截短的人乳头瘤病毒的l1蛋白、其类病毒颗粒及其制备方法和应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及截短的人乳头瘤病毒的L1蛋白，其类病毒颗粒，以及其制备方法和用途。具体地，本发明涉及人乳头瘤病毒HPV6型、HPV11型、HPV16型、HPV18型或HPV58型的截短型L1蛋白，其类病毒颗粒，以及其制备方法和用途。
【专利说明】截短的人乳头瘤病毒的L1蛋白、其类病毒颗粒及其制备方 法和应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及截短的人乳头瘤病毒的Ll蛋白，其类病毒颗粒，以及其制备方法和用 途。具体地，本发明涉及人乳头瘤病毒HPV6型、HPVll型、HPV16型、HPV18型或HPV58型的 截短型Ll蛋白，其类病毒颗粒，以及其制备方法和用途。
【背景技术】
[0002] 人乳头瘤病毒（Human Papillomavirus, HPV)是一类双链小分子DNA病毒，具有严 格的种属特异性，主要感染人的皮肤和粘膜组织，引起相应部位上皮组织的增生性病变。根 据核酸序列同源性，HPV可分为100多型。HPV16U8和58与宫颈癌的发生高度相关，其中 HPV16是最主要的致癌因素。HPV6和11是90%以上生殖器疣和喉乳头瘤的致病因子。
[0003] 完整的人乳头瘤病毒颗粒由病毒基因组DNA与衣壳两部分组成。病毒基因组是双 链环状DNA(约8kb)，根据功能分为三个功能区：早期区，编码6个非结构蛋白（E1，E2，E4， E5, E6, E7)，所述蛋白与病毒的复制、转录和转化作用有关；晚期区，含LI和L2两个0RF， 编码主要衣壳蛋白Ll和次要衣壳蛋白L2两个结构蛋白，参与病毒粒子的组装；长控制区 (LCR)，又称非编码区或上游调控区，不编码任何蛋白，但含有复制起点、启动子、增强子、沉 默子等多种调控元件，影响病毒的复制和转录。
[0004] HPV Ll蛋白为人乳头瘤病毒主要衣壳蛋白，分子量为55-60kDa，是HPV疫苗主要 结构蛋白。在多种表达系统中表达的HPV Ll蛋白无需L2蛋白辅助，即可形成在形态结构 与天然病毒颗粒相似的类病毒颗粒（Virus-Like Particle，VLP)。该种类病毒颗粒保留了 病毒颗粒的天然表位，具有较强的免疫原性，可诱导针对同型HPV病毒的中和杭体，是HPV 预防性疫苗主要研究方向。在动物实验中，只有Ll蛋白装配成的VLP诱发的抗体具有中和 病毒、预防感染的能力，而变性的Ll蛋白免疫后不能预防感染。
[0005] 现有技术中主要采用原核系统大肠杆菌和真核系统酿酒酵母来表达HPV的类病 毒颗粒。但是原核系统所表达的HPV Ll蛋白翻译后修饰程度低，无法自行正确折叠，大多 失去其天然构象，主要以包含体形式存在。虽然通过包含体纯化，复性等步骤也可得到HPV 的VLP，但是在复性过程中蛋白损失量大，用得率低，难以在大规模工业化生产中应用。酿 酒酵母作为一种表达异源蛋白的宿主也有其局限性。由实验室扩展到工业规模时，其产量 迅速下降。原因是培养基中维持质粒高拷贝数的选择压力消失，质粒变得不稳定，拷贝数下 降。拷贝数是高效表达的必备因素，因此拷贝数下降，也直接导致外源基因表达量的下降。 酿酒酵母分泌的蛋白质还可能会被过度糖基化修饰，这种过糖基化修饰会严重地改变蛋白 质的免疫原性，降低活性，缩短在血液中滞留的时间。酿酒酵母分泌的许多蛋白质，并没有 分泌到培养基中，而是以与细胞结合的方式滞留在周质空间，给大规模生产中蛋白质的纯 化制造了困难。
[0006] 杆状病毒一昆虫细胞体系的优点在于安全性高，对外源基因克隆容量大，具有多 角体启动子控制下的高效表达，翻译后加工修饰，无内毒素污染等特点，但在大规模工业化 生产中存在表达量低、培养成本高的问题，使得最终产品的成本高昂，限制了其应用。因此 本领域中仍然需要提高HPV Ll蛋白在杆状病毒一昆虫细胞体系中的表达量，并在机体内诱 发高滴度的中和抗体，进一步降低大规模生产HPV疫苗的成本。
【发明内容】
[0007] 本发明人发现，与野生型HPV Ll基因相比，密码子经优化的且去除C端核定位信 号的HPV Ll基因在杆状病毒一昆虫细胞体系中的表达量有明显提高；同时发现与野生型 HPV Ll类病毒颗粒相比，去除C端核定位信号HPV Ll类病毒颗粒免疫动物后可诱导更高的 针对HPV的特异性中和抗体，在此基础上完成了本发明。
[0008] 本发明提供一种去除C端核定位信号的HPV Ll蛋白，由其组成的类病毒颗粒及含 该类病毒颗粒的疫苗。
[0009] 本发明的一方面涉及HPV Ll基因，包括根据昆虫细胞偏爱密码子进行优化的HPV Ll基因。
[0010] 本发明一方面涉及HPV，具体而言，涉及HPV6型、HPVll型、HPV16型、HPV18型或 HPV58 型。
[0011] 本发明一方面涉及以下HPV Ll蛋白：
[0012] C端截短了 9个或21个氨基酸的HPV6型Ll蛋白；优选地，该截短蛋白的序列为 SEQ ID N0:1或2 ;更优选地，该截短蛋白的序列为SEQ ID NO: 2 ;
[0013] C端截短了 9个或21个氨基酸HPVll型Ll蛋白；优选地，该截短蛋白的序列为SEQ ID N0:3或4 ;更优选地，该截短蛋白的序列为SEQ ID N0:4 ;
[0014] C端截短了 7个或22个氨基酸的HPV16L1蛋白；优选地，该截短蛋白的序列为SEQ ID N0:5或6 ;更优选地，该截短蛋白的序列为SEQ ID N0:6 ;
[0015] C端截短了 9个或24个氨基酸的HPV18L1蛋白；优选地，该截短蛋白的序列为SEQ ID N0:7或8;更优选地，该截短蛋白的序列为SEQ ID N0:8;或
[0016] C端截短了 7个或19个氨基酸的HPV58L1蛋白；优选地，该截短蛋白的序列为SEQ ID N0:9或10;更优选地，该截短蛋白的序列为SEQ ID NO: 10。
[0017] 本发明一方面涉及编码C端截短的HPV Ll蛋白且密码子经优化的HPV Ll基因， 根据昆虫细胞偏爱密码子进行优化，其中：
[0018] 所述C端截短的HPV Ll蛋白为C端截短了 9个或21个氨基酸HPV6型Ll蛋白； 优选地，所述HPV Ll基因的序列为SEQ ID NO: 11或12;更优选地，所述HPV Ll基因的序 列为 SEQ ID NO: 12 ;
[0019] 所述C端截短的HPV Ll蛋白为C端截短了 9个或21个氨基酸HPVll型Ll蛋白； 优选地，所述HPV Ll基因的序列为SEQ ID NO: 13或14 ;更优选地，所述HPV Ll基因的序 列为 SEQ ID NO: 14 ;
[0020] 所述C端截短的HPV Ll蛋白为C端截短了 7个或22个氨基酸的HPV16L1蛋白； 优选地，所述HPV Ll基因的序列为SEQ ID NO: 15或16;更优选地，所述HPV Ll基因的序 列为 SEQ ID NO: 16 ;
[0021] 所述C端截短的HPV Ll蛋白为C端截短了 9个或24个氨基酸的HPV18L1蛋白； 优选地，所述HPV Ll基因的序列为SEQ ID NO: 17或18;更优选地，所述HPV Ll基因的序 列为 SEQ ID NO: 18 ;或
[0022] 所述C端截短的HPV LI蛋白为C端截短了 7个或19个氨基酸的HPV58L1蛋白； 优选地，所述HPV Ll基因的序列为SEQ ID NO: 19或20 ;更优选地，所述HPV Ll基因的序 列为 SEQ ID NO:20。
[0023] 以及含有上述基因的载体。
[0024] 本发明一方面涉及包含上述载体的细胞，所述细胞包含sf9、sf21、HighFive等昆 虫细胞。
[0025] 本发明一方面涉及包含上述C端截短的Ll蛋白或其多核苷酸或载体或细胞的组 合物。
[0026] 本发明一方面涉及HPV6型、HPVll型、HPV16型、HPV18型或HPV58型类病毒颗粒， 其中上述类病毒颗粒包含：
[0027] C端截短了 9个或21个氨基酸HPV6型Ll蛋白；优选地，
[0028] 所述C端截短的HPV Ll蛋白的序列为SEQ ID NO: 1或2 ;
[0029] 更优选地，C端截短的HPV Ll蛋白的序列为SEQ ID NO:2 ;
[0030] C端截短了 9个、21个氨基酸HPVll型Ll蛋白；优选地，
[0031] 所述C端截短的HPV Ll蛋白的序列SEQ ID NO: 3或4 ;
[0032] 更优选地，C端截短的HPV Ll蛋白的序列为SEQ ID N0:4 ;
[0033] C端截短了 7个、22个氨基酸HPV16型LI蛋白；优选地，
[0034] 所述C端截短的HPV Ll蛋白的序列SEQ ID NO: 5或6 ;
[0035] 更优选地，C端截短的HPV Ll蛋白的序列为SEQ ID N0:6 ;
[0036] C端截短了 9个、24个氨基酸HPV18型LI蛋白；优选地，
[0037] 所述C端截短的HPV Ll蛋白的序列SEQ ID NO: 7或8 ;
[0038] 更优选地，C端截短的HPV Ll蛋白的序列为SEQ ID N0:8 ;或
[0039] C端截短了 7个、19个氨基酸HPV58型Ll蛋白；优选地，
[0040] 所述C端截短的HPV Ll蛋白的序列SEQ ID NO:9或10 ;
[0041] 更优选地，C端截短的HPV Ll蛋白的序列为SEQ ID NO: 10 ;。
[0042] 本发明再一方面涉及一种获得HPV6型、HPVll型、HPV16型、HPV18型或HPV58型 类病毒颗粒的方法，其包括在杆状病毒一昆虫细胞中表达前述截短的HPV6型、HPVll型、 HPV16型、HPV18型或HPV58型Ll基因片段，裂解所述细胞，然后将含有上述截短的HPV Ll 蛋白的裂解上清进行纯化处理。
[0043] 本发明还涉及预防性HPV疫苗，其包含本发明所述的由HPV16L1蛋白形成的类病 毒颗粒。优选地，该疫苗还包含至少一种选自以下的类病毒颗粒：本发明所述的由HPV6L1 蛋白形成的HPV6类病毒颗粒、由HPVl ILl蛋白形成的HPVll类病毒颗粒、由HPV18L1蛋白 形成的HPV18类病毒颗粒和由HPV58L1蛋白形成的HPV58类病毒颗粒。
[0044] 在一个实施方案中，所述疫苗含有本发明所述的由HPV58L1蛋白形成的HPV58类 病毒颗粒。优选地，所述疫苗含有由具有SEQ ID NO: 10蛋白序列的HPV58型Ll蛋白形成的 HPV58类病毒颗粒。更优选地，所述疫苗还含有本发明所述的由HPV16L1蛋白形成的HPV16 类病毒颗粒和由HPV18L1蛋白形成的HPV18类病毒颗粒，特别是含有由具有SEQ ID N0:6 蛋白序列的HPV16型LI蛋白形成的HPV16类病毒颗粒，含有由具有SEQ ID NO:8蛋白序列 的HPV18型LI蛋白形成的HPV18类病毒颗粒。
[0045] 在一个实施方案中，所述疫苗含有本发明所述的由HPV6L1蛋白形成的HPV6类病 毒颗粒和由HPV11L1蛋白形成的HPVll类病毒颗粒。优选地，所述疫苗含有由具有SEQ ID NO:2蛋白序列的HPV6型Ll蛋白形成的HPV6类病毒颗粒和含有由具有SEQ ID NO:4蛋白 序列的HPVll型Ll蛋白形成的HPVll类病毒颗粒。更优选地，所述疫苗还含有本发明所述 的由HPV16L1蛋白形成的HPV16类病毒颗粒和由HPV18L1蛋白形成的HPV18类病毒颗粒， 特别是含有由具有SEQ ID NO:6蛋白序列的HPV16型Ll蛋白形成的HPV16类病毒颗粒，含 有由具有SEQ ID NO:8蛋白序列的HPV18型Ll蛋白形成的HPV18类病毒颗粒。
[0046] 在一个实施方案中，所述疫苗含有本发明所述的HPV6类病毒颗粒、HPVll类病毒 颗粒和HPV58类病毒颗粒。优选地，所述疫苗含有由具有SEQ ID NO:2蛋白序列的HPV6型 Ll蛋白形成的HPV6类病毒颗粒、含有由具有SEQ ID N0:4蛋白序列的HPVll型Ll蛋白形 成的HPVll类病毒颗粒和含有由具有SEQ ID NO: 10蛋白序列的HPV58型Ll蛋白形成的 HPV58类病毒颗粒。更优选地，所述疫苗还含有本发明所述的由HPV16L1蛋白形成的HPV16 类病毒颗粒和由HPV18L1蛋白形成的HPV18类病毒颗粒，特别是含有由具有SEQ IDN0:6蛋 白序列的HPV16型Ll蛋白形成的HPV16类病毒颗粒，含有由具有SEQ ID NO:8蛋白序列的 HPV18型Ll蛋白形成的HPV18类病毒颗粒。
[0047] 相比于现有技术，本发明选用密码子优化设计的且C端截短的HPV6L1基因、 HPV11L1基因、HPV16L1基因、HPV18L1基因、或HPV58L1基因，表达于杆状病毒-昆虫细胞 表达系统，使上述截短的HPV Ll蛋白表达量较野生型HPV6型、HPVll型、HPV16型、HPV18 型或HPV58型Ll蛋白表达量有明显提高。表达所得类病毒颗粒经纯化后在电镜下观察为 50-60nm，与野生型HPV Ll病毒颗粒相似。以密码子优化设计的C端截短的HPV6型、HPVll 型、HPV16型、HPV18型或HPV58型类病毒颗粒免疫小鼠，较野生型HPV6型、HPVll型、HPV16 型、HPV18型或HPV58型，能产生更高效价的HPV特异性中和抗体。
[0048] 实验证明：Sf9昆虫细胞表达的HPV全长Ll蛋白的VLP主要定位于Sf9细胞核。 C-末端截短核定位信号后不影响VLP的形成，并且其VLP形成效率大大提高。因此，在 不影响VLP形成及生物活性的情况下，使所表达的Ll蛋白主要定位于胞浆，而不进入细胞 核，从而使得Ll蛋白纯化变得相对容易，而且还能增加表达水平。
[0049] 去除C端核定位信号的截短型HPV16L1蛋白（HPV16-483)中和抗体滴度显著高于 全长型（HPV16-505)，说明截短型所诱发的体液免疫应答水平显著高于全长型。这可能是由 于去除核定位信号的HPV16VLP滞留在细胞质中，而含有核定位信号的HPV16VLP定位于细 胞核中，而细胞质中的截短型HPV16VLP比全长HPV16VLP更易于呈递给B淋巴细胞，诱发特 异性的体液免疫应答。通过上述研究结果可知，去除核定位信号的HPV VLP更易于被B淋 巴细胞识别，有利于产生高滴度的中和抗体。
【具体实施方式】
[0050] 下面结合实施例对本发明进一步举例描述。
[0051] 实施例1密码子优化设计合成人乳头瘤病毒Ll基因
[0052] 按照昆虫细胞使用的密码子偏爱性、mRNA二级结构、mRNA自由能稳定性、GC含量 等原则，设计全长HPV6型、HPVl 1型、HPV16型、HPV18型、HPV58型核酸序列（参见序列表中 的对应序列）。由捷瑞公司分别商业合成上述全长基因。
[0053] 实施例2各型HPV Ll蛋白-重组杆粒构建
[0054] 表1.引物表：
[0055]
[0056]
【权利要求】
1. 一种部分去除c端核定位信号的人乳头瘤病毒L1蛋白，其中所述人乳头瘤病毒为 HPV6型、HPV11型、HPV16型、HPV18型或HPV58型，所述L1蛋白选自： C端截短了 9个、21个氨基酸的HPV6型L1蛋白；优选该截短蛋白具有SEQ ID NO: 1、 2 ;优选 SEQ ID N0:2 ; C端截短了 9个、21个氨基酸的HPV11型LI蛋白；优选该截短蛋白具有SEQ ID NO: 3、 4 ;优选 SEQ ID NO:4 ; C端截短了 7个、22个氨基酸的HPV16L1蛋白；优选该截短蛋白具有SEQ ID N0:5、6 ; 优选 SEQ ID NO:6 ; C端截短了 9个、24个氨基酸的HPV18L1蛋白；优选该截短蛋白具有SEQ ID N0:7、8; 优选 SEQ ID NO:8 ; C端截短了 7个、19个氨基酸的HPV58L1蛋白；优选该截短蛋白具有SEQ ID N0:9、10 ; 优选 SEQ ID NO: 10。
2. -种编码权利要求1所述的HPV LI蛋白的多核苷酸序列，优选地，所述多核苷酸序 列是经密码子优化设计的；更优选地，所述多核苷酸序列是按照昆虫细胞使用的密码子优 化设计的；优选地，其中： 所述HPV L1基因的序列为SEQ ID N0:11或12 ;更优选地， 所述HPV L1基因的序列为SEQ ID N0:12 ; 所述HPV L1基因的序列为SEQ ID NO: 13或14 ;更优选地， 所述HPV L1基因的序列为SEQ ID NO: 14 ; 所述HPV L1基因的序列为SEQ ID NO: 15或16 ;更优选地， 所述HPV L1基因的序列为SEQ ID NO: 16 ; 所述HPV LI基因的序列为SEQ ID NO: 17或18 ;更优选地， 所述HPV LI基因的序列为SEQ ID NO: 18 ;或 所述HPV LI基因的序列为SEQ ID NO: 19或20 ;更优选地， 所述HPV LI基因的序列为SEQ ID N0:20。
3. -种包含权利要求2所述的多核苷酸的载体。
4. 一种包含权利要求3所述的载体的细胞，优选地，所述细胞为昆虫细胞；更优选地， 所述细胞选自sf9、sf21、HighFive昆虫细胞。
5. -种组合物，包含权利要求1所述的L1蛋白；或者权利要求2所述的多核苷酸；或 者权利要求3所述的载体；或者权利要求4所述的细胞。
6. -种人乳头瘤病毒类病毒颗粒，其包含权利要求1所述的L1蛋白。
7. -种获得权利要求6所述的类病毒颗粒的方法，包括在杆状病毒一昆虫细胞中表达 权利要求2所述的多核苷酸序列，然后将含有所述截短的L1蛋白的裂解上清进行纯化处 理。
8. -种HPV疫苗，其包括权利要求6的由HPV16L1蛋白形成的HPV16类病毒颗粒；更 优选地，所述疫苗还包含选自以下的至少一种HPV类病毒颗粒：权利要求6的由HPV6L1蛋 白形成的HPV6类病毒颗粒、由HPV11L1蛋白形成的HPV11类病毒颗粒、由HPV18L1蛋白形 成的HPV18类病毒颗粒和由HPV58L1蛋白形成的HPV58类病毒颗粒。
9. 一种HPV疫苗，其包括权利要求6的由HPV58L1蛋白形成的HPV58类病毒颗粒；优 选地，所述疫苗含有具有SEQ ID NO: 10蛋白序列的HPV58L1蛋白的HPV58类病毒颗粒；优 选地，所述疫苗还含有权利要求6的由HPV16L1蛋白形成的HPV16类病毒颗粒和由HPV18L1 蛋白形成的HPV18类病毒颗粒；优选地，HPV16类病毒颗粒含有具有SEQ ID N0:6蛋白序列 的HPV16L1蛋白，HPV18类病毒颗粒含有具有SEQ ID N0:8蛋白序列的HPV18L1蛋白。
10. -种HPV疫苗，所述疫苗含有权利要求6的由HPV6L1蛋白形成的HPV6类病毒颗粒 和由HPV11L1蛋白形成的HPV11类病毒颗粒；优选地，所述疫苗含有具有SEQ ID N0:2蛋白 序列的HPV6L1蛋白的HPV6类病毒颗粒和含有具有SEQ ID勵:4蛋白序列的即￥1111蛋白 的HPV11类病毒颗粒；优选地，所述疫苗还含有权利要求6的由HPV16L1蛋白形成的HPV16 类病毒颗粒和由HPV18L1蛋白形成的HPV18类病毒颗粒；优选地，HPV16类病毒颗粒含有具 有SEQ ID N0:6蛋白序列的HPV16L1蛋白，HPV18类病毒颗粒含有具有SEQ ID N0:8蛋白 序列的HPV18L1蛋白。
11. 一种HPV疫苗，所述疫苗含有权利要求6的由HPV6L1蛋白形成的HPV6类病毒颗 粒、由HPV11L1蛋白形成的HPV11类病毒颗粒和由HPV58L1蛋白形成的HPV58类病毒颗粒； 优选地，所述疫苗含有具有SEQ ID腸:2蛋白序列的即￥611蛋白的即￥6类病毒颗粒、含有 具有5￡〇10勵:4蛋白序列的即￥1111蛋白的即￥11类病毒颗粒和含有具有5￡〇10勵：10 蛋白序列的HPV58L1蛋白的HPV58类病毒颗粒；优选地，所述疫苗还含有权利要求6的由 HPV16L1蛋白形成的HPV16类病毒颗粒和由HPV18L1蛋白形成的HPV18类病毒颗粒；优选 地，HPV16类病毒颗粒含有具有SEQ ID N0:6蛋白序列的HPV16L1蛋白，HPV18类病毒颗粒 含有具有SEQ ID N0:8蛋白序列的HPV18L1蛋白。
【文档编号】C07K14/025GK104418942SQ201310388695
【公开日】2015年3月18日 申请日期:2013年8月30日 优先权日:2013年8月30日
【发明者】孔维, 姜春来, 孙博, 徐菲, 宋海鹏, 张喆 申请人:长春百克生物科技股份公司, 吉林大学