去糖基化的人类抗体、其融合蛋白质及用途

去糖基化的人类抗体、其融合蛋白质及用途
【专利摘要】本发明是通过给受影响的受试对象给药有效量的工程化的去糖基化的人单克隆抗体来降低治疗性中和抗体的效应子功能的方法，所述单克隆抗体含有工程化的Fc区域，其中Fc区域的去糖基化降低与治疗性中和抗体有关的、抗体介导的细胞激活、抗体介导的经典激活途径和炎症。
【专利说明】去糖基化的人类抗体、其融合蛋白质及用途
[0001] 相关申请
[0002] 本申请要求2011年12月28日提交的61/581，080的权益，该申请的主题以引用 方式全文并入本文。

【背景技术】
[0003] 免疫球蛋白（IgG)是大分子。它们是由2条重链和2条轻链构成的抗体。每条轻 链都具有2个部分：恒定区（LC)和可变区（LV)。每条轻链都具有1个可变部分（HV)和4 个恒定部分（CHI、CH2、CH3和CH4)。每条链上，各可变部分后面为恒定部分。各轻链通过 一个或多个链间共价二硫键而与重链连接。各重链和轻链还包括规则间隔的链间二硫桥。 可变结构域由各抗体特异性的互补决定区（CDR)和构架区（FW)构成。可变结构域决定了 抗体的功能和结合。CDR是抗体与抗原结合的主要结合节段。恒定结构域（由CH1、CH2和 CH3区构成）不参与抗原的结合。CH2和CH3构成了抗体的Fc区。Fc区形成了多种"效应 器功能"（参见下文），包括某些生物活性，这些活性在治疗性中和抗体中可能是不利的。此 类不利的效应器功能包括Clq结合以及抗体依赖的细胞毒作用（ADCC)的应答。抗体的Fc 区I (具体而言为效应器结构域）与免疫效应器细胞（例如巨噬细胞）表面上的Fc受体 (Fc. y.Rs)结合。这导致吞噬作用或靶细胞的溶解。在补体依赖的细胞毒作用（CDC)中， 抗体通过引发细胞表面上补体的级联作用并形成MAC而杀死靶细胞。
[0004] 有5种主要类型的免疫球蛋白：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM。IgG被进一步分为4 种同种型：IgGl、IgG2、IgG3和IgG4。由于位于这些同种型恒定结构域中的序列而引发不 同的应答。已知IgGl、IgG2和IgG3同种型会导致补体系统激活及⑶C(参见图1)。已知 IgGl和IgG3同种型会介导ADCC。4种IgG同种型的重链组成不同。在治疗性抗体中，人 类IgGl为最常用的同种型。因此，修改治疗性抗体效应器功能的尝试集中在IgGl同种型 上。但是，不同的IgG同种型（具有不同的固有的效应器功能性）更通常用于降低和/或 利用效应器功能。本领域须要研发IgG2、IgG3、IgG4同种型及同种型杂交体（Fc修饰或Fc 未修饰）用作治疗性抗体的用途。本发明的目的在于解决一部分所述的这些须要。
[0005] 杂交同种型-IgG抗体的铰链区位于重链的CH1和CH2部分之间，并且特别容易 被蛋白水解酶切割。抗体可以经重组改造，从而形成杂交同种型，其包括由2种或多种不同 的同种型得到的部分。例如现有技术包括杂交抗体，其包括与IgG4同种型抗体的CH2和 CH3部分融合的、IgG2同种型抗体的可变部分和第一恒定部分（美国专利20070041972)。
[0006] Fc介导的效应器功能-Fc "效应器功能"是除了抗体的主要功能和目的以外的抗 体（天然抗体或改造抗体）的生物活性。在治疗性中和抗体中，效应器功能是除了中和靶 蛋白或途径以外的抗体的生物活性。抗体效应器功能的实例包括：Clq结合和补体依赖的 细胞毒作用；Fc受体结合；抗体依赖的细胞介导的细胞毒作用（ADCC);吞噬作用；细胞表 面受体（例如B细胞受体）的下调节；表达Fc受体的血小板激活的缺乏；以及B细胞的激 活。许多效应器功能起始于Fc与Fc γ受体（Fc. γ . R)的结合。有3种亚类的Fc. γ . R : Fc. γ · RI (CD64)、Fc. γ · RII (CD32)和 Fc. γ · RIII (CD16)。
[0007] 发明概述
[0008] 本发明为包括Fc变体的改造抗体，该抗体衍生自同种型IgG2、IgG3和IgG4的亲 代抗体，其中Fc区的至少1个氨基酸被修饰。大部分的治疗性抗体都是IgG同种型，它们 往往显示更强的效应器功能活性。但是，未修饰的野生型同种型IgG2、IgG3和IgG4表现出 低于IgGl同种型抗体的效应器功能活性。所述的改造抗体的Fc区为多种不理想的效应器 功能（例如经典的激活途径及抗体介导的细胞溶解）的基因座。同种型IgGl和其他同种 型之间的效应器功能活性差异可归因于同种型Fc区的差异。在本发明的多个实施方案中， Fc区衍生自除了 IgGl以外的同种型的抗体。本发明为通过向痛苦中的受试对象给药有效 量的除了 IgGl以外的同种型的改造人类单克隆抗体，来降低治疗性中和抗体的效应器功 能的方法，其中对Fc区的修饰阻止了抗体介导的细胞激活、Clq结合、炎症以及抗体引发的 经典的激活途径。本发明描述了改造抗体和抗体杂交体，它们在Fc区具有突变，和/或具 有由除了 IgGl以外的同种型衍生的Fc区。本发明包括这样的抗体：具有由一种同种型衍 生的不同的目标结合区的杂交体；与由IgG2、IgG3或IgG4同种型衍生的经修饰和/或未修 饰的Fc区结合。本发明的目的在于能够使用具有降低的Fc介导的应答、但具有正常的体 内半衰期的治疗性中和抗体。
[0009] 在一些应用中，例如在治疗性抗体作为抗癌药品的用途中，某些效应器功能是理 想的。在其他的应用中，某些效应器功能是不理想的。例如在靶向旁路途径的特异性蛋白 质的治疗性抗体的情况下，激活经典的补体途径的效应器功能是不理想的。为了减小或消 除治疗性抗体的副作用，本发明提供了减小或消除效应器功能的方法。
[0010] Fc区的作用-抗体的Fc区介导了抗体的效应器功能和血清半衰期。这些效应器 功能包括但不限于：补体依赖的细胞毒作用（CDC)、抗体依赖的细胞毒作用（ADCC)、抗体依 赖的细胞吞噬作用（ADCP)、以及Clq依赖的经典的激活途径。IgG与Fc. Y.R和/或Clq 的结合由Fc区内的特异性残基或结构域控制。此外，结合依赖于位于抗体铰链区及CH2部 分的残基。由许多发明人制造的多种突变来识别与Fc结合有关的区域。改造治疗性单克 隆抗体（mAb)的Fc区、或Fc融合蛋白质能够使人们得到这样的分子，其更适于中和治疗所 需的药理学活性。
[0011] FcRn :-种类型的Fc受体为新生的Fc受体（FcRn)。该受体在测定单克隆抗体的 血清半衰期中是重要的。FcRn在内皮细胞的表面上表达并以pH依赖的方式与IgG结合。 该结合导致抗体内吞至内吞膜泡中。这使细胞能够使所述的抗体再循环至血清中，从而使 IgG半衰期为大约23天。
[0012] Fc效应器&Clq结合：抗体的效应器功能在体内是重要的，并且在抗癌治疗性抗体 的研发中已经针对它们的益处进行了开发。尽管增强的效应器功能是研发抗癌治疗所必 须的，但是降低的效应器功能在慢性指征的中和抗体的研发中是必要的。所有4种IgG同 种型均与Fc受体Fc. γ . RI、Fc. γ . RIIA和Fc. γ . RIIIA结合，并激活Fc受体Fc. γ . RI、 Fc. Y.RIIA和Fc. Y.RIIIA。由于Fc. Y.RIIB为抑制性受体，所以抗体与该受体结合不会 激活补体和细胞应答。Fc. Y.RI为以单体形式与IgG结合的高亲和性受体。Fc. Y.RIIA、 和Fc. γ . RIIIA为仅以多聚体形式与IgG结合并具有稍低亲和性的低亲和性受体。因此， 需要大量的IgG抗体来产生免疫源性应答。
[0013] 本文中"野生型或WT"是指自然界发现的氨基酸序列或核苷酸序列，包括等位基因 变体。WT蛋白质具有具有未经特异修饰的氨基酸序列或核苷酸序列。
[0014] 去糖基化-已知IgG抗体Fc区的去糖基化会干扰抗体的效应器功能。Fc区的去 糖基化可以以多种方式完成。一种所述的方式是通过Fc区的CH2部分内在位置297处氨 基酸（天冬氨酸）的突变。该位置似乎为IgGl、IgG2、IgG3和IgG4中天冬氨酸297处的单 一保守位点。与该糖基化位点连接的糖链对于IgG效应器功能而言是重要的。晶体学研究 证明碳水化合物链在2个相对的CH2结构域之间形成的桥。去糖基化的IgG不再与FcyR 或Clq结合，因此不会引发ADCC和经典的补体激活途径。
[0015] 许多报告显示，调节与FcyRIIIA结合的IgG对于生成用于肿瘤抑制的治疗性mAb 是重要的。在小鼠模型中，治疗性mAb必须存在激活的FcyR来控制肿瘤的进程并增加存活 率。因此，在抗癌治疗方面，已经广泛探索修饰人类IgGl的糖基化谱的策略。Fc受体（FcyR) 连接细胞与体液的免疫应答。通过IgG的Fc区刺激表达这些受体的细胞具有引人注意的 结果，包括ADCC、ADCP、经典的激活途径、氧爆作用及炎症中间体的释放。IgGl对经典激活 途径和Fc效应器功能具有强烈的影响。除去IgGl同种型Fc区的糖基化会极大地减少经 典激活途径。Fc介导的效应器功能可以通过在Fc区内引入所选的定点突变而降低。如发 明详述中所讨论的那样，Fc介导的效应器功能的降低还可以通过使用另一种同种型的Fc 区取代IgGl同种型的Fc区来实现。
[0016] 在本发明的一个实施方案中，改造抗体包括在位置297处的突变，其阻止了在该 位点处的糖基化。位置297处的天冬氨酸可以被不会导致N-连接的糖基化的氨基酸残基 替代。可以识别一部分所述的这种氨基酸为丙氨酸和谷氨酸。阻止糖基化会阻止不理想的 效应器的功能。
[0017] 用于阻止Clq结合&补体激活的现有方法-Clq与Clr和Cls形成了 C1复合物， 其为补体依赖的细胞毒作用（CDC)途径的第一成分。效应器功能为全长IgG的固有性质， 并且在中和特异性蛋白质的治疗性单克隆抗体中必须受到下调节/抑制。在现有技术范围 内，有3种不同的策略来降低抗体的效应器功能：1)位于Fc结构域内的氨基酸的突变，这 些氨基酸涉及效应器结合的相互作用；2)除去Fc区，并使用聚乙二醇（PEG)缀合物替代Fc 区；以及3)使用IgG4抗体的Fc区替代IgG2抗体的Fc区（创建杂交同种型）。体外试验 已经用于证明Clq与抗体的结合。
[0018] 通过N297处的定点突变去糖基化-已经显示糖基化会诱导经典激活途径，这 会导致炎症中间体（包括C3a、C5a、C5b-9)以及一系列有害的白细胞介素（包括IL-1和 TNF-α)的形成。这种多余的经典补体激活途径可以通过将位置297处的天冬氨酸（N)突 变成丙氨酸（A)或谷氨酰胺（Q)而降低。去糖基化的IgGl抗体会减少Clq的结合（示于 表1中）。这种去糖基的抗体还可以通过利用酶和/或化学的去糖基化而形成。宿主细胞 可以是细菌、哺乳动物病毒或酵母。去糖基抗体或抗体衍生物在转基因哺乳动物（其在牛 奶中表达抗体）中生产，从而有利于大规模地生产去糖基的抗体。几乎所有市场化的抗体 均为IgGl。
[0019] 通过PEG取代去糖基化-使用聚乙二醇（PEG)缀合物替代Fc区会降低效应器功 能，而且还会减小抗体的半衰期。因此，该方法在具有更慢性指征的治疗性抗体中是不理想 的。
[0020] 通过同种型杂交体去糖基化-尽管IgG2和IgG4抗体是糖基化的，但是它们固有 地降低补体的激活并减少Fc结合（参见表1)。这些观察表明这些同种型包括具有氨基酸序 列或蛋白质基元的Fc区，这证明了降低的Fc效应器功能和补体依赖的细胞毒作用。为了进 一步降低这些同种型的效应器功能，如同IgG2m4和IgG2m3抗体一样，将去糖基化的突变引 入到IgG2抗体的Fc区。这些抗体证明了甚至进一步降低的效应器功能。位置234/235/237 在介导Fc应答中似乎是重要的，由此已经由V/A/G突变为A/A/A。此外，诸如330/331之类 的其他突变似乎也是重要的，并被许多研究组广泛研究。
[0021] 在一个实施方案中，本发明新生成的抗体具有完整的FcRn结合区及保持的半衰 期。效应器功能降低且Clq结合能力降低的抗体为这样的抗体，与未突变的天然IgG相比， 所述的抗体对Fc受体1、11和III的结合亲和性降低，且ADCCXDC及Clq降低。本发明包 括一种方法，其会降低效应器的功能，同时保持半衰期，其中改造的抗体会结合FcRn，但不 会结合Clq。所述的此类抗体具有保持的半衰期，但不会激活经典途径。
[0022] 如本文所述，IgG的Fc区、特别是本发明的CH2区可以用于生产任何非免疫刺激 性抗体或抗体样蛋白质、融合蛋白质（包括人源化的和治疗性抗体），并且可以用于阻止Fc 受体的结合，或者与补体蛋白质的结合。本领域的技术人员生成并生产的抗体包括但不限 于它们的多克隆或单克隆抗体、嵌合或人类抗体、人源化的或人类中和抗体、双特异性或单 链抗体。本发明的抗体可以具有附着于其上的其他部分，例如微球体、微粒子或聚乙二醇化 的分子可以附着在抗体或抗体片段上。
[0023] N297突变阻止IgGl的糖基化-目前公开的技术描述了 N297突变在阻止IgGl的 糖基化、并由此降低IgGl的效应器功能中的有效性。与IgGl相比，IgG2固有地降低了补 体激活途径、ADCC和Fc效应器功能，如图1所示。因此，除去糖基化应该会进一步降低补 体的激活、ADCC活性剂Fc受体的结合。因此，本发明靶向于如同IgG2固有地降低效应器 功能及补体激活的、具有297突变的IgG2同种型。通过297突变而除去糖基化，可以进一 步降低Clq的结合和效应器功能。突变可以包括不会导致天冬氨酸（asp)被糖基化的任何 氨基酸。
[0024] IgGl的CH2区内的突变-已经识别IgGl的CH2区内的一系列突变。公开的突 变涵盖整个CH2区。难以选择一种可以得到所需的降低的⑶C、ADCC和Fc受体的结合的 突变。本发明要求形成特异性删除了 CH1的抗体的权利，其中所述的抗体会降低CDC、ADCC 和Fc受体（不包括FcRn)的结合。在之前的发明涉及突变为IgGl同种型的条件下，本发 明将这些突变应用于IgG2同种型。可以使用CH2删除方法来构建这些抗体，其中大部分的 Fc效应器突变位于IgG的CH2区中。此外，这种删除还生成了去糖基化的抗体，这是由于 N297为CH2结构域的一部分。N297是指位置297处（Kabat编号）的天冬氨酸，其被Q或 Ala替代。
[0025] 具有4个IgG2m4的IgG2抗体-之前的发明要求被称为IgG2m4的具有4个突变 的糖基化IgG2抗体的权利。这种突变的IgG2m4构建体是基于IgG2和IgG4序列。由IgG4 得到的一些天然发现的序列被引入到IgG2序列中。这种突变的IgG2似乎阻止了 Fc效应器 功能，包括Clq结合和Fc受体的结合。Merk(USPT0#7700099)描述了效应器能够被降低的 糖基化IgG2抗体的用途。与去糖基化的IgGl抗体相似的突变会进一步降低Fc应答。IgG2 的CH1序列与IgGl的CH1序列不同。但是，可以使用由IgGl、IgG3和IgG4得到的CH1，并 与由IgG2或IgG4序列衍生得到的铰链区、CH2和CH3连接。本发明（本申请）得到抗体 杂合体，其中IgGl抗体的可变区与IgG2或IgG抗体的下方恒定区（包括Fc)结合。CH2结 构域在以下残基234, 235, 230, 237, 268, 297, 309, 330和331的一个或多个残基处具有突变 (或不包括突变），从而生成IgGl/IgG2或IgGl/IgG4杂交体。
[0026] 附图简述
[0027] 图1为不同IgG同种型的特征的表，其比较了正常的性质、结合及效应器功能活 性。
[0028] 图2描述了 IgG2野生型（WT)与底物结合的抗原的结合。抗体以高亲和性与其目 标抗原结合。
[0029] 图3描述了去糖基化的IgG2 (297突变）与底物结合的抗原的结合。去糖基化的 IgG2抗体以高亲和性与其目标抗原结合。
[0030] 图4描述了 IgGl和IgG2的去糖基化的IgG2 (297突变）杂交体与底物结合的抗 原的结合。去糖基化的杂交体抗体以高亲和性与其目标抗原结合。
[0031] 图5描述了正常人类血清中，IgG(297突变）对备选途径的抑制。去糖基化的杂 交体抗体与备选途径的特异性蛋白质结合并中和该蛋白质。
[0032] 图6描述了正常人类血清中，具有297突变的IgGl/IgG2杂交体对备选途径的抑 制。杂交体抗体与备选途径的特异性蛋白质结合并中和该蛋白质。
[0033] 图7描述了正常人类血清中，具有297突变的IgGl/IgG2杂交体对经典途径的抑 制或激活的缺乏。杂交体抗体不会影响经典途径的活性。
[0034] 图8描述了正常人类血清中，具有IgG2Fc区（其具有297突变）的抗体对经典途 径的抑制或激活的缺乏。去糖基化的IgG2抗体会结合但不会影响经典途径的活性。
[0035] 图9证明了在正常人类血清中，IgGl/IgG2杂交体抗体不会结合Clq。Clq被用作 Clq的来源。Avastin被用作以高亲和性与Clq结合的阳性对照。
[0036] 图10证明了在正常人类血清中，去糖基化的IgG2 (297突变）抗体不会结合Clq。 人类血清被用作Clq的来源。Avastin被用作以高亲和性与Clq结合的阳性对照。
[0037] 图11证明了糖基化的IgGl抗体以高亲和性与目标抗原备解素结合。
[0038] 图12证明了去糖基化的IgGl (297突变）抗体以高亲和性与目标蛋白质备解素结 合。
[0039] 图13证明了糖基化的IgGl抗体会抑制AP的激活。
[0040] 图14证明了去糖基化的IgGl (297突变）抗体会抑制AP的激活。
[0041] 图15证明了在正常的人类血清中，去糖基化的IgGl (297突变）抗体不会结合 Clq。糖基化的抗体会结合Clq。
[0042] 图16证明了去糖基化的IgGl (297突变）不会结合Fc. γ · RI蛋白质。
[0043] 图17证明了去糖基化的IgGl (297突变）抗体不会结合Fc. Y.RIII蛋白质。
[0044] 发明详述
[0045] 定义
[0046] 除非本文中特意说明，否则该文件中使用的所有术语都具有如同本发明领域的那 些普通技术人员所理解的相同的含义。为了清楚起见，提供以下定义，并将它们的预期含义 定义为如同描述本发明的说明书和权利要求书中所用的那样。
[0047] "抗体依赖的细胞介导的细胞毒作用"（"ADCC"）是指细胞介导的反应，其中表达 FcyR的非特异性细胞毒细胞识别并导致具有结合抗体的目标细胞的溶解。
[0048] "抗体依赖的细胞介导的吞噬作用"("ADCP"）是指细胞介导的反应，其中表达FcyR 的非特异性细胞毒性细胞识别并导致具有结合抗体的目标细胞的吞噬作用。
[0049] "去糖基化的"是指具有羟基或未附着于糖基化基团上的其他官能团的抗体。也称 为不具有碳水化合物残基的抗体。
[0050] 如本文所用，术语"抗体"是指由生产抗体的任何哺乳动物（例如小鼠、大鼠、兔子 和灵长动物，包括人）衍生得到的抗体或其抗体片段，其特异性地与备选途径的特异性蛋 白质结合。示例性的抗体包括单克隆抗体、多克隆抗体、重组抗体；多特异性抗体（例如双 特异性抗体）；人源化的抗体；鼠抗体；嵌合、鼠-人、鼠-灵长动物、灵长动物-人单克隆抗 体；以及抗独特型抗体，并且可以为任何完整的分子或其片段。
[0051] "抗体片段"是指由全长抗体衍生的或者与全长抗体相关的部分，通常包括抗原结 合或其可变区（参见"抗原结合片段"）。术语"抗体片段"是指由全长抗体衍生的部分，通 常包括抗原结合及其可变区。其他抗体包括由抗体片段形成的双价抗体、线性抗体、单链抗 体分子和多特异性抗体。抗体片段的实例包括Fab、Fab'、F(ab)2、F(ab'）2、Fv片段或scFv 片段。
[0052] 抗体的"抗原结合片段"（或"抗原结合区"）是指完整抗体的一个或多个片段，其 中所述的抗体保持了与给定抗原特异性结合的能力。可以通过完整抗体的片段来进行抗体 的抗原结合功能，其中所述的抗体包括互补决定区（CDR)。抗原结合片段的实例：
[0053] "Fab"片段（具有VH和VL的单链可变区）；
[0054] "单价片段"（由VL、VH、CL和CH1结构域组成的抗体片段）；
[0055] "F (ab'）2"片段（包括2个Fab片段的二价片段，其中所述的2个Fab片段是通过 在绞链区的-硫键连接的）；
[0056] "Fd"片段（其由抗体的VH和CH1结构域组成）；
[0057] "Fv"片段（其由抗体的单臂的VL和VH结构域组成）；
[0058] 单一结构域抗体（"dAb"），其由VH结构域或VL结构域组成；
[0059] 分离的互补决定区（"⑶R"）。
[0060] ⑶R(抗原结合片段）还可以被引入到单一结构域抗体、大抗体、小抗体、内抗体、 双价抗体、三价抗体、四价抗体、v-NAR抗体和bis-scFv。抗体的抗原结合片段可以被接枝 到基于多肽（例如III型纤维连接蛋白Fn3)的构架上。抗原结合片段可以被引入到包括 一对串联的Fv节段（VH-CH1-VH-CH1)的单链分子中，其中所述的节段与互补的轻链多肽一 起形成了一对抗原结合区。
[0061] 如本文所用，"单链Fv"或"scFv"抗体片段包括抗体的VH和VL结构域，其中这些 结构域存在于单一多肽链中。
[0062] "补体依赖的细胞毒作用""⑶C"）是指由于补体系统激活及MAC形成所导致的 细胞溶解。⑶C作为效应器功能，由Fc与Clq结合而引发。
[0063] "嵌合抗体"为重组蛋白质，其包括由得自非人类物种的动物衍生的可变结构域和 CDR，而所述的嵌合抗体分子的剩余部分则由人类抗体衍生得到。使用人类恒定区替代抗体 的非结合区能够使嵌合抗体在识别并结合目标抗原中保持其特异性，同时在人类中具有降 低的抗原性（与最初的小鼠抗体相比）。
[0064] "经典途径"是指由抗体-抗体复合物引发并需要C1Q激活的补体。经典途径的传 播可以需要或不需要备选途径的扩增环。
[0065] "互补决定区（⑶R) "是抗体重要的结合区。在2条重链和2条轻链可变区的每个 可变区内通常都可以发现3个⑶R。就位置而言，⑶R可以是变换位置的，从而创建了特定 的结合亲和性。还可参见"抗原结合片段"。
[0066] "效应器功能"是指有助于抗体的天然Fc区的那些生物活性，并随抗体同种型的不 同而改变。抗体效应器功能的实例包括：Clq结合及补体依赖的细胞毒作用；Fc受体的结 合；抗体依赖的细胞介导的细胞毒作用（ADCC);吞噬作用；下调节细胞表面受体（例如B细 胞受体）；表达Fc受体的血小板激活的缺乏；以及B细胞的激活。为了减小或消除治疗性 抗体的副作用，优选的是减小或消除效应器功能。
[0067] 就所述的这些应用而言，"不理想的效应器功能"包括ADCC、⑶C、经典的激活途径、 细胞激活以及抗体介导的炎症。
[0068] "改造的抗体"为非天然生产的抗体，其经改变或创建，从而取得特定的目的或者 具有特定的特征。例如对野生型形式进行蓄意的修饰从而具有降低的效应器功能的抗体为 改造的抗体。
[0069] 如本文所用，术语"Fc区"是指对给定抗原提供防御的抗体区域。
[0070] "抗体的第一部分"是指整个抗体的一部分（小于整个抗体的部分），其包括抗体 的抗原结合区。"抗体的第二部分"是指整个抗体的一部分（小于整个抗体的部分），其由 抗体的一部分组成，该部分未包括在第一部分中。
[0071] 术语"Fc受体"或"FcyR"描述了与IgG的Fc区结合的受体。"FcyRI"、"FCyRII" 及"FcyRIII"为FcyR的亚类。
[0072] 如本文所用，术语"降低的Fc效应器功能"是指抗体的功能，其中所述的抗体不会 针对识别抗体的Fc区的抗原发生作用。降低的Fc效应器功能的实例包括但不限于降低的 Fc与抗原的结合；针对抗原的Fc激活的缺乏；包括突变（阻止正常的Fc效应器功能）的 Fc区；或者阻止血小板和具有Fc受体的其他细胞的激活。
[0073] "人类抗体"为这样的抗体，其中抗体的所有成分均为人类起源的，包括构架、CDR 和恒定区。术语"人源化的抗体"为非人类起源的抗体，其保持了非人类抗体的结合特异性， 同时在人类中具有较低的免疫源性。参见嵌合抗体和人源化抗体。
[0074] 如本文所用，术语"免疫源性"是指抗原引发受试对象产生免疫应答的能力。
[0075] 对抗体、抗体片段和/或抗体的Fc区进行的"修饰"是指在蛋白质的野生型多肽 序列中，一个或多个氨基酸的取代、插入或删除。修饰的抗体、抗体片段和/或Fc区为其中 采用人工方法进行修饰的那些。
[0076] "亲本抗体"为野生型或未修饰的抗体，由这些抗体衍生得到改造的抗体或抗体片 段。
[0077] "目标抗原"是指抗体特异性地结合的蛋白质、碳水化合物、脂质或其他化学化合 物。
[0078] "治疗性中和抗体"是指这样的任何抗体，其经研发将靶向特定蛋白质并预计/预 期在给与该抗体的受试对象中具有治疗作用。
[0079] 本发明的详细描述
[0080] 本发明中，我们描述了具有改造的重链恒定区的重组单克隆治疗性抗体，该抗体 可表征为不理想的效应器功能被降低，例如ADCC、CDC、经典的激活途径和抗体引发的炎症。 我们的目标是设计并研发不理想的效应器功能被降低的效应器功能。在一个实施方案中， 本发明为其中位置N297处的氨基酸被修饰的、去糖基化的IgG2同种型抗体。在另一个实施 方案中，本发明为具有修饰的Fc区的去糖基化的IgGl/IgG2杂交体。这些抗体不会与Clq 结合，因此不会激活经典途径。
[0081] 文献综述表明效应器功能的降低可以通过以下3种方式来完成：
[0082] 1)通过产生缺乏完整的Fc区的抗体；
[0083] 2)通过在IgGl同种型抗体的Fc区内进行突变；以及
[0084] 3)形成杂交同种型抗体，其中由IgG2同种型得到的Fab部分与由IgG4同种型得 到的 Fc 区连接（EP1635872 A2)。
[0085] 完全缺乏Fc区（上述方法2)的抗体的血清半衰期会降低。使用此类抗体进行治 疗在临床上需要频繁的定量给药，从而在慢性情况下取得效力。有多种临床指征，在临床上 对这些指征进行所述的频繁定量给药并非是不可能，但是不切实际的。尽管具有修饰的Fc 区的IgGl抗体未显示出降低的效应器功能，但是IgGl同种型并非是降低效应器功能的理 想的同种型。杂交IgG2m4同种型抗体（上述方法3)显示效应器功能有一些降低。IgG2和 IgG4同种型是极相似的，因此相对容易研发出IgG2/IgG4杂交体。本发明的杂交抗体证明 效应器功能甚至进一步降低。
[0086] 在本发明的一个实施方案中，IgG2同种型的Fc区经修饰而产生具有降低的效应 器功能的去糖基化的抗体。在本发明的另一个实施方案中，IgG2或IgG3同种型的天然或 修饰的Fc区域与由IgGl、IgG2、IgG3或IgG4同种型得到的可变区结合。本发明为通过在 IgG2、IgG3或IgG4抗体的Fc区内进行定点突变和/或重组改造来生产杂交同种型（其中 Fc区衍生自IgG2、IgG3或IgG4抗体），从而制备和使用去糖基化的抗体。此类抗体具有降 低的抗体依赖的细胞介导的细胞毒作用（ADCC)、Fcy受体结合及补体依赖的细胞毒作用 (CDC)。Fc区内的天冬氨酸（N)突变为丙氨酸和/或谷氨酸会降低抗体的C1Q结合性。 [0087] 本发明涵盖了具有以下构造的非杂交和杂交抗体：
[0088] 1)抗体的第一部分得自IgGl、IgG3或IgG4,而Fc区得自野生型IgG4或去糖基化 的IgG4冋种型；
[0089] 2)抗体的第一部分得自IgG2,而Fc区得自去糖基化的IgG2、IgG3或IgG4 ;
[0090] 3)抗体的第一部分得自IgGl，而Fc区得自未修饰的IgG2、IgG3、IgG4,以及
[0091] 4)抗体的第一部分得自IgG4,而Fc部分得自去糖基化的及糖基化的IgGl、IgG2、 IgG3。
[0092] 通过在Fc区内位置297处的突变使IgGl去糖基化在本领域中已经有所描述。此 类抗体已经显示在体内具有较长的半衰期。此外，它们还被描述为显示出降低的C1Q结合、 降低的Fc结合以及降低的效应器功能。
[0093] 术语"Fc受体"及"FcyR"描述了与IgG的Fc区结合的受体。优选的FcyR为FcyRI、 FcyRII和FcyRIII亚类。FcyRII受体包括FcyRIIA( "激活受体"）和FcyRIIB( "抑制受 体"）。本发明分离的非免疫刺激性抗体伴随而来的是不能与Clq结合。
[0094] 在具体的实施方案中，本发明并入了 IgG2、IgG3或IgG4的Fc区氨基酸序列的基 本部分。免疫球蛋白的Fc区通常涵盖了 2个恒定结构域CH2和CH3。如本文所用，"IgG2 的Fc区的基本部分"是指80%至98%的Fc区的氨基酸序列为天然IgG2。ADCC、CDC、Fc结 合及Clq结合的降低是通过使IgG2Fc区的所选氨基酸残基突变而取得的。CH2结构域由氨 基酸231延伸至氨基酸340。在具体的实施方案中，IgG2Fc区包括在氨基酸残基297、234、 235和331处的氨基酸残基突变。此外，去糖基化的IgG2的非糖基化Fc区除了 N297突变 以外，还可以包括在氨基酸残基H268Q、V309L、A330S和P331S处的突变。在297、234、235 和331处具有突变的本发明的IgG2Fc区可以用于生产具有降低的Fc效应器和Clq结合的 抗体和/或融合蛋白质，而不会影响抗体的FcRn和其他药理学性质。此外，突变的这些组 合还可以被引入到它们的多克隆或单克隆抗体，嵌合或人类抗体，人源化的、中和的、双特 异性的或单链抗体。本发明的抗体可以具有附着于其上的其他部分。
[0095] 本发明的抗体或抗体样分子可以作为药物组合物或药剂的成分给与。药物组合物 或药剂通常包括活性治疗剂以及多种其他药物可接受的成分。
[0096] 杂夺抗体和融合蛋白质
[0097] 此外，还可以使用本发明所建议的IgG的改变的恒定区来制备抗体融合蛋白 质。可以使用连接体或不使用连接体，将抗体的抗原结合区（例如Fab、F(ab)2、SCFv)与 CH2-CH3融合。还可以使用本领域已知的其他连接体。此外，本发明还描述了其中CH2被 CH1替代的融合蛋白质。CH1区是温和的，并且不会导致不理想的Fc效应器功能。由于CH3 结构域中的FcRn结合区，所述的分子的半衰期将保持与在它们的原始位置具有CH2和CH3 的分子相似。此外，还制备并生产CH1和CH2区被删除的抗体。本发明涵盖以下抗体：
[0098] 1)去糖基化的IgG2和IgG4抗体。去糖基化是由于297位置处的突变所导致的。
[0099] 2)包括H268Q、V309L、A330S和P331S突变的去糖基化的IgG2,其将效应器功能降 低超过至去糖基化的IgG2的基线设定以外。
[0100] 3)去糖基化的IgGl和IgG4杂交体，其中CH1得自IgGl或IgG3,而CH2和CH3得 自IgG2或IgG4。IgG4中的297残基由N297突变为A297。
[0101] 4)其中使用CH1结构域替代CH2结构域从而使构建体为F(ab) 2-CH1-CH3的抗体。
[0102] 在4)中，在Fab和CH1之间以及CH1和CH2之间加入连接体。最终的构建体应该 具有以下（或相似的）结构之一：a)Fv-CHl-连接体-CH1-连接体-CH3 ;或b)Fv-CHl-连 接体-CH2-连接体-CH3。CH1为非活性的恒定区，因此用于形成具有较长半衰期的延长的 Fab。连接体可以多种类型，特别是本领域已知的那些，例如（GGGGS)n。可以通过本领域已 知的任何连接体（例如那些（GGGGS)n)将融合蛋白质和/或抗原结合片段、或任何受体蛋 白质多肽固定至CH2-CH3上。可以由结构a)和b)制备多种修饰和组合，例如改变连接体 在Fv、CHI、CH2和CH3之间的位置。连接体的存在和缺乏可以创建具有较长半衰期的所关 注的分子。Fc融合将抗体的Fc区（并由此形成有力的效应器功能和药代动力学）与受体、 配体或一些其他蛋白质或蛋白质结构域的靶物结合区结合。由于Fc融合为与抗体具有功 能重叠部分，因此，本发明包括Fc融合物。
[0103] 对于AP中和抗体而言，特别重要的是介导的Fc应答被减小并且Clq结合被抑制。 我们的目标是形成具有降低的Fc和Clq结合的治疗性AP中和抗体，从而作为完全除去Fc 区的备选方法。目前很多报告显示Fc区（CH2和CH3结构域）内的单点或多点突变可以降 低抗体与Fc受体及Clq的结合，由此将此不理想的效应器功能，而不会损害抗体的血清寿 命。具有此类修饰的抗体可以用于研发靶向AP的任何治疗性抗体，该抗体将中和AP而不 会激活CP (通过效应器功能）。IgG2的去糖基化从未被描述用于阻止CP激活及抗体的其 他Fc效应器功能。这是本发明的创新。
[0104] 实施例1
[0105] 与目标蛋白质各解素的结合亲和件
[0106] 野生型IgG2、去糖基化的IgG2以及去糖基化的IgGl/IgG2杂交抗体以高亲和 性与目标蛋白质结合。在常规测试中，使用处于磷酸盐缓冲盐水（PBS)中的人类因子 P(Complement Technologies, San Diego, CA)涂敷聚苯乙烯微滴定板，并过夜。在吸出因 子P溶液后，在室温下使用包括1 %牛血清白蛋白（BSA) (Sigma Chemical Company, St. L〇uis，M〇.)的PBS将各孔封闭2小时。未涂敷因子P的孔作为背景对照。将处于封闭溶 液中的各种浓度的研究抗体的等分液加入到因子P涂敷的孔中，并允许平板静置1小时，从 而使单克隆抗体与结合有因子P的基底结合。使用PBS洗涤平板，并通过加入过氧化物酶 缀合的山羊抗人单克隆抗体（检测抗体）（American Qualex)(在封闭溶液中以1:2000稀 释）（允许在室温下温育1小时）检测因子P结合的单克隆抗体。使用PBS洗涤平板后，加 入 100 μ 1 3, 3'，5, 5' -四甲基联苯胺（TMB)底物（Kirkegaard&Perry Laboratories, Gaith ersburg, Md.，Cat. No. A50-65-00)。在 25°C下温育 10 分钟后，通过加入 100 μ 1 磷酸使 TMB 的反应猝灭，并在微板读取器上在450nm下读取平板（例如SPECTRA MAX 250, Molecular Devices, Sunnyvale, CA)〇
[0107] 所有3种类型的IgG2抗体（IgG2野生型、具有297突变的IgG2以及具有297突 变的IgGl/IgG2杂交体）分别如图2、3和4所示以高亲和性与目标蛋白质结合。如图11 和12中所示，糖基化的IgGl以及具有297突变的去糖基化的IgGl以低皮摩尔的亲和性与 目标蛋白质解备素结合。
[0108] 实施例2
[0109] 证明各诜激活涂径（AP)的抑制的牛物测试
[0110] 为了评估本发明的示例性化合物在类体内系统中抑制AP激活的能力，采用红细 胞溶血测试。兔红细胞（rRBC)与正常人类血清（NHS)在能够产生AP的缓冲剂中温育。 rRBC( "外来物体"）的存在优选地诱导了 AP的激活，使得C5b-9沉积在红细胞上，并最终 导致细胞溶解。基于700nm光密度下的光散射来检测细胞溶解的程度。
[0111] 将兔红细胞（rRBC)引入到10%人类血清（具有Mg2+/EGTA)中呈现为引入了外源 细胞表面，该表面引发了备选的补体级联反应。AP的激活导致MAC的形成，这使得外源细 胞（rRBC)溶解。本发明所选的抗体会阻止这些红细胞溶解。在通过检测由完整红细胞所 导致的光散射后，对上述过程进行定量。
[0112] 已经良好的建立的是兔红细胞会特异性地激活AP，并通过C5b_9 (MAC)复合物使 得rRBC最终溶解。在700nm下测量光散射的程序性降低（由于完整细胞溶解所导致）， 其在温度控制的ELISA平板读取器中作为时间的函数。使用SpectraMax 190平板读取器 和SoftMax Pro软件记录和分析数据。使用MicroCal Origin软件绘制结果。如图6和7 所示，去糖基化的抗体（具有297突变的IgG2)和去糖基化的杂交抗体（具有297突变的 IgGl/IgG2)会抑制AP的激活。如图13和14所示，糖基化的IgGl及具有297突变的去糖 基化的IgGl会以相似的效力抑制备选的激活途径。
[0113] 实施例3
[0114] 去糖某化的抗体不会抑制或激活经A的涂径
[0115] 根据已知的文献，已知IgG2(未改变的）会激活补体途径-参见图1。为了检验抗 体对CP的作用，将抗体致敏的绵羊红细胞（sRBC)与1%正常人类血清在CP缓冲剂（Ca2+/ Mg2+)中温育。这些sRBC会激活CP，这会诱导细胞膜的溶解。细胞膜溶解导致细胞散射 的光逐渐降低。当在37°C下将本发明备选途径的特异性抗体与sRBC在具有缓冲剂（包括 Ca2+和Mg2+) ( "CP缓冲剂"）的1% NHS中温育时，在溶血开始至以最大溶血为结束的时 间段内，未观察到溶血作用。这表明备选途径的中和IgG2抗体在NHS中不会影响CP溶血 活性（数据未示出）。在700nm下测量光散射（由于完整细胞溶解所导致），其为时间的函 数。经典途径的激活不会升至100%对照水平以上，表明去糖基化的抗体及去糖基化的杂交 IgGl/IgG2抗体都不会激活经典途径。相反，已知IgGl本身会激活经典途径。
[0116] 实施例4
[0117] 与补体Cla的结合亲和件
[0118] Clq与抗体结合作为抗体的效应器功能开始了经典的补体激活途径。Clq结合的 程度随着抗体的类型而改变，并且发现与IgGl同种型结合的程度比与IgG2同种型结合的 程度更高。此外，补体依赖的细胞毒作用（CDC)也是通过Clq结合介导的。因此，抗体与Clq 结合的越多，CP激活和CDC活性越高。同样，Clq结合的缺乏与CDC活性的缺乏直接相关。使 用结合测试来评价所有查询抗体的结合情况。在4°C下，使用处于PBS中的2μ g/mL抗体过 夜涂敷结合有培养基的96孔板。在与磷酸盐缓冲盐水pH7. 4温育的各步骤之后洗涤平板， 并在室温下进行温育。涂敷后，使用200 μ 1/孔的封闭溶液（1 % BSA处于PBS中）将平板封 闭1小时，并与各种浓度的正常人类血清温育1小时，其中所述的血清包括内源水平的Clq。 温育并洗漆后，使用HRP缀合的山羊抗人Clq抗体（Complement Technology，Tyler，TX)及 TMB(Kirkegaard&Perry)作为底物，检测结合的Clq。通过加入ΙΟΟμΙ 1M %504溶液终止 反应。通过450nm下的吸光值来测量最终的信号（Spectramax 190and250)。
[0119] 如图15所示，Avastin与Clq极其强烈地结合，这是由于这样的事实：Avastin的 Fc结构域被设计成以增强的⑶C活性与Clq结合。此夕卜，Humira还证明了显著的Clq结 合。Humira的Fc区是未改变的。糖基化的IgGl还证明会与Clq结合。然而，去糖基化的 IgGl不与Clq结合，因此不会表现出⑶C活性。
[0120] 实施例5
[0121] 与Fc. Y.RI及Fc. Y.RIII蛋白质的结合亲和件
[0122] Fc效应器功能对于细胞功能和细胞激活是重要的。就治疗性抗体而言，重要的是 这些抗体不会导致细胞激活和抗体介导的细胞毒作用。已知IgGl同种型显示以高的结合 亲和性激活FcyRI受体。这种特定的同种型与FcyRII和RIII的结合亲和性低于与FcyRI 的结合亲和性。IgG2同种型对这些Fcy受体通常显示低的结合亲和性，如图1所示。通 过制备IgGl和IgG2的去糖基化的亚型，ADCC活性可以被进一步降低。图16显示，去糖 基化的IgGl表现为对测试的FcyRI和FcyRIII受体不结合。在4°C下，使用Fc γ肽过夜 涂敷由Costar得到的结合有培养基的96孔板。在与磷酸盐缓冲盐水pH7. 4温育的各步 骤之后洗涤平板，并在室温下进行温育。涂敷后，使用200 μ 1/孔的封闭溶液（1 % BSA处 于PBS中）将平板封闭1小时，并与各种浓度的抗体（处于封闭溶液中）温育1小时。温 育并洗漆后，使用HRP缀合的山羊抗人Clq抗体（Complement Technology, Tyler, TX)及 TMB(Kirkegaard&Perry)作为底物，检测结合的抗体。通过加入ΙΟΟμΙ 1Μ !12304溶液终止 反应。通过450nm下的吸光值来测量最终的信号（Spectramaxl90and250)。
[0123] 如图16和17所示，去糖基化的抗体显示未与Fc受体结合。
【权利要求】
1. 一种用于降低与治疗性中和抗体有关的、抗体介导的细胞激活、抗体介导的经典激 活途径和炎症的方法，该方法包括：向受试对象给药改造形式的抗体，该抗体包括具有第一 部分和第二部分的改造重链恒定区，其中所述的第一部分衍生自4种已知同种型（由IgGl、 IgG2、IgG3和IgG4组成的一组同种型）的任意一种的一个或多个抗体，而所述的第二部分 衍生自一种或多种人类抗体，该抗体选自由IgGl、IgG2和IgG3组成的一组同种型，其中至 少一部分所述的给药抗体得自除了 IgGl以外的抗体。
2. 权利要求1所述的方法，其中所述的给药抗体是去糖基化的。
3. 权利要求2所述的方法，其中所述的去糖基化是通过使位置297处的天冬氨酸（N) 突变为丙氨酸（A)或谷氨酰胺（Q)而实现的。
4. 权利要求1所述的方法，其中所述的可变区衍生自IgGl、IgG2、IgG3或IgG4同种型 的抗体，而所述的第一恒定区（CH1)衍生自同种型的抗体，该同种型不同于所述的第一恒 定区所衍生的同种型。
5. 权利要求1所述的方法，其中所述的CH2和CH3并非衍生自IgG4。
6. 权利要求1所述的方法，其中所述的抗体与所述的人类补体系统的成分蛋白质结 合。
7. 权利要求7所述的方法，其中所述的抗体与所述的经典途径的成分蛋白质结合。
8. 权利要求7所述的方法，其中所述的抗体与所述的备选途径的成分蛋白质结合。
9. 权利要求1所述的方法，其中所述的通过去糖基化的Fc改造会降低ADCC和CDC的 活性。
10. 权利要求1所述的方法，其中所述的抗体与细胞因子或细胞因子受体结合。
11. 权利要求1所述的方法，其中所述的抗体与生长因子结合。
12. 权利要求1所述的方法，其中所述的抗体与趋化因子或趋化因子受体结合。
13. 权利要求7、8、9、11、12或13所述的方法，其中所述的抗体与可溶的或分泌蛋白质 结合。
14. 权利要求7、8、9、11、12或13所述的方法，其中所述的抗体与细胞表面的分子结合。
15. 权利要求1所述的方法，其中所述的给药抗体包括取自以下序列组中的一条序列 的结合区，其中所述的序列组由 SEQ ID#1，SEQ ID#2，SEQ ID#3，SEQ ID#4，SEQ ID#5，SEQ ID#6，SEQ ID#7，SEQ ID#8，SEQ ID#9 和 SEQ ID#10 组成。
16. -种用于降低与治疗性中和抗体有关的、抗体介导的细胞激活、抗体介导的经典 激活途径和炎症的方法，该方法包括：向受试对象给药改造形式的抗体，该抗体包括：可变 区；由IgGl、IgG3或IgG4抗体得到的恒定区的一部分；以及由一种或多种人类IgG2抗体 衍生得到的经改造的CH2和CH3区。
17. 权利要求16所述的方法，其中所述的给药抗体是去糖基化的。
18. 权利要求16所述的方法，其中所述的去糖基化是通过使位置297处的天冬氨酸 (N)突变为丙氨酸（A)或谷氨酰胺（Q)而实现的。
19. 权利要求16所述的方法，其中所述的可变区衍生自IgGl、IgG2、IgG3或IgG4同种 型的抗体，而所述的第一恒定区（CH1)衍生自同种型的抗体，该同种型不同于所述的第一 恒定区所衍生的同种型。
20. 权利要求16所述的方法，其中所述的CH2或CH3衍生自IgG2,但并非CH2和CH3 同时衍生自IgG2。
21. 权利要求16所述的方法，其中所述的抗体与所述的人类补体系统的成分蛋白质结 合。
22. 权利要求21所述的方法，其中所述的抗体与所述的经典途径的成分蛋白质结合。
23. 权利要求21所述的方法，其中所述的抗体与所述的备选途径的成分蛋白质结合。
24. 权利要求16所述的方法，其中所述的通过去糖基化的Fc改造会降低ADCC和CDC 的活性。
25. 权利要求16所述的方法，其中所述的抗体与细胞因子或细胞因子受体结合。
26. 权利要求16所述的方法，其中所述的抗体与生长因子结合。
27. 权利要求16所述的方法，其中所述的抗体与趋化因子或趋化因子受体结合。
28. 权利要求21、22、23、25、26或27所述的方法，其中所述的抗体与可溶的或分泌蛋白 质结合。
29. 权利要求21、22、23、25、26或27所述的方法，其中所述的抗体与细胞表面的分子结 合。
30. -种用于降低与治疗性中和抗体有关的、抗体介导的细胞激活、抗体介导的经典激 活途径和炎症的方法，该方法包括：给药改造形式的抗体，该抗体包括：可变区；由IgGl或 IgG2得到的恒定区的一部分；以及由一种或多种人类IgG4抗体衍生得到的去糖基化的CH2 和CH3区。
31. 权利要求30所述的方法，其中所述的给药抗体的IgG4部分是去糖基化的。
32. 权利要求30所述的方法，其中所述的去糖基化是通过使位置297处的天冬氨酸 (N)突变为丙氨酸（A)或谷氨酰胺（Q)而实现的。
33. 权利要求30所述的方法，其中所述的可变区可以衍生自抗体IgGl、IgG2、IgG3或 IgG4同种型。
34. 权利要求30所述的方法，其中所述的可变区衍生自IgGl或IgG2同种型的抗体，而 所述的第一恒定区（CH1)衍生自同种型的抗体，该同种型不同于所述的第一恒定区所衍生 的同种型。
35. 权利要求30所述的方法，其中所述的CH2或CH3衍生自IgG4,但并非CH2和CH3 同时衍生自IgG2。
36. 权利要求30所述的方法，其中所述的抗体与所述的人类补体系统的成分蛋白质结 合。
37. 权利要求36所述的方法，其中所述的抗体与所述的经典途径的成分蛋白质结合。
38. 权利要求36所述的方法，其中所述的抗体与所述的备选途径的成分蛋白质结合。
39. 权利要求30所述的方法，其中所述的通过去糖基化的Fc改造会降低ADCC和⑶C 的活性。
40. 权利要求30所述的方法，其中所述的抗体与细胞因子或细胞因子受体结合。
41. 权利要求30所述的方法，其中所述的抗体与生长因子结合。
42. 权利要求30所述的方法，其中所述的抗体与趋化因子或趋化因子受体结合。
43. 权利要求36、37、38、40、41或42所述的方法，其中所述的抗体与可溶的或分泌蛋白 质结合。
44. 权利要求36、37、38、40、41或42所述的方法，其中所述的抗体与细胞表面的分子结 合。
45. -种用于降低与治疗性中和抗体有关的、抗体介导的细胞激活、抗体介导的经典激 活途径和炎症的方法，该方法包括：向有需要的哺乳动物给药改造形式的去糖基化的IgG2 抗体，以预防炎症。
46. 权利要求45所述的方法，其中所述的给药IgG2抗体是通过位置297处的天冬氨酸 (N)突变为丙氨酸（A)或谷氨酰胺（Q)而去糖基化的。
47. 权利要求45所述的方法，其中所述的抗体与所述的人类补体系统的成分蛋白质结 合。
48. 权利要求47所述的方法，其中所述的抗体与所述的经典途径的成分蛋白质结合。
49. 权利要求47所述的方法，其中所述的抗体与所述的备选途径的成分蛋白质结合。
50. 权利要求45所述的方法，其中所述的通过去糖基化的Fc改造会降低ADCC和CDC 的活性。
51. 权利要求45所述的方法，其中所述的抗体与细胞因子或细胞因子受体结合。
52. 权利要求45所述的方法，其中所述的抗体与生长因子结合。
53. 权利要求45所述的方法，其中所述的抗体与趋化因子或趋化因子受体结合。
54. 权利要求47、48、49、51、52或53所述的方法，其中所述的抗体与可溶的或分泌蛋白 质结合。
55. 权利要求47、48、49、51、52或53所述的方法，其中所述的抗体与细胞表面的分子结 合。
56. -种用于降低与治疗性抗体有关的、抗体介导的细胞激活、经典激活途径和炎症事 件的方法，其中所述的抗体特异性地靶向备选途径的成分蛋白质，所述的方法包括给药改 造形式的所述的抗体，其中所述的给药抗体的第一部分衍生自同种型IgGl、IgG2、IgG3和 IgG4的一种或多种抗体，而第二部分衍生自选自IgGl、IgG2、IgG3和IgG4中的一种或多种 抗体。
57. 权利要求56所述的方法，其中所述的去糖基化是通过位置297处的天冬氨酸（N) 突变为丙氨酸（A)或谷氨酰胺（Q)而实现的。
58. 权利要求56所述的方法，其中所述的第二部分并非衍生自IgG4抗体。
59. 权利要求56所述的方法，其中所述的抗体与所述的人类补体系统的成分蛋白质结 合。
60. 权利要求56所述的方法，其中所述的抗体与所述的经典途径的成分蛋白质结合。
61. 权利要求56所述的方法，其中所述的抗体与所述的备选途径的成分蛋白质结合。
62. 权利要求56所述的方法，其中所述的通过去糖基化的Fc改造会降低ADCC和CDC 的活性。
63. 权利要求56所述的方法，其中所述的抗体与细胞因子或细胞因子受体结合。
64. 权利要求56所述的方法，其中所述的抗体与生长因子结合。
65. 权利要求56所述的方法，其中所述的抗体与趋化因子或趋化因子受体结合。
66. 权利要求59、60、61、63、64或65所述的方法，其中所述的抗体与可溶的或分泌蛋白 质结合。
67. 权利要求59、60、61、63、64或65所述的方法，其中所述的抗体与细胞表面的分子结 合。
68. 权利要求56所述的方法，其中所述的给药抗体的第一部分衍生自IgG2同种型，而 所述的第二部分衍生自IgG4同种型。
69. 权利要求68所述的方法，其中所述的给药抗体在所述的Fc区是去糖基化的。
70. 权利要求16所述的方法，其中所述的给药抗体包括取自以下一组序列之一的结合 区：SEQ ID#1, SEQ ID#2, SEQ ID#3, SEQ ID#4, SEQ ID#5, SEQ ID#6, SEQ ID#7, SEQ ID#8, SEQ ID#9 和 SEQ ID#10。
71. 权利要求30所述的方法，其中所述的给药抗体包括取自以下一组序列之一的结合 区：SEQ ID#1，SEQ ID#2，SEQ ID#3，SEQ ID#4，SEQ ID#5，SEQ ID#6，SEQ ID#7，SEQ ID#8，SEQ ID#9 和 SEQ ID#10。
72. 权利要求45所述的方法，其中所述的给药抗体包括取自以下一组序列之一的结合 区：SEQ ID#1，SEQ ID#2，SEQ ID#3，SEQ ID#4，SEQ ID#5，SEQ ID#6，SEQ ID#7，SEQ ID#8，SEQ ID#9 和 SEQ ID#10。
73. 权利要求56所述的方法，其中所述的给药抗体包括取自以下一组序列之一的结合 区：SEQ ID#1，SEQ ID#2，SEQ ID#3，SEQ ID#4，SEQ ID#5，SEQ ID#6，SEQ ID#7，SEQ ID#8，SEQ ID#9 和 SEQ ID#10。
【文档编号】C07K16/22GK104114187SQ201280069501
【公开日】2014年10月22日 申请日期:2012年12月28日 优先权日:2011年12月28日
【发明者】R·班赛尔 申请人:诺沃姆德治疗公司