2的外壳蛋白质的下述DNA序列（序列A ; SEQ ID N0:7)克隆到 pDEST14(Life Technologies)质粒内：
[0220] ACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTAAGAAGGAGATATACATATGGCTTCTAACTTTACTCAGTTCGTT CTCGTCGACAATGGCGGAACTGGCGACGTGACTGTCGCCCCAAGCAACTTCGCTAACGGGGTCGCTGAATGGATCAG CTCTAACTCGCGTTCACAGGCTTACAAAGTAACCTGTAGCGTTCGTCAGAGCTCTGCGCAGAATCGCAAATACACCA TCAAAGTCGAGGTGCCTAAAGTGGCAACCCAGACTGTTGGTGGTGTAGAGCTTCCTGTAGCCGCATGGCGTTCGTAC TTAAATATGGAACTAACCATTCCAATTTTCGCTACGAATTCCGACTGCGAGCTTATTGTTAAGGCAATGCAAGGTCT CCTAAAAGATGGAAACCCGATTCCCTCAGCAATCGCAGCAAACTCCGGCATCTACTAATAG(SEQ ID NO:7)
[0221] 将下述DNA序列，序列E (SEQ ID NO:26)克隆到质粒pACYC184内。还将转录终 止子克隆到序列E(SEQ ID NO:26)的3'末端处（未示出）。序列E(SEQ ID NO:26)编码 BamHI限制位点、T7启动子和起始序列、设计为以反式模式切割针对增强型绿色荧光蛋白 的siRNA(siEGPF)的3'末端的HDV核酶、ΑΤΑΤ间隔物、设计为切割siEGFP发夹的5'末端 的长锤头状核酶、siEGFP发夹、以反式模式切割siEGFP发夹的3'末端的HDV核酶的互补 序列、MS2的特异性RNA19聚体和PacI限制位点：
[0222] GGATCCTAATACGACTCACTATAGGGATCTCCCAGCCTCCTCGCTGGCGCCGGCTGGGCAACATTCGTG GCGAATGGGGGATCATATCTTGATGAACTTCAGGGTCAGCTTGCTGATGAGGCGCTTCGGCGCCGAAACACCGTGTC CAAGCTGACCCTGAAGTTCATCAAGAATGAACTTCAGGGTCAGCTTGTCGGCCGGCATGCATTCAAACATGAGGATT ACCCATGTCGAAGTTAATTAA(SEQ ID NO:26)
[0223] BamHI和Hindlll位点分别在5,末端和3,末端处添加，以促进克隆到pACYC184 内（未示出）。
[0224] 使用各含有序列A(SEQ ID N0:104)和序列E(SEQ ID N0:26)的2种质粒转化 One Shot BL21(DE3)化学感受态大肠杆菌（Life Technologies)细胞，选择氯霉素和氨节 青霉素抗性转化体。对于衣壳生产，使这些转化体在37°C下在750mL含有氨苄青霉素和 氯霉素两者的LB培养基中生长。当培养物密度达到0W600nm) =0.8时，随后加入异丙 基β -D-1-硫代半乳批喃糖苷（Sigma-Aldrich)至ImM的终浓度。诱导后4小时，通过在 3, OOOg和4°C下离心40分钟收获细胞。在诱导前和在收获时获得样品用于分析。
[0225] 实例U :使用编码靶向GFP的3种不同siRNA的转录物生产MS2衣壳，所述siRNA 的侧翼为附着至MS2 19聚体RNA发夹的长锤头状核酶。
[0226] 如下进行MS2衣壳的生产。将编码MS2的外壳蛋白质的下述DNA序列（序列A ; SEQ ID N0:7)克隆到 pDEST14(Life Technologies)质粒内：
[0227] ACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTAAGAAGGAGATATACATATGGCTTCTAACTTTACTCAGTTCGTT CTCGTCGACAATGGCGGAACTGGCGACGTGACTGTCGCCCCAAGCAACTTCGCTAACGGGGTCGCTGAATGGATCAG CTCTAACTCGCGTTCACAGGCTTACAAAGTAACCTGTAGCGTTCGTCAGAGCTCTGCGCAGAATCGCAAATACACCA TCAAAGTCGAGGTGCCTAAAGTGGCAACCCAGACTGTTGGTGGTGTAGAGCTTCCTGTAGCCGCATGGCGTTCGTAC TTAAATATGGAACTAACCATTCCAATTTTCGCTACGAATTCCGACTGCGAGCTTATTGTTAAGGCAATGCAAGGTCT CCTAAAAGATGGAAACCCGATTCCCTCAGCAATCGCAGCAAACTCCGGCATCTACTAATAG(SEQ ID NO:7)
[0228] 将下述DNA序列，序列F(SEQ ID N0:27)克隆到质粒pACYC184内。还将转录终止 子克隆到序列F(SEQ ID N0:27)的3'末端处（未示出）。序列F(SEQ ID N0:27)编码T7 启动子和起始序列、设计为切割针对增强型绿色荧光蛋白的siRNA(siEGPF)的5'末端的3 种锤头状核酶、3种不同的siEGFP发夹、设计为切割siEGFP发夹的3'末端的3种长锤头状 核酶、MS2的特异性RNA19聚体：
[0229] GGATCCTAATACGACTCACTATAGGGAGACTTGATGAACTTCAGGGTCAGCTTGCTGATGAGGCGCTT CGGCGCCGAAACACCCAGTGGTGTCCAAGCTGACCCTGAAGTTCATCAAGAATGAACTTCAGGGTCAGCTTGTCAC CGGATGTGCTCTCCGGTCTGATGAGTCCGTGAGGACGAAACAAGCTGACCCTGAAGTTCATTATATCTTGGCAGA TGAACTTCAGGGTCAGCTGATGAGACTCTTCGGAGTCGAAACACCCAGTGGTGTCCTGACCCTGAAGTTCATCTG CCAAGAGCAGATGAACTTCAGGGTCAGTCACCGGATGTGCTCTCCGGTCTGATGAGTCCGTGAGGACGAAACTGA CCCTGAAGTTCATCTGCTATATCTTGTGGTGCAGATGAACTTCAGGGCTGATGAGGCTCTTCGGAGCCGAAACAC CCAGTGGTGTCCCCTGAAGTTCATCTGCACCACAAGATGGTGCAGATGAACTTCAGGGTCACCGGATGTGCTCTC CGGTCTGATGAGTCCGTGAGGACGAAACCCTGAAGTTCATCTGCACCATACGCCGGCCATTCAAACATGAGGATT ACCCATGTCGAAGTTAATTAA(SEQ ID NO :27)
[0230] 使用各含有序列A (SEQ ID NO :7)及其他序列F (SEQ ID NO :27)的2种质粒转化 One Shot BL21(DE3)化学感受态大肠杆菌（Life Technologies)细胞，选择氯霉素和氨节 青霉素抗性转化体。对于衣壳生产，使这些转化体在37°C下在750mL含有氨苄青霉素和 氯霉素两者的LB培养基中生长。当培养物密度达到0D(600nm) =0.8时，随后加入异丙 基β-D-l-硫代半乳批喃糖苷（Sigma-Aldrich)至ImM的终浓度。诱导后4小时，通过在 3, 000g和4°C下离心40分钟收获细胞。在诱导前和在收获时获得样品用于分析。
[0231] 实例V :使用编码靶向GFP的3种不同siRNA的转录物生产MS2衣壳，所述siRNA 的侧翼为位于其5'末端处的间隔物和附着至MS219聚体RNA发夹、位于其3'末端处的HDV 核酶。
[0232] 如下进行MS2衣壳的生产。将编码MS2的外壳蛋白质的下述DNA序列（序列A ; SEQ ID N0:7)克隆到 pDEST14(Life Technologies)质粒内：
[0233] ACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTAAGAAGGAGATATACATATGGCTTCTAACTTTACTCAGTTCGTT CTCGTCGACAATGGCGGAACTGGCGACGTGACTGTCGCCCCAAGCAACTTCGCTAACGGGGTCGCTGAATGGATCAG CTCTAACTCGCGTTCACAGGCTTACAAAGTAACCTGTAGCGTTCGTCAGAGCTCTGCGCAGAATCGCAAATACACCA TCAAAGTCGAGGTGCCTAAAGTGGCAACCCAGACTGTTGGTGGTGTAGAGCTTCCTGTAGCCGCATGGCGTTCGTAC TTAAATATGGAACTAACCATTCCAATTTTCGCTACGAATTCCGACTGCGAGCTTATTGTTAAGGCAATGCAAGGTCT CCTAAAAGATGGAAACCCGATTCCCTCAGCAATCGCAGCAAACTCCGGCATCTACTAATAG(SEQ ID N07)
[0234] 将下述DNA序列，序列G(SEQ ID N0:28)克隆到质粒pACYC184内。还将转录终 止子克隆到序列G(SEQ ID N0:28)的3'末端处（未示出）。序列G(SEQ ID N0:28)编码 BamHI限制位点、T7启动子和起始序列、在针对增强型绿色荧光蛋白的siRNA (siEGPF)的5' 末端处的3个间隔物、3种不同的siEGFP发夹、设计为切割siEGFP发夹的3'末端的3种 HDV核酶、MS2的特异性RNA19聚体和PacI限制位点：
[0235] GGATCCTAATACGACTCACTATAGGGAGAATATATATACAAGCTGACCCTGAAGTTCATCAAGAATGAA CTTCAGGGTCAGCTTGTCGGCCGGCATGGTCCCAGCCTCCTCGCTGGCGCCGGCTGGGCAACATTCGTGGCGAATGG GACCAATTAATTACTGACCCTGAAGTTCATCTGCCAAGAGCAGATGAACTTCAGGGTCAGTCGGCCGGCATGGTCCC AGCCTCCTCGCTGGCGCCGGCTGGGCAACATTCGTGGCGAATGGGACCAATAATAATCCCTGAAGTTCATCTGCACC ACAAGATGGTGCAGATGAACTTCAGGGTCGGCCGGCATGGTCCCAGCCTCCTCGCTGGCGCCGGCTGGGCAACATTC GTGGCGAATGGGACCCATTCAAACATGAGGATTACCCATGTCGAAGTTAATTAA(SEQ ID NO:28)
[0236] 使用各含有序列A (SEQ ID NO :7)和序列G (SEQ ID NO :28)的2种质粒转化One Shot BL21(DE3)化学感受态大肠杆菌（Life Technologies)细胞，选择氯霉素和氨节青 霉素抗性转化体。对于衣壳生产，使这些转化体在37°C下在750mL含有氨苄青霉素和氯 霉素两者的LB培养基中生长。当培养物密度达到0W600nm) =0.8时，随后加入异丙基 β-D-l-硫代半乳批喃糖苷（Sigma-Aldrich)至ImM的终浓度。诱导后4小时，通过在 3, 000g和4°C下离心40分钟收获细胞。在诱导前和在收获时获得样品用于分析。
[0237] 实例W :使用编码靶向GFP的两条siRNA链的转录物生产MS2衣壳，所述siRNA链 各自的侧翼为位于其3'末端处的长锤头状核酶和附着至MS219聚体RNA发夹、位于其5' 末端处的HDV核酶。
[0238] 如下进行MS2衣壳的生产。将编码MS2的外壳蛋白质的下述DNA序列（序列A ; SEQ ID N0:7)克隆到 pDEST14(Life Technologies)质粒内：
[0239] ACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTAAGAAGGAGATATACATATGGCTTCTAACTTTACTCAGTTCGTT CTCGTCGACAATGGCGGAACTGGCGACGTGACTGTCGCCCCAAGCAACTTCGCTAACGGGGTCGCTGAATGGATCAG CTCTAACTCGCGTTCACAGGCTTACAAAGTAACCTGTAGCGTTCGTCAGAGCTCTGCGCAGAATCGCAAATACACCA TCAAAGTCGAGGTGCCTAAAGTGGCAACCCAGACTGTTGGTGGTGTAGAGCTTCCTGTAGCCGCATGGCGTTCGTAC TTAAATATGGAACTAACCATTCCAATTTTCGCTACGAATTCCGACTGCGAGCTTATTGTTAAGGCAATGCAAGGTCT CCTAAAAGATGGAAACCCGATTCCCTCAGCAATCGCAGCAAACTCCGGCATCTACTAATAG(SEQ ID NO:7)
[0240] 将下述DNA序列，序列H(SEQ ID NO: 29)克隆到质粒pACYC184内。还将转录终止 子克隆到序列Η的3'末端处（未示出）。
[0241] 序列 T7_Rz8
[0242] GGATCCTAATACGACTCACTATAGGGAGAATGAACTTCAGGGTCAGCTTGCTGATGAGGCGCTTCGGCG CCGAAACACCGTGTCCAAGCTGACCCTGAAGTTCATGGCCGGCATGGTCCCAGCCTCCTCGCTGGCGCCGGCTGGGC AACATTCGTGGCGAATGGGACCATTAGCCAAGCTGACCCTGAAGTTCATCTGATGAGACTCCGAATTCGGAGTCGAA ACACGGTAACCGTGTCATGAACTTCAGGGTCAGCTTGGCGGCCGGCATGGTCCCAGCCTCCTCGCTGGCGCCGGCTG GGCAACATTCGTGGCGAATGGGACCCATTCAAACATGAGGATTACCCATGTCGAAGCCATGG(SEQ ID NO:29)
[0243] 使用各含有序列A(SEQ ID NO: 104)和序列H(SEQ ID NO: 126)的2种质粒转化 One Shot BL21(DE3)化学感受态大肠杆菌（Life Technologies)细胞，选择氯霉素和氨节 青霉素抗性转化体。对于衣壳生产，使这些转化体在37°C下在750mL含有氨苄青霉素和 氯霉素两者的LB培养基中生长。当培养物密度达到0W600nm) =0.8时，随后加入异丙 基β-D-l-硫代半乳批喃糖苷（Sigma-Aldrich)至ImM的终浓度。诱导后4小时，通过在 3, 000g和4°C下离心40分钟收获细胞。
[0244] 实例X :使用编码靶向绿色荧光蛋白（GFP)的2种不同siRNA的转录物生产MS2 衣壳，所述siRNA的侧翼为位于其3'末端和5'末端处、附着至MS219聚体RNA发夹的间隔 物。
[0245] 如下进行MS2衣壳的生产。将编码MS2的外壳蛋白质的下述DNA序列（序列A ; SEQ ID N0:7)克隆到 pDEST14(Life Technologies)质粒内：
[0246] ACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTAAGAAGGAGATATACATATGGCTTCTAACTTTACTCAGTTCGTT CTCGTCGACAATGGCGGAACTGGCGACGTGACTGTCGCCCCAAGCAACTTCGCTAACGGGGTCGCTGAATGGATCAG CTCTAACTCGCGTTCACAGGCTTACAAAGTAACCTGTAGCGTTCGTCAGAGCTCTGCGCAGAATCGCAAATACACCA TCAAAGTCGAGGTGCCTAAAGTGGCAACCCAGACTGTTGGTGGTGTAGAGCTTCCTGTAGCCGCATGGCGTTCGTAC TTAAATATGGAACTAACCATTCCAATTTTCGCTACGAATTCCGACTGCGAGCTTATTGTTAAGGCAATGCAAGGTCT CCTAAAAGATGGAAACCCGATTCCCTCAGCAATCGCAGCAAACTCCGGCATCTACTAATAG(SEQ ID NO:7)
[0247] 将下述DNA序列，序列I (SEQ ID NO: 30)克隆到质粒pACYC184内。还将转录终止 子克隆到序列I (SEQ ID NO: 30)的3'末端处（未示出）。序列I (SEQ ID NO: 30)编码T7 启动子和起始序列、分离针对绿色荧光蛋白的siRNA(siGPF)的末端的3个间隔物、2种不同 的siEGFP发夹、MS2的特异性RNA19聚体：
[0248] GGATCCTAATACGACTCACTATAGGGAGAAATAATAATCAAGCTGACCCTGAAGTTCATCAAGAATGAA CTTCAGGGTCAGCTTGTCAATAATAATCCGCTACCCCGACCACATGAACAAGATTCATGTGGTCGGGGTAGCGGTCA ATAATAATACGCTTCAAACATGAGGATTACCCATGTCGAAGCGACCATGG(SEQ ID NO:30)
[0249] 使用各含有序列A (SEQ ID NO :7)和序列I (SEQ ID NO :30)的2种质粒转化One Shot BL21(DE3)化学感受态大肠杆菌（Life Technologies)细胞，选择氯霉素和氨节青 霉素抗性转化体。对于衣壳生产，使这些转化体在37°C下在750mL含有氨苄青霉素和氯 霉素两者的LB培养基中生长。当培养物密度达到0W600nm) =0.8时，随后加入异丙基 β-D-l-硫代半乳批喃糖苷（Sigma-Aldrich)至ImM的终浓度。诱导后4小时，通过在 3, 000g和4°C下离心40分钟收获细胞。在诱导前和在收获时获得样品用于分析。
[0250] 实例Y :实例0至X中获得的MS2VLP的纯化。
[0251] 使用实例N中概述的操作纯化实例0至X中获得的MS2衣壳。
[0252] 实例Z :实例N中获得的MS2衣壳中壳体化的RNA的分离
[0253] 根据由制造商（Life Technologies, Grand Island, NY)提供的方案，使 用TRIzol?'试剂，从每个实验中提取如实例N中所述纯化的MS2衣壳中壳体化 的RNA。获得的RNA通过在95 °C下在甲酰胺中加热5分钟进行变性，并且通过在 17.6〇1?38〇]?0.04〇11(1，1^1')凝胶中电泳进行分析，所述凝胶由8%聚丙烯酰胺、8摩尔尿 素、1. 08% Tris碱、0. 55%硼酸和0. 093% EDTA组成。电泳缓冲液具有与凝胶相同浓度的 Tris碱、硼酸和EDTA。功率以约40W递送。使用在以pH8含有25%甲酰胺、19%异丙醇和 15mM Tris 的含水混合物中的 Stains-All 染料（Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)的 0· 025% 溶液将凝胶染色。获得的结果显示于图15中。图15中用于RNA电泳的泳道编号指图14 中用于蛋白质电泳的相同泳道编号。在每个泳道中可观察到单一 RNA条带，与在每种情况 下回收的高纯度RNA-致。
[0254] 实例AA :HDV核酶在体外转录过程中产生shRNA。
[0255] 构建体T7_Rz2用于体外转录。将该构建体克隆到pACYC184质粒（New England Biolabs)内。使用该质粒转化One Shot BL21 (DE3)化学感受态大肠杆菌（Life Technologies)细胞。含有该质粒的BL21(DE3)在37°C下在含有氨苄青霉素的LB培养 基中生长至0D(600nm)等于0. 8。根据制造商的说明书，使用QIAprep? Spin Miniprep Kit(Qiagen)分离质粒。Ncol (New England Biolabs)用于在引入该构建体内的限制位点 处切割分离的质粒。在消化后，模板通过在1. 5 %琼脂糖凝胶上电泳进行纯化，并且根据制 造商的说明书，使用 PureLink? Quick Gel Extraction Kit(Life Technologies)进行分 离。根据制造商的说明书，使用MAXIscript?T7试剂盒完成逆转录。RNA产物在70°C下 运行的Novex?变性15%聚丙烯酰胺TBE-尿素凝胶（Life Technologies)中进行电泳。 使用溴化乙陡（Sigma-Aldrich)显现RNA条带。使用Image Lab4.0. 1软件（Bio-Rad)完 成凝胶成像。
[0256] 模板T7_Rz2如下编码T7启动子、shRNA发夹、设计为切割shRNA发夹的3'末端 的HDV核酶、ATATATATAT间隔物和Ncol _曝_魁倍点_ :
[0257] TAATACGACTCACTATAGGCTTGTGATGCTTCAGCCAAATCAAGAGTTTGGCTGAAGCATCACAAGCG GCCGGCATGGTCCCAGCCTCCTCGCTGGCGCCGGCTGGGCAACATTCGTGGCGAATGGGACCATATATATATACAT GAGGATTACCCATGTCCATGG(SEQ ID NO:31)
[0258] 结果显示HDV核酶切割。顶部条带是未切割的转录物，并且两个较低条带是预期 切割的RNA小片。
[0259] 图16中的凝胶显示在最左边泳道中的一组RNA标记，在以后泳道中的49核苷酸 shRNA标记，在第三泳道中在37°C下运行1小时的T7-Rz2构建体的体外转录和切割，以及 在第四、最右边泳道中在37°C下运行1小时并在42°C下温育另外一小时的T7-Rz2构建体 的体外转录和切割。
[0260] 三个最强烈的条带中最慢的具有在37处高于在37/42处的强度。另外，两个更快 速的条带具有在37/42处高于在37处的强度。在最后一个泳道中的最低分子量条带运行 略微慢于49nt shRNA标准物，如对于T7Rz2中所得的51核苷酸shRNA预期的。总之，如图 16中所示的结果与HDV核酶在T7-Rz2中切割的假设一致。
[0261] 实例BB :长侧翼锤头状核酶在体外转录过程中切割至比短侧翼锤头状核酶显著 更高的程度
[0262] 构建体T7_Rzl和T7_Rz4用于体外转录。T7_Rzl包含常见核酶，即具有小于6对 杂交核苷酸的杂交被切割siRNA的茎。T7-Rz4包含具有长度长的茎的侧翼核酶，所述茎杂 交被切割的siRNA，即具有超过6对杂交核苷酸的茎。
[0263] 构建体T7_Rzl编码T7启动子、具有与siRNA互补的5个核苷酸的设计为切割 siRNA发夹的5'末端的锤头状（HH)核酶、siRNA发夹、具有与siRNA互补的5个核苷酸的 设计为切割siRNA发夹的3'末端的HH核酶、和Ncol限制位点：
[0264] TAATACGACTCACTATAGGCTCGAGCAAGCCTGATGAGGCGCTTCGGCGCCGAAACACCGTGTCGCTT GTGATGCTTCAGCCAAATCAAGAGTTTGGCTGAAGCATCACAAGCTCACCGGATGTGCTCTCCGGTCTGATGAGTC CGTGAGGACGAAAGCTTGCCATGG(SEQ ID NO :32)
[0265] 构建体T7_Rz4编码siRNA，所述siRNA的侧翼为具有与siRNA杂交的12个核苷 酸、设计为切割其5'末端的HH核酶，和具有与siRNA杂交的23个核苷酸、设计为切割其3' 末端的HH核酶：
[0266] TAATACGACTCACTATAGGGAGAACGCCGGCCATTCAAATAGTAAATAATAGAGGGTCAGCTTGCTGAT GAGGCGCTTCGGCGCCGAAACACCGTGTCCAAGCTGACCCTGAAGTTCATCAAGAGTGAACTTCAGGGTCAGCTTGT CACCGGATGTGCTCTCCGGTCTGATGAGTCCGTGAGGACGAAACAAGCTGACCCTGAAGTTCACTACGCCGGCCATT CAAACATGAGGATTACCCATGTCCATGG(SEQ ID NO :33)
[0267] 体外转录实验和分析以与实例Y中那些相似的方式用这些构建体运行。如图17 中所示，用构建体T7-Rzl获得的结果与核酶切割至极低程度的假设一致。图17中所示的 用构建体T7-Rz4获得的结果与核酶切割至显著程度的假设一致。
[0268] 实例CC :使用编码针对EGFP的shRNA的转录物生产MS2衣壳，所述shRNA的侧翼 为在其5'末端处的长锤头状核酶和在其3'末端处附着至MS219聚体RNA发夹的另一种长 锤头状核酶。
[0269] 如下进行MS2衣壳的生产。将编码MS2的外壳蛋白质的下述DNA序列（序列A ; SEQ ID N0:7)克隆到 pDEST14(Life Technologies)质粒内：
[0270] ACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTAAGAAGGAGATATACATATGGCTTCTAACTTTACTCAGTTCGTT CTCGTCGACAATGGCGGAACTGGCGACGTGACTGTCGCCCCAAGCAACTTCGCTAACGGGGTCGCTGAATGGATCAG CTCTAACTCGCGTTCACAGGCTTACAAAGTAACCTGTAGCGTTCGTCAGAGCTCTGCGCAGAATCGCAAATACACCA TCAAAGTCGAGGTGCCTAAAGTGGCAACCCAGACTGTTGGTGGTGTAGAGCTTCCTGTAGCCGCATGGCGTTCGTAC TTAAATATGGAACTAACCATTCCAATTTTCGCTACGAATTCCGACTGCGAGCTTATTGTTAAGGCAATGCAAGGTCT CCTAAAAGATGGAAACCCGATTCCCTCAGCAATCGCAGCAAACTCCGGCATCTACTAATAG(SEQ ID N07)
[0271] 将下述DNA序列（构建体T7_Rz4)克隆到质粒pACYC184内。还将转录终止子克 隆到构建体T7-Rz4的3'末端处（未示出）。
[0272] TAATACGACTCACTATAGGGAGAACGCCGGCCATTCAAATAGTAAATAATAGAGGGTCAGCTTGCTGAT GAGGCGCTTCGGCGCCGAAACACCGTGTCCAAGCTGACCCTGAAGTTCATCAAGAGTGAACTTCAGGGTCAGCTTGT CACCGGATGTGCTCTCCGGTCTGATGAGTCCGTGAGGACGAAACAAGCTGACCCTGAAGTTCACTACGCCGGCCATT CAAACATGAGGATTACCCATGTCCATGG(SEQ ID NO :33)
[0273] 使用各含有序列A (SEQ ID NO: 7)和构建体T7-Rz4 (SEQ ID NO: 33)的2种质粒转 化One Shot BL21(DE3)化学感受态大肠杆菌（Life Technologies)细胞，选择氯霉素和氨 苄青霉素抗性转化体。对于衣壳生产，使这些转化体在37 °C下在750mL含有氨苄青霉素和 氯霉素两者的LB培养基中生长。当培养物密度达到0W600nm) =0.8时，随后加入异丙 基β -D-1-硫代半乳批喃糖苷（Sigma-Aldrich)至ImM的终浓度。诱导后4小时，通过在 3, 000g和4°C下离心40分钟收获细胞。在诱导前和在收获时获得样品用于分析。
[0274] 实例DD :实例CC中获得的病毒样颗粒的纯化。
[0275] 如实例N中进行实例CC中产生的病毒样颗粒的纯化。
[0276] 实例EE :实例DD中获得的病毒样颗粒中的RNA的分离
[0277] 根据由制造商（Life Technologies, Grand Island, NY)提供的方案，使用 TRIzol?试剂，提取如实例DD中所述纯化的病毒样颗粒中壳体化的RNA。获得的RNA通过 在95°C下在甲酰胺中加热5分钟进行变性，并且通过在70°C下运行的Novex?变性15% 聚丙烯酰胺TBE-尿素凝胶（Life Technologies)中电泳进行分析。使用0.5yg溴化乙陡 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) /mL水溶液显现RNA条带。获得的结果显示于图18,泳道3 中。泳道1显示一组分子标准物。泳道2显示化学合成的长49个核苷酸的shRNA。
[0278] 实例FF :实例DD中获得的包含MS2衣壳的病毒样颗粒对来自白色侧齿霉菌 (Engyodontium album)、地衣芽孢杆菌（licheniformis)的蛋白酶K，来自猪胃粘膜的胃蛋 白酶，和来自木瓜乳的木瓜蛋白酶是抗性的。
[0279] 包含得自250mL培养物且如实例DD中所述纯化的MS2衣壳的病毒样颗粒悬浮于 以 pH = 7. 5 的 400 μ L20mM CaCl2 水溶液中。
[0280] 将66 μ L该悬浮液的等分试样用以pH = 7. 5的20mM CaCl2水溶液稀释至0. 25mL， 并且在37°C下温育。在温育1小时和4小时后获得样品用于蛋白质浓度（Pierce? BCA Protein Assay Kit, Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL)和 SDS PAGE 分析。在这 2 份样品中的蛋白质浓度分别为3086和4656mg/L。SDS PAGE分析分别显示于图19,泳道IB 和6中。将相同量的蛋白质装载到每个泳道中（4yg)。该组实验用作阴性对照。
[0281] 将2 μ g来自灰色链霉菌的蛋白酶（Sigma Aldrich, St. Louis, M0)用以pH = 7. 5 的20mMCaCl2水溶液稀释至0. 25mL，并且在37°C下温育。在温育1小时和4小时后获得样 品用于蛋白质浓度和SDS PAGE分析。在这2份样品中的蛋白质浓度分别为361和324mg/ L。SDS PAGE分析分别显示于图19,泳道1和7中。将相同量的蛋白质装载到每个泳道中 (4yg)。该组实验用作另一种阴性对照。
[0282] 将2 μ g来自灰色链霉菌的蛋白酶加入包含MS2衣壳的病毒样颗粒悬浮液的另一 个66yL等分试样中，用以pH= 7. 5的20mM CaCl2水溶液稀释至0. 25mL，并且在37°C下 温育。在温育1小时和4小时后获得样品用于蛋白质浓度和SDS PAGE分析。在这2份样 品中的蛋白质浓度分别为2940和3012mg/L。SDS PAGE分析分别显示于图19,泳道2和8 中。将相同量的蛋白质装载到每个泳道中（4yg)。该组实验用于测试形成病毒样颗粒的 MS2衣壳针对来自灰色链霉菌的蛋白酶的蛋白酶解稳定性。观察到小于10%降解。
[0283] 用以pH = 7. 5的20mM CaCl2水溶液稀释至0. 25mL、包含MS2衣壳的病毒样颗粒 悬浮液的另一个66 μ L等分试样被实施加热至95°C 10分钟和在湿冰上冷却10分钟的三个 循环，以实现病毒样颗粒的拆卸。随后将2 μ g来自灰色链霉囷的蛋白酶加入该悬浮液中， 并且在37°C下温育。在温育1小时和4小时后获得样品用于蛋白质浓度和SDS PAGE分析。 在这2份样品中的蛋白质浓度分别为2601和3033mg/L。SDS PAGE分析分别显示于图19， 泳道3和9中。将相同量的蛋白质装载到每个泳道中（4yg)。拆卸的颗粒由来自灰色链霉 菌的蛋白酶降解至显著程度。该组实验用作阳性对照。
[0284] 将溶解于以pH = 7. 5的0. 002mL20mM CaCl2水溶液中的2 μ g来自灰色链霉菌的 蛋白酶加入〇. 248mL细菌细胞裂解物中，所述细菌细胞裂解物得自来自实例CC的41mL细 胞培养物，并且在37°C下温育。在温育1小时和4小时后获得样品用于蛋白质浓度和SDS PAGE分析。在这2份样品中的蛋白质浓度分别为3192和4837mg/L。SDS PAGE分析分别显 示于图19,泳道4和10中。标记为L的图19的最后一个泳道显示未经处理的细菌细胞裂 解物。将相同量的蛋白质装载到每个泳道中（4 μ g)。超过90%的除MS2衣壳蛋白质以外 的蛋白质由来自灰色链霉菌的蛋白酶降解。该组实验用作另一种阳性对照。
[0285] 该组五个实验证实形成本公开内容的病毒样颗粒的MS2衣壳对由来自灰色链霉 菌的蛋白酶的蛋白酶解是抗性的。
[0286] 将2 μ g来自地衣芽孢杆菌的蛋白酶（Sigma Aldrich, St. Louis, M0)用以pH = 7. 5的lOmM乙酸钠和5mM乙酸钙水溶液稀释至0. 25mL，并且在37°C下温育。在温育1小时 和4小时后获得样品用于蛋白质浓度和SDS PAGE分析。在这2份样品中的蛋白质浓度分 别为976和1003mg/L。SDS PAGE分析分别显示于图19,泳道2B和7B中。将相同量的蛋白 质装载到每个泳道中（4 μ g)。该组实验用作另一种阴性对照。
[0287] 将2 μ g来自地衣芽孢杆菌的蛋白酶加入包含MS2衣壳的病毒样颗粒悬浮液的另 一个66 μ L等分试样中，用以pH = 7. 5的10mM乙酸钠和5mM乙酸钙水溶液稀释至0. 25mL， 并且在37°C下温育。在温育1小时和4小时后获得样品用于蛋白质浓度和SDS PAGE分析。 在这2份样品中的蛋白质浓度分别为3144和3727mg/L。SDS PAGE分析分别显示于图19， 泳道3B和8B中。将相同量的蛋白质装载到每个泳道中（4yg)。该组实验用于测试形成病 毒样颗粒的MS2衣壳针对来自地衣芽孢杆菌的蛋白酶的蛋白酶解稳定性。观察到小于10% 降解
[0288] 用以pH = 7. 5的10mM乙酸钠和5mM乙酸钙水溶液稀释至0. 25mL、包含MS2衣壳 的病毒样颗粒悬浮液的另一个66 μ L等分试样被实施加热至95°C 10分钟和在湿冰上冷却 10分钟的三个循环，以实现病毒样颗粒的拆卸。随后将2 μ g来自地衣芽孢杆菌的蛋白酶 加入该悬浮液中，并且在37°C下温育。在温育1小时和4小时后获得样品用于蛋白质浓度 和SDS PAGE分析。在这2份样品中的蛋白质浓度分别为1769和1785mg/L。SDS PAGE分 析分别显示于图19,泳道4B和9B中。将相同量的蛋白质装载到每个泳道中（4yg)。拆卸 的颗粒由来自地衣芽孢杆菌的蛋白酶降解。该组实验用作阳性对照。
[0289] 将溶解于以pH = 7. 5的0. 002mL 10mM乙酸钠和5mM乙酸钙水溶液中的2 μ g来自 地衣芽孢杆菌的蛋白酶加入0. 248mL细菌细胞裂解物中，所述细菌细胞裂解物得自来自实 例CC的41mL细胞培养物，并且在37°C下温育。在温育1小时和4小时后获得样品用于蛋 白质浓度和SDS PAGE分析。在这2份样品中的蛋白质浓度分别为3696和4078mg/L。SDS PAGE分析分别显示于图19,泳道6B和10B中。标记为L的图19的最后一个泳道显示未经 处理的细菌细胞裂解物。将相同量的蛋白质装载到每个泳道中（4 μ g)。超过90%的除MS2 衣壳蛋白质以外的蛋白质由来自地衣芽孢杆菌的蛋白酶降解。该组实验用作另一种阳性对 照。
[0290] 该组四个实验证实形成本公开内容的病毒样颗粒的MS2衣壳对由来自地衣芽孢 杆菌的蛋白酶的蛋白酶解是抗性的。
[0291] 三组另外的等价实验证实形成本公开内容的病毒样颗粒的MS2衣壳对由下述三 种蛋白酶中的任一种的蛋白酶解是抗性的：来自白色侧齿霉菌的蛋白酶K、来自猪胃粘膜 的胃蛋白酶（CAS编号9001-75-6)、和来自木瓜乳的木瓜蛋白酶（CAS编号9001-73-4) (Sigma-Aldrich，St.Louis，M0)。每种蛋白酶根据制造商的说明书使用。蛋白酶K在pH = 7. 5下使用，胃蛋白酶在pH = 1. 6下使用，并且木瓜蛋白酶在pH = 6. 6下使用。
[0292] 实例GG :衣壳外壳蛋白质变体
[0293] MS2病毒衣壳蛋白质（SEQ. ID No. 3)具有单个折叠结构域，并且属于超家族d. 85 的折叠家族d. 85. 1 (RNA细菌噬菌体衣壳蛋白质），所述超家族d. 85包括光滑病毒科和 alloleviviridae衣壳蛋白质。该家族中的每个衣壳单体由6链β片层随后为两个螺旋 (有时描述为具有纽结的长螺旋）组成。180个单体非共价装配，以形成二十面体（大致球 形的）病毒衣壳，其中连续β片层面向衣壳内部，并且 α-螺旋在衣壳外部上。关于均为 d. 85. 1家族光滑病毒科外壳蛋白质的肠杆菌噬菌体MS2、GA(UniProt序列标识符Ρ07234) 和FR(UniProt序列标识符P03614)病毒衣壳以及由MS2二聚体（其中一个MS2的一个C 末端已融合至另一个的N末端）形成的MS2衣壳，X射线晶体结构已得到解决并且置于公 众域中。关于这些结构的蛋白质数据库标识符分别为1AQ3(SEQ ID N0:34)、1GAV(SEQ ID N0:35)、1FRS(SEQ ID N0:36)和 2VTU(SEQ ID N0:37)，并且这些的比对显示于图 20 中。 在本文描述的所有比对中，残基编号是序贯残基编号，例如SEQ ID3以由细胞去除的引导 Met (M)残基的0开始，如大多数PDB结构使用的。
[0294] MS2病毒衣壳蛋白质相对于GA和FR病毒衣壳蛋白质的序列分别为59 %和87 %相 同的。仅56%的序列位置具有相同序列，并且当所有三种序列一起考虑时，就主链而言的拓 扑学等价的位置重叠。MS2病毒衣壳蛋白质相对于GA和FR病毒衣壳单体的主链构象的均 方根（rms)偏差在1A下。1AQ3单体A相对于1GAV单体0的主链均方根偏差为0. 89埃。 1AQ3单体A相对于1FRS单体A的主链均方根偏差为0. 37埃。使用免费软件实用jFATCAT 刚性（Prlic,等人，Bioinformatics26, 2983-2985 (2010) ;www. rcsb.org/pdb/workbench/ workbench, do ;www. rcsb. org/pdb/workbench/workbench. do)作出比较，所述免费软件是 在其标准蛋白质结构工具工作台中在RCSB蛋白质数据库网站处可获得的结构研究蛋白质 从业者熟悉的工具。这些蛋白质的总体折叠是相同的。不存在插入或缺失。独立精制结 晶学非对称单位中的每种蛋白质。在非对称单位内的不同的组成上相同蛋白质一般主链 均方根偏差1埃或更大，尽管核心的拓扑学等价C α原子趋于相差小于约0. 45埃（Cyrus Chothia & Arthur M Lesk(1986)EMB0 J5,823-826)。例如 1AQ3 单体 A 和 1AQ3 单体 B 具 有1. 72A的均方根偏差（jFATCAT刚性），主要是由于Lys66-Trp82区域中的构象差异。
[0295] 如果已鉴定折叠家族的足够成员，则在家族很少或从未突变的序列内保守残基、 拓扑学等价残基位置的清晰画面出现。非保守位置可预期从一个序列到另一个突变，而不 扰乱家族折叠，可能与折叠中的一个或多个空间邻居的协调突变结合，特别是如果侧链针 对空间邻居的一条或多条侧链压实。保守残基对于蛋白质的折叠稳定性、功能或加工例如 蛋白酶解消化可以是关键的。一些可以是一致保守的。GenBank(Dennis A. Benson, Ilene Karsch-Mizrachi, David J.Lipman, James Ostell 和 David L.Wheeler(2005) Nucleic Acids Res 33, D34-D38)目前容纳353种光滑病毒科外壳蛋白质序列。图 21中所示的比对表显示40种完全光滑病毒科外壳蛋白质序列的多重比对，所述外壳 蛋白质序列从总体蛋白质序列数据库UniProt (Universal Protein Resource, (The UniProt Consortium, Reorganizing the protein space at the Universal Protein Resource(UniProt)NucleicAcidsRes. 40 ：D71~D75 (2012)), http://www. uniprot. org) (参见下表1)中检索，并且用BLAST(阈值=10,自动加权阵列选择，无过滤，允许缺口）比 对。除 efl08465 之外的所有序列均得自 UniProt。efl08465 来自 GenBank(www.ncbi.nlm. nih.gov/genbank)。在比对表中，星号〇)指示保守残基，x基于侧链溶剂可接近性、氢键 合需求和主链构象约束计算为可置换的。这些家族成员的序列中的五十七（57)个残基是 保守的，或45%的序列彼此相同。这些序列中的一些具有在SEQ ID N0:3的C末端Tyrl29 残基后的另外的残基，其他具有就SEQ ID N0:3而g从N末端去除的1_2个残基。在折置 内不存在插入或缺失。
[0296] 表1 :从总体蛋白质序列数据库UniProt中检索的40种完全光滑病毒科外壳蛋白 质序列列表
[0297] 登记条目名称_4#_标识符 G4WZU0 G4WZU0_BPMS2116 肠杆菌噬菌体 ms2 329852 DOU1D6 D0U1D6_BPMS2116 肠杆菌噬菌体 ms2 12022 C0M2U4 C0M2U4_BPMS2116 肠杆菌噬菌体 ms2 12022 基因 ms2g2 C0M2S8 C0M2S8_BPMS2116 肠杆菌噬菌体 ms2 12022 基因 ms2g2 C0M212 C0M212_BPMS2116 肠杆菌噬菌体 ms2 12022 基因 ms2g2 C0M1M2 C0M1M2_BPMS2116 肠杆菌噬菌体 ms2 12022 基因 ms2g2 C0M2L4 C0M2L4_BPMS2116 肠杆菌噬菌体 ms2 12022 基因 ms2g2 C0M220 C0M220_BPMS2116 肠杆菌噬菌体 ms2 12022 基因 ms2g2 Q2V0S8 Q2VOS8_BPB01116 肠杆菌噬菌体 bol 12014 C0M216 C0M216_BPMS2116 肠杆菌噬菌体 ms2 12022 基因 ms2g2 C0M1Y0 C0M1Y0_BPMS2116 肠杆菌噬菌体 ms2 12022 基因 ms2g2 D0U1E4 D0U1E4_BPMS2116 肠杆菌噬菌体 ms2 12022 基因 ms2g2 C0M309 C0M309_BPMS2116 肠杆菌噬菌体 ms2 12022 基因 ms2g2 C0M325 C0M325_BPMS2116 肠杆菌噬菌体 ms2 12022 基因 ms2g2 Q9T丨C7 Q9T丨C7_BPMS2丨丨6肠杆菌噬菌体ms丨2 110679 C0M2Z1 C0M2Z1_BPMS2116 肠杆菌噬菌体 ms2 12022 基因 ms2g2 C0M1N8 C0M1N8_BPMS2116 肠杆菌噬菌体 ms2 12022 基因 ms2g2 J9QBW2 J9QBW2_BPMS2116 肠杆菌噬菌体 ms2 12022 基因 ms2g2 C8XPC9 C8XPC9_BPMS2113 肠杆菌噬菌体 ms2 329852 COM2Y4 COM2Y4_BPMS2115 肠杆菌噬菌体 ms2 12022 基因 ms2g2 P69171 外壳_BPZR115 肠杆菌噬菌体zr 332942 P69170外壳_BPR17116肠杆菌噬菌体rl7 12026 P03612外壳_BPMS2 肠杆菌噬菌体ms2 329852 C0M1L4 C0M1L4_BPMS2116 肠杆菌噬菌体 ms2 12022 基因 ms2g2 C8XPD7 C8XPD7_BPMS2116 肠杆菌噬菌体 ms2 329852 基因 cp Q2V0T1 Q2V0T1_BPZR116 肠杆菌噬菌体 zr 332942 Q9MCD7 Q9MCD7_BPJP5 丨 15 肠杆菌噬菌体 jp501 丨 2020 P03611 外壳_BPF2115 肠杆菌噬菌体￡2 12016
[0298] P34700外壳_BPJP3115 肠杆菌噬菌体jp34 12019 Q2V01.J0 Q2V0U0_BPBZ1115 肠杆菌噬菌体 jp500 332939 Q2V0T7 Q2V0T7_BPBZ 1115 肠杆菌噬菌体 sd 332940 Q9MBL2Q9MBL2_BPKU1115 肠杆菌噬菌体 kul 12021 P07234外壳_BPGA115 肠杆菌噬菌体ga 12018 C8YJG7 C8YJG7-BPBZ1115 肠杆菌噬菌体 bzl3 329853 C8YJH1 C8YJH 1_BPBZ丨1丨5 肠杆菌噬菌体 bzl3 329853 C8YJH5 C8YJH5_BPBZ1 丨 15 肠杆菌噬菌体 bzl3 329853 Q2V0T4 Q2V0T4_BPTH 1115 肠杆菌噬菌体 th 1 12029 Q2V0U3 Q2V0U3_BPBZ1116 肠杆菌噬菌体 t丨2 332938 P03614 n*_BPFR116 肠杆菌噬菌体 fr 12017 ef108465 肠杆菌噬菌体rl7 329852
[0299] SEQ ID N0:341AQ3肠杆菌噬菌体MS2外壳蛋白质T59S
[0300] ASNFTQFVLVDNGGTCDVTVAPSNFANGVAEWISSNSRSQAYKVTCSVRQSSAQNRKYSIKVEVPKVAT QTVGGVELPVAAWRSYLNMELTIPIFATNSDCELIVKAMQGLLKDGNPIPSAIAANSGIY
[0301] SEQ ID N0:351GAV肠杆菌噬菌体GA外壳蛋白质A59T G79V
[0302] ATLRSFVLVDNGGTGNVTVVPVSNANGVAEWLSNNSRSQAYRVTASYRASGADKRKYTIKLEVPKIVTQ VVNGVELPGSAWKAYASIDLTIPIFAATDDVTVISKSLAGLFKVGNPIAEAISSQSGFYA
[0303] SEQ ID N0:361FRS肠杆菌噬菌体FR外壳蛋白质
[0304] >sp | P03614 |外壳_BPFR外壳蛋白质0S =肠杆菌噬菌体frPE = 1 SV = 4
[0305] ASNFEEFVLVDNGGTCDVKVAPSNFANGVAEWISSNSRSQAYKVTCSVRQSSANNRKYTVKVEVPKVAT QVQGGVELPVAAWRSYMNMELTIPVFATNDDCALIVKALQGTFKTGNPIATAIAANSGIY
[0306] SEQ ID N0:372VTU肠杆菌噬菌体MS2外壳蛋白质共价二聚体
[0307] sp|P03612|外壳_BPMS2外壳蛋白质0S =肠杆菌噬菌体MS2PE = 1 SV = 2
[0308] ASNFTQFVLVDNGGTCDVTVAPSNFANGVAEWISSNSRSQAYKVTCSVRQSSAQNRKYTIKVEVPKVAT QTVGGVELPVAAWRSYLNMELTIPIFATNSDCELIVKAMQGLLKDGNPIPSAIAANSGIYANFTQFVLVDNGGTCDV TVAPSNFANGVAEWISSNSRSQAYKVTCSVRQSSAQNRKYTIKVEVPKVATQTVGGVELPVAAWRSYLNMELTIPIF ATNSDCELIVKAMQGLLKDGNPIPSAIAANSGIY
[0309] SEQ ID N0:38(SEQ ID N0:38)G4WZU0G4WZU0_BPMS2116 肠杆菌噬菌体 ms2329852
[0310] >sp|P03612|外壳_BPMS2外壳蛋白质OS =肠杆菌噬菌体MS2 PE = 1SV = 2
[0311] MASNFTQFVLVDNGGTCDVTVAPSNFANGVAEWISSNSRSQAYKVTCSVRQSSAQNRKYTIKVEVPKVA TQTVGGVELPVAAWRSYLNLELTIPIFATNSDCELIVKAMQGLLKDGNPIPSAIAANSGIY
[0312] SEQ ID NO :39
[0313] D0U1D6 D0U1D6_BPMS2116 肠杆菌噬菌体 ms2 12022
[0314] >tr|D0UlD6|D0UlD6_BPMS2 外壳蛋白质 OS =肠杆菌噬菌体 MS2 PE = 4SV = 1
[0315] MASNFTQFVLVDNGGTCDVTVAPSNFANGVAEWISSNSRSQAYKVTCSVRQSSAQNRKYTIKVEVPKVA TQTVGGVELPVAAWRSYLNLELTIPIFATNSDCELIVKAMQGLLKDGNPIPSAIAANSGIY
[0316] SEQ ID NO :40
[0317] C0M2U4 C0M2U4_BPMS2116 肠杆菌噬菌体 ms2 12022 基因 ms2g2
[0318] >tr | C0M2U4 | C0M2U4_BPMS2 外壳蛋白质 OS =肠杆菌噬菌体 MS2GN = MS2g2PE = 4SV = 1
[0319] MASNFTQFVLVDNGGTCDVTVAPSNFANGVAEWISSNSRSQAYKVTCSVRQSSAQNRKYTIKVELPKVA TQTVGGVELPVAAWRSYLNMELTIPIFATNSDCELIVKAMQGLLKDGNPIPSAIAANSGIY
[0320] SEQ ID NO:41
[0321] C0M2S8 C0M2S8_BPMS2116 肠杆菌噬菌体 ms2 12022 基因 ms2g2
[0322] >tr I C0M2S8 I C0M2S8_BPMS2 外壳蛋白质 OS =肠杆菌噬菌体 MS2GN = MS2g2PE = 4SV = 1
[0323] MASNFTQFVLVDNGGTCDVTVAPSNFANGVAEWISSNSRSQAYKVTCSVRQSSAQNRKYTIKVEVPKVA TQTVGGVELPVAAWRSYLNVELTIPIFATNSDCELIVKAMQGLLKDGNPIPSAIAANSGIY
[0324] SEQ ID NO :42
[0325] C0M212 C0M212_BPMS2116 肠杆菌噬菌体 ms2 12022 基因 ms2g2
[0326] tr I C0M212 I C0M212_BPMS2 外壳蛋白质 OS =肠杆菌噬菌体 MS2GN = MS2g2PE = 4SV =1
[0327] MASNFTQFVLVDNGGTCDVTVAPSNFANGVAEWISSNSRSQAYKVTCSVRQSSAQNRKYTIKVEVPKVA TQTVGGVELPVAAWRSYLNMELTIPIFATNPDCELIVKAMQGLLKDGNPIPSAIAANSGIY
[0328] SEQ ID NO :43
[0329] C0M1M2 C0M1M2_BPMS2116 肠杆菌噬菌体 ms2 12022 基因 ms2g2
[0330] >tr I C0M1M2 I C0M1M2_BPMS2 外壳蛋白质 OS =肠杆菌噬菌体 MS2GN = MS2g2PE = 4SV = 1
[0331] MASNFTQFVLVDNGGTCDVAVAPSNFANGVAEWISSNSRSQAYKVTCSVRQSSAQNRKYTIKVEVPKVA TQTVGGVELPVAAWRSYLNMELTIPIFATNSDCELIVKAMQGLLKDGNPIPSAIAANSGIY
[0332] SEQ ID NO :44
[0333] C0M2L4 C0M2L4_BPMS2116 肠杆菌噬菌体 ms2 12022 基因 ms2g2
[0334] >tr I C0M2L4 I C0M2L4_BPMS2 外壳蛋白质 OS =肠杆菌噬菌体 MS2GN = MS2g2PE = 4SV = 1
[0335] MASNFTQFVLVDNGGTCDVTVAPSNFANGVAEWISSNSRSQAYKVTCSVXQSSAQNRKYTIKVEVPKVA TQTVGGVELPVAAWRSYLNMELTIPIFATNSDCELIVKAMQGLLKDGNPIPSAIAANSGIY
[0336] SEQ ID NO :45
[0337] C0M220 C0M220_BPMS2116 肠杆菌噬菌体 ms2 12022 基因 ms2g2
[0338] >tr I C0M220 I C0M220_BPMS2 外壳蛋白质 OS =肠杆菌噬菌体 MS2GN = MS2g2PE = 4SV = 1
[0339] MASNFTXFVLVDNGGTCDVTVAPSNFANGVAEWISSNSRSQAYKVTCSVRQSSAQNRKYTIKVEVPKVA TQTVGGVELPVAAWRSYLNMELTIPIFATNSDCELIVKAMQGLLKDGNPIPSAIAANSGIY
[0340] SEQ ID NO :46
[0341] Q2V0S8 Q2V0S8_BPB01116 肠杆菌噬菌体 bol 12014
[0342] >tr I Q2V0S8 I Q2V0S8_BPB01 外壳蛋白质 OS =肠杆菌噬菌体 B01 PE = 4SV = 1
[0343] MASNFTQFVLVDNGGTCDVTVAPSNFANGVAEWISSNSRSQAYKVTCSVRQSSAQNRKYTIKVEVPKVA TQTVGGVELPVAAWRSYLNMELTIPIFATNSDCELIVKAMQGPLKDGNPIPSAIAANSGIY
[0344] SEQ ID NO :47
[0345] C0M216 C0M216_BPMS2116 肠杆菌噬菌体 ms2 12022 基因 ms2g2
[0346] >tr|C0M216|C0M216_BPMS2 外壳蛋白质 OS =肠杆菌噬菌体 MS2GN = MS2g2PE = 4SV = 1
[0347] MASNFTQFVLVDNDGTCDVTVAPSNFANGVAEWISSNSRSQAYKVTCSVRQSSAQNRKYTIKVEVPKVA TQTVGGVELPVAAWRSYLNMELTIPIFATNSDCELIVKAMQGLLKDGNPIPSAIAANSGIY
[0348] SEQ ID NO :48
[0349] C0M1Y0 C0M1Y0_BPMS2116 肠杆菌噬菌体 ms2 12022 基因 ms2g2
[0350] >tr I C0M1Y0 I C0M1Y0_BPMS2 外壳蛋白质 OS =肠杆菌噬菌体 MS2GN = MS2g2PE = 4SV = 1
[0351] MASNFTQFVLVDNGGTGXVTVAPSNFANGVAEWISSNSRSQAYKVTCSVRQSSAQNRKYTIKVEVPKVA TQTVGGVELPVAAWRSYLNMELTIPIFATNSDCELIVKAMQGLLKDGNPIPSAIAANSGIY
[0352] SEQ ID NO :49
[0353] D0U1E4 D0U1E4_BPMS2116 肠杆菌噬菌体 ms2 12022 基因 ms2g2
[0354] >tr |D0U1E4|D0U1E4_BPMS2 外壳蛋白质 OS =肠杆菌噬菌体 MS2 PE = 4SV = 1
[0355] MASNFTQFVLVDNGGTCDVTVAPSNFANGVAEWISSNSRSQAYKVTCSVRQSSAQNRKYTIKVEVPKVA TQTVGGVELPVAAWRSYLNLELTIPIFATNPDCELIVKAMQGLLKDGNPIPSAIAANSGIY
[0356] SEQ ID NO :50
[0357] C0M309 C0M309_BPMS2116 肠杆菌噬菌体 ms2 12022 基因 ms2g2
[0358] >tr I C0M309 I C0M309_BPMS2 外壳蛋白质 OS =肠杆菌噬菌体 MS2GN = MS2g2PE = 4SV = 1
[0359] MASNFTQFVLVDNGGTCDVTVAPSNFANGVAEWISSNSRSQAYKVTCSVRQSSAQNRKYTIKVEVPKVA TQTVGGVELPVAAWRSYLNMELTIPIFATNSDCELIVKAMQGLLKDGNPISSAIAANSGIY
[0360] SEQ ID NO:51
[0361] C0M325 C0M325_BPMS2116 肠杆菌噬菌体 ms2 12022 基因 ms2g2
[0362] >tr|C0M325|C0M325_BPMS2 外壳蛋白质 OS =肠杆菌噬菌体 MS2GN = MS2g2PE = 4SV = 1
[0363] MASNFTQFVLVDNGGTCDVTVAPSNFANGVAEWISSNSRSQAYKVTCSVRQSSAQNRKYTIKVEVPKVA TQTVGGVELPVAAWRSYLNVELTIPIFATNSDCEXIVKAMQGLLKDGNPIPSAIAANSGIY
[0364] SEQ ID NO :52
[0365] Q9T1C7 Q9T1C7_BPMS2116 肠杆菌噬菌体 msl2 110679
[0366] >tr|Q9TlC7|Q9TlC7_BPMS2 外壳蛋白质 OS =肠杆菌噬菌体 M12 PE = 4SV = 1
[0367] MASNFTQFVLVDNGGTCDVTVXPSNFANGVAEWISSNSRSQAYKVTCSVRQSSAQNRKYTIKVEVPKVA TQTVGGVELPVAAWRSYLNMELTIPIFATNSDCALIVKAMQGLLKDGNPIPSAIAANSGIY
[0368] SEQ ID NO :53
[0369] C0M2Z1 C0M2Z1_BPMS2116 肠杆菌噬菌体 ms2 12022 基因 ms2g2
[0370] >tr|C0M2Zl |C0M2Z1_BPMS2 外壳蛋白质 OS =肠杆菌噬菌体 MS2GN = MS2g2PE = 4SV = 1
[0371] MASNFTQFVLVDNGGTCDVTVAPSNFANGVAEWISSNSRSQAYKVTCSVRQSSAQNRKYTIKVEVPKVA TQTVGGVELPVAAWRSYLNVELTIPIFATNSDCELIVKAMQGLLKDGNPIPSAIAANSGIX
[0372] SEQ ID NO :54
[0373] C0M1N8 C0M1N8_BPMS2116 肠杆菌噬菌体 ms2 12022 基因 ms2g2
[0374] >tr|C0M2Zl |C0M2Z1_BPMS2 外壳蛋白质 OS =肠杆菌噬菌体 MS2GN = MS2g2PE = 4SV = 1
[0375] MASNFTQFVLVDNGGTCDVTVAPSNFANGVAEWISSNSRSQAYKVTCSVRQSSAQNRKYTIKVEVPKVA TQTVGGVELPVAAWRSYLNVELTIPIFATNSDCELIVKAMQGLLKDGNPIPSAIAANSGIX
[0376] SEQ ID NO :55
[0377] J9QBW2 J9QBW2_BPMS2116 肠杆菌噬菌体 ms2 12022 基因 ms2g2
[0378] >tr I J9QBW2 I J9QBW2_BPMS2 衣壳蛋白质 OS =肠杆菌噬菌体 MS2 PE = 4SV = 1
[0379] MASNFTQFVLVDNGGTCDVTVAPSNFANGVAEWISSNSRSQAYKVTCSVRQSSAQNRKYTIKVEVPKVA TQTVGGVQLPVAAWRSYLNMELTIPIFATNDDCALIVKAMQGLLKDGNPIPSAIAANSGIY
[0380] SEQ ID NO :56
[0381] C8XPC9 C8XPC9_BPMS2113 肠杆菌噬菌体 ms2 329852
[0382] >tr I C8XPC9 I C8XPC9_BPMS2 外壳蛋白质 OS =肠杆菌噬菌体 MS2 PE = 4SV = 1
[0383] MASNFTQFVLVDNGGTCDVTVAPSNFANGVAEWISSNSRSQAYKVTCSVRQSSAQNRKYTIKVEVPKVA TQTVGGVQLPVAAWRSYLNMELTIPIFATNDDCALIVKAMQGLLKDGNPIPSAIAANSGIY
[0384] SEQ ID NO :57
[0385] C0M2Y4 C0M2Y4_BPMS2115 肠杆菌噬菌体 ms2 12022 基因 ms2g2
[0386] >tr I C0M2Y4 I C0M2Y4_BPMS2 外壳蛋白质（片段）OS =肠杆菌噬菌体 MS2GN = MS2g2PE = 4SV = 1
[0387] NFTQFVLVDNGGTGDVTVAPSNFANGVAEWISSNSRSQAYKVTCSVRQSSAQNRKYTIKVEVPKVATQT VGGVELPVAAWRSYLNVELTIPIFATNSDCELIVKAMQGLLKDGNPIPSAIAANSGIY
[0388] SEQ ID NO :58
[0389] P69171 外壳 _BPZR115 肠杆菌噬菌体 zr 332942
[0390] >sp|P6917l|外壳_BPZR外壳蛋白质OS =肠杆菌噬菌体ZRPE = 1SV = 1
[0391] ASNFTQFVLVNDGGTGNVTVAPSNFANGVAEWISSNSRSQAYKVTCSVRQSSAQNRKYTIKVEVPKVAT QTVGGVELPVAAWRSYLNMELTIPIFATNSDCELIVKAMQGLLKDGNPIPSAIAANSGIY
[0392] SEQ ID NO :59
[0393] P69170 外壳 _BPR17116 肠杆菌噬菌体 rl7 12026
[0394] >sp|P6917〇|外壳_BPR17外壳蛋白质OS =肠杆菌噬菌体R17PE = 1 SV = 1
[0395] ASNFTQFVLVNDGGTGNVTVAPSNFANGVAEWISSNSRSQAYKVTCSVRQSSAQNRKYTIKVEVPKVAT QTVGGVELPVAAWRSYLNMELTIPIFATNSDCELIVKAMQGLLKDGNPIPSAIAANSGIY
[0396] SEQ ID NO :60
[0397] P03612 外壳 _BPMS2 肠杆菌噬菌体 ms2 329852
[0398] >sp|P03612|外壳_BPMS2外壳蛋白质OS =肠杆菌噬菌体MS2PE = 1SV = 2
[0399] MASNFTQFVLVDNGGTCDVTVAPSNFANGVAEWISSNSRSQAYKVTCSVRQSSAQNRKYTIKVEVPKVA TQTVGGVELPVAAWRSYLNMELTIPIFATNSDCELIVKAMQGLLKDGNPIPSAIAANSGIY
[0400] SEQ ID NO:61
[0401] C0M1L4 C0M1L4_BPMS2116 肠杆菌噬菌体 ms212022 基因 ms2g2
[0402] >tr | C0M1L4 | C0M1L4_BPMS2 外壳蛋白质 OS =肠杆菌噬菌体 MS2GN = MS2g2PE = 2SV = 1
[0403] MASNFTQFVLVDNGGTCDVTVAPSNFANGVAEWISSNSRSQAYKVTCSVRQSSAQNRKYTIKVEVPKVA TQTVGGVELPVAAWRSYLNMELTIPIFATNSDCELIVKAMQGLLKDGNPIPSAIAANSGIY
[0404] SEQ ID NO :62
[0405] C8XPD7 C8XPD7_BPMS2116 肠杆菌噬菌体 ms2 329852 基因 cp
[0406] >tr I C8XPD7 I C8XPD7_BPMS2 外壳蛋白质 OS =肠杆菌噬菌体 MS2 GN = cpPE = 4SV =1
[0407] MASNFTQFVLVDNGGTCDVTVAPSNFANGVAEWISSNSRSQAYKVTCSVRQSSAQNRKYTIKVEVPKVA TQTVGGVELPVAAWRSYLNMELTIPIFATNSDCELIVKAMQGLLKDGNPIPSAIAANSGIY
[0408] SEQ ID NO :63
[0409] Q2V0T1 Q2V0T1_BPZR116 肠杆菌噬菌体 zr 332942
[0410] >tr|Q2V0Tl|Q2V0Tl_BPZR外壳蛋白质0S=肠杆菌噬菌体ZRPE = 4SV=l
[0411] MASNFTQFVLVDNGGTCDVTVAPSNFANGVAEWISSNSRSQAYKVTCSVRQSSAQNRKYTIKVEVPKVA TQTVGGVELPVAAWRSYLNMELTIPIFATNSDCELIVKAMQGLLKDGNPIPSAIAANSGIY
[0412] SEQ ID NO :64
[0413] Q9MCD7 Q9MCD7_BPJP5115 肠杆菌噬菌体 jp501 12020
[0414] >tr | Q9MCD7 | Q9MCD7_BPJP5 外壳蛋白质 OS =肠杆菌噬菌体 JP501 PE = 4SV = 1
[0415] MASNFTEFVLVDNGETGNVTVAPSNFANGVAEWISSDSRSQAYKVTCSVRQSSAQNRKYTIKVAVPKVA TQTVGGVELPVAAWRSYLNMELTIPIFATNSDCALIVKAMQGLLKDGNPIPSAIAANSGIY
[0416] SEQ ID NO :65
[0417] P03611 外壳 _BPF2115 肠杆菌噬菌体 f2 12016
[0418] >sp|P0361l|外壳_BPF2外壳蛋白质OS =肠杆菌噬菌体f2PE = 1 SV = 1
[0419] ASNFTQFVLVNDGGTGNVTVAPSNFANGVAEWISSNSRSQAYKVTCSVRQSSAQNRKYTIKVEVPKVAT QTVGGVELPVAAWRSYLNLELTIPIFATNSDCELIVKAMQGLLKDGNPIPSAIAANSGIY
[0420] SEQ ID NO :66
[0421] P34700 外壳 _BPJP3115 肠杆菌噬菌体 jp34 12019
[0422] >sp |P34700 I外壳_BPJP3外壳蛋白质OS =肠杆菌噬菌体JP34PE = 3 SV = 2
[0423] MATLRSFVLVDNGGTCDVTVVPVSNANGVAEWLSNNSRSQAYRVTASYRASGADKRKYTIKLEVPKIVT QVVNGVELPVSAWKAYASIDLTIPIFAATDDVTVISKSLAGLFKVGNPIADAISSQSGFYA
[0424] SEQ ID NO :67
[0425] Q2V0U0 Q2V0U0_BPBZ1115 肠杆菌噬菌体 jp500332939
[0426] >tr I Q2V0U0 I Q2V0U0_BPBZ1 外壳蛋白质 OS =肠杆菌噬菌体 JP500 PE = 4SV = 1
[0427] MATLRSFVLVDNGGTCDVTWPVSNANGVAEWLSNNSRSQAYRVTASYRASGADKRKYTIKLEVPKIVT QVVNGVELPVSAWKAYASIDLTIPIFAATDDVTVISKSLAGLFKVGNPIADAISSQSGFYA
[0428] SEQ ID NO :68
[0429] Q2V0T7 Q2V0T7_BPBZ1115 肠杆菌噬菌体 sd 332940
[0430] >tr I Q2V0T7 I Q2V0T7_BPBZ1 外壳蛋白质 OS =肠杆菌噬菌体 SD PE = 4SV = 1
[0431] MATLRSFVLVDNGGTGNVTVVPVSNANGVAEWLSNNSRSQAYRVTASYRASGADKRKYTIKLEVPKIVT QVVNGVELPISAWKAYASIDLTIPIFAATDDVTTISKSLAGLFKVGNPIADAISSQSGFYA
[0432] SEQ ID NO :69
[0433] Q9MBL2 Q9MBL2_BPKU1115 肠杆菌噬菌体 kul 12021
[0434] >tr I Q9MBL2 I Q9MBL2_BPKU1 外壳蛋白质 OS =肠杆菌噬菌体 KU1 PE = 4SV = 1
[0435] MATLRSFVLVDNGGTGNVTVVPVSNANGVAEWLSNNSRSQAYRVTASYRASGADKRKYTIKLEVPKIVT QSVNGVELPVSAWKAFASIDLTIPIFAATDDVTLISKSLAGLFKIGNPVADAISSQSGFYA
[0436] SEQ ID NO :70
[0437] P07234 外壳 _BPGA115 肠杆菌噬菌体 ga 12018
[0438] >sp|P07234|外壳_BPGA外壳蛋白质OS =肠杆菌噬菌体GAPE = 1SV = 3
[0439] MATLRSFVLVDNGGTGNVTVVPVSNANGVAEWLSNNSRSQAYRVTASYRASGADKRKYAIKLEVPKIVT QVVNGVELPGSAWKAYASIDLTIPIFAATDDVTVISKSLAGLFKVGNPIAEAISSQSGFYA
[0440] SEQ ID NO:71
[0441] C8YJG7 C8YJG7_BPBZ1115 肠杆菌噬菌体 bz 13 329853
[0442] >tr I C8YJG7 I C8YJG7_BPBZ1 衣壳蛋白质 OS =肠杆菌噬菌体 BZ13 PE = 4SV = 1
[0443] MATLRSFVLVDNGGTGNVTVVPVSNANGVAEWLSNNSRSQAYRVTASYRASGADKRKYTIKLEVPKIVT QVVNGVELPVSAWKAYASIDLTIPIFAATDDVTVISKSLAGLFKVGNPIAEAISSQSGFYA
[0444] SEQ ID NO :72
[0445] C8YJH1 C8YJH1_BPBZ1115 肠杆菌噬菌体 bz 13 329853
[0446] >tr I C8YJH11 C8YJH1_BPBZ1 衣壳蛋白质 OS =肠杆菌噬菌体 BZ 13 PE = 4SV = 1
[0447] MATLRSFVLVDNGGTGNVTVVPVSNANGVAEWLSNNSRSQAYRVTASYRASGADKRKYTIKLEVPKIVT QTVNGVELPVSAWKAYASIDLTIPIFAATDDVTLISKSLAGLFKIGNPVADAISSQSGFYA
[0448] SEQ ID NO :73
[0449] C8YJH5 C8YJH5_BPBZ1115 肠杆菌噬菌体 bz 13 329853
[0450] >tr I C8YJH5 I C8YJH5_BPBZ1 衣壳蛋白质 OS =肠杆菌噬菌体 BZ13 PE = 4SV = 1
[0451] MATLRSFVLVDNGGTGNVTVVPVSNANGVAEWLSNNSRSQAYRVTASYRASGADKRKYTIKLEVPKIVT QVVNGVELPVSAWKAYASIDLTIPIFAATDDVTVISKSLAGLFKVGDPIADAISSQSGFYA
[0452] SEQ ID NO :74
[0453] Q2V0T4 Q2V0T4_BPTH1115 肠杆菌噬菌体 thl 12029
[0454] >tr I Q2V0T4 I Q2V0T4_BPTH1 外壳蛋白质 OS =肠杆菌噬菌体 TH1 PE = 4SV = 1
[0455] MATLRSFVLVDNGGTGNVTVVPVSNANGVAEWLSNNSRSQAYRVTASYRASGADKRKYTIKLEVPKIVT QVVNGVELPVSAWKAYASIDLTIPIFAATDDVTVISKSLAGLFKVGNPIADAISSQSGFYA
[0456] SEQ ID NO :75
[0457] Q2V0U3 Q2V0U3_BPBZ1116 肠杆菌噬菌体 tl2 332938
[0458] >tr I Q2V0U3 I Q2V0U3_BPBZ1 外壳蛋白质 OS =肠杆菌噬菌体 TL2 PE = 4SV = 1
[0459] MATLRSFVLVDNGGTGNVTVVPVSNANGVAEWLSNNSRSQAYRVTASYRASGADKRKYTIKLEVPKIVT QVVNGVELPVSAWKAYASIDLTIPIFAATDDVTVISKSLAGLFKVGNPIADAISSQSGFYA
[0460] SEQ ID NO :76
[0461] P03614 外壳 _BPFR116 肠杆菌噬菌体 fr 12017
[0462] >sp|P03614|外壳_BPFR外壳蛋白质OS =肠杆菌噬菌体frPE = 1 SV = 4
[0463] MASNFEEFVLVDNGGTCDVKVAPSNFANGVAEWISSNSRSQAYKVTCSVRQSSANNRKYTVKVEVPKVA TQVQGGVELPVAAWRSYMNMELTIPVFATNDDCALIVKALQGTFKTGNPIATAIAANSGIY
[0464] SEQ ID NO :77
[0465] ef 108465 肠杆菌噬菌体 rl7 329852
[0466] gi 1132424616|gb|AB033465. 11 外壳蛋白质[肠杆菌噬菌体 MS2]
[0467] MASNFTQFVLVDNGGTCDVTVAPSNFANGVAEWISSNSRSQAYKVTCSVRQSSAQNRKYTIKVEVPKVA TQTVGGVELPVAAWRSYLNMELTIPIFATNSDCELIVKAMQGLLKDGNPIPSAIAANSGIY
[0468] SEQ ID N0:781QBE
[0469] >sp|P03615|外壳_BPQBE外壳蛋白质OS =肠杆菌噬菌体QP PE = 1SV = 2
[0470] AKLETVTLGNIGKDGKQTLVLNPRGVNPTNGVASLSQAGAVPALEKRVTVSVSQPSRNRKNYKVQVKIQ NPTACTANGSCDPSVTRQAYADVTFSFTQYSTDEERAFVRTELAALLASPLLIDAIDQLNPAY
[0471] 此外，氨基酸残基通过其侧链的特性区分。它们共享共同主链和允许的主链构象 的共同集合（Kleywegt & Jones, Structure 4 1395-1400 (1996))，除了两个例外。甘氨酸 可稳定折叠成对其他氨基酸不允许的主链构象，因为它的侧链由单个氢原子组成。脯氨酸 侧链环化成刚性环，其通过消除其酰胺氢而共价结合至其主链氮，从而使脯氨酸约束于就 其他氨基酸而言的主链构象小子集，并且消除其成为氢键供体的能力。
[0472] 用于装配成衣壳的结构域折叠和结构域结合（例如SEQ ID N0:3的氨基酸序列 通过下述得到稳定：限定其二级结构单位的主链氢键合模式，侧链和一起稳定局部结构或 结合附近二级结构单位（例如螺旋、折叠股、卷曲、环、转角和柔性末端）的主链原子之间 的氢键，一起稳定局部结构或结合附近二级结构单位（例如螺旋、折叠股、卷曲、环、转角和 柔性末端）的不同侧链的原子之间的氢键，和疏水侧链原子的紧密包装，所述原子作用于 通过范德华相互作用在能量上稳定折叠且防止溶剂渗透到折叠内，所述溶剂渗透可能导 致失稳和局部解折叠。剩余残基的侧链不参与结构域折叠维持或结构域-结构域相互作 用。只要它们的主链构象不具有仅由Gly或顺式Pro满足的专门需求，以便参与结构域折 叠，这些残基就可单独或作为组突变，而基本上不影响最终结构域折叠或其表面的总体拓 扑学，并且可通过下述明确地鉴定为类别：对已知结构执行表面可接近性计算（参见例如 Fraczkiewicz&Braun，JMB;MethEnzym;JCompCheml9,319(1998))，随后为已知结构 的氢键分析，蛋白质结构和功能研究中的所有常规技术。
[0473] 使用来自蛋白质数据库的两种MS2衣壳结构用于检查，由C末端与N末端融 合（以形成单链蛋白质2结构域蛋白质）的2个MS2衣壳蛋白质单体形成的含有稳定 八面体衣壳的RNA和2VTU的二十面体衣壳的1AQ3,鉴定17个残基（Alai、Ser2、Thr5、 Gln6、Ala21、Ala53、Val67、Thr69、Thr71、Val72、Val75、Ser99、Glul02、Lysll3、Aspll4、 617115、171"129)，其具有高度溶剂化的侧链位置（?四〇21^6￥；[02&13四1111服务器111^口:/7 curie, utmb. edu/getarea，使用L 4A溶剂探针，无梯度，2个区域/能量/残基）；不参 与和衣壳的其他部分的氢键（在广泛使用的免费软件可视化软件包Chimera(ERICF. PETTERSEN, THOMAS D.GODDARD, CONRAD C.HUANG, GREGORY S.COUCH,DANIELM. GREENBLATT, ELAINE C.MENG, THOMAS E.FERRIN(2004 J Comp Chem 25,1605-1612)中计算 的氢键，伴随松弛0. 5A和30度的氢键标准）；并且所述主链构象由除脯氨酸之外的所有氨 基酸残基允许。当这17个残基的子集与肠杆菌噬菌体MS2的结构比对相比较时，其中忽视 GA和FR衣壳序列以及在肠杆菌噬菌体GA或FR衣壳序列中已突变的残基，留下推定对突变 敏感的6个位置，而不影响单体的结构或功能或者其装配成稳定衣壳的能力。这代表与野 生型肠杆菌噬菌体MS2衣壳蛋白质（SEQ ID N0:3)的52%序列同一性。
[0474] 在二级结构元件（螺旋、折叠股、具有限定氢键合模式的转角和结构化环例如Ω 环）内的残基插入和/或缺失促使这些元件丧失其限定氢键合或疏水包装模式，或迫使其 氢键合或疏水包装模式中的改变，这可改变来自原始蛋白质序列的稳定性、形状和/或功 能。这可破坏包装且影响折叠的总体稳定性。另一方面，具有表面暴露但对蛋白质折叠的 剩余部分不提供关键稳定（通常经由侧链针对结构化元件的包装，或者邻近结构化元件的 相互作用面与溶剂或在衣壳的情况下与货物的屏蔽）的非结构化环、无规卷曲以及N和C 末端是下述的极佳候选物：（1)如果不需要连接的结构化元件的显著再定位，则残基缺失， (2)如果残基的添加不显著改变折叠中的结构化元件的相对处置，或在蛋白质的环境中由 满足其与氢键供体或受体的氢键合能力筛选表面暴露的残基，则氨基酸残基的插入，或（3) 天然存在的一种或多种氨基酸突变或对非天然残基（其可共价连接至有用部分，例如荧光 团、发磷光基团、聚乙二醇、亲和标签、报道基团等）的一种或多种突变的掺入。当然，此类 插入、缺失和突变可同时或以任何组合在单个合适元件内发生，并且其掺入可引起具有改 善特征的蛋白质。区分插入和/或缺失的最佳点的简单方法是就插入和/或缺失扫描紧密 相关序列的多重比对。除N末端和C末端添加和缺失外，已知光滑病毒科外壳蛋白质序列 不具有就彼此而言的插入或缺失。这不意指不发生插入和/或缺失。只是必须检查折叠家 族的更遥远成员的结构/功能。
[0475] 最简单的多重比对算法通常在公众域序列和结构数据库处对普通民众可获得。 如果序列空间通过从高％同一性例如90 %到低％同一性例如20 %的连续序列谱填充，则 这些算法可正确比对共享极低％同一性的序列。当这些簇共享低％同一性时，这些算法 趋于未能正确比对具有相同折叠的序列簇；然而，如果每个簇的一个或多个成员的X射 线晶体结构已得到解决且充分精制，则此类簇可成功且明确比对。通过最佳叠加蛋白质 结构的二级结构元件的主链原子，所述蛋白质通过折叠紧密相关但通过序列遥远相关，明 确限定在其序列之间的一对一对应关系，并且通过简单序列比对方案成功生成的高％同 一性簇可锚定至起因于主链叠加的配对比对，和生成的折叠家族的正确总体序列比对， 从而导致折叠家族成员的拓扑学有意义的比对（Arthur M Lesk, Michael Levitt, Cyrus Chothia(1986), ProtEngl, 77-78)。通过检查总体序列比对，可查看其中折叠可耐受插入和 /或缺失而不损害其形式或功能的全面画面。
[0476] alloleviviridae外壳蛋白质属于与光滑病毒科外壳蛋白质相同的折叠家族（折 叠家族d. 85. 1)，并且也装配成由180个单体组成的二十面体衣壳。图27中的比对表中显 示了 UniProt中保藏的alloleviviridae外壳蛋白质序列的多重比对。百分之六十（60% ) 的alloleviviridae外壳蛋白质序列是保守的。光滑病毒科和alloleviviridae的外壳蛋 白质均长约130个氨基酸，但因为相同残基百分比很低，约20%，所以多重序列比对算法通 常未能正确针对光滑病毒科序列比对alloleviviridae。实现这点的简单方法是使序列逆 转，并且随后使用相同方案比对逆转序列。序列和逆转序列的多重比对将不一致。这个困难 可通过检查代表结构得到避免。allolevividae (PDB-ID:1QBE)(SEQ ID N0:78,参见下 文）衣壳的x射线晶体结构已保藏于公众域数据库RCSB蛋白质数据库（http://www. rcsb. org)中。使用在RCSB蛋白质数据库处的jFATCAT比较工具，通过使{Ca }原子之间的均方 根偏差降到最低，使独立精制的1QBE单体拟合至独立精制的1AQ3单体。均方根偏差在范围 2. 33-2. 76埃中，这取决于比较哪个独立精制的单体，主要是由于连接二级结构元件的N末 端残基1-3以及区段8-18、26-28、50-55和67-76 (编号参考MS2结构1AQ3中的拓扑学等价 的残基）的主链处置中的差异，如图22-25中所示和【专利附图】

【附图说明】中所述。由于相同区域中的 构象差异，对于1AQ3中的独立精制的单体，通过jFATCAT测量的主链均方根偏差为1. 72A。 拓扑学比对显示于表中，对于1AQ3指示通过氢键合模式的二级结构指定（DSSP，W Wolfgang Kabsch & Christian Sander (1983)，Biopolymers22, 2577-2636)，并且或因为精制的主链 构象是基本上不同的，或因为区段太易移动而在精制过程中不能局限于电子密度而显示极 大偏差的区段以小写字母提供。在晶体环境中显示主链柔性的区域也是插入和/或缺失的 极佳候选物，如同这些残基和折叠的剩余部分之间的相互作用对于折叠稳定是重要的，其 电子密度将局限化。对2VTU追加相同信息提供最适于适应改变的区段的进一步了解。这 些比较在图26中象征性捕获，所述图26显示1AQ3相对于2VTU相对于1QBE的比对。
[0477] 1AQ3和1QBE单体的检查提供下述了解，如通过参考图28-31及其各自描述进一步 举例说明的。所有残基编号就1AQ3中的单体而言给出。
[0478] 这还意指相对于1QBE肠杆菌噬菌体外壳蛋白质Qi3的序列，SEQ ID#3肠 杆菌噬菌体MS2外壳蛋白质的折叠保存下至21 %同一性，并且对于此处提及的所有 alloleviviridae外壳蛋白质序列，就保守残基而言为16%同一'I"生。较早计算的高度溶剂 化的侧链位置中的仅一个，侧链不参与和衣壳的其他部分的氢键并且其主链构象由除脯氨 酸之外的所有氨基酸残基允许，保持保守，Y129(在SEQ N0 3编号中）。它的主链位置和侧 链包装在由融合的MS2二聚体（2VTU)形成的八面体肠杆菌噬菌体MS2衣壳结构中基本上 改变。考虑该最后改变使阈值氨基酸序列同一性百分比达到15%。参见图26和图27中的 比对表（1AQ3相对于2VTU相对于1QBE，以及用于说明的allolevi多重序列比对表）。该 段落中的所有相似性百分比均仅在结构锚定比对的情况下是有效的。
[0479] N末端残基1-3可满足其与C末端残基129和水的氢键合潜力，并且反之亦然；因 此，应能够缺失这些残基中的一些或全部，并且由截短的蛋白质形成稳定VLP。图32显示 在装配的衣壳中围绕对称点包装的3个非共价肠杆菌噬菌体MS2非共价二聚体的主链色 带图解。所有N末端颜色均为绿色，C末端颜色均为红色。末端的接近意指单体的序列可 融合成单链，以形成共价二聚体，如通过在另一个后追加一个单体对于2VTU完成的，即产 生由（单体残基1-129-单体残基1-129)组成的单条蛋白质链，或通过在单体序列之间添 加另外的连接残基（单体1-129 -接头残基-单体1-129)，只要相对链方向（从N末端到 C末端）允许由串联单体形成连续肽链。无需添加接头残基的单体-单体串联得到解决 (PDB-ID:2VTU)。在2VTU中，每个非共价二聚体已改造成单个蛋白质；然而，因为残基2和 129的Ca相隔约6埃，所以勉强足够紧密以与连接区段连接，而不扰乱折叠（Ca-Ca距离 约束于约3. 8埃，由于肽单位的共振形式），并且在一些单体中，它们的主链彼此氢键合。每 个二聚体（共价或非共价）的β片层侧形成衣壳的内壁。β片层的几何学可由片层的曲 率限定（Cyrus Chothia，Jiri Novotny, Robert Bruccoleri, Martin Karplus (1985) J Mol Biol 186,651-663)。2VTU中的紧密偶联使β片层约束至较低曲率，从而引起八面体而不 是二十面体衣壳。在单体间掺入0-6个残基的接头将提供允许共价二聚体松弛成二十面体 衣壳相同所需的足够柔性，其中物理性质可能与二十面体非共价衣壳结构更紧密相关。一 般地，接头将是1-6个残基。然而，例如，2VTU的共价二聚体实际上具有在第二拷贝中缺失 的Ser2。在此类情况下，接头长度可以是0。
[0480] 选择用于接头的残基应具有小侧链，以避免可由大量原子包装成相对小体积引起 的立体张力。张力还可通过避免选择具有更小主链构象空间的氨基酸残基例如Pro而降到 最低。避免张力可转变成更快速或更有效折叠的蛋白质。特别是在更长环的中间区段中的 更庞大的和荷电的侧链趋于成为蛋白酶的结合靶标。含Gly接头是优选的。
[0481] 根据图32还明确的是一个单体的C末端可连接至参与附近非共价二聚体的单体 的N末端，并且仍可形成稳定的二十面体衣壳，只要接头具有适当长度和柔性，并且在衣壳 环境中不含可由蛋白酶接近的潜在切割位点。事实上，三个单体可由适当接头连接并仍形 成该衣壳区段。因为图32的黄褐色、灰色和中蓝色单体也是衣壳的不对称单位。具有适当 连接区段的末端至末端串联的三个单体也应能够形成稳定的二十面体衣壳。
[0482] N末端残基1-3可满足其与C末端残基129和水的氢键合潜力，并且反之亦然；因 此，应能够缺失这些残基中的一些或全部，并且由截短的蛋白质或可替代地由通过串联蛋 白质中的缺失数目延长的相应潜在接头长度，形成稳定VLP。
[0483] 相应地，本公开内容包括包含衣壳的VLP，所述衣壳包含这样的衣壳蛋白质，其是 野生型肠杆菌噬菌体MS2衣壳（SEQ ID N0:3)的变体，并且对由肽键水解酶类别EC 3. 4催 化的水解是抗性的。例如，VLP可包含这样的衣壳蛋白质，其具有野生型肠杆菌噬菌体MS2 衣壳（SEQ ID N0:3)的氨基酸序列，除了在第1位处的A残基被缺失之外。VLP可包含这样 的衣壳蛋白质，其具有野生型肠杆菌噬菌体MS2衣壳（SEQ ID N0:3)的氨基酸序列，除了在 第1位处的A残基被缺失和在第2位处的S残基被缺失之外。VLP可包含这样的衣壳蛋白 质，其具有野生型肠杆菌噬菌体MS2衣壳（SEQ ID N0:3)的氨基酸序列，除了在第1位处的 A残基被缺失、在第2位处的S残基被缺失和在第3位处的N残基被缺失之外。VLP可包含 这样的衣壳蛋白质，其具有野生型肠杆菌噬菌体MS2衣壳（SEQ ID N0:3)的氨基酸序列，除 了在第129位处的Y残基被缺失之外。VLP可包含这样的衣壳蛋白质，其具有野生型肠杆 菌噬菌体MS2衣壳（SEQ ID N0:3)的氨基酸序列，但具有在112-117区段中的单个（1个） 氨基酸缺失。VLP可包含这样的衣壳蛋白质，其具有野生型肠杆菌噬菌体MS2衣壳（SEQ ID N0:3)的氨基酸序列，但具有在112-117区段中的单个（1个）氨基酸缺失。VLP可包含这 样的衣壳蛋白质，其具有野生型肠杆菌噬菌体MS2衣壳（SEQ ID N0:3)的氨基酸序列，但具 有在65-83区段中的1-2个残基插入，并且对由肽键水解酶类别EC 3. 4催化的水解是抗性 的。VLP可包含这样的衣壳蛋白质，其具有野生型肠杆菌噬菌体MS2衣壳（SEQ ID N0:3)的 氨基酸序列，但具有在44-55区段中的1-2个残基插入。VLP可包含这样的衣壳蛋白质，其 具有野生型肠杆菌噬菌体MS2衣壳（SEQ ID N0:3)的氨基酸序列，但具有在33-43区段中 的单个（1个）残基插入，并且对由肽键水解酶类别EC 3. 4催化的水解是抗性的。VLP可 包含这样的衣壳蛋白质，其具有野生型肠杆菌噬菌体MS2衣壳（SEQ ID N0:3)的氨基酸序 列，但具有在24-30区段中的1-2个残基插入。VLP可包含这样的衣壳蛋白质，其具有野生 型肠杆菌噬菌体MS2衣壳（SEQ ID NO:3)的氨基酸序列，但具有在10-18区段中的单个（1 个）残基插入。VLP可包含与第二衣壳单体序列串联的衣壳蛋白质单体序列，所述衣壳蛋白 质单体序列装配成对由肽键水解酶类别EC 3. 4催化的水解是抗性的衣壳。VLP可包含其C 末端由0-6残基接头区段延伸的衣壳蛋白质单体序列，所述接头区段的C末端与第二衣壳 单体序列串联，所有这些装配成对由肽键水解酶类别EC 3.4催化的水解是抗性的衣壳。合 适的接头序列包括但不限于-(Gly) X-，其中X是0-6,或Gly-Ser接头例如但不限于-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-、-Gly-Gly-Ser 和-Gly-Ser-Gly-。VLP 还可包含与第三衣壳单体序列 串联的衣壳蛋白质单体序列，所述衣壳蛋白质单体序列装配成对由肽键水解酶类别EC 3. 4 催化的水解是抗性的衣壳。再次，在衣壳蛋白质中，C末端可由0-6残基接头区段延伸，所述 接头区段的C末端与第三衣壳单体序列串联，所有这些装配成对由肽键水解酶类别EC 3. 4 催化的水解是抗性的衣壳。一种或两种接头序列可选自-(Gly)x-，其中X = 0-6,或是选自 -Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-、-Gly-Gly-Ser 和-Gly-Ser-Gly-的 Gly-Ser 接头。例如，在一 种或两种接头序列中，接头是-(Gly) X-，并且X是1、2或3。VLP可包含其N末端截短1_3 个残基的一种或多种外壳蛋白质序列，其中接头序列延长缺失的残基数目，其中接头序列 是-(Gly)x-，其中X = 0-6。例如，VLP可包含其C末端截短1个残基的一种或多种外壳蛋 白质序列，并且随后接头序列延长1个残基，其中接头序列是-(Gly)x-，其中X = 0-6。VLP 可包含两种外壳蛋白质序列，其中在串联二聚体中的第一外壳蛋白质序列C末端截短1个 残基，并且接头序列延长1个残基，或其中在串联三聚体中的第一和/或第二外壳蛋白质序 列C末端截短1个残基，其中接头序列是-(Gly)x-，其中X = 0-6。
[0484] 本文引用的所有专利和出版物包括下文列出的那些均以引用的方式整体并入本 文。
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[0002] acgaaggttc accttcaaga gtttcttcct atgagagccg tacgtcaggt cggtactaac 840 atcaagttag atggccgtct gtcgtatcca gctgcaaact tccagacaac gtgcaacata 900 tcgcgacgta tcgtgatatg gttttacata aacgatgcac gtttggcatg gttgtcgtct 960 ctaggtatct tgaacccact aggtatagtg tgggaaaagg tgcctttctc attcgttgtc 1020 gactggctcc tacctgtagg taacatgctc gagggcctta cggcccccgt gggatgctcc 1080 tacatgtcag gaacagttac tgacgtaata acgggtgagt ccatcataag cgttgacgct 1140 ccctacgggt ggactgtgga gagacagggc actgctaagg cccaaatctc agccatgcat 1200 cgaggggtac aatccgtatg gccaacaact ggcgcgtacg taaagtctcc tttctcgatg 1260 gtccatacct tagatgcgtt agcattaatc aggcaacggc tctctagata gagccctcaa 1320 ccggagtttg aagcatggct tctaacttta ctcagttcgt tctcgtcgac aatggcggaa 1380 ctggcgacgt gactgtcgcc ccaagcaact tcgctaacgg ggtcgctgaa tggatcagct 1440 ctaactcgcg ttcacaggct tacaaagtaa cctgtagcgt tcgtcagagc tctgcgcaga 1500 atcgcaaata caccatcaaa gtcgaggtgc ctaaagtggc aacccagact gttggtggtg 1560 tagagcttcc tgtagccgca tggcgttcgt acttaaatat ggaactaacc attccaattt 1620 tcgctacgaa ttccgactgc gagcttattg ttaaggcaat gcaaggtctc ctaaaagatg 1680 gaaacccgat tccctcagca atcgcagcaa actccggcat ctactaatag acgccggcca 1740 ttcaaacatg aggattaccc atgtcgaaga caacaaagaa gttcaactct ttatgtattg 1800 atcttcctcg cgatctttct ctcgaaattt accaatcaat tgcttctgtc gctactggaa 1860 gcggtgatcc gcacagtgac gactttacag caattgctta cttaagggac gaattgctca 1920 caaagcatcc gaccttaggt tctggtaatg acgaggcgac ccgtcgtacc ttagctatcg 1980 ctaagctacg ggaggcgaat ggtgatcgcg gtcagataaa tagagaaggt ttcttacatg 2040 acaaatcctt gtcatgggat ccggatgttt tacaaaccag catccgtagc cttattggca 2100 acctcctctc tggctaccga tcgtcgttgt ttgggcaatg cacgttctcc aacggtgctc 2160 ctatggggca eaagttgcag gatgcagcgc cttacaagaa gttcgctgaa caagcaaccg 2220 ttaccccccg cgctctgaga gcggctctat tggtccgaga ccaatgtgcg ccgtggatca 2280 gacacgcggt ccgctataac gagtcatatg aatttaggct cgttgtaggg aacggagtgt 2340 ttacagttcc gaagaataat aaaatagatc gggctgcctg taaggagcct gatatgaata 2400 tgtacctcca gaaaggggtc ggtgctttca tcagacgccg gctcaaatcc gttggtatag 2460
[0003] acctgaatga tcaatcgatc aaccagcgtc tggctcagca gggcagcgta gatggttcgc 2520 ttgcgacgat agacttatcg txtgcatccg attccatctc cgatcgcctg gtgtggagtt 2580 ttctcccacc agagctatat tcatatctcg atcgtatccg ctcacactac ggaatcgtag 2640 atggcgagac gatacgatgg gaactatttt ccacaatggg aaatgggttc acatttgagc 2700 tagagtccat gatattctgg gcaatagtca aagcgaccca. aatccatttt ggtaacgccg 2760 gaaccatagg catctacggg gacgatatta tatgtcccag tgagattgca ccccgtgtgc 2820 tagaggcact tgcctactac ggttttaaac cgaatcttcg taaaacgttc gtgtccgggc 2880 tctttcgcga gagctgcggc gcgcactttt accgtggtgt cgatgtcaaa ccgttttaca 2940 tcaagaaacc tgttgacaat ctcttcgccc tgatgctgat attaaatcgg ctacggggtt 3000 ggggagttgt cggaggtatg tcagatccac gcctctataa ggtgtgggta cggctctcct 3060 cccaggtgcc ttcgatgttc ttcggtggga cggacctcgc tgccgactac tacgtagtca 3120 gcccgcctac ggcagtctcg gtatacacca agactccgta cgggcggctg ctcgcggata 3180 cccgtacctc gggtttccgt cttgctcgta tcgctcgaga acgcaagttc ttcagcgaaa 3240 agcacgacag tggtcgctac atagcgtggt tccatactgg aggtgaaatc accgacagca 3300 tgaagtccgc cggcgtgcgc gttatacgca cttcggagtg gctaacgccg gttcccacat 3360 tccctcagga. gtgtgggcca. gcgagctxtc ctcggtagct gaccgaggga cccccgtaaa. 3420 cggggtgggt gtgctcgaaa gagcacgggt gcgaaagcgg tccggctcca ccgaaaggtg 3480 gKCKggcttc ggcccaggga cctcccccta aagagaggac ccgggattct cccgatttgg 3540 taactagctg cttggctagt taccaccca 3569 <210〉 2 <211> 396 <212〉 DNA <213〉肠杆菌噬菌休MS2 <400〉 2 atggcttcta actttactca gttcgttctc gtcgacaatg gcggaactgg cgacgtgact 60 gtcgccccaa gcaacttcgc taacggggtc gctgaatgga tcagctctaa ctcgcgttca 120 caggcttaca aagtaacctg tagcgttcgt cagagctctg cgcagaatcg caaatacacc 180 atcaaagtcg aggtgcctaa agtggcaacc cagactgttg gtggtgtaga gcttcctgta 240 gccgcatggc gttcgtactt aaatatggaa ctaaccattc caattttcgc tacgaattcc 300 gactgcgagc ttattgttaa ggcaatgcaa ggtctcctaa aagatggaaa cccgattccc 360
[0004] tcagcaatcg cagcaaactc cggcatctac taatag 396 <210> 3 <2U> 130 <212> PRT <213〉肠杆菌噬菌体MS2 <400> 3 Met Ala Ser Asn Phe Thr Gin Phe Val Leu Val Asp Asn Gly Gly Thr 15 10 15 Gly Asp Val Thr Val Ala Pi-? Scr Asn Phc Ala Asn Gly Val Ala Glu 20 25 30 ?rp lie Ser Ser Asn Ser Arg Ser Gin Aia Tyr Lys Val I'hr Cys Ser 35 40 45 Val Arg Gin Ser Ser Ala Gin Asn Arg Lys Tyr Thr lie Lys Val Glu 50 55 60 Val Pro Lys Val Ala Thr Gin Thr Val Gly Gly Val Glu Leu Pro Val 65 70 75 80 Ala Ala Trp Arg Ser Tyr Leu Asn Met Glu Leu Thr lie Pro lie Phe 85 90 95 Ala, Thr Asn Ser Asp Cys Glu Leu Tie Val Lys Ala. Met Gin Gly Leu 100 105 110 Leu Lys Asp Gly Asn Pro lie Pro Ser Ala lie Ala Ala Asn Ser Gly 115 120 125 lie Tyr 130 <210> 4 <211〉 36 <212> DNA 〈213〉噬菌体T7 <400〉 4 ctagcataac cccttggggc ctctaaacgg gtcttg 36 <210> 5 <211> 47
[0005] /1 <212> DNA <213〉噬菌体T7 <400〉 5 tagcataacc ccttggggcc tctaaacggg tcttgagggg ttttttg 47 <210> 6 <211> 480 <212> DNA <213〉人工序列 <220〉 <223〉合成的 <400> 6 acaagtttgt acaaaaaagc aggctaagaa ggagatatac atatggcttc taactttact 60 cagttcgttc tcgtcgacaa tggcggaact ggcgacgtga ctgtcgcccc aagcaacttx 120 gctaacgggg tcgctgaatg gatcagctct aactcgcgtt cacaggctta caaagtaacc 180 tgtagcgttc gtcagagctc tgcgcagaat cgcaaataca ccatcaaagt cgaggtgcct Z4U aaagtggcaa cccagactgt tggtggtgta gagcttcctg tagccgcatg gcgttcgtac 300 ttaaatatgg aactaaccat tccaattttc gctacgaatt ccgactgcga gcttattgtt 360 aaggcaatgc aaggtctcct aaaagatgga aacccgattc cctcagcaat cgcagcaaac 420 tccggcatct actaatagac gccggccatt caaacatgag gattacccat gtacccagct 480 <210〉 7 <211> 438 <212> DNA <213〉人工序列 <220〉 <223〉合成的 <400〉 7 acaagtttgt acaaaaaagc aggctaagaa ggagatatac atatggcttc taactttact 60 cagttcgttc tcgtcgacaa tggcggaact ggcgacgtga ctgtcgcccc aagcaacttc 120 gctaacgggg tcgctgaatg gatcagctct aactcgcgtt cacaggctta caaagtaacc 180 tgtagcgttc gtcagagctc tgcgcagaat cgcaaataca ccatcaaagt cgaggtgcct 240 aaagtggcaa cccagactgt tggtggtgta gagcttcctg tagccgcatg gcgttcgtac 300 ttaaatatgg aactaaccat tccaattttc gctacgaatt ccgactgcga gcttattgtt 360 aaggcaatgc aaggtctcct aaaagatgga aacccgattc cctcagcaat cgcagcaaac 420 tccggcatct actaatag 438
[0006] <210〉 8 <211> 179 <212> DNA <213〉人工序列 <220> 〈223>合成的 <400〉 8 ggatcctaat acgactcact ataggcaagc tgaccctgaa gttctcaaga ggaacttcag 60 ggtcagcttg ccaaggccgg catggtccca gcctcctcgc tggcgccggc tgggcaacat 120 tcgtggcgaa tgggaccacg cttcaaacat gaggattacc catgtcgaag cgaccatgg 179 <210〉 9 <211〉 385 <212> DNA <213〉人工序列 <220> 〈223>合成的 <400〉 9 ggatcctaat acgactcact atagggagat aaataaataa atttgaatga acttcagggt 60 cagcttgctg atgaggcgct tcggcgccga aacacccagt ggtgtccaag ctgaccctga 120 agttcattca agagatgaac ttcagggtca gcttgtcggc cggcatggtc ccagcctcct 180 cgctggcgcc ggctgggcaa cattcgtggc gaatgggacc acgcttcaaa catgaggatt 240 acccatgtcg aagcgaattt atttatttaa ttattattat tattattggc cggcatggtc 300 ccagcctcct cgctggcgcc ggctgggcaa caccttcggg tggcgaatgg gaccaaaaaa 360 aaataataat aataataatc catgg 385 <210> 10 <211> 165 <212> DNA <213〉人工序列 <220> 〈223>合成的 <400> 10 taatacgact cactatagca agctgaccct gaagttcatc aagagtgaac ttcagggtca 60 gcttgtcggc cggcatggtc ccagcctcct cgctggcgcc ggctgggcaa cattcgtggc 120 taatgggacc atatatatat acatgaggat tacccatgtc catgg 165
[0007] <210> 11 <2Π > 165 <212〉 DNA <213〉人工序列 <220> <223〉合成的 <400> 11 taatacgact cactatagca agctgaccct gaagttcatc aagagtgaac ttcagggtca 60 gcttgtcggc cggcatggtc ccagcctcct cgctggcgcc ggctggtcaa cattcgtggc 120 gaatgggacc atatatatat acatgaggat tacccatgtc catgg 165 <210〉 12 <211〉 165 <212> DNA <213〉人工序列 <220> 〈223>合成的 <400> 12 taatacgact cactatagca agctgaccct gaagttcatc aaga.gtgaac ttcagggtca 60 gcttgtcggc cggcatggtc ccggcctcct cgctggcgcc ggctgggcaa cattcgtggc 120 gaatgggacc atatatatat acatgaggat tacccatgtc catgg 165 <210> 13 <211> 165 <212> DNA <213〉人工序列 <220〉 <223〉合成的 <400〉 13 taatacgact cactatagca agctgaccct gaagttcatc aagagtgaac ttcagggtca 60 gcttgtcggc cggcatggtc ccagcctcct cgctggcgcc ggctgtgcaa cattcgtggc 120 gaatgggacc atatatatat acatgaggat tacccatgtc catgg 165 <210〉 14 <211〉 165 <212> DNA <213〉人工序列 <220> <223〉合成的
[0008] <400> 14 taatacgact cactatagca agctgaccct, gaagttcatc aagagt.gaac ttcagggtca 60 gcttgtcggc cggcatggtc ccagcctcct cgctggcgcc ggctgggcaa cattcgtggc 120 gagtgggacc atatatatat acatgdggat tacccatgtc catgg 165 <210> 15 <211〉 165 <212> DNA <213〉人工序列 <220〉 <223〉合成的 <400〉 15 taatacgact cactatagca agctgaccct. gaagttcatc aagagtgaac ttcagggtca 60 gcttgtcggc cggcatggtc ccagccttct cgctggcgcc ggctgggcaa cattcgtggc 120 gaatgggacc atatatatat acatgaggat tacccatgtc catgg 165 <210〉 16 <211> 165 <212> DNA <213〉人工序列 <220〉 <223〉合成的 <400> 16 taatacgact cactatagca agctgaccct gaagttcatc aagagtgaac ttcagggtca 60 gcttgtcggc cggcatggtc ccagcctcct cactggcgcc ggctgggcaa cattcgtggc 120 gaatgggacc ata,tatatat acatgaggat tacccatgtc catgg 165 <210〉 17 <211〉 165 <212〉 DNA <213〉人工序列 <220〉 <223〉合成的 <400> 17 taatacgact cactatagca agctgaccct gaagttcatc aagagtgaac ttcagggtca 60 gcttgtcggc cggcatggtc ccagcctcct cgctggcgcc ggctgggcaa cattcgtggc 120 gattgggacc atatatatat acatgaggat tacccatgtc catgg 165 <210> 18
[0009] <211> 165 <212〉 DNA <213〉人工序列 <220〉 <223〉合成的 <400> 18 taatacgact cactatagca agctgaccct gaagttcatc aagagtgaac ttcagggtca 60 gcttgtcggc cggcatggtc ccagcctcct cgctggcgcc ggctgggcaa cattcgtgcc 120 gaatgggacc atatatatat acatgaggat tacccatgtc catgg 165 <210〉 19 <211> 365 <212> DNA <213〉人工序列 <220〉 <223〉合成的 <400 19 ggatcctaat acgactcact atagggagac gttcacgttg aatgaacttc agggtcagct 60 tgctgatgag gcgcttcggc gccgaaacac ccagtggtgt ccaagctgac cctgaagttc 120 attcaagaga tgaacttcag ggtcagcttg tcaccggatg tgctctccgg tctgatgagt 180 ccgtgaggac gaaacaagct gaccctgaag ttcatccgtg aacgacgctt caaacatgag 240 gattacccat gtcgaagcga atatatatat ataggccggc atggtcccag cctcctcgct 300 ggcgccggct gggcaacacc ttcgggtggc gaatgggacc aaaaaaatat atatatatac 360 catgg 365 <210〉 20 <211> 154 <212〉 DNA <213〉人工序列 <220〉 <223〉合成的 <400〉 20 taatacgact cactatagca agctgaccct gaagttcatc aagagtgaac ttcagggtca 60 gcttgtcacc ggatgtgctc tccggtctga tgagtccgtg aggacgaaac aagctgacca 120 tatatatata catgaggatt acccatgtcc atgg 154 <210〉 21 <211〉 159
[0010] <212> DNA 〈213>人工序列 <220> <223〉合成的 <400> 21 taatacgact cactatagca agctgaccct gaagttcatc aagagtgaac ttcagggtca 60 gc.ttgtcacc ggatgtgctc tccggtctga tgagtccgtg aggacgaaac aagctgaccc 120 tgaaatatat atatacatga ggattaccca tgtccatgg 159 <210〉 22 <211〉 164 <212> DNA <213〉人工序列 <220〉 <223〉合成的 <400 22 taatacgact cactatagca agctgaccct gaagttcatc aagagtgaac ttcagggtca 60 gcttgtcacc ggatgtgctc tccggtctga tgagtccgtg aggacgaaac aagctgaccc 120 tgaagttcaa tatatatata catgaggatt acccatgtcc atgg 164 <210〉 23 <211〉 166 <212> DNA <213〉人丄序列 <220〉 <223〉合成的 <400> 23 taatacgact cactatagca agctgaccct gaagttcatc aagagtgaac ttcagggtca 60 gcttgtcacc ggatgtgctc tccggtctga tgagtccgtg aggacgaaac aagctgaccc 120 tgaagttcac tatatatata tacatgagga ttacccatgt ccatgg 166 <210> 24 <211〉 169 <212> DNA <213〉人工序列 <220〉 〈223>合成的 <400〉 24 taatacgact cactatagca agctgaccct gaagttcatc aagagtgaac ttcagggtca 60
[0011] gcttgtcacc ggatgtgctc tccggtctga tgagtccgtg aggacgaaac aagctgaccc 120 tgaagttcac tcttatatat atatacatga ggattaccca tgtccatgg 169 <210> 25 <211> 171 <212〉 DNA 〈213〉人工序列 <220〉 <223〉合成的 <400> 2δ taatacgact cactatagca agctgaccct gaagttcatc aagagtgaac ttcagggtca 60 gcttgtcacc ggatgtgctc tccggtctga tgagtccgtg aggacgaaac aagctgaccc 12U tgaagttcac tcttgaatat atatatacat gaggattacc catgtccatg g 171 <210〉 26 <211> 244 <212〉 DNA <213〉人工序列 /oon\ <223^合成的 <400> 26 ggatcctaat acgactcact atagggatct cccagcctcc tcgctggcgc cggctgggca 60 acattcgtgg cgaatggggg atcatatctt gatgaacttc agggtcagct tgctgatgag 120 gcgcttcggc gccgaaacac cgtgtccaag ctgaccctga agttcatcaa gaatgaactt 180 cagggtcagc ttgtcggccg gcatgcattc aaacatgagg attacccatg tcgaagttaa 240 ttaa 241 <210〉 27 <211> 615 <212> DNA 〈213>人工序列 <220〉 <223〉合成的 <400〉 27 ggatcctaat acgactcact atagggagac ttgatgaact tcagggtcag cttgctgatg 60 aggcgcttcg gcgccgaaac acccagtggt gtccaagctg accctgaagt tcatcaagaa 120 tgaacttcag ggtcagcttg tcaccggatg tgctctccgg tctgatgagt ccgtgaggac 180 gaaacaagct gaccctgaag ttcattatat cttggcagat gaacttcagg gtcagctgat 240
[0012] gagactcttc ggagtcgaaa cacccagtgg tgtcctgacc ctgaagttca tctgccaaga 300 gcagatgaac ttcagggtca gtcaccggat gtgctctccg gtctgatgag tccgtgagga 360 cgaaactgac cctgaagttc atctgctata tcttgtggtg cagatgaact tcagggctga 420 tgaggctctt cggagccgaa acacccagtg gtgtcccctg aagttcatct gcaccacaag 480 atggtgcaga tgaacttcag ggtcaccgga tgtgctctcc ggtctgatga gtccgtgagg 540 acgaaaccct gaagttcatc tgcaccatac gccggccatt caaacatgag gattacccat 600 gtcgaagtta attaa 615 <210> 28 <211> 431 <212> DNA <213〉人工序列 <220〉 <223〉合成的 <400〉 28 ggatcctaat acgactcact atagggagaa tatatataca agctgaccct gaagttcatc 60 aagaatgaac ttcagggtca gcttgtcggc cggcatggtc ccagcctcct cgctggcgcc 120 ggctgggcaa cattcgtggc gaatgggacc aattaattac tgaccctgaa gttcatctgc 180 caagagcaga tgaacttcag ggtcagtcgg ccggcatggt cccagcctcc tcgctggcgc 240 cggctgggca acattcgtgg cgaatgggac caataataat ccctgaagtt catctgcacc 300 acaagatggt gcagatgaac ttcagggtcg gccggcatgg tcccagcctc ctcgctggcg 360 ccggctgggc aacattcgtg gcgaatggga cccattcaaa catgaggatt acccatgtcg 420 aagttaatta a 431 <210〉 29 <211〉 362 <212> DNA <213〉人工序列 <220〉 <223〉合成的 <400> 29 ggatcctaat acgactcact atagggagaa tgaacttcag ggtcagcttg ctgatgaggc 60 gcttcggcgc cgaaacaccg tgtccaagct gaccctgaag ttcatggccg gcatggtccc 120 agcctcctcg ctggcgccgg ctgggcaaca ttcgtggcga atgggaccat tagccaagct 180
[0013] gaccctgaag ttcatctgat gagactccga attcggagtc gaaacacggt aaccgtgtca 240 tgaacttcag ggtcagcttg gcggccggca tggtcccagc ctcctcgctg gcgccggctg 300 ggcaacattc gtggcgaatg ggacccattc aaacatgagg attacccatg tcgaagccat 360 gg 362 <210〉 30 <211〉 196 <212〉 DNA <213〉人工序列 <220〉 <223〉合成的 <400〉 30 ggatcctaat acgactcact atagggagaa ataataatca agctgaccct gaagttcatc 60 aagaatgaac ttcagggtca gcttgtcaat aataatccgc taccccgacc acatgaacaa 120 gattcatgtg gtcggggtag cggtcaataa taatacgctt caaacatgag gattacccat 180 gtcgaagcga ccatgg 196 <210〉 31 <211〉 165 <212〉 DNA <213〉人工序列 <220〉 <M3>合成的 <400> 31 taatacgact cactataggc ttgtgatgct tcagccaaat caagagtttg gctgaagcat 60 cacaagcggc cggcatggtc ccagcctcct cgctggcgcc ggctgggcaa cattcgtggc 120 gaatgggacc atatatatat acatgaggat tacccatgtc catgg 165 <210〉 32 <211〉 168 <212> DNA <213〉人工序列 <220> <223>合成的 <400> 32 taatacgact cactataggc tcgagcaagc ctgatgaggc gcttcggcgc cgaaacaccg 60 tgtcgcttgt gatgcttcag ccaaatcaag agtttggctg aagcatcaca. agctcaccgg 120 at.gtgctctc cggtctgatg agtccgtgag gacgaaagct tgccatgg 168
[0014] <210> 33 <211> 251 <212〉 DNA <213〉人工序列 <220> <223〉合成的 <400> 33 taatacgact cactataggg agaacgccgg ccattcaaat agtaaataat agagggtcag 60 cttgctgatg aggcgcttcg gcgccgaaac accgtgtcca agctgaccct gaagttcatc 120 aagagtgaac ttcagggtca gcttgtcacc ggatgtgctc tccggtctga tgagtccgtg 180 aggacgaaac aagctgaccc tgaagttcac tacgccggcc attcaaacat gaggattacc 240 catgtccatg g 251 <210〉 34 <211> 129 <212〉 PRT <213〉肠杆菌噬菌体MS2 <400〉 34 Ala Ser Asn Phe Thr Gin Phe Val Leu Val Asp Asn Gly Gly Thr Gly 15 10 15 Asp Val Thr Val Ala Pro Ser Asn Phe Ala Asn Gly Val Ala Glu Trp 20 25 30 lie Ser Ser Asn Ser Arg Ser Gin Ala Tyr Lys Val Thr Cys Ser Val 35 40 45 Arg Gin Ser Ser Ala Gin Asn Arg Lys Tyr Ser lie Lys Val Glu Val 50 55 60 Pro Lys Val Ala Thr Gin Thr Val Gly Gly Val Glu Leu Pro Val Ala 65 70 75 80 Ala Trp Arg Ser Tyr Leu Asn Met Glu Leu Thr lie Pro lie Phe Ala 85 90 95 Thr Asn Ser Asp Cys Glu Leu lie Val Lys Ala Met Gin Gly Leu Leu 100 105 110
[0015] Lys Asp Gly Asn Pro lie Pro Ser Ala lie Ala Ala Asn Ser Gly lie 115 120 125 Tyr <210〉 35 <211〉 129 <212〉 PRT <213〉肠杆菌噬菌体GA <400〉 35 Ala Thr Leu Arg Ser Pbe Val Leu Val Asp Asn Gly Gly Thr Gly Asn 15 10 15 Val Thr Val Val Pro Val Ser Asn Ala Asn Gly Val Ala Glu Trp Leu 20 25 30 Ser Asn Asn Ser Arg Ser Gin Ala Tyr Arg Val Thr Ala Ser Tyr Arg 35 40 45 Ala Ser Gly Ala Asp Lys Arg Lys Tyr Thr lie Lvs Leu Glu Val Pro 50 55 60 Lys lie Val Thr Gin Val Val Asn Gly Val Glu Leu Pro Gly Ser Ala 65 70 75 80 Trp Lys Ala Tyr Ala Ser lie Asp Leu Thr lie Pro lie Phe Ala Ala 85 90 95 Thr Asp Asp Val Thr Val lie Ser Lys Ser Leu Ala Gly Leu Phe Lys 100 105 110 Val Gly Asn Pro lie Ala Glu Ala lie Ser Ser Gin Ser Gly Phe Tyr 115 120 125 Ala <210〉 36 <211〉 129 <212> PRT <213〉肠杆菌噬菌体FR <400〉 36
[0016] Ala Ser Asn Phe Glu Glu Phe Val Leu Val Asp Asn Gly Gly Thr Gly 1 5 10 15 Asp Val Lys Val Ala Pro Ser Asn Phe Ala Asn Gly Yal Ala Glu Trp 20 25 30 lie Ser Ser Asn Ser Arg Ser Gin Ala Tyr Lys Val Thr Cys Ser Yal 35 40 45 Arg Gin Ser Ser Ala Asn Asn Arg Lys Tyr Thr Val Lys Val Glu Val 50 55 60 Pro Lya Val Ala Thr Gin Val Gin Gly Gly Val Glu Leu Pro Val Ala 65 70 75 80 Ala Trp Arg Ser Tvr Met Asn Met Glu Leu Thr lie Pro Val Phe Ala 85 90 95 Thr Asn Asp Asp Cys Ala Leu lie Val Lys Ala Leu Gin Gly Thr Phe 100 105 110 Lys Thr Gly Asn Pro lie Ala Thr Ala lie Ala Ala Asn Ser Gly He 115 120 125 Tyr <210〉 37 <211〉 257 <212〉 PRT <213〉肠杆菌噬菌体MS2 <400> 37 Ala Ser Asn Phe Thr Gin Phe Val Leu Val Asp Asn Gly Gly Thr Gly 15 10 15 Asp Val Thr Val Ala Pro Ser Asn Phe Ala Asn Gly Val Ala Glu Trp 20 25 30 lie Ser Ser Asn Ser Arg Ser Gin Ala Tyr Lys Val Thr Cys Ser Val 35 40 45 Arg Gin Ser Ser Ala Gin Asn Arg Lys Tyr Thr lie Lys Val Glu Val
[0017] 50 55 60 Pro Lys Val Ala Thr Gin Thr Val Gly Gly Val Glu Leu Pro Val Ala 65 70 75 80 Ala Trp Arg Ser Tyr Leu Asn Met Glu Leu Thr lie Pro lie Phe Ala 85 90 95 Thr Asn Scr Asp Cys Glu Leu lie Val Lys Ala Met Gin Gly Leu Leu 100 105 110 Lys Asp Gly Asn Pro lie Pro Ser Ala lie Ala Ala Asn Ser Gly lie 115 120 125 Tyr Ala Asn Phe Thr Gin Phe Val Leu Val Asp Asn Gly Gly Thr Gly 130 135 14-0 Asp Val Thr Val Ala Pro Ser Asn Phe Ala Asn Gly Val Ala Glu Trp 145 150 155 160 lie Ser Ser Asn Ser Arg Ser Gin Ala Tyr Lys Val Thr Cys Ser Val 165 170 175 Arg Gin Ser Ser Ala Gin Asn Arg Lys Tyr Thr lie Lys Va] Glu Val 180 185 190 Pro Lys Val Ala Thr Gin Thr Val Gly Gly Val Glu Leu Pro Val Ala 195 200 205 Aia Trp Arg Ser Tyr Leu Asn Met G丄ii Leu Thr 丄丄e Pro 丄丄e Phe Ala 210 215 220 Thr Asn Ser Asp Cys Glu Leu lie Val Lys Ala Met Gin Gly Leu Leu 225 230 235 240 Lys Asp Gly Asn Pro lie Pro Ser Ala lie Ala Ala Asn Ser Gly lie 245 250 255 Tyr <210〉 38 <211〉 130
[0018] Met Ala Ser Asn Phe Thr Gin Phe Val Leu Val Asp Asn Gly Gly Thr 15 10 15 <212〉 PRT <213〉肠杆菌噬菌体MS2 <400> 38 Gly Asp Val Thr Val Ala Pro Ser Asn Phe Ala Asn Gly Val Ala Glu 20 25 30 Trp lie Ser Ser Asn Ser Arg Ser Gin Ala Tyr Lys Val Thr Cys Ser 35 40 45 Val Arg Gin Ser Ser Ala Gin Asn Arg Lys Tyr Thr Tie Lys Val Glu 50 55 60 Val Pro Lys Val Ala Thr Gin Thr Val Gly Gly Val Glu Leu Pro Val 65 70 75 80 Ala Ala --ρ Arg Ser Tyr Leu Asn Leu Glu Leu Thr 丄丄e Pro 丄丄e Phe 85 90 95 Ala Thr Asn Ser Asp Cys Glu Leu lie Val Lys Ala Met Gin Gly Leu 100 105 110 Leu Lys Asp Gly Asn Pro lie Pro Ser Ala lie Ala Ala Asn Ser Gly 115 120 125 lie Tyr 130 <210〉 39 <211〉 120 <212〉 PRT <213〉肠杆菌噬菌体MS2 <400> 39 Met Ala Scr Asn Phe Thr Gin Phe Val Leu Val Asp Asn Glv Gly Thr 1 5 10 15 Gly Asp Val Thr Val Ala Pro Ser Asn Phe Ala Asn Gly Val Ala Glu 20 25 30 Trp lie Ser Ser Asn Ser Arg Ser Gin Ala Tyr Lys Val Thr Cys Ser
[0019] 35 40 45 Val Arg Gin Ser Ser Ala Gin Asn Arg Lys Tyr Thr lie Lys Val Glu 50 55 60 Val Pro Lys Val Ala Thr Gin Thr Val Gly Gly Val Glu Leu Pro Val 65 70 75 80 Ala Ala Trp Arg Ser Tyr Leu Asn Leu Glu Leu Thr lie Pro lie Phe 85 90 95 Ala Thr Asn Ser Asp Cys Glu Leu lie Val Lys Ala Met Gin Gly Leu 100 105 110 Leu Lys Asp Gly Asn Pro lie Pro 115 120 <210> 40 <211〉 130 <212〉 PRT 〈213〉肠杆菌噬菌体MS2 <400> 40 Met Ala Ser Asn Phe Thr Gin Phe Val Leu Val Asp Asn Gly Gly Thr 1 5 10 15 Gly Asp Val Thr Val Ala Pro Ser Asn Phe Ala Asn Gly Val Ala Glu 20 25 30 Trp lie Ser Ser Asn Ser Arg Ser Gin Ala Tyr Lys Val Thr Cys Ser 35 40 45 Val Arg Gin Ser Ser Ala Gin Asn Arg Lys Tyr Thr lie Lys Val Glu 50 55 60 Leu Pro Lys Val Ala Thr Gin Thr Val Glv Gly Val Glu Leu Pro Val 65 70 75 80 Ala Ala Trp Arg Ser Tyr Leu Asn Met Glu Leu Thr lie Pro lie Phe 85 90 95 Ala Thr Asn Ser Asp Cys Glu Leu lie Val Lys Ala Met Gin Gly Leu 100 105 110
[0020] Leu Lys Asp Gly Asn Pro lie Pro Ser Ala lie Ala Ala Asn Ser Gly 115 120 125 lie Tyr 130 <210> 41 <211> 130 <212〉 PRT <213〉肠杆菌噬菌体MS2 <400〉 41 Met Ala Ser Asn Phe Thr Gin Phe Val Leu Val Asp Asn Gly Gly Thr 1 5 10 15 Gly Asp Val Thr Val Ala Pro Ser Asn Phe Ala Asn Gly Val Ala Glu 20 25 30 Trp lie Ser Ser Asn Ser Arg Ser Gin Ala Tyr Lys Val Thr Cys Ser 35 40 45 Yal Arg Gin Ser Ser Ala Gin Asn Arg Lys Tyr Thr He Lys Val Glu 50 55 60 Yal Pro Lys Val Ala Thr Gin Thr Yal Gly Gly Val Glu Leu Pro Val 65 70 75 80 Ala Ala Trp Arg Ser Tyr Leu Asn Yal Glu Leu Thr lie Pro lie Phe 85 90 95 Ala Thr Asn Ser Asp Cys Glu Leu lie Val Lys Ala Met Gin Gly Leu 100 105 110 Leu Lys Asp Gly Asn Pro lie Pro Ser Ala lie Ala Ala Asn Ser Gly 115 120 125 lie Tyr 130 <210〉 42 <211> 130 <212〉 PRT <213〉肠杆菌噬菌体MS2
[0021] Met Ala Ser Asn Phe Thr Gin Phe Val Leu Val Asp Asn Gly Gly Thr 1 5 10 15 <400> 42 Gly Asp Val Thr Val Ala Pro Ser Asn Phe Ala Asn Gly Val Ala Glu 20 25 30 Trp lie Ser Ser Asn Ser Arg Ser Gin Ala Tyr Lys Val Thr Cys Ser 35 40 45 Val Arg Gin Ser Ser Ala Gin Asn Arg Lys Tyr Thr lie Lys Val Glu 50 55 60 Val Pro Lys Val Ala Thr Gin Thr Val Gly Gly Val Glu Leu Pro Val 65 70 75 80 Ala Ala Trp Arg Ser Tyr Leu Asn Met Glu Leu Thr lie Pro lie Phe 85 90 95 Ala Thr Asn Pro Asp Cys Glu Leu lie Val Lys Ala Met Gin Gly Leu 100 105 110 Leu Lys Asp Gly Asn Pro lie Pro Ser Ala lie Ala Ala Asn Ser Gly 115 120 125 lie Tyr 130 <210〉 43 <211〉 130 <212> PRT <213〉肠杆菌噬菌体MS2 <400> 43 Met Ala Ser Asn Phe Thr Gin Phe Val Leu Val Asp Asn Gly Gly Thr 15 10 15 Gly Asp Val Ala Val Ala Pro Ser Asn Phe Ala Asn Gly Val Ala Glu 20 25 30 Trp lie Ser Ser Asn Ser Arg Ser Gin Ala Tyr Lys Yal Thr Cys Ser 35 40 45
[0022] ￥al Arg Gin Ser Ser Ala Gin Asn Arg Lys Tyr Thr lie Lys Val Glu 50 55 60 Val Pro Lys Val Ala Thr Gin Thr Val Gly Gly Val Glu Leu Pro Val 65 70 75 80 Ala Ala Trp Arg Ser Tyr Leu Asn Met Glu Leu Thr lie Pro lie Phe 85 90 95 Ala Thr Asn Ser Asp Cys Glu Leu lie Val Lys Ala Met Gin Glv Leu 100 105 110 Leu Lys Asp Gly Asn Pro lie Pro Ser Ala lie Ala Ala Asn Ser Gly 115 120 125 lie Tyr 130 <210〉 44 <211> 130 <212〉 PRT <213〉肠杆菌噬菌体MS2 <220> <221> misc-feature <222> (50)..(50) <223〉Xaa可以是任何天然发生的氨基酸 <400> 44 Met Ala Ser Asn Phe Thr Gin Phe Val Leu Val Asp Asn Gly Gly Thr 15 10 15 Gly Asp Val Thr Val Ala Pro Ser Asn Phe Ala Asn Gly Val Ala Glu 20 25 30 Trp lie Ser Ser Asn Ser Arg Ser Gin Ala Tyr Lys Val Thr Cys Ser 35 40 45 Val Xaa Gin Ser Ser Ala Gin Asn Arg Lys Tyr Thr lie Lys Val Glu 50 55 60 Val Pro Lys Val Ala Thr Gin Thr Val Gly Gly Val Glu Leu Pro Val 65 70 75 80
[0023] Ala Ala Trp Arg Ser Tyr Leu Asn Met Glu Leu Thr lie Pro lie Phe 85 90 95 Ala Thr Asn Ser Asp Cys Glu Leu lie Val Lys Ala Met Gin Gly Leu 100 105 110 Leu Lys Asp Gly Asn Pro lie Pro Ser Ala lie Ala Ala Asn Ser Gly 115 120 125 lie Tyr 130 <210〉 45 <211〉 130 <212> PRT <213〉肠杆菌噬菌体MS2 <220〉 <221> misc feature <222> (7) (7) <223〉Xaa^j以是任何天然发生的氨基酸 <400> 45 Met Ala Ser Asn Phe Thr Xaa Phe Val Leu Val Asp Asn Gly Glv Thr 15 10 15 Gly Asp Val Thr Val Ala Pro Ser Asn Phe Ala Asn Gly Val Ala Glu 20 25 30 Trp lie Ser Ser Asn Ser Arg Ser Gin Ala Tyr Lys Val Thr Cys Ser 35 40 45 Val Arg Gin Ser Ser Ala Gin Asn Arg Lys Tyr Thr lie Lys Val Glu 50 55 60 Val Pro Lys Val Ala Thr Gin Thr Val Gly Gly Val Glu Leu Pro Val 65 70 75 80 Ala Ala Trp Arg Ser Tyr Leu Asn Met Glu Leu Thr lie Pro lie Phe 85 90 95 Ala Thr Asn Ser Asp Cys Glu Leu lie Val Lys Ala Met Gin Glv Leu 100 105 110
[0024] Leu Lys Asp Gly Asn Pro lie Pro Ser Ala lie Ala Ala Asn Ser Gly 115 120 125 lie Tyr 130 <210> 46 <211〉 130 <212> PRT <213〉肠杆菌噬菌体B01 <400〉 46 Met Ala vSer Asn Phe Thr Gin Phe Val Leu Val Asp Asn Gly Gly Thr 15 10 15 Gly Asp Val Thr Val Ala Pro Ser Asn Phe Ala Asn Gly Val Ala Glu 20 25 30 Trp lie Ser Ser Asn Ser Arg Ser Gin Ala Tyr Lys Val Thr Cys Ser 35 40 45 Val Arg Gin Ser Ser Ala Gin Asn Arg Lys Tyr Thr lie Lys Yal Glu 50 55 60 Val Pro Lys Val Ala Thr Gin Thr Val Gly Gly Val Glu Leu Pro Val 65 70 75 80 Ala Ala Trp Arg Ser Tyr Leu Asn Met Glu Leu Thr lie Pro lie Phe 85 90 95 Ala Thr Asn Ser Asp Cys Glu Leu lie Vai bys Aia Met Gin Gly Pro 100 105 110 Leu Lys Asp Gly Asn Pro lie Pro Ser Ala lie Ala Ala Asn Ser Gly 115 120 125 lie Tyr 130 <210〉 47 <211〉 130 <212> PRT <213〉肠杆菌噬菌体MS2 <400> 47
[0025] Met Ala Ser Asn Phe Thr Gin Phe Val Leu Val Asp Asn Asp Gly Thr 15 10 15 Gly Asp Val Thr Val Ala Pro Ser Asn Phe Ala Asn Gly VaJ Ala C Lu 20 25 30 Trp lie Ser Ser Asn Ser Arg Ser Gin Ala Tyr Lys Yal Thr Cys Ser 35 40 45 Val Arg Gin Ser Ser Ala Gin Asn Arg Lys Tyr Thr lie Lys Val Glu 50 55 60 Val Pro Lys Vai Ala Thr Gin Thr Vai Gly Gly Val Glu Leu Pro Vai 65 70 75 80 Ala Ala Trp Arg Ser Tyr Leu Asn Met Glu Leu Thr lie Pro lie Phe 85 90 95 Ala Thr Asn Ser Asp Cys Glu Leu He Val Lys Ala Met Gin Gly Leu 100 105 110 Leu Lys Asp Gly Asn Pro lie Pro Scr Ala lie Ala Ala Asn Scr Gly 115 120 125 lie Tyr 130 <210> 48 〈211〉 130 <212〉 PRT <213〉肠杆菌噬菌体MS2 <220> <221> misc-feature <222〉 (18)7. (18) <223〉Xaa可以是任何天然发生的氨基酸 <400> 48 Met Ala Ser Asn Phe Thr Gin Phe Val Leu Val Asp Asn Gly Gly Thr 15 10 15 Gly Xaa Val Thr Val Ala Pro Ser Asn Phe Ala Asn Gly Val Ala Glu 20 25 30
[0026] Trp He Ser Ser Asn Ser Arg Ser Gin Ala Tyr Lys Val Thr Cys Ser 35 40 45 Val Arg Gin Ser Ser Ala Gin Asn Arg Lys Tyr Thr lie Lys Val Glu 50 55 60 Val Pro Lys Val Ala Thr Gin Thr Val Gly Gly Val Glu Leu Pro Val 65 70 75 80 Ala Ala Trp Arg Ser Tyr Leu Asn Met Glu Leu Thr lie Pro lie Phe 85 90 95 Ala Thr Asn Ser Asp Cys Glu Leu lie Val Lys Ala Met Gin Gly Leu 100 105 110 Leu Lys Asp Gly Asn Pro lie Pro Ser Ala lie Ala Ala Asn Ser Gly 115 120 125 lie Tyr 130 <210〉 49 <211〉 130 <212> PRT <213〉肠杆菌噬茼体MS2 <400> 49 Met Ala Ser Asn Phe Thr Gin Phe Val Leu Val Asp Asn Gly Gly Thr 15 10 15 Gly Asp Val Thr Val Ala Pro Ser Asn Phe Ala Asn Gly Val Ala Glu 20 25 30 Trp lie Ser Scr Asn Sdr Arg Scr Gin Ala Tyr Lys Val Thr Cys Scr 35 40 45 Val Arg Gin Ser Ser Ala Gin Asn Arg Lys Tyr Thr lie Lys Val Glu 50 55 60 Val Pro Lys Val Ala Thr Gin Thr Val Gly Gly Val Glu Leu Pro Val 65 70 75 80 Ala Ala Trp Arg Ser Tyr Leu Asn Leu Glu Leu Thr lie Pro lie Phe
[0027] 85 90 95 Ala Thr Asn Pro Asp Cys Glu Leu lie Val Lys Ala Met Gin Gly Leu 100 105 110 Leu I.ys Asp Gly Asn Pro Tie Pro Ser Ala ile Ala Ala Asn Ser Gly 115 120 125 lie Tyr 130 <210〉 50 <211〉 130 <212〉 PRT <213〉肠杆菌噬菌体MS2 <400> 50 Met Ala Ser Asn Phe Thr Gin Phe Val Leu Val Asp Asn Gly Gly Thr 15 10 15 Gly Asp Val Thr Val Ala Pro Ser Asn Phe Ala Asn Gly Val Ala Glu 20 25 30 Trp Ile Ser Ser Asn Ser Arg Ser Gin Ala Tyr Lys Val Thr Cys Ser 35 40 45 Val Arg Gin Ser Ser Aia G丄n Asn Arg Lys Tyr Thr 丄ie Lys Vai Glu 50 55 60 Val Pro Lys Val Ala Thr Gin Thr Val Gly Gly Val Glu Leu Pro Val 65 70 75 80 Ala Ala Trp Arg Ser Tyr Leu Asn Met Glu Leu Thr Ile Pro lie Phe 85 90 95 Ala Thr Asn Scr Asp Cys Glu Leu lie Val Lys Ala Met Gin Gly Leu 100 105 110 Leu Lys Asp Gly Asn Pro Ile Ser Ser Ala Ile Ala Ala Asn Ser Gly 115 120 125 Ile Tyr 130
[0028] <210> 51 <211〉 130 <212> PRT <213〉肠杆菌噬菌体MS2 <220〉 <221> misc-feature <222> (1047.. (104) <223〉Xaa可以是仟何天然发牛的氨基酸 <400〉 51 Met Ala Ser Asn Phe Thr Gin Phe Val Leu Val Asp Asn Gly Gly Thr 15 10 15 Gly Asp Val Thr Val Ala Pro Ser Asn Phe Ala Asn Gly Val Ala Glu 20 25 30 Trp lie Ser Ser Asn Ser Arg Ser Gin Ala Tyr Lys Val Thr Cys Ser 35 40 45 Val Arg Gin Ser Ser Ala Gin Asn Arg Lys Tyr Thr lie Lys Val Glu 50 55 60 Val Pro Lys Val Ala Thr Gin Thr Val Gly Gly Val Glu Leu Pro Val 65 70 75 80 Ala Ala Trp Arg Ser Tyr Leu Asn Val Glu Leu Thr lie Pro He Phe 85 90 95 Ala Thr Asn Ser Asp Cys Glu Xaa lie Val Lys Ala Met Gin Gly Leu 100 105 110 Leu Lys Asp Gly Asn Pro lie Pro Ser Ala lie Ala Ala Asn Ser Gly 115 120 125 lie Tyr 130 <210〉 52 <211〉 130 <212> PRT <213〉肠杆菌噬菌体MS12 <220〉
[0029] <221> misc-feature <222> (22) (22) <223〉Xaa可?以甚任何天然发生的氨基酸 <400〉 52 Met Ala Ser Asn Phe Thr Gin Phe Val Leu Val Asp Asn Gly Gly Thr 15 10 15 Gly Asp Val Thr Val Xaa Pro Ser Asn Phe Ala Asn Gly Val Ala G_Lu 20 25 30 Trp Tie Ser Ser Asn Ser Arg Ser Gin Ala Tyr Lys Val Thr Cys Ser 35 40 45 Val Arg Gin Ser Ser Ala G]n Asn Arg Lys Tyr Thr He Lys Val Glu 50 55 60 Val Pro Lys Val Ala Thr Gin Thr Val Gly Gly Val Glu Leu Pro Val 65 70 75 80 Ala Ala Trp Arg Ser Tvr Leu Asn Met Glu Leu Thr lie Pro lie Phe 85 90 95 Ala Thr Asn Ser Asp Cvs Ala Leu lie Val Lys Ala Met Gin Glv Leu 100 105 110 Leu Lys Asp Gly Asn Pro 丄le Pro Ser Ala He A_La Asn Ser Gly 115 120 125 lie Tyr 130 <210> 53 <211〉 130 <212> PRT <213〉肠杆菌噬菌体MS2 <220〉 <221> misc_feature <222〉 （130)-.. (130) <223> Xaa可以是任何天然发生的氨基酸 <400> 53 Met, Ala Ser Asn Phe Thr Gin Phe Val Leu Val Asp Asn Gly Glv Thr 15 10 15
[0030] Gly Asp ￥al Thr Val Ala Pro Ser Asn Phe Ala Asn Gly Val Ala Glu 20 25 30 Trp lie Ser Ser Asn Ser Arg Ser Gin Ala Tyr Lys Val Thr Cys Ser 35 40 45 Val Arg Gin Sor Scr Ala Gin Asn Arg Lys Tyr Thr lie Lys Val Glu 50 55 60 Val Pro Lys Val Ala Thr Gin Thr Val Gly Gly Val Glu Leu Pro Val 65 70 75 80 Ala Ala Trp Arg Ser Tyr Leu Asn Val Glu Leu Thr lie Pro lie Phe 85 90 95 Ala Thr Asn Ser Asp Cys Glu Leu lie Val Lys Ala Met Gin Glv Leu 100 105 110 Leu Lys Asp Gly Asn Pro lie Pro Ser Ala lie Ala Ala Asn Ser Gly 115 120 125 lie Xaa 130 <210> 54 <211〉 130 <212> PRT <213〉肠杆菌噬菌体MS2 <220> <221> misc-feature (?ηΥ (} <223丨1船可^是任何天然发生的氨基酸 <400> 54 Met Ala Ser Asn Phe Thr Gin Phe Val Leu Val Asp Asn Gly Glv Thr 15 10 15 Gly Asp Val Thr Val Ala Pro Ser Asn Phe Ala Asn Gly Yal Ala Glu 20 25 30 Trp lie Ser Ser Asn Ser Arg Ser Gin Ala Tyr Lys Val Thr Cys Ser 35 40 45
[0031] Val Arg Gin Ser Ser Ala Gin Asn Arg Lys Tyr Thr lie Lys Val Glu 50 55 60 Val Pro Lys Val Ala Thr Gin Thr Val Gly Gly Val Glu Leu Pro Val 65 70 75 80 Ala Ala Trp Arg Ser Tyr Leu Asn Val Glu Leu Thr lie Pro lie Phe 85 90 95 Ala Thr Asn Ser Asp Cys Glu Leu lie Val Lys Ala Met Gin Gly Leu 100 105 110 Leu Lys Asp Gly Asn Pro lie Pro Ser Ala lie Ala Ala Asn Ser Gly 115 120 125 lie Xaa 130 <210> 55 <211〉 130 <212〉 PRT <213〉肠杆菌噬菌体MS2 <400〉 55 Met Ala Ser Asn Phe Thr Gin Phe Val Leu Val Asp Asn Gly Gly Thr 15 10 15 Gly Asp Val Thr Val Ala Pro Ser Asn Phe Ala Asn Gly Val Ala Glu 20 25 30 Trp lie Ser Ser Asn Ser Arg Ser Gin Ala Tyr Lys Val Thr Cys Ser 35 40 45 Val Arg Gin Ser Ser Ala Gin Asn Arg Lys Tyr Thr lie Lys Val Glu 50 55 60 Val Pro Lys Val Ala Thr Gin Thr Val Gly Gly Val Gin Leu Pro Val 65 70 75 80 Ala Ala Trp Arg Ser Tyr Leu Asn Met Glu Leu Thr lie Pro lie Phe 85 90 95
[0032] Ala Thr Asn Asp Asp Cys Ala Leu lie Val Lys Ala Met Gin Gly Leu 100 105 110 Leu Lys Asp Gly Asn Pro lie Pro Ser Ala lie Ala Ala Asn Ser Gly 115 120 125 lie Tyr 130 <210〉 56 <211〉 130 <212> PRT <213〉肠杆菌噬菌体MS2 <400> 56 Met Ala Ser Asn Phe Thr Gin Phe Val Leu Val Asp Asn Glv Gly Thr 15 10 15 Gly Asp Val Thr Val Ala Pro Ser Asn Phe Ala Asn Gly Val Ala, Glu 20 25 30 Trp lie Ser Ser Asn Ser Arg Ser Gin Ala Tyr Lvs Val Thr Cys Ser 35 40 45 Val Arg Gin Ser Ser Ala Gin Asn Arg Lys Tyr Thr lie Lys Val Glu 50 55 60 Yal Pro Lys Val Ala Thr Gin Thr Val Gly Gly Val Gin Leu Pro Val 65 70 75 80 Ala Ala Trp Arg Ser Tyr Leu Asn Met Glu Leu Thr lie Pro lie Phe 85 90 95 Ala Thr Asn Asp Asp Cys Ala Leu lie Val Lys Ala Met Gin Gly Leu 100 105 110 Leu Lys Asp Gly Asn Pro lie Pro Ser Ala lie Ala Ala Asn Ser Gly 115 120 125 lie Tyr 130 <210〉 57 <211> 127
[0033] Asn Phe Thr Gin Phe Val Leu Yal Asp Asn Gly Gly Thr Gly Asp Val 1 5 10 15 <212> PRT <213〉肠杆菌噬菌体MS2 <400> 57 Thr Val Ala Pro Ser Asn Phe Ala Asn Gly Val Ala, Glu Trp lie Ser 20 25 30 Ser Asn Ser Arg Ser Gin Ala Tyr Lys Val Thr Cys Ser Val Arg Gin 35 40 45 Ser Ser Ala Gin Asn Arg Lys Tyr Thr lie Lys Val Glu Val Pro Lvs 50 55 60 Val Ala Thr Gin Thr Val Gly Gly Val Glu Leu Pro Val Ala Ala Trp 65 70 75 80 Arg Ser Tyr Leu Asn Val Glu Leu Thr lie Pro lie Phe Ala Thr Asn 85 90 95 Ser Asp Cys Glu Leu lie Val Lys Ala Met Gin Gly Leu Leu Lys Asp 100 105 110 Gly Asn Pro lie Pro Ser Ala lie Ala Ala Asn Ser Glv lie Tyr 115 120 125 <210〉 58 <211〉 129 <212> PRT <213〉肠杆菌噬菌体ZR <400> 58 Ala Ser Asn Phe Thr Gin Phe Val Leu Val Asn Asp Gly Gly Thr Gly 15 10 15 Asn Val Thr Val Ala Pro Ser Asn Phe Ala Asn Gly Val Ala Glu Trp 20 25 30 He Ser Ser Asn Ser Arg Ser Gin Ala Tyr Lys Val Thr Cys Ser Val 35 40 45 Arg Gin Ser Ser Ala Gin Asn Arg Lys Tyr Thr lie Lys Val Glu Val
[0034] 50 55 60 Pro Lys Val Ala Thr Gin Thr ￥al Gly Gly Val Glu Leu Pro Val Ala 65 70 75 80 Ala Trp Arg Ser Tvr Leu Asn Met Glu f,eu Thr Tie Pro Tie Phe Ala 85 90 95 Thr Asn Ser Asp Cys Glu Leu lie Val Lys Ala Met Gin Gly Leu Leu 100 105 110 Lys Asp Gly Asn Pro lie Pro Ser Ala lie Ala Ala Asn Ser Gly lie 115 120 125 Tyr <210〉 59 <211> 129 <212〉 PRT <213〉肠杆菌噬菌体R17 <400> 59 Ala Ser Asn Phe Thr Gin Phe Va] Leu Val Asn Asp Gly Gly Thr Gly 15 10 15 Asn Vai 1'hr Va_L Aia Pro Ser Asn Phe Asn G丄y Vai Ala Glu Trp 20 25 30 lie Ser Ser Asn Ser Arg Ser Gin Ala Tyr Lys Val Thr Cys Ser Val 35 40 45 Arg Gin Ser Ser Ala Gin Asn Arg Lys Tyr Thr lie Lys Val Glu Va] 50 55 60 Pro Lys Val Ala Thr Gin Thr Val Gly Gly Val Glu Leu Pro Val Ala 65 70 75 80 Ala Trp Arg Ser Tyr Leu Asn Met Glu Leu Thr He Pro lie Phe Ala 85 90 95 Thr Asn Ser Asp Cvs Glu Leu lie Val Lys Ala Met Gin Gly Leu Leu 100 105 110
[0035] Lys Asp Gly Asn Pro lie Pro Ser Ala lie Ala Ala Asn Ser Gly lie 115 120 125 Tyr <210> 60 <211> 130 <212〉 PRT <213〉肠杆菌噬菌体MS2 <400〉 60 Met Ala Ser Asn Phe Thr Gin Phe Val Leu Val Asp Asn Gly Gly Thr 1 5 10 15 Gly Asp Val Thr Val Ala Pro Ser Asn Phe Ala Asn Gly Val Ala Glu 20 25 30 Trp lie Ser Ser Asn Ser Arg Ser Gin Ala Tyr Lys Val Thr Cys Ser 35 40 45 Yal Arg Gin Ser Ser Ala Gin Asn Arg Lys Tyr Thr He Lys Val Glu 50 55 60 Yal Pro Lys Val Ala Thr Gin Thr Yal Gly Gly Val Glu Leu Pro Val 65 70 75 80 Ala Ala Trp Arg Ser Tyr Leu Asn Met Glu Leu Thr lie Pro lie Phe 85 90 95 Ala Thr Asn Ser Asp Cys Glu Leu lie Val Lys Ala Met Gin Gly Leu 100 105 110 Leu Lys Asp Gly Asn Pro lie Pro Ser Ala lie Ala Ala Asn Ser Gly 115 120 125 lie Tyr 130 <210〉 61 <211> 130 <212〉 PRT <213〉肠杆菌噬菌体MS2
[0036] <400> 61 Met Ala Ser Asn Phe Thr Gin Phe Val Leu Val Asp Asn Gly Gly Thr 1 5 10 15 Gly Asp Val Thr Val Ala Pro Ser Asn Phe Ala Asn Gly Val Ala Glu 20 25 30 Trp lie Ser Ser Asn Ser Arg Ser Gin Ala Tyr Lys Val Thr Cys Ser 35 40 45 Val Arg Gin Ser Ser Ala Gin Asn Arg Lys Tyr Thr lie Lys Val Glu 50 55 60 Val Pro Lys Val Ala Thr Gin Thr Val Gly Gly Val Glu Leu Pro Val 65 70 75 80 Ala Ala Trp Arg Ser Tyr Leu Asn Met Glu Leu Thr lie Pro lie Phe 85 90 95 Ala Thr Asn Ser Asp Cys Glu Leu lie Val Lys Ala Met Gin Gly Leu 100 105 110 Leu Lys Asp Gly Asn Pro lie Pro Ser Ala lie Ala Ala Asn Ser Gly 115 120 125 lie Tyr 130 <210〉 62 <211〉 130 <212> PRT <213〉肠杆菌噬菌体MS2 <400〉 62 Met Ala Ser Asn Phe Thr Gin Phe Val Leu Val Asp Asn Gly Gly Thr 15 10 15 Gly Asp Val Thr Val Ala Pro Ser Asn Phe Ala Asn Gly Val Ala Glu 20 25 30 Trp lie Ser Ser Asn Ser Arg Ser Gin Ala Tyr Lys Val Thr Cys Ser 35 40 45
[0037] Val Arg Gin Ser Ser Ala Gin Asn Arg Lys Tyr Thr He Lys Val Glu 50 55 60 Val Pro Lys Val Ala Thr Gin Thr Val Gly Gly Val Glu Leu Pro Val 65 70 75 80 Ala Ala Trp Arg Ser Tyr Leu Asn Met Glu Leu Thr lie Pro lie Phe 85 90 9o Ala Thr Asn Ser Asp Cys Glu Leu lie Val Lys Ala Met Gin Gly Leu 100 105 110 Leu Lys Asp Gly Asn Pro lie Pro Ser Ala lie Ala Ala Asn Ser Gly 115 120 125 lie Tyr 130 <210〉 63 <211> 130 <212〉 PRT <213〉肠杆菌噬菌体ZR <400> 63 Met Ala Ser Asn Phe Thr Gin Phe Val Leu Val Asp Asn Gly Gly Thr 15 10 15 Gly Asp Val Thr Val Ala Pro Ser Asn Phe Ala Asn Gly Val Ala Glu 20 25 30 Trp lie Ser Ser Asn Ser Arg Ser Gin Ala Tyr Lys Val Thr Cys Ser 35 40 45 Val Arg Gin Ser Ser Ala Gin Asn Arg Lys Tyr Thr lie Lys Val Glu 50 55 60 Val Pro Lys Val Ala Thr Gin Thr Val Gly Gly Val Glu Leu Pro Val 65 70 75 80 Ala Ala Trp Arg Ser Tyr Leu Asn Met Glu Leu 丁hr lie Pro lie Phe 85 90 95 Ala Thr Asn Ser Asp Cys Glu Leu lie Val Lys Ala Met Gin Gly Leu 100 105 110
[0038] Leu Lys Asp Gly Asn Pro lie Pro Ser Ala lie Ala Ala Asn Ser Gly 115 120 125 lie Tyr 130 <210> 64 <211> 130 <212> PRT 〈213〉肠杆菌噬菌体JP501 <400> 64 Met Ala Ser Asn Phe Thr Glu Phe Val Leu Val Asp Asn Gly Glu Thr 1 5 10 15 Gly Asn Val Thr Val Ala Pro Ser Asn Phe Ala Asn Gly Val Ala Glu 20 25 30 Trp lie Ser Ser Asp Ser Arg Ser Gin Ala Tyr Lys Val Thr Cys Ser 35 40 45 Val Arg Gin Ser Ser Ala Gin Asn Arg Lys Tyr Thr lie Lys Val Ala 50 55 60 Val Pro Lys Val Ala Thr Gin Thr Val Gly Gly Val Glu Leu Pro Yal 65 70 75 80 Ala Ala Trp Arg Ser Tyr Leu Asn Met Glu Leu Thr lie Pro lie Phe 85 90 95 Ala Thr Asn Ser Asp Cys Ala Leu lie Val Lys Ala Met Gin Gly Leu 100 105 110 Leu Lys Asp Gly Asn Pro lie Pro Scr Ala lie Ala Ala Asn Scr Gly 115 120 125 lie Tyr 130 <210〉 65 <211> 129 <212> PRT <213〉肠杆菌噬菌体F2
[0039] Ala Ser Asn Phe Thr Gin Phe Val Leu Val Asn Asp Glv Gly Thr Gly 15 10 15 <400> 65 Asn Val Thr ￥al Ala Pro Ser Asn Phe Ala Asn Gly Val Ala Glu Trp 20 25 30 lie Ser Ser Asn Ser Arg Ser Gin Ala Tyr Lys Val Thr Cys Ser Val 35 40 45 Arg Gin Ser Ser Ala Gin Asn Arg Lys Tyr Thr lie Lys Val Glu Val 50 55 60 Pro Lys Val Ala Thr Gin Thr Val Gly Cily Val Glu Leu Pro Val Ala 65 70 75 80 Ala Trp Arg Ser Tyr Leu Asn Leu Glu Leu Thr lie Pro lie Phe Ala 85 90 95 Thr Asn Ser Asp Cys Glu Leu lie Yal Lys Ala Met Gin Gly Leu Leu 100 105 110 Lys Asp Gly Asn Pro lie Pro Ser Ala lie Ala Ala Asn Ser Gly lie 115 120 125 Tyr <210> 66 <211> 130 <212> PRT <213〉肠杆菌噬菌体JP34 <400> 66 Met Ala Thr Leu Arg Ser Phe Val Leu Val Asp Asn Gly Gly Thr Gly 15 10 15 Asp Val Thr Val Val Pro Val Ser Asn Ala Asn Gly VaL Ala Glu Trp 20 25 30
[0040] Leu Ser Asn Asn Ser Arg Ser Gin Ala Tyr Arg Val Thr Ala Ser Tyr 35 40 45 Arg Ala Ser Gly Ala Asp Lys Arg Lys Tyr Thr lie Lys Leu Glu Val 50 55 60 Pro Lys lie Val Thr Gin Val Val Asn Gly Val Glu Leu Pro Val Ser 65 70 75 80 Ala Trp Lys Ala Tyr Ala Ser lie Asp Leu Thr lie Pro lie Phe Ala 85 90 95 Ala Thr Asp Asp Val Thr Val lie Ser Lys Ser Leu Ala Gly Leu Phe 100 105 110 Lys Val Gly Asn Pro lie Ala Asp Ala lie Ser Ser Gin Ser Gly Phe 115 120 125 Tyr Ala 130 <210〉 67 <211〉 130 <212〉 PRT <213〉肠杆菌噬菌体JF500 <400> 67 Met Ala Thr Leu Arg Ser Phe Val Leu Val Asp Asn Gly Gly Thr Gly 15 10 15 Asp Val Thr Val Val Pro Val Ser Asn Ala Asn Gly Val Ala Glu Trp 20 25 30 Leu Ser Asn Asn Ser Arg Ser Gin Ala Tyr Arg Val Thr Ala Ser Tyr 35 40 45 Arg Ala Ser Gly Ala Asp Lys Arg Lys Tyr Thr lie Lys Leu Glu Val 50 55 60 Pro Lys lie Val Thi^ Gin Val Val Asn Gly Val Glu Leu Pro Val Ser 65 70 75 80 Ala Trp Lys Ala Tvr Ala Ser lie Asp Leu Thr lie Pro lie Phe Ala 85 90 95 Ala Thr Asp Asp Val Thr Val lie Ser Lys Ser Leu Ala Gly Leu Phe
[0041] 100 105 110 Lys Val Gly Asn Pro lie Ala Asp Ala lie Scr Scr Gin Scr Glv Phe 115 120 125 丁yr Ala 130 <210> 68 <211〉 130 <212〉 PRT <213〉肠杆茼噬菌体SD <400> 68 Met Ala Thr Leu Arg Ser Phe Val Leu Val Asp Asn Gly Gly Thr Gly 15 10 15 Asn Val Thr Val Val Pro Val Ser Asn Ala Asn Gly Val Ala Glu Trp 20 25 30 Leu Ser Asn Asn Ser Arg Ser Gin Ala Tyr Arg Val Thr Ala Ser Tyr 35 40 45 Arg Ala Ser Gly Ala Asp Lys Arg Lys Tyr Thr lie Lvs Leu Glu Val 50 55 60 Pro Lys He Val Thr Gin Val Val Asn Gly Val Glu Leu Pro lie Ser 65 70 75 80 Ala Trp Lys Ala Tyr Ala Ser lie Asp Leu Thr lie Pro lie Phe Ala 85 90 95 Ala Thr Asp Asp Val Thr Thr lie Ser Lys Ser Leu Ala Gly Leu Phe 100 105 110 Lys Val Gly Asn Pro lie Ala Asp Ala lie Ser Ser Gin Ser Gly Phe 115 120 125 Tyr Ala 130 <210〉 69 <211〉 130 <212> PRT
[0042] Met Ala Thr Leu Arg Ser Phe Val Leu Val Asp Asn Gly Gly Thr Gly 15 10 15 <213〉肠杆菌噬菌体KU1 <400> 69 Asn Val Thr Val Val Pro Val Ser Asn Ala Asn Gly Val Ala Glu Trp 20 25 30 Leu Ser Asn Asn Ser Arg Ser Gin Ala Tyr Arg Val Thr Ala Ser Tyr 35 40 45 Arg Ala Ser Gly Ala Asp Lys Arg Lys Tyr Thr lie Lys Leu Glu Val 50 55 60 Pro Lys lie Val Thr Gin Ser Val Asn Gly Val Glu Leu Pro Val Ser 65 70 75 80 Ala Trp Lys Ala Phc Ala Sor lie Asp Leu Thr lie Pro lie Phc Ala 85 90 95 Ala Thr Asp Asp Val Thr Leu lie Ser Lys Ser Leu Ala Gly Leu Phe 100 105 110 ],ys Tie Gly Asn Pro Val Ala Asp Ala Tie vSer Ser Gin Ser Gly Phe 115 120 125 Tyr Ala 130 <210〉 70 <211〉 130 <212> PRT <213〉肠杆菌噬菌体GA <400〉 70 Met Ala Thr Leu Arg Ser Phe Val Leu Val Asp Aan Gly Gly Thr Gly 1 5 10 lo Asn Val Thr Val Val Pro Val Ser Asn Ala Asn Gly Val Ala Glu Trp 20 25 30 Leu Ser Asn Asn Ser Arg Ser Gin Ala Tyr Arg Val Thr Ala Ser Tyr 35 40 45
[0043] Arg Ala Ser Gly Ala Asp Lys Arg Lys Tyr Ala lie Lys Leu Glu Val 50 55 60 Pro Lys lie Val Thr Gin Val Val Asn Gly Val Glu Leu Pro Gly Ser 65 70 75 80 Ala Trp Lys Ala Tyr Ala Ser lie Asp Leu Thr lie Pro lie Phe Ala 85 90 95 Ala Thr Asp Asp Val Thr Val lie Ser Lys Ser Leu Ala Gly Leu Phe 100 105 110 Lys Val Gly Asn Pro lie Ala Glu Ala lie Ser Ser Gin Ser Gly Phe 115 120 125 Tyr Ala 130 <210> 71 <211> 130 <212> PRT <213〉肠杆菌噬菌体BZ13 <400〉 71 Met Ala Thr Leu Arg Ser Phe Val Leu Val Asp Asn Gly Gly Thr Gly 15 10 15 Asn Val Thr Val Val Pro Val Ser Asn Ala Asn Gly Val Ala Glu Trp 20 25 30 Leu Ser Asn Asn Ser Arg Ser Gin Ala Tyr Arg Val Thr Ala Ser Tyr 35 40 45 Arg Ala Ser Gly Ala Asp Lys Arg Lys Tyr Thr lie Lys Leu Glu Val 50 55 60 Pro Lys lie Val Thr Gin Val Val Asn Gly Val Glu Leu Pro Val Ser 65 70 75 80 Ala Trp Lys Ala Tyr Ala Ser lie Asp Leu Thr lie Pro lie Phe Ala 85 90 95
[0044] Ala Thr Asp Asp Val Thr Val lie Ser Lys Ser Leu Ala Gly Leu Phe 100 105 110 Lys Val Gly Asn Pro lie Ala Glu Ala lie Ser Ser Gin Ser Gly Phe 115 120 125 Tyr A丄a 130 <210〉 72 <211〉 130 <212> PRT <213〉肠杆菌噬菌体BZ13 <400> 72 Met Ala Thr Leu Arg Ser Phe Val Leu Val Asp Asn Gly Gly Thr Gly 15 10 15 Asn Vai Thr Vai Va丄 Pro Val Ser Asn Ala Asn Giv Vai Aia G_Lu Trp 20 25 30 Leu Ser Asn Asn Ser Arg Ser Gin Ala Tyr Arg Val Thr Ala Ser Tyr 35 40 45 Arg Ala Ser Gly Ala Asp Lys Arg Lys Tyr Thr lie Lys Leu Glu Val 50 55 60 Pro Lys lie Val Thr Gin Thr Val Asn Gly Val Glu Leu Pro Val Ser 65 70 75 80 Ala Trp Lys Ala Tyr Ala Ser lie Asp Leu Thr lie Pro lie Phe Ala 85 90 95 Ala Thr Asp Asp Val Thr Leu lie Ser Lys Ser Leu Ala Gly Leu Phe 100 105 110 Lys lie Gly Asn Pro Val Ala Asp Ala lie Ser Ser Gin Ser Gly Phe 115 120 125 Tyr Ala 130 <210〉 73 <211> 130
[0045] Met Ala Thr Leu Arg vSer Phe Val Leu Val Asp Asn Gly Gly Thr Gly 15 10 15 <212> PRT <213〉肠杆菌噬菌体BZ13 <400〉 73 Asn Val Thr Yal Val Pro Val Ser Asn Ala Asn Gly Val Ala Glu Trp 20 25 30 Leu Ser Asn Asn Ser Arg Ser Gin Ala Tyr Arg Val Thr Ala Ser Tyr 35 40 45 Arg Ala Ser Gly Ala Asp Lys Arg Lys Tyr Thr lie Lvs Leu Glu Val 50 55 60 Pro Lys lie Val Thr Gin Val Val Asn Gly Val Glu Leu Pro Val Ser 65 70 75 80 A丄a Trp Lys A丄a Tyr Ala Ser .lie Asp Leu Thr 丄丄e Pro lie Phe Aia 85 90 95 Ala Thr Asp Asp Val Thr Val lie Ser Lys Ser Leu Ala Gly Leu Phe 100 105 110 Lys Val Gly Asp Pro lie Ala Asp Ala lie Ser Ser Gin Ser Gly Phe 115 120 125 Tyr Ala 130 <210〉 74 <211> 130 <212〉 PRT <213〉肠杆菌噬菌体TH1 <400〉 74 Met Ala Thr Leu Arg Scr Phe Val Leu Val Asp Asn Gly Gly Thr Gly 15 10 15 Asn Val Thr Val Val Pro Val Ser Asn Ala Asn Gly Val Ala Glu Trp 20 25 30 Leu Ser Asn Asn Ser Arg Ser Gin Ala Tyr Arg Val Thr Ala Ser Tyr
[0046] 35 40 45 Arg Ala Ser Gly Ala Asp Lys Arg Lys Tyr Thr lie Lys Leu Glu Val 50 55 60 Pro Lys lie Val Thr Gin Val Val Asn Gly Val Glu Leu Pro Val Ser 65 70 75 80 Ala Trp Lys Ala Tyr Ala Ser lie Asp Leu Thr lie Pro lie Phe Ala 85 90 95 Ala Thr Asp Asp Val Thr Val lie Ser Lys Ser Leu Ala Gly Leu Phe 100 105 110 Lys Val Gly Asn Pro lie Ala Asp Ala lie Ser Ser Gin Ser Gly Phe 115 120 125 Tyr Ala 130 <210〉 75 <211〉 130 <212〉 PRT <213〉肠杆菌噬菌体T12 <400〉 75 Met Ala Thr Leu Arg Ser Phe Val Leu Val Asp Asn Glv Gly Thr Gly 15 10 15 Asn Val Thr Val Val Pro Val Ser Asn Ala Asn Gly Val Ala Glu Trp 20 25 30 Leu Ser Asn Asn Ser Arg Ser Gin Ala Tyr Arg Val Thr Ala Ser Tyr 35 40 45 Arg Ala Ser Gly Ala Asp Lys Arg Lys Tyr Thr lie Lys Leu Glu Val 50 55 60 Pro Lys lie Val Thr Gin Val Val Asn Gly Val Glu Leu Pro Val Ser 65 70 75 80 Ala Trp Lys Ala Tyr Ala Ser lie Asp Leu Thr lie Pro lie Phe Ala 85 90 95
[0047] Ala Thr Asp Asp Val Thr Val lie Ser Lys Ser Leu Ala Gly Leu Phe 100 105 110 Lys Val Gly Asn Pro lie Ala Asp Ala lie Ser Ser Gin Ser Gly Phe 115 120 125 Tyr Ala 130 <210〉 76 <211〉 130 <212〉 PRT <213〉肠杆菌噬菌体FR <400> 76 Met Ala Ser Asn Phe Glu Glu Phe Val Leu Val Asp Asn Gly Gly Thr 15 10 15 Gly Asp Val Lys Val Ala Pro Ser Asn Phe Ala Asn Gly Val Ala Glu 20 25 30 Trp lie Ser Ser Asn Ser Arg Ser Gin Ala Tyr Lys ￥al Thr Cys Ser 35 40 45 Val Arg Gin Ser Ser Ala Asn Asn Arg Lys Tyr Thr Val Lys Val Glu 50 55 60 Val Pro Lys Val Ala Thr Gin Val Gin Gly Gly Val Glu Leu Pro Val 65 70 75 80 Ala Ala Trp Arg Ser Tyr Met Asn Met Glu Leu Thr lie Pro Val Phe 85 90 95 Ala Thr Asn Asp Asp Cys Ala Leu lie Val Lys Ala Leu Gin Gly Thr 100 105 110 Phe Lys Thr Gly Asn Pro lie Ala Thr Ala lie Ala Ala Asn Ser Gly 115 120 125 lie Tyr 130 <210> 77
[0048] <211〉 130 <212> PRT <213〉肠杆菌噬菌体R17 <400〉 77 Met Ala Ser Asn Phe Thr Gin Phe Val Leu Val Asp Asn Gly Gly Thr 1 5 10 15 Gly Asp Val Thr Val Ala Pro Scr Asn Phe Ala Asn Gly Val Ala Glu 20 25 30 Trp lie Ser Ser Asn Ser Arg Ser Gin Ala Tyr Lys Val Thr Cys Ser 35 40 45 Val Arg Gin Ser Ser Ala Gin Asn Arg Lys Tyr Thr lie Lys Val Glu 50 55 60 Val Pro Lys Val Ala Thr Gin Thr Val Gly Gly Val Glu Leu Pro Val 65 70 75 80 Ala Ala Trp Arg Ser Tyr Leu Asn Met Glu Leu Thr lie Pro lie Phe 85 90 95 Ala Thr Asn Ser Asp Cys Glu Leu lie Val Lys Ala Met Gin Gly Leu 100 105 110 Leu Lys Asp Gly Asn Pro lie Pro Ser Ala lie Ala Ala Asn Ser Gly 115 120 125 lie Tyr 130 <210〉 78 <211〉 132 <212〉 PRT <213〉肠杆菌噬菌体Qbeta <400> 78 Ala Lys Leu Glu Thr Val Thr Leu Gly Asn lie Gly Lys Asp Gly Lys 15 10 15 Gin Thr Leu Val Leu Asn Pro Arg Gly Val Asn Pro Thr Asn Gly Val 20 25 30
[0049] Ala Ser Leu Ser Gin Ala Gly Ala Val Pro Ala Leu Glu Lys Arg Val 35 40 45 Thr Val Ser Val Ser Gin Pro Ser Arg Asn Arg Lys Asn Tyr Lys Val 50 55 60 Gin Val Lys lie Gin Asn Pro Thr Ala Cys Thr Ala Asn Gly Ser Cys 65 70 75 80 Asp Pro Ser Val Thr Arg Gin Ala Tyr Ala Asp Val Thr Phe Ser Phe 85 90 95 Thr Gin Tyr Ser Thr Asp Glu Glu Arg Ala Phe Val Arg Thr Glu Leu 100 105 110 Ala Ala Leu Leu Ala Ser Pro Leu Leu lie Asp Ala lie Asp Gin Leu 115 120 125 Asn Pro Ala Tyr 130
【权利要求】
1. 一种病毒样颗粒（VLP)，所述病毒样颗粒包含封入至少一种异源货物分子和包装序 列的衣壳。
2. 根据权利要求1所述的VLP，所述VLP还包含由所述衣壳封入的至少一种核酶。
3. 根据权利要求2所述的VLP，其中所述异源货物分子包含寡核苷酸。
4. 根据权利要求3所述的VLP，其中所述异源货物分子包含寡核糖核苷酸。
5. 根据权利要求4所述的VLP，其中所述核酶的侧翼为所述包装序列和所述寡核糖核 苷酸，以形成核酸构建体。
6. 根据权利要求5所述的VLP，所述VLP包含多个所述核酸构建体。
7. 根据权利要求4所述的VLP，其中所述寡核糖核苷酸是选自siRNA、shRNA、sshRNA、 IshRNA 和 miRNA 的短 RNA。
8. 根据权利要求7所述的VLP，所述VLP包含至少两种核酶，其中每种核酶选择为切割 所述短RNA的一个末端。
9. 根据权利要求4所述的VLP，所述VLP还包含由至少1-100个核苷酸组成的接头，所 述接头包含至少40%的A或至少40 %的U，其中所述接头连接所述寡核糖核苷酸和所述包 装序列、或所述寡核糖核苷酸和所述核酶。
10. 根据权利要求2所述的VLP，其中所述核酶选自锤头状核酶和丁型肝炎病毒核酶。
11. 根据权利要求2所述的VLP，其中所述核酶是具有与所述寡核糖核苷酸的至少6个 连续核苷酸互补的连续核苷酸组的锤头状核酶变体。
12. 根据权利要求2所述的VLP，其中所述核酶是能够切割其与所述寡核糖核苷酸的连 接的突变型丁型肝炎病毒核酶，其速率为野生型丁型肝炎病毒核酶速率的至多约50%。
13. 根据权利要求2所述的VLP，其中所述核酶是具有选自SEQ ID No :10-18的核酸序 列的突变型HDV核酶。
14. 根据权利要求1所述的VLP，其中所述衣壳包含野生型病毒衣壳，其对由肽键水解 酶类别EC 3. 4催化的水解是抗性的。
15. 根据权利要求1所述的VLP，其中所述衣壳包含这样的衣壳蛋白质，其与野生型肠 杆菌噬菌体MS2衣壳（SEQ ID N0:3)的氨基酸序列具有至少40%序列同一性，并且对由肽 键水解酶类别EC 3. 4催化的水解是抗性的。
16. 根据权利要求1所述的VLP，其中所述衣壳包含这样的衣壳蛋白质，其与野生型肠 杆菌噬菌体MS2衣壳（SEQ ID NO: 3)的氨基酸序列具有至少41 %序列同一性，并且对由肽 键水解酶类别EC 3. 4催化的水解是抗性的。
17. 根据权利要求1所述的VLP，其中所述衣壳包含这样的衣壳蛋白质，其与野生型肠 杆菌噬菌体MS2衣壳（SEQ ID N0:3)的氨基酸序列具有至少45%序列同一性，并且对由肽 键水解酶类别EC 3. 4催化的水解是抗性的。
18. 根据权利要求1所述的VLP，其中所述衣壳包含这样的衣壳蛋白质，其与野生型肠 杆菌噬菌体MS2衣壳（SEQ ID N0:3)的氨基酸序列具有至少52%序列同一性，并且对由肽 键水解酶类别EC 3. 4催化的水解是抗性的。
19. 根据权利要求1所述的VLP，其中所述衣壳包含这样的衣壳蛋白质，其与野生型肠 杆菌噬菌体MS2衣壳（SEQ ID NO: 3)的氨基酸序列具有至少53%序列同一性，并且对由肽 键水解酶类别EC 3. 4催化的水解是抗性的。
20. 根据权利要求1所述的VLP，其中所述衣壳包含这样的衣壳蛋白质，其与野生型肠 杆菌噬菌体MS2衣壳（SEQ ID NO:3)的氨基酸序列具有至少56%序列同一性，并且对由肽 键水解酶类别EC 3. 4催化的水解是抗性的。
21. 根据权利要求1所述的VLP，其中所述衣壳包含这样的衣壳蛋白质，其与野生型肠 杆菌噬菌体MS2衣壳（SEQ ID NO:3)的氨基酸序列具有至少59%序列同一性，并且对由肽 键水解酶类别EC 3. 4催化的水解是抗性的。
22. 根据权利要求1所述的VLP，其中所述衣壳包含这样的衣壳蛋白质，其与野生型肠 杆菌噬菌体MS2衣壳蛋白质（SEQ ID NO:3)的氨基酸序列具有至少86%序列同一性，并且 对由肽键水解酶类别EC 3. 4催化的水解是抗性的。
23. 根据权利要求1所述的VLP，其中所述衣壳包含具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的 野生型肠杆菌噬菌体MS2衣壳蛋白质。
24. 根据权利要求1所述的VLP，其中所述衣壳包含这样的衣壳蛋白质，基于有效的 结构锚定比对，其与野生型肠杆菌噬菌体MS2衣壳（SEQ ID NO: 3)的氨基酸序列具有至少 15%序列同一性，并且对由肽键水解酶类别EC 3. 4催化的水解是抗性的。
25. 根据权利要求1所述的VLP，其中所述衣壳包含这样的衣壳蛋白质，基于有效的 结构锚定比对，其与野生型肠杆菌噬菌体MS2衣壳（SEQ ID NO: 3)的氨基酸序列具有至少 16%序列同一性，并且对由肽键水解酶类别EC 3. 4催化的水解是抗性的。
26. 根据权利要求1所述的VLP，其中所述衣壳包含这样的衣壳蛋白质，基于有效的 结构锚定比对，其与野生型肠杆菌噬菌体MS2衣壳（SEQ ID NO: 3)的氨基酸序列具有至少 21%序列同一性，并且对由肽键水解酶类别EC 3. 4催化的水解是抗性的。
27. 根据权利要求1所述的VLP，其中所述异源货物分子包括肽或多肽。
28. 根据权利要求27所述的VLP，所述VLP还包含偶联所述异源货物分子和所述病毒 衣壳的寡核苷酸接头。
29. 根据权利要求28所述的VLP，其中所述寡核苷酸接头是包含核酶序列的寡核糖核 苷酸。
30. 根据权利要求1所述的VLP，其中所述异源货物分子包括包含双功能多核苷酸的双 分子货物分子，所述双功能多核苷酸包含第一适体序列和第二适体序列，所述第一适体序 列特异性结合具有约1，500Da或更少的分子量的生物活性小分子，所述第二适体序列用于 结合所述衣壳的包装序列。
31. 根据权利要求30所述的VLP，所述VLP还包含与所述第一适体序列结合的所述生 物活性小分子。
32. 根据权利要求31所述的VLP，其中所述生物活性小分子包含除草剂或杀虫剂。
33. 根据权利要求32所述的VLP，其中所述生物活性小分子选自：莠去津、啶虫脒甲拌 憐、丙漠憐、水胺硫憐和氧乐果。
34. -种核酸构建体，所述核酸构建体包含编码短RNA、核酶和包装序列的核苷酸序 列。
35. 根据权利要求34所述的核酸构建体，其中所述短RNA是siRNA或shRNA。
36. 根据权利要求34所述的核酸构建体，所述核酸构建体还包含4-100个核苷酸的连 接核苷酸序列，所述核苷酸中至少40%是A，至少40%是T或至少40%是U，其中所述连接 核苷酸序列的侧翼为所述包装编码序列和所述siRNA编码序列。
37. 根据权利要求34所述的核酸构建体，其中所述核酶的侧翼为所述短RNA和所述包 装序列。
38. 根据权利要求37所述的核酸构建体，其中所述短RNA是siRNA或shRNA。
39. -种载体，所述载体包含根据权利要求34所述的核酸构建体。
40. -种宿主细胞，所述宿主细胞包含根据权利要求39所述的载体。
41. 根据权利要求40所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞由所述载体稳定转染。
42. 根据权利要求40所述的宿主细胞，所述宿主细胞是细菌细胞。
43. 根据权利要求40所述的宿主细胞，所述宿主细胞是大肠杆菌细胞。
44. 根据权利要求40所述的宿主细胞，所述宿主细胞是植物细胞。
45. 根据权利要求40所述的宿主细胞，所述宿主细胞是哺乳动物细胞。
46. 根据权利要求40所述的宿主细胞，所述宿主细胞是真菌细胞。
47. 根据权利要求40所述的宿主细胞，所述宿主细胞是酵母细胞。
48. 根据权利要求40所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞还由第二载体稳定转染，所 述第二载体包含编码病毒衣壳的第二核酸序列，所述病毒衣壳对由肽键水解酶类别EC 3. 4 催化的水解是抗性的。
49. 根据权利要求40所述的宿主细胞，其中所述第二核酸序列编码编码病毒衣壳的病 毒蛋白质，所述病毒衣壳与野生型肠杆菌噬菌体MS2衣壳蛋白质（SEQ ID NO:3)的氨基酸 序列具有至少40%序列同一性，并且对由肽键水解酶类别EC 3. 4催化的水解是抗性的。
50. 根据权利要求40所述的宿主细胞，其中所述核酸序列编码野生型肠杆菌噬菌体 MS2衣壳蛋白质（SEQ ID NO:3)。
51. 根据权利要求34所述的核酸构建体，其中所述核酶是锤头状核酶。
52. 根据权利要求34所述的核酸构建体，其中所述核酶是具有与所述短RNA的至少6 个连续核苷酸互补的连续核苷酸组的锤头状核酶变体。
53. 根据权利要求34所述的核酸构建体，其中所述核酶是丁型肝炎病毒核酶。
54. 根据权利要求34所述的核酸构建体，其中所述核酶是能够切割其与所述短RNA的 连接的突变型丁型肝炎病毒核酶，其速率为野生型丁型肝炎病毒核酶速率的至多50 %，或 是具有选自SEQ ID No: 10-18的核酸序列的突变型HDV核酶。
55. -种植物或植物组织，所述植物或植物组织被转化以含有根据权利要求34所述的 核酸构建体。
56. 根据权利要求55所述的植物或植物组织的种子或后代，其中所述种子或后代包含 所述核酸构建体。
57. -种组合物，所述组合物包含：a)各自包含封入至少一种异源货物分子的病毒衣 壳的多个病毒样颗粒；和b)对于所述组合物中存在的每100克衣壳以小于4克的量存在的 一种或多种细胞裂解产物，其中所述细胞裂解产物选自蛋白质、多肽、肽及其任何组合。
58. 根据权利要求57所述的组合物，其中所述衣壳对由肽键水解酶类别EC 3. 4催化的 水解是抗性的。
59. 根据权利要求57所述的组合物，其中所述衣壳包含这样的衣壳蛋白质，其与野生 型肠杆菌噬菌体MS2衣壳（SEQ ID N0:3)的氨基酸序列具有至少40%序列同一性，并且对 由肽键水解酶类别EC 3. 4催化的水解是抗性的。
60. 根据权利要求57所述的组合物，其中所述衣壳包含野生型肠杆菌噬菌体MS2衣壳 蛋白质（SEQ ID NO:3)。
61. 根据权利要求57所述的组合物，其中所述异源货物分子包含寡核苷酸。
62. 根据权利要求57所述的组合物，其中所述异源货物分子包含选自siRNA、shRNA、 sshRNA、IshRNA和miRNA的寡核糖核苷酸。
63. 根据权利要求62所述的组合物，其中每个病毒样颗粒还包含至少一种核酶，其中 所述核酶的侧翼为所述包装序列和所述寡核糖核苷酸，以形成核酸构建体。
64. 根据权利要求63所述的组合物，其中每个病毒样颗粒包含多个所述核酸构建体。
65. 根据权利要求63所述的组合物，其中所述核酶选自锤头状核酶和丁型肝炎病毒核 酶。
66. 根据权利要求63所述的组合物，其中所述核酶是具有与所述寡核糖核苷酸的至少 6个连续核苷酸互补的连续核苷酸组的锤头状核酶变体。
67. 根据权利要求63所述的组合物，其中所述核酶是能够切割其与所述寡核糖核苷 酸的连接的突变型丁型肝炎病毒核酶，其速率为野生型丁型肝炎病毒核酶速率的至多约 50%，或是具有选自SEQ ID NO: 10-18的核酸序列的突变型HDV核酶。
68. 根据权利要求63所述的组合物，其中所述寡核糖核苷酸和所述包装序列由长度为 1-100个核苷酸的核苷酸序列连接，此类连接序列包含超过40%的A或超过40%的U。
69. 根据权利要求57所述的组合物，其中所述异源货物分子包括肽或多肽。
70. 根据权利要求69所述的组合物，所述组合物还包含偶联所述异源货物分子和所述 病毒衣壳的寡核苷酸接头。
71. 根据权利要求70所述的组合物，其中所述寡核苷酸接头是包含核酶序列的寡核糖 核苷酸。
72. 根据权利要求57所述的组合物，其中所述细胞裂解产物以小于0. 5克的量存在。
73. 根据权利要求57所述的组合物，其中所述细胞裂解产物以小于0. 2克的量存在。
74. 根据权利要求57所述的组合物，其中所述细胞裂解产物以小于0. 1克的量存在。
75. -种用于分离和纯化靶标货物分子的方法，所述方法包括：(a)获得包含多个病毒 样颗粒（VLP)的全细胞裂解物，所述多个病毒样颗粒各自包含封入至少一种靶标货物分子 的衣壳，其中所述衣壳对由肽键水解酶类别EC 3. 4催化的水解是抗性的；(b)对所述VLP 实施使用肽键水解酶类别EC 3. 4的水解，其时间和条件足以切割所述全细胞裂解物中存 在的但未由所述衣壳封入的每100个个别多肽中的至少60、至少70、至少80或至少90个， 同时在此类水解前所述全细胞裂解物中存在的每100个衣壳中的至少60、至少70、至少80 或至少90个在所述水解后保持完整。
76. 根据权利要求75所述的方法，其中所述衣壳各自包含这样的病毒衣壳蛋白质，其 与野生型肠杆菌噬菌体MS2衣壳蛋白质（SEQ ID N0:3)的氨基酸序列具有至少40%序列同 一性，并且对由肽键水解酶类别EC 3. 4催化的水解是抗性的。
77. 根据权利要求75所述的方法，其中所述衣壳各自包含野生型肠杆菌噬菌体MS2衣 壳蛋白质（SEQ ID NO:3)。
78. 根据权利要求75所述的方法，其中所述靶标货物分子包含寡核苷酸。
79. 根据权利要求75所述的方法，其中所述靶标货物分子包含选自siRNA、shRNA、 sshRNA、IshRNA和miRNA的寡核糖核苷酸。
80. 根据权利要求75所述的方法，其中每个病毒样颗粒还包含核酶，其中所述核酶的 侧翼为所述包装序列和所述寡核糖核苷酸，以形成核酸构建体。
81. 根据权利要求75所述的方法，所述方法还包括在水解后纯化所述衣壳。
82. 根据权利要求81所述的方法，其中纯化包括液-液萃取步骤、结晶步骤、分级沉淀 步骤和超滤步骤中的至少一个。
83. 根据权利要求75所述的方法，其中所述靶标货物分子包括肽或多肽。
84. -种组合物，所述组合物通过根据权利要求75所述的方法产生。
85. -种在宿主细胞中的细胞内生产靶分子后，用于保护全细胞裂解物中的所述靶分 子不受水解的方法，所述方法包括：(a)选择对由肽键水解酶类别EC 3. 4催化的水解是抗 性的病毒衣壳；(b)用第一载体和第二载体稳定转染所述宿主细胞，所述第一载体包含编 码形成所述病毒衣壳的病毒蛋白质的核酸序列，所述第二载体包括包含核酶的核酸序列， 所述核酶的侧翼为包装序列和siRNA序列；和（c)使所述细胞维持在足以使所述经转化的 细胞表达且装配壳体化所述核酶的衣壳的时间和条件下，所述核酶的侧翼为所述包装序列 和所述siRNA序列。
86. -种用于纯化封入至少一种异源货物分子的VLP的方法，所述方法包括：（a)获 得包含多个所述VLP的细胞裂解物；(b)使所述细胞裂解物与蛋白酶接触足以水解除所述 VLP外的细胞裂解产物的时间和条件，以形成水解产物；和（c)从所述水解产物中分离所述 VLP。
87. 根据权利要求86所述的方法，其中步骤（c)包括（i)执行使用硫酸铵的第一沉淀， 随后为第一离心，以获得第一沉淀物和第一上清液；和（ii)对所述第一上清液执行使用硫 酸铵的第二沉淀，随后为第二离心，以获得第二沉淀物，其中所述第二沉淀物包含按重量计 至少约90%的所述VLP。
88. 根据权利要求86所述的方法，其中步骤（c)包括（i)执行使用乙醇的第一沉淀，随 后为第一离心，以获得第一沉淀物和第一上清液；和（ii)对所述第一上清液执行使用硫酸 铵的第二沉淀，随后为第二离心，以获得第二沉淀物，其中所述第二沉淀物包含按重量计至 少约90%的所述VLP。
89. 根据权利要求86所述的方法，其中步骤（c)包括使所述水解产物超离心，以获得包 含按重量计至少约90%的所述VLP的沉淀物。
90. 根据权利要求86所述的方法，其中所述VLP各自包含对由肽键水解酶类别EC 3. 4 催化的水解是抗性的衣壳。
91. 根据权利要求86所述的方法，其中所述VLP各自包括包含衣壳蛋白质的衣壳，所述 衣壳蛋白质与野生型肠杆菌噬菌体MS2衣壳（SEQ ID NO:3)的氨基酸序列具有至少40%序 列同一性，并且对由肽键水解酶类别EC 3. 4催化的水解是抗性的。
92. 根据权利要求86所述的方法，其中所述VLP各自包含野生型肠杆菌噬菌体MS2衣 壳蛋白质（SEQ ID NO:3)。
93. 根据权利要求86所述的方法，其中步骤（b)在约37°C下执行至少约30分钟。
94. 根据权利要求86所述的方法，所述方法还包括在步骤（b)前，使所述细胞裂解物与 核酸酶、淀粉酶和脂肪酶中的至少一种在约37°C下接触至少约30分钟。
95. 根据权利要求86所述的方法，其中所述蛋白酶是肽键水解酶类别EC 3.4。
96. 根据权利要求86所述的方法，其中所述蛋白酶选自蛋白酶K、来自灰色链霉菌的蛋 白酶、和来自地衣芽孢杆菌的蛋白酶、胃蛋白酶和木瓜蛋白酶。
97. 根据权利要求86所述的方法，其中所述异源货物分子包含寡核苷酸。
98. 根据权利要求86所述的方法，其中所述异源货物分子包含寡核糖核苷酸。
99. 根据权利要求98所述的方法，其中所述寡核糖核苷酸是选自siRNA、shRNA、 sshRNA、IshRNA 和 miRNA 的短 RNA。
100. 根据权利要求86所述的方法，其中所述VLP各自还包含侧翼为包装序列和所述寡 核糖核苷酸的核酶，以形成核酸构建体。
101. 根据权利要求1〇〇所述的方法，其中所述核酶选自锤头状核酶和丁型肝炎病毒核 酶。
102. 根据权利要求100所述的方法，其中所述核酶是具有与所述寡核糖核苷酸的至少 6个连续核苷酸互补的连续核苷酸组的锤头状核酶变体。
103. 根据权利要求100所述的方法，其中所述核酶是能够切割其与所述寡核糖核苷 酸的连接的突变型丁型肝炎病毒核酶，其速率为野生型丁型肝炎病毒核酶速率的至多约 50%。
104. 根据权利要求100所述的方法，其中所述核酶是具有选自SEQ ID No:10-18的核 酸序列的突变型HDV核酶。
105. 根据权利要求100所述的方法，其中所述寡核糖核苷酸和所述包装序列由接头序 列连接，所述接头序列具有至少1-100个核苷酸，并且包含超过40 %的A或超过40 %的U。
106. 根据权利要求86所述的方法，其中所述异源货物分子包括肽或多肽。
107. 根据权利要求106所述的方法，其中所述VLP各自还包含偶联所述异源货物分子 和所述病毒衣壳的寡核苷酸接头。
108. 根据权利要求107所述的方法，其中所述寡核苷酸接头是包含核酶序列的寡核糖 核苷酸。
109. 根据权利要求86所述的方法，所述方法还包括在步骤（a)前通过下述制备所述细 胞裂解物：在所述细胞中表达所述VLP后离心细胞；重悬浮所述细胞；裂解所述细胞且离心 所述细胞裂解物，以获得上清液，其中所述上清液用作步骤（a)的细胞裂解物。
110. 根据权利要求1所述的VLP，其中所述衣壳包含这样的衣壳蛋白质，其具有野生型 肠杆菌噬菌体MS2衣壳（SEQ ID NO: 3)的氨基酸序列，除了在第1位处的A残基被缺失，并 且对由肽键水解酶类别EC 3. 4催化的水解是抗性的之外。
111. 根据权利要求1所述的VLP，其中所述衣壳包含这样的衣壳蛋白质，其具有野生型 肠杆菌噬菌体MS2衣壳（SEQ ID NO: 3)的氨基酸序列，除了在第1位处的A残基被缺失和 在第2位处的S残基被缺失，并且对由肽键水解酶类别EC 3. 4催化的水解是抗性的之外。
112. 根据权利要求1所述的VLP，其中所述衣壳包含这样的衣壳蛋白质，其具有野生型 肠杆菌噬菌体MS2衣壳（SEQ ID NO: 3)的氨基酸序列，除了在第1位处的A残基被缺失、在 第2位处的S残基被缺失和在第3位处的N残基被缺失，并且对由肽键水解酶类别EC 3. 4 催化的水解是抗性的之外。
113. 根据权利要求1所述的VLP，其中所述衣壳包含这样的衣壳蛋白质，其具有野生型 肠杆菌噬菌体MS2衣壳（SEQ ID N0:3)的氨基酸序列，除了在第129位处的Y残基被缺失， 并且对由肽键水解酶类别EC 3. 4催化的水解是抗性的之外。
114. 根据权利要求1所述的VLP，其中所述衣壳包含这样的衣壳蛋白质，其具有野生 型肠杆菌噬菌体MS2衣壳（SEQ ID N0:3)的氨基酸序列，具有在112-117区段中的单个（1 个）氨基酸缺失，并且对由肽键水解酶类别EC 3. 4催化的水解是抗性的。
115. 根据权利要求1所述的VLP，其中所述衣壳包含这样的衣壳蛋白质，其具有野生 型肠杆菌噬菌体MS2衣壳（SEQ ID N0:3)的氨基酸序列，具有在112-117区段中的单个（1 个）氨基酸缺失，并且对由肽键水解酶类别EC 3. 4催化的水解是抗性的。
116. 根据权利要求1所述的VLP，其中所述衣壳包含这样的衣壳蛋白质，其具有野生型 肠杆菌噬菌体MS2衣壳（SEQ ID N0:3)的氨基酸序列，具有在65-83区段中的1-2个残基 插入，并且对由肽键水解酶类别EC 3. 4催化的水解是抗性的。
117. 根据权利要求1所述的VLP，其中所述衣壳包含这样的衣壳蛋白质，其具有野生型 肠杆菌噬菌体MS2衣壳（SEQ ID N0:3)的氨基酸序列，具有在44-55区段中的1-2个残基 插入，并且对由肽键水解酶类别EC 3. 4催化的水解是抗性的。
118. 根据权利要求1所述的VLP，其中所述衣壳包含这样的衣壳蛋白质，其具有野生型 肠杆菌噬菌体MS2衣壳（SEQ ID N0:3)的氨基酸序列，具有在33-43区段中的单个（1个） 残基插入，并且对由肽键水解酶类别EC 3. 4催化的水解是抗性的。
119. 根据权利要求1所述的VLP，其中所述衣壳包含这样的衣壳蛋白质，其具有野生型 肠杆菌噬菌体MS2衣壳（SEQ ID N0:3)的氨基酸序列，具有在24-30区段中的1-2个残基 插入，并且对由肽键水解酶类别EC 3. 4催化的水解是抗性的。
120. 根据权利要求1所述的VLP，其中所述衣壳包含这样的衣壳蛋白质，其具有野生型 肠杆菌噬菌体MS2衣壳（SEQ ID NO:3)的氨基酸序列，具有在10-18区段中的单个（1个） 残基插入，并且对由肽键水解酶类别EC 3. 4催化的水解是抗性的。
121. 根据权利要求1所述的VLP，其中所述衣壳包含与第二衣壳单体序列串联的衣壳 蛋白质单体序列，所述衣壳蛋白质单体序列装配成对由肽键水解酶类别EC 3. 4催化的水 解是抗性的衣壳。
122. 根据权利要求1所述的VLP，其中所述衣壳包含其C末端由0-6残基接头区段延 伸的衣壳蛋白质单体序列，所述接头区段的C末端与第二衣壳单体序列串联，所有这些装 配成对由肽键水解酶类别EC 3. 4催化的水解是抗性的衣壳。
123. 根据权利要求122所述的VLP，其中所述接头序列是_(Gly)x_，其中X = 0-6,或 是选自 _Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-、-Gly-Gly-Ser 和-Gly-Ser-Gly-的 Gly-Ser 接头。
124. 根据权利要求122所述的VLP，其中所述衣壳包含与第三衣壳单体序列串联的衣 壳蛋白质，所述衣壳蛋白质装配成对由肽键水解酶类别EC 3. 4催化的水解是抗性的衣壳。
125. 根据权利要求122所述的VLP，其中所述衣壳包含其中所述C末端由0-6残基接 头区段延伸的衣壳蛋白质，所述接头区段的C末端与第三衣壳单体序列串联，所有这些装 配成对由肽键水解酶类别EC 3. 4催化的水解是抗性的衣壳。
126. 根据权利要求125所述的VLP，其中所述衣壳包含衣壳蛋白质，其中一个或两个 接头序列是-(Gly)x-，其中 X = 0-6,或是选自-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-、-Gly-Gly-Ser 和-Gly-Ser-Gly-的Gly-Ser接头，所述衣壳蛋白质装配成对由肽键水解酶类别EC 3. 4 催化的水解是抗性的衣壳。
127. 根据权利要求125所述的VLP，其中所述衣壳包含其中一个或两个接头序列 是-(Gly)x-，X = 1的衣壳蛋白质，所述衣壳蛋白质装配成对由肽键水解酶类别EC 3. 4催 化的水解是抗性的衣壳。
128. 根据权利要求125所述的VLP，其中所述衣壳包含其中一个或两个接头序列 是-(Gly)x-，X = 2的衣壳蛋白质，所述衣壳蛋白质装配成对由肽键水解酶类别EC 3. 4催 化的水解是抗性的衣壳。
129. 根据权利要求134所述的VLP，其中所述衣壳包含其中一个或两个接头序列 是-(Gly)x-，X = 3的衣壳蛋白质，所述衣壳蛋白质装配成对由肽键水解酶类别EC 3. 4催 化的水解是抗性的衣壳。
130. 根据权利要求1所述的VLP，其中一种或多种外壳蛋白质序列N末端截短1-3个 残基，并且接头序列延长缺失的残基数目，并且其对由肽键水解酶类别EC 3. 4催化的水解 是抗性的，其中所述接头序列是_(Gly)x-，其中X = 0-6。
131. 根据权利要求1所述的VLP，其中一种或多种外壳蛋白质序列C末端截短1个 残基，并且接头序列延长一个残基，并且其对由肽键水解酶类别EC 3. 4催化的水解是抗性 的，其中所述接头序列是-(Gly)x_，其中X = 0-6。
132. 根据权利要求1所述的VLP，其中在串联二聚体中的第一外壳蛋白质序列C末端 截短1个残基，并且接头序列延长一个残基，或其中在串联三聚体中的所述第一和/或第二 外壳蛋白质序列C末端截短1个残基，并且对由肽键水解酶类别EC 3. 4催化的水解是抗性 的，其中所述接头序列是-(Gly)x_，其中X = 0-6。
133. 根据权利要求1所述的VLP，所述VLP包含N末端和C末端截短，并且对由肽键水 解酶类别EC 3. 4催化的水解是抗性的。
【文档编号】C07H21/00GK104114696SQ201280062447
【公开日】2014年10月22日 申请日期:2012年12月21日 优先权日:2011年12月21日
【发明者】胡安·彼得罗·亨伯图·阿汉塞特, 胡安·P·阿汉塞特, 金伯利·德莱尼, 凯思琳·B·霍尔, 尼纳·萨默斯 申请人:阿普斯有限责任公司