专利名称：一种利用高速逆流色谱分离白木香叶片中活性成分的方法
一种利用高速逆流色谱分离白木香叶片中活性成分的方法
技术领域：
本发明涉及分离白木香叶片中活性成分的方法，该活性成分为抗癌活性成分和抗氧化活性成分，具体地涉及一种利用高速逆流色谱分离白木香叶片中活性成分的方法，即分离白木香叶片中抗癌和抗氧化活性成分的方法。
背景技术：
国产沉香为瑞香科沉香属植物白木香(Aquilaria sinensis (Lour.)Gilg)含有树脂的木材，是中医临床常用名贵药材，为广东著名的地产药材。白木香是国产沉香药材的来源植物，其叶片活性成分据报道具有抗氧化、镇痛、抗炎、调节糖尿病、抑制呼吸系统疾病等活性。众所周知，癌症是当今全世界范围的医学难题。王红刚等[沉香叶抗肿瘤活性化学成分研究，林产化学·与工业，2008，28 (2):1-5]认为黄酮类化合物是沉香叶中所含的主要的一类化合物，并将白木香叶总提取物按极性大小分为石油醚层、乙酸乙酯层、正丁醇层、水层4个部位进行抗肿瘤活性筛选，发现乙酸乙酯层部位具有明显的抑制肿瘤细胞生长的活性；余伯阳等[中国专利，申请号200710019969.3]发现白木香叶提取物具有抑制小鼠H22肝癌的肿瘤生长作用，但该叶提取物是用溶剂提取样品原料所得的成分组成复杂的混合物，里面含有多种不同的化合物，提取物或萃取后的浸膏成分不清楚、结果难重复、成分间可能有相互作用等情况，在用药或药物研发中使用不方便，而高纯度的白木香叶抗癌作用的活性单体化合物及其分离纯化方法未见报道。而传统的固-液柱色谱分离单体化合物时，大多需要一个月左右，同时需要使用大量的溶剂，分离成本高，对环境有很大的污染，得率一般小于5%，纯度需要多次细分才能达到95%。高速逆流色谱(high-speedcounter current chromatography, HSCCC)是一种独特的不用固态载体的液相分配色谱技术，是一种能实现连续有效分离的实用分离制备技术。在黄酮、生物碱、植物多酚、醌类、萜类、木脂素、香豆素、皂苷等天然植物化学成分的精细分离中都已有广泛的应用。在沉香药材和叶片化学成分的研究方法方面，活性成分的提取目前主要是有机溶剂浸提、柱层析等传统的方法。HSCCC技术是不用任何固态支撑体的液-液分配色谱技术，不会出现对于样品成分的不可逆吸附，对于黄酮类等容易在固-液色谱过程中被吸附和损耗的物质，是更加有效和经济的处理手段，利用HSCCC技术对白木香叶片的活性成分进行分离纯化，国内外尚未见报道。
发明内容本发明的要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种高速逆流色谱法提纯白木香叶片中活性成分的方法，可以得到纯度很高的活性成分。本发明为解决上述技术问题，采用以下技术方案:一种利用高速逆流色谱分离白木香叶片中活性成分的方法，其特征在于包括以下步骤:(I)常温下用渗漉溶剂以渗漉法提取干燥粉碎后的白木香叶片得提取液，减压浓缩提取液后得到白木香叶片提取液浸膏；(2)依次用石油醚、乙酸乙酯对白木香叶片提取液浸膏各萃取3-4次，分别将石油醚萃取液和乙酸乙酯萃取液减压浓缩，得到石油醚部位浸膏和乙酸乙酯部位浸膏；(3)将石油醚部位浸膏和乙酸乙酯部位浸膏分别用高速逆流色谱法分离得到活性成分A:7，4’ - 二甲氧基-5-羟基黄酮；(4)将乙酸乙酯部位浸膏用硅胶柱层析粗分离出含有目标成分的粗提物后，再将所述的粗提物用高速逆流色谱分离得到活性成分B:3，5，7，3’，4’ -五羟基-黄酮和活性成分C:3，5，7，4’ -四羟基-黄酮。本发明步骤(I)中渗漉法所用的渗漉溶剂为60-80%体积浓度的丙酮水溶液或者75-95%体积浓度的乙醇水溶液，所述的渗漉溶剂的流速为2-3ml/min。本发明中减压浓缩步骤中所用的设备为真空旋转蒸发仪。本发明步骤(2)中用石油醚和乙酸乙酯对白木香叶片提取液进行萃取时，石油醚和乙酸乙酯作为萃取溶剂，其用量按照浸膏:萃取溶剂体积比=1:1，得到的石油醚部位浸膏的极性小于乙酸乙酯部位浸膏。石油醚部位浸膏和乙酸乙酯部位浸膏经过活性鉴定，发现石油醚部位浸膏和乙酸乙酯部位浸膏均含有活性成分A:7，4’ -二甲氧基-5-羟基黄酮，乙酸乙酯部位浸膏还含有活性成分B:3，5，7，3’，4’ -五羟基-黄酮和活性成分C:3，5，7，4’ -四羟基-黄酮。因此，可 以用以下参数条件分别对石油醚部位浸膏和乙酸乙酯部位浸膏进行高速逆流色谱分离得到活性成分A:溶剂体系为正己烷:乙酸乙酯:甲醇:水体积比=(0.5 1.5): (Γ2): (Γ2):(0.5^1.5)，其中上相为流动相，下相为固定相。高速逆流色谱主机顺时针转动，转速为75(T900rpm，样品量40.0^60.0mg ;固定相保留值为:65.4% 73.0%，流动相的流速为0.8^1.2ml/min ;检测波长254nm ;分离温度为17^23 0C ο进样后40_66min收集活性成分A。通过质谱和1H-NMRU3C-NMR图谱并参考相关文献确定活性成分A为7，4’ - 二甲氧基-5-羟基黄酮，该活性成分A又称为洋芹素_7，4’ - 二甲醚，其结构示为:
权利要求
1.一种利用高速逆流色谱分离白木香叶片中活性成分的方法，其特征在于包括以下步骤: (1)常温下用渗漉溶剂以渗漉法提取干燥粉碎后的白木香叶片得提取液，减压浓缩提取液后得到白木香叶片提取液浸膏； (2)依次用石油醚、乙酸乙酯对白木香叶片提取液浸膏各萃取3-4次，分别将石油醚萃取液和乙酸乙酯萃取液减压浓缩，得到石油醚部位浸膏和乙酸乙酯部位浸膏； (3)将石油醚部位浸膏和乙酸乙酯部位浸膏分别用高速逆流色谱法分离得到活性成分A:7，4’ - 二甲氧基-5-羟基黄酮； (4)将乙酸乙酯部位浸膏用硅胶柱层析粗分离出含有目标成分的粗提物后，再将所述的粗提物用高速逆流色谱分离得到活性成分B:3，5，7，3’，4’-五羟基-黄酮和活性成分C:3，5，7，4’ -四羟基-黄酮。
2.根据权利要求1所述的一种利用高速逆流色谱分离白木香叶片中活性成分的方法，其特征在于所述的渗漉法所用的渗漉溶剂为60-80%体积浓度的丙酮水溶液或者75-95%体积浓度的乙醇水溶液，所述的渗漉溶剂的流速为2-3ml/min。
3.根据权利要求1所述的一种利用高速逆流色谱分离白木香叶片中活性成分的方法，其特征在于所述的步骤(2)中石油醚和乙酸乙酯作为萃取剂的用量按照浸膏:萃取溶剂体积比=1:1。
4.根据权利要求1所述的一种利用高速逆流色谱分离白木香叶片中活性成分的方法，其特征在于所述的石油醚部位浸膏或乙酸乙酯部位浸膏用高速逆流色谱分离得到活性成分A的参数包括: 溶剂体系为正己烷:乙酸乙酯:甲醇:水体积比=(0.5 1.5): (Γ2): (Γ2):(0.5^1.5)，其中上相为流动相，下相为固定相； 高速逆流色谱主机顺时针转动，转速为75(T900rpm ;样品量40.(Γ60.0mg，固定相保留值为:65.4% ^73.0%，流动相的流速为0.8^1.2ml/min ;检测波长为254nm ;分离温度为17^23 0C ； 进样后40-66min收集活性成分A。
5.根据权利要求1所述的一种利用高速逆流色谱分离白木香叶片中活性成分的方法，其特征在于所述乙酸乙酯部位浸膏用硅胶柱层析粗分离得到含有目标成分的粗提物包括以下步骤: 用硅胶柱层析粗分离，先按以下体积比、顺序的石油醚-乙酸乙酯体系进行梯度洗脱:5:1 — 3:1 — 2:1 — 1:1 — 0:1，再按以下体积比、顺序的乙酸乙酯-甲醇体系进行梯度洗脱:20:1 — 10:1 — 5:1 — 1:1,每500ml接收为I个懼分至减压浓缩已无浸膏即更换下一梯度的洗脱剂，全部梯度的洗脱剂洗脱完成后合并薄层色谱主点相同的馏分后，对合并的各馏分进行检测确定含有活性成分B和C的馏分为含有目标成分的粗提物。
6.根据权利要求1所述的一种利用高速逆流色谱分离白木香叶片中活性成分的方法，其特征在于所述的含有目标成分的粗提物用高速逆流色谱法分离得到活性成分B和活性成分C的参数包括: 溶剂体系为正己烷:乙酸乙酯:甲醇:水体积比=(0.5 1.5): (0.5 1.5): (0.5 1.5):(0.5 1.5)，其中上相为固定相，下相为流动相；高速逆流色谱主机顺时针转动，转速为75(T900rpm ;样品量40.(Γ60.0mg,固定相保留值为:72.0% ^75.9%，流动相的流速为0.8^1.2ml/min ;检测波长为254nm ;分离温度为17^23 0C ο 进样后52-72min收集活性成分B，90_120min收集活性成分C。
7.根据权利要求1或4所述的一种利用高速逆流色谱分离白木香叶片中活性成分的方法，其特征在于所述的活性成分A又称为洋芹素_7，4’ - 二甲醚，其结构示为:
8.根据权利要求1或6所述的一种利用高速逆流色谱分离白木香叶片中活性成分的方法，其特征在于所述的活性成分B又称为槲皮素，其结构示为:
9.根据权利要求1或6所述的一种利用高速逆流色谱分离白木香叶片中活性成分的方法，其特征在于 所述的活性成分C又称为山萘酚，其结构示为:
10.一种权利要求1或6所述的利用高速逆流色谱分离白木香叶片中活性成分的抗癌药物应用，其特征在于所述的活性成分B对人肝癌细胞株HepG2具有良好的抑制活性，所述的活性成分C对人肝癌细胞株HepG2具有中等的抑制活性。
全文摘要
本发明公开了一种利用高速逆流色谱分离白木香叶片中活性成分的方法，其步骤为常温下以渗漉法提取干燥粉碎后的白木香叶片，得到白木香叶片提取液浸膏；依次用石油醚、乙酸乙酯对该提取液浸膏各萃取3-4次，分别将石油醚萃取液和乙酸乙酯萃取液减压浓缩为浸膏；再将石油醚部位浸膏和乙酸乙酯部位浸膏分别用高速逆流色谱法分离得到活性成分A7，4’-二甲氧基-5-羟基黄酮；将乙酸乙酯部位浸膏用硅胶柱层析粗分离后，再用高速逆流色谱分离得到活性成分B3，5，7，3’，4’-五羟基-黄酮和活性成分C3，5，7，4’-四羟基-黄酮。本发明分离出的活性成分损失少，分离速度快，纯度高，稳定，易于应用。
文档编号C07D311/30GK103145677SQ201310062910
公开日2013年6月12日 申请日期2013年2月27日 优先权日2013年2月27日
发明者杨懋勋, 陈河如, 梁耀光, 张天佑, 谢朝良, 蒋建平, 高慎凎, 李小玉 申请人:中山火炬职业技术学院, 陈河如, 梁耀光