重组载体及应用该重组载体的转基因鱼卵和生物材料的制作方法
【专利摘要】一种重组载体及应用该重组载体产生的转基因鱼卵与生物材料，可提供能够于特定部位分泌重组人类前胶原蛋白或胶原蛋白的转基因鱼，以利用具有分泌的重组人类前胶原蛋白或胶原蛋白的鱼体的特定部位作为生物材料或纯化出其中的重组人类前胶原蛋白或胶原蛋白。
【专利说明】重组载体及应用该重组载体的转基因鱼卵和生物材料
【技术领域】
[0001]本发明为一种生物医学材料的制备技术，特别是一种重组载体及应用该重组载体而产生的转基因鱼卵与生物材料。
[0002]先前技术
[0003]由于胶原蛋白是生物医学材料的重要组成材料，主要包括使组织生长、整型、烧烫伤敷料、伤口愈合等功能，并且市场规模不断地扩大，因此，开发更具医疗价值及更多样性的胶原蛋白及其衍生物，以应用于各种用途，是现今研发者所希望解决的课题。
[0004]目前生产重组胶原蛋白的表达系统包括大肠杆菌0011 0011--酵母菌、哺乳动物细胞株、昆虫细胞株、转基因动物以及转基因植物。然而，大肠杆菌表达系统没有翻译后修饰。酵母菌表达系统缺乏脯氨酸4-羟化酶活性，但甲醇酵母中的胶原蛋白产量却又是这些表达系统中最高的。哺乳动物细胞株的表达系统产量低且受限于特定细胞类型。昆虫细胞的表达系统中脯氨酸4-羟化酶活性又低。而转基因动物(如，蚕或小鼠)以及转基因植物(如，烟草),其胶原蛋白产物会过度交联。
[0005]目前已建立有含有编码人类脯氨酸4-羟化酶以及胶原蛋白的基因的杆状病毒表达系统(参照美国专利第5，077，214号以及第5，593，859号兄然而，经转染的昆虫细胞在72小时内死亡，造成仅有暂时性的重组胶原蛋白生产。此外，由于胞溶作用，因此将很难回收或纯化重组胶原蛋白。而且，杆状病毒对于内质网或高尔基氏体的破坏更限制了胶原蛋白的生产。
【发明内容】
[0006]在一实施例中，一种生物材料包括:由鱼体生产并获得的重组人类前胶原蛋白或月父原蛋白。
[0007]在一些实施例中，此生物材料更包括鱼体的至少鱼鳞，并且各鱼鳞具有表达的重组人类前胶原蛋白或胶原蛋白。
[0008]在一些实施例中，重组人类前胶原蛋白或胶原蛋白是由转移到鱼体中的人类胶原蛋白基因表达的。
[0009]在另一实施例中，一种转基因鱼卵包括鱼类染色体以及重组载体。重组载体整合到鱼类染色体中，并且此重组载体包括人类胶原蛋白基因。
[0010]在又一实施例中，一种重组载体包括上游基因以及人类胶原蛋白基因。上游基因是由鱼体获得，而人类胶原蛋白基因是连接在上游基因的下游。其中，上游基因可为在鱼体中存在的启动子、增强子或其组合 。
[0011〕 在一些实施例中，重组载体更包括报道基因，并且此报道基因是连接在人类胶原蛋白基因的下游。
[0012]综上，根据本发明的重组载体及应用其产生的转基因鱼卵和生物材料可提供能于特定部位分泌重组人类前胶原蛋白或胶原蛋白的转基因鱼，以利用具有分泌的重组人类前胶原蛋白或胶原蛋白的鱼体的特定部位作为生物材料或纯化出其中的重组人类前胶原蛋白或胶原蛋白。所述生物材料已在位于德国0-38124布伦瑞克茵荷芬斯特街78号的德国微生物菌种保藏中心进行了保藏，保藏日期为2013年8月20日，保藏编号为03127616，分类命名为:斑马鱼角蛋白4启动子在如12载体连接第1型0 1人类胶原蛋白基因
1(61-81:11141)1-011101:61- 11=垃 1111111811 00118^6111^1^6116 111
[0013]附图简要说明
[0014]图1为根据本发明一实施例的转基因鱼卵的转化方法的流程图。
[0015]图2为根据本发明一实施例的重组载体的示意图。
[0016]图3为图1步骤310的一实施例的详细流程图。
[0017]图4为图3步骤3110的一实施例的详细流程图。 [0018]图5为图3步骤3120的一实施例的详细流程图。
[0019]图6为图3步骤3130的一实施例的详细流程图。
[0020]图7为图3步骤3140的一实施例的详细流程图。
[0021]图8为具有第1型人类胶原蛋白基因的重组质粒的一实施例的示意图。
[0022]实施方式
[0023]以下所述的「第一」至「第二十三」等序号用语是用于区别所指的组件，而非用于排序或限定所指组件的差异性，且也非用于限制本发明的范围。
[0024]参照图1，一种转基因鱼卵的转化方法包括构建具有人类胶原蛋白基因的重组载体(步骤31(0、利用适当的限制性酶￡112,6)将构建好的重组载体(1^600111131118111:变成线性(步骤320 )、以及将线性的重组载体引入鱼类的胚胎中以整合到胚胎中的鱼类染色体中(步骤330 )。
[0025]在此，参照图2，重组载体更具有上游基因呢，而人类胶原蛋白基因卜⑶是连接在此上游基因呢的下游。此上游基因呢至少包括可特异性在在特定组织驱动下游基因序列(即，人类胶原蛋白基因卜⑶)表达(6^1^6881011)的启动子(即011101:61~)、作用于此启动子的增强子(6-^1⑶10或其组合。换言之，将此重组载体引入至鱼体之后，此重组载体能在鱼体上表达人类前胶原蛋白或胶原蛋白((6^0(301188611 01~⑶丨丨叫的)。
[0026]在此，激活子存在于鱼体中且具有组织特异性的表达。增强子存在于鱼体中。
[0027]在一些实施例中，启动子例如可为角蛋白4 (匕!'社1=4 ^4)启动子、角蛋白5:1(5)启动子或角蛋白 1x6 (1^1-1:1:106)启动子。
[0028]其中，角蛋白4启动子为3即10勵:1所示的序列。角蛋白化6启动子为3即10勵:2所示的序列。
[0029]在一些实施例中，人类胶原蛋白基因卜⑶可为单股或三股的人类胶原蛋白的氨基酸序列。
[0030]人类胶原蛋白基因卜⑶可为第1型至第28型中的任一种或其配体。人类胶原蛋白基因卜⑶可为单链或多链。举例来说，第1型人类胶原蛋白具有二条0 1链以及一条0 2链，而第2型人类胶原蛋白具有三条01链。人类胶原蛋白的配体总体为本领域技术人员所熟知，故不在此赘述。
[0031]其中，第1型人类胶原蛋白基因为3即10勵:3及4所示的序列。第2型人类胶原蛋白基因为3即10顯:5所示的序列。在此，示范性列出第1及2型人类胶原蛋白基因的单一链的基因序列，但本发明不限于此。[0032]在一些实施例中，重组载体更具有报道基因RG，并且此报道基因RG是连接在人类胶原蛋白基因CG的下游。
[0033]在此，报道基因RG可为萤光素酶(Iuciferase)基因、突光蛋白(fluorescentprotein)基因或IacZ ( β -半乳糖昔酶；β -galactosidase)基因等。
[0034]其中，突光蛋白基因可为绿色突光蛋白(green fluorescent protein ;GFP)基因、修饰绿色突光蛋白(modified green fluorescent protein)基因、增强绿色突光蛋白(enhanced green fluorescent protein ;EGFP)基因、红色突光蛋白(red fluorescentprotein ;RFP)基因、增强红色突光蛋白(enhanced red fluorescent protein, ERFP)基因、蓝色突光蛋白(blue fluorescent protein ;BFP)基因、增强蓝色突光蛋白(enhancedblue fluorescent protein ;EBFP)基因、黄色突光蛋白(yellow fluorescent protein ；YFP)基因、增强黄色突光蛋白(enhanced yellow fluorescent protein ;EYFP)基因、青定色突光蛋白(cyan fluorescent protein ;CFP)基因或增强青定色突光蛋白(enhanced cyanfluorescent protein ；ECFP)基因等。
[0035]在一些实施例中，重组载体可为重组质粒(plasmid)、重组病毒载体、粘粒(cosmid)或人工染色体(artificial chromosome)等。
[0036]在步骤S30中，将重组载体引入胚胎的方法包括:显微注射，转染(例如:以DEAE-右旋糖酐或磷酸钙沉淀)、以病毒载体(例如:反转录病毒、腺病毒)感染、电穿孔法、细胞膜通透性增加、基因枪、脂质体传递(例如:Lipofectin? (脂质体转染试剂)、Lipofectamine? (脂质体转染试剂)、Superfect# (脂质体转染试剂)、Transiectani R)
(脂质体转染试剂)或其它根据公知方法发展出的脂质体)，或受体中介的吸收及其它胞饮机制等。
[0037]参照图3，步骤SlO可包括克隆鱼类的启动子(步骤S110)、克隆人类胶原蛋白基因hCG (步骤S120)、利用克隆的启动子与第一表达载体构建上游基因UG (步骤S130)、以及利用克隆的人类胶原蛋白基因hCG以及上游基因UG构建重组载体(步骤S140)。
[0038]参照图4，步骤SllO包括根据在基因数据库中所找出的启动子(或增强子)的氨基酸序列设计对应的正向引物(forward primer ;5’ primer)与反向引物(reverse primer ；3’primer)(步骤Sill)、利用鱼体(鱼类组织)进行DNA (脱氧核糖核酸；deoxyribonucleicacid)提取以得到基因组DNA (genomic DNA)(步骤S112)、使用步骤S112所取得的基因组DNA作为模板(template)以及步骤SllI所设计的正向引物及反向引物作为引物，并利用DNA聚合酶(DNA polymerase)及三憐酸脱氧核糖核苷(deoxyribonucleosidetriphsphate ；dNTP)等试剂共同进行聚合酶链反应(polymerase chain reaction ；PCR)以得到第一产物(步骤S113)、将得到的第一产物与第一载体接合以产生第二载体(步骤S114)、将第二载体转化至感受态细胞(competent cell)中进行培养以及菌落筛选以得到含有启动子(或增强子)的菌株(步骤S115)、以及由含有启动子的菌株中纯化的所需的启动子(或增强子)并利用琼脂糖凝胶电泳(agarose gel electrophoresis)确认(步骤S116)。
[0039]其中，鱼体可为斑马鱼(Zebra fish)等。以SEQ ID NO:1所示的启动子为例，正向引物可为SEQ ID NO:6所示的序列以及反向引物可为SEQ ID NO:7所示的序列。
[0040]参照图5，步骤S120包括根据在基因数据库中所找出的人类胶原蛋白基因hCG的mRNA(信使核糖核酸;message RNA)序列设计对应的正向引物与反向引物(步骤S121)、利用人类细胞进行觀八(核糖核酸的提取，并通过柱层析()进行分离和纯化以取得1111很八(步骤3122〉、使用步骤3122所取得的作为模板及步骤3121设计的反向引物作为引物，进行反转录(^6^6^86 1:1-811801-11)1:1011)以得到(60嫩(互补脱氧核糖核酸；。0卹0^)(步骤3123〉、使用步骤3123所取得的嫩作为模板以及步骤3121所设计的正向引物及反向引物作为引物，并利用0嫩聚合酶及三磷酸脱氧核糖核苷等试剂共同进行以得到第二产物(步骤3124〉、将得到的第二产物与第三载体接合以产生第四载体(步骤3125〉、将第四载体转化至感受态细胞中进行培养以及菌落筛选以得到含有人类胶原蛋白基因卜⑶的菌株(步骤3126〉、以及由含有人类胶原蛋白基因卜⑶的菌株中纯化所需的人类胶原蛋白基因卜⑶并利用琼脂糖凝胶电泳确认(步骤3127)0
[0041]其中，人类细胞可为纤维母细胞(￡11^01315181:)、或软骨细胞((6^011(1:^0(35^6)等。以820 10勵:3所示的人类胶原蛋白基因卜⑶为例，正向引物可为3即10勵:8及10所示的序列以及反向引物可为320 10勵:9及11所示的序列。以3即10勵:4所示的人类胶原蛋白基因匕⑶为例，正向引物可为3即10勵:12所示的序列以及反向引物可为3即10勵:13所示的序列。以3即10勵:5所示的人类胶原蛋白基因卜⑶为例，正向引物可为3即10勵:14及16所示的序列以及反向引物可为3即10勵:15及17所示的序列。
[0042]参照图6，步骤3130包括利用一个或二个限制性酶分别对步骤3116所得到的启动子以及第一表达载体进行剪切(步骤3130、接合剪切后的启动子以及第一表达载体以形成上游基因呢(步骤3132〉、将上游基因呢转化至感受态细胞中进行培养以及菌落筛选以得到含有启动子的菌株(步骤3133)、以及由含有启动子的菌株中纯化出所需的上游基因呢并利用琼脂糖凝胶电泳确认(步骤3134)0
[0043]参照图7，步骤3 140还可包括利用一个或二个限制性酶分别对步骤3127所得到的人类胶原蛋白基因卜⑶以及步骤3134所得到的上游基因呢进行剪切(步骤3140、接合剪切后的人类胶原蛋白基因卜⑶以及上游基因呢以形成第二表达载体(步骤3142〉、将第二表达载体转化至感受态细胞中进行培养以及菌落筛选以得到含有人类胶原蛋白基因匕⑶的菌株(步骤3143〉、由含有人类胶原蛋白基因卜⑶的菌株中纯化出所需的第二表达载体并利用琼脂糖凝胶电泳确认(步骤3144〉、利用一个或二个限制性酶分别对步骤3144所得到的第二表达载体以及报道基因％进行剪切(步骤3145〉、接合剪切后的第二表达载体以及报道基因％以形成重组载体(步骤3146〉、将重组载体转化至感受态细胞中进行培养以及菌落筛选以得到含有报道基因％的菌株(步骤3147〉、以及由含有报道基因％的菌株中纯化出所需的重组载体并利用琼脂糖凝胶电泳确认(步骤3148)0
[0044]在一些实施例中，当重组载体不插入报道基因％时，则无需步骤3145至步骤3148，此时步骤3144所得到的第二表达载体即为所需的重组载体。
[0045]在此，本领域技术人员都应该知晓许多适合的感受态细胞，且许多感受态细胞是可以购得的，例如:细菌或真核细胞等，故不在此赘述。
[0046]本领域技术人员都应该知晓，在本发明中所述的转基因鱼卵是指人工引入前述的重组载体的胚胎、或此胚胎孵化成的鱼体所产生的鱼卵、或此鱼体的后代所产生的鱼卵。为了方便说明，人工引入前述的重组载体的胚胎所孵化成的鱼体及其后代在本文中通称为转基因鱼。换言之，转基因鱼的细胞中具有重组载体的至少一复制体。为了方便说明，人工引入的重组载体及其复制体在下文中通称为重组基因结构。[0047]因此，根据选用的上游基因呢的种类，复制体中的上游基因呢可直接或间接驱动复制体中的人类胶原蛋白基因卜⑶在转基因鱼的鳞片、表皮或眼睛等特定部位分泌重组人类前胶原蛋白或胶原蛋白。进一步可利用具有分泌的重组人类前胶原蛋白或胶原蛋白的鱼体特定部位作为生物材料(例如:具有重组人类前胶原蛋白或胶原蛋白及无机成份的生物材料)或纯化出其中的重组人类胶原蛋白。
[0048]在此，各重组人类前胶原蛋白可为第1型至第28型胶原蛋白中的任一条链。各重组人类胶原蛋白可为第1型至第28型胶原蛋白中的任一种或其配体。再者，分泌的重组人类胶原蛋白的三条链可均源自于人类胶原蛋白基因卜⑶，或者仅其中的一条链或两条链源自于人类胶原蛋白基因卜⑶而其余的链则源自于鱼胶原蛋白基因。
[0049]在一些实施例中，具有重组人类前胶原蛋白或胶原蛋白的鱼的特定部位可为鱼鳞、皮肤、鱼眼等部位中的一个或其组合。
[0050]以下通过实 例更进一步地详细说明，但这些实例仅是作为举例说明，而非用以限定本发明的范围。在此，涉及的0嫩序列是交由源资国际生物科技股份有限公司协助测序，而其所使用的测序机型为八813730(^61161:1(3八的匕况!"。所使用的[8 (1111-18-801-1:81111)培养液的配制为取208 [8粉末((6101(1610加水至11，然后以灭菌爸灭菌后即可使用。03粉末(购自810 08810 111(3.)的成份包括:108的胰蛋白胨的酵母提取物(^6881:以廿已。!:)以及 5邑的氯化钠($0(1111111 0^101-1(1603/八即(1881111)10111111)培养基则是在03培养液中加入50 9 的氨节青霉素(抗生素
[0051]实例一:利用鱼体进行0嫩提取
[0052]在此，以野生型斑马鱼(031110 1-61-10,仙系)为例，利用基因组0嫩纯化试剂盒(6611018^61-试剂盒)进行斑马鱼的基因组0嫩的提取。661101成61~试剂盒包括661101成61~试剂1-08^6111: I？嫩酶混合物(觀386⑶(^仏丨1 )和乙醇沉淀缓冲液(￡1:1181101
[0053]首先，用液态氮研磨或用组织匀浆机研磨斑马鱼组织。然后，取约1008~100呢的研磨后的鱼组织，并以11111 (66=01成61'试剂来裂解细胞以得到裂解均质的样品。将裂解均质的样品(101)放置于室温下3~5分钟，随后加入500 1的酹(91161101)/氯仿(01101^0:011)(1:1),并均匀混和，以得到第一混合液。将第一混合液以转速12000印！11离心5分钟后，小心吸取第一混合液的上清液到新的离心管。再加入0.7~0.81111的异丙醇至离心管内，并均匀混和，以得到第二混合液。将第二混合液以转速12000印！11离心5分钟后，将离心管中的第二混合液的上清液去除干净，而留下沉淀物于离心管中。加入409 [的酶混合物至具有沉淀物的离心管中并置于371中5分钟，以将半湿状态的沉淀物溶解。之后再加入600^ [的乙醇沉淀缓冲液于离心管中，并均匀混和，以得到第三混合液。将第三混合液以转速12000印！11离心5分钟后，将离心管中的第三混合液的上清液去除干净，而留下沉淀物于离心管中。最后，再加入50~200此的12缓冲液至离心管中以溶解沉淀物，即得到鱼的基因组0嫩。将得到的基因组0嫩储存于-201，待进一步实验使用。
[0054]实例二:克隆鱼类的启动子
[0055]聚合酶链反应:
[0056]以3即10勵:1所示的1(4启动子为例，在此正向引物采用3即10勵:6所示的序列，以及反向引物采用3即10勵:7所示的序列。[0057]依据下列表一加至0.2ml微量试管中进行聚合酶链反应，以得到第一产物。在此，聚合酶链反应的条件为阶段1:94°C反应I分钟；阶段2:58°C反应I分钟；阶段3:72°C反应I分钟10秒；并且3个阶段依序进行35个循环。
[0058]并且，将第一产物利用1%琼脂糖凝胶电泳确认是否存在所需的K4启动子。
[0059]表一
【权利要求】
1.一种生物材料，包括:由鱼体获得的重组人类前胶原蛋白或胶原蛋白。
2.如权利要求1所述的生物材料，进一步包括该鱼体的至少鱼鳞，其中各该鱼鳞具有表达的该重组人类前胶原蛋白或胶原蛋白。
3.如权利要求1所述的生物材料，其中该重组人类前胶原蛋白或胶原蛋白是由人类胶原蛋白基因在该鱼体表达的。
4.一种转基因鱼卵，包括: 鱼类染色体；以及 重组载体，其整合到该鱼类染色体中，其中该重组载体包括人类胶原蛋白基因。
5.如权利要求4所述的转基因鱼卵，其中该重组载体进一步包括上游基因，该人类胶原蛋白基因连接在该上游基因的下游。
6.如权利要求5所述的转基因鱼卵，其中该上游基因为在鱼体中存在的启动子、增强子或其组合。
7.如权利要求4或5所述的转基因鱼卵，其中该重组载体进一步包括报道基因，该报道基因连接在该人类胶原蛋白基因的下游。
8.—种重组载体包括: 上游基因，由鱼体获得；以及 人类胶原蛋白基因，连接在该上游基因的下游。
9.如权利要求8所述的重组载体，进一步包括报道基因，该报道基因连接在该人类胶原蛋白基因的下游。
10.如权利要求8所述的重组载体，其中该上游基因为在该鱼体中普遍存在的启动子、增强子或其组合。
【文档编号】C07K14/78GK103833846SQ201310388654
【公开日】2014年6月4日 申请日期:2013年8月30日 优先权日:2012年8月30日
【发明者】耿全福, 龚纮毅, 吴金洌, 赖弘基, 林建成, 陈永貴, 周正鸿 申请人:柏登生医股份有限公司