从初乳获取免疫球蛋白的方法
【专利摘要】本发明提供了用于从初乳获取免疫球蛋白的方法，其中（a）对0天到7天的初乳进行热处理，脱去乳脂，（b）对这样获得的脱脂乳进行无菌微滤从而产生含有酪蛋白的第一滞留物R1、以及第一渗透物P1，（c）对所述第一渗透物P1进行超滤从而产生含有乳糖和矿物质的第二渗透物P2、以及第二滞留物R2，其中所述免疫球蛋白被浓缩。
【专利说明】从初乳获取免疫球蛋白的方法
【技术领域】
[0001]本发明总体上涉及药物组合物领域，具体涉及获取免疫球蛋白的方法，其中对初乳(colostral milk)进行组合的微滤和超滤。
【背景技术】
[0002]初乳是给新生哺乳动物的第一乳(first milk),由雌性的乳腺产生以在新生生命的最初日子里最优地喂养新生儿。它也被称为前乳(foremilk)、首乳(beestings)、第一乳，特别地被称为初乳，它含有蛋白质、酶、维生素、矿物质、生长因子、氨基酸和抗体。通过这种方式，它维持年幼的哺乳动物的力量和免疫防御。初乳被认为是一种健康食品。
[0003]对初乳的效力有许多研究。其中，初乳被认为提供某种保护，防止传染性疾病(参见 Cesarone 等人，Clinical and Applied Thrombosis/Hemostasisl3 (2),130-136(2007))，且帮助伤口愈合和受损肠黏膜的再生二者。初乳也被用在过敏症、高血压、糖尿病和抑郁症的联合治疗中。但至今仍没有证据证明对这些适应症的疗效。
[0004]牛的初乳作为原料源特别是免疫球蛋白源尤其令人关注。然而，对分离而言，至多只使用在产后最初的24小时至48小时内产生的乳在技术上是合理的，因为之后球蛋白含量会以某种浓缩方式显著下降，其在经济上将不再合理。
[0005]EP0410272A1 (Biotest)描述了免疫球蛋白浓缩物的产生，其中来自产后最初30小时的初乳被脱脂、巴氏灭菌、消毒、进行超滤和喷雾干燥。但是，这种方法只在使用具有相对较高的免疫球蛋 白含量的初乳时才是经济的。该浓缩方法不适用于在48小时之后才获得的乳。
[0006]EP0918464B1 (Achenbach)的主题是用于生产去酪蛋白的(decaseinated)初乳产品的方法，其中原初乳被脱脂并被酸化使得酪蛋白被保持在溶液中，并执行具有至少106道尔顿的切割分子量的超滤方法。这样获得的初乳产品以饮品的形式特别适于用作药品、膳食补充剂、饮料、婴儿食品、动物饮料的添加剂，所述饮品在高强度运动中用于肌肉细胞保护或者用于缩短肌肉恢复阶段以及用于预防和治疗细菌感染、病毒感染和真菌感染。但是，该公开与免疫球蛋白的浓缩无关。
[0007]EP0410272A1 (Biotest)描述了免疫球蛋白浓缩物的产生，其中来自产后最初30小时的初乳被脱脂、巴氏灭菌、消毒、进行超滤并最终被喷雾干燥。
[0008]此外，AT511308A2 (Vitalplus)公开了用于生产乳糖含量低或者不含乳糖的初乳产品的方法，其中原初乳被脱脂并被去酪蛋白，且对含有在超滤之后获得的高分子成分的产物进行灭菌和/或除菌过滤。对来自超滤步骤的渗透物(含有特别是原初乳的低分子成分和乳糖)进行乳糖裂解，然后，低分子成分和乳糖裂解产物在灭菌或除菌过滤之前或者在灭菌或除菌过滤过程中被再次加入到含有高分子成分的产物。但是，该方法没有作为其目标的免疫球蛋白的浓缩和获取。
[0009]最后，EP0085005B1 (Fromageries Bel)公开了用于从初乳分离免疫球蛋白的方法，其中通过电泳法对初乳进行裂解，对富含免疫球蛋白的部分进行电泳，使获得的第一浓缩部分穿过阴离子交换剂以便因此获得具有免疫球蛋白的第二的、进一步的浓缩部分。
[0010]因此，本发明的目的是提供方法，通过该方法，可以浓缩产后2至7天内收集的初乳中的免疫球蛋白含量，也保持尽量低的技术努力。
【发明内容】
[0011]本发明的主题是用于获取免疫球蛋白的方法，其中
[0012](a)对O天到7天的初乳进行热处理,脱去乳脂(skimming the cream),
[0013](b)对这样获得的脱脂乳进行无菌微滤从而产生含有酪蛋白的第一滞留物R1、以及第一渗透物Pl，
[0014](C)对所述第一渗透物Pl进行超滤从而产生含有乳糖和矿物质的第二渗透物P2、以及第二滞留物R2，其中所述免疫球蛋白(特别是有价值的种类IgGUIgA和IgM)被浓缩。
[0015]令人惊讶的是，已发现通过这种方式，在使用产后7天内收集的初乳时，也能获得含有高达15重量％的免疫球蛋白的部分。接着，所述部分可被浓缩，优选地利用离子交换剂，直至85重量％至90重量％的免疫球蛋白含量。随后，该产物可通过干燥、透析或超滤被进一步提纯和浓缩。【具体实施方式】
[0016]热处理
[0017]初乳的热处理(“提纯”)优选地在热交换器中执行，其中特别是板式热交换器已被证明特别适合。热交换器有温度梯度，但是，对其进行选择使得初乳被加热至温度为约70°C至80°C，且更特别是从约72°C至74°C，停留时间最少10秒且最多30秒，优选约15秒。
[0018]固体非乳颗粒(比如，例如体细胞、秸杆颗粒以及类似物)的分离和约4重量％的脂肪含量的脱去通常在下游部件(优选分离器)中执行。这种部件可从现有技术的陈述中充分了解。GEA Westfalia Separator GmbH公司的分离器被广泛应用在乳制品工业中，其允许两种步骤的联合使用或单独使用(http://www.westfalia-separator.com/de/anwendungen/molkereitechnik/milch-molke.html)。相应的部件也已被公开，例如，在DE10036085C1 (Westfalia)中，且为本领域技术人员所熟知。因此，不需要对执行这些工艺步骤进行说明，因为它们被理解为是一般专业知识的一部分。
[0019]微滤和超滤
[0020]根据本发明所述的方法的核心是微滤和超滤的组合。
[0021]微滤是用于物质去除的工艺。微滤和超滤之间的本质区别在于不同的孔径和不同的膜结构，以及在于涉及的材料和过滤器材料。通过具有〈0.1 μ m的孔径的膜的过滤通常被称为超滤，而使用>0.1 μ m的孔径的过滤通常被称为微滤。在这两种情况下，就应用机械尺寸排阻的原理的纯物理的(即，机械式的)膜分离方法而言:流体中比膜孔大的所有颗粒被膜截留。这两种分离方法中的驱动力是过滤区域的入口和出口之间的压差，该压差在0.1巴至10巴之间。根据应用的领域，过滤区域的材料可以由不锈钢、合成材料、陶瓷或织物组成。过滤器元件以不同的形式出现:烛式过滤器、平板膜、螺旋线圈膜、袋式过滤器和中空纤维模块；在本发明的内涵内所有这些都基本适用。
[0022]在热处理和脱脂之后，对脱脂乳进行微滤，从而不仅分离微生物，还特别分离酪蛋白，这样获得第一滞留物Rl。微滤优选地借助具有0.2 μ m、优选0.1 μ m的选择性分离机构的膜来执行。已令人惊讶地证明，这在提纯的背景之前也是足够的，因为多数不耐热孢子已作为热处理的结果被分离，并连同之前的分离器黏质物(separator slime)—起被排出。结合所述孔径和基本上由螺旋线圈膜但优选由陶瓷膜构成的微滤装置，同时解决了频繁堵塞的问题。通过这样做，微滤可被“冷”执行或“暖”执行，即在5°C至70°C范围内的温度下执行。但优选地，微滤在50°C至55°C范围内的温度下执行，因为变性(denaturation)在这些条件下被避免，且乳清蛋白至渗透物中的最大通量和最佳渗透率被实现。
[0023]对微滤过程中获得的第一渗透物Pl进行超滤步骤。通过这样做，获得基本上包含乳糖和矿物质(“灰”)且能被分开处理的第二渗透物P2。在该工艺中，在聚合物基础上的螺旋线圈膜特别合适；原则上也可使用其它材料，但它们通常要昂贵得多同时它们也没有表现出明显更高的性能。超滤优选地利用具有0.01 μ m至0.1 μ m的选择性分离机构的膜来执行。超滤也可被“冷”执行或“暖”执行，即在5°C至70°C范围内的温度下执行。在超滤的情况下，冷过滤，即在10°C至15°C范围内的温度下过滤，对避免乳清蛋白的破坏是有帮助的。
[0024]免疫球蛋白的分离
[0025]可根据现有技术中的已知方法、特别是根据前述EP0085005B1中所记载的方法来执行免疫球蛋白从第二滞留物中的分离。优选地，第二滞留物通过填充有阴离子交换剂颗粒的柱状物。特别适用于该目的的是例如由Rhone-Poulenc公司以商品名Spherosil销售的多孔产品，尤其是QMA型(对极端的碱性pH值敏感的交换剂)、C型(对非常弱的酸性pH值敏感的交换剂)、S型(对极端的酸性pH值敏感的交换剂)和X OBO15 (对非常弱的酸性pH值敏感的交换剂)，这些通常可在多孔氧化硅的载体上获得。此外，合适的是例如1.B.F.的产品Trisacryl。所述 离子交换剂具有如下优点:它们不改变优选的pH值,在该优选的pH值执行分离且该优选的PH值介于7和8之间。这特别避免了球蛋白的变性。所述分离可在2°C和25°C之间、优选在3°C和10°C之间的温度下执行。免疫球蛋白被吸附在树脂上，而分泌的介质几乎不含免疫球蛋白。通过用IN HCl清洗所述柱状物，免疫球蛋白可被再次溶解且几乎可被完全回收。随后，这样获得的部分可通过干燥、透析、超滤和类似工艺被浓缩直至98重量％至100重量％的浓度。
[0026]实施例1
[0027]在板式热交换器中将具有免疫球蛋白含量为3重量％的O天至7天的初乳加热至72°C，维持15秒。通过所连接的分离器，如此巴氏灭菌过的初乳被脱脂而固体物被去除。在50°C借助具有0.1 μ m孔径的陶瓷膜对获得的脱脂乳进行微滤，含酪蛋白的滞留物Rl被分离。此外，在10°C借助具有0.04 μ m孔径的螺旋线圈膜对渗透物Pl进行超滤。通过这样做，获得含有乳糖和矿物质且被分开处理的第二渗透物P2、以及具有15重量％的免疫球蛋白含量的第二滞留物R2。
[0028]2升滞留物通过填充有Spherosil QMA型树脂的阴离子交换剂柱状物。温度为4°C, pH值为约6.5，流率为300毫升/小时。通过的介质具有小于0.5重量％的残留免疫球蛋白含量。然后，用500毫升的IN HCl清洗该柱状物。由此获得的部分具有30重量％的蛋白质含量，且就蛋白质数量来说，免疫球蛋白含量为89重量％而白蛋白含量为11重量％。随后喷雾干燥得到干燥粉末。
[0029]比较例Vl[0030]在板式热交换器中将具有免疫球蛋白含量为3重量％的O天至7天的初乳加热至72°C，维持15秒。通过所连接的分离器，如此巴氏灭菌过的初乳被脱脂而固体物被去除。所获得的脱脂乳被酸化使得酪蛋白被保持在溶液中，接着，在25°C借助具有0.04μπι孔径的螺旋线圈膜对所述脱脂乳进行超滤。通过这样做，获得含有乳糖和矿物质且被分开处理的渗透物Ρ1、以及具有8重量％的免疫球蛋白含量的滞留物Rl。
[0031]2升滞留物通过填充有Spherosil QMA型树脂的阴离子交换剂柱状物。温度为4°C, pH值为约6.5，流率为300毫升/小时。通过的介质具有小于0.5重量％的残留免疫球蛋白含量。然后，用500毫升的IN HCl清洗该柱状物。由此获得的部分具有22重量％的蛋白质含量，且就蛋白质数量来说，免疫球蛋白含量为71重量％而白蛋白含量为29重量％。随后喷雾干燥得到干 燥粉末。
【权利要求】
1.一种用于获取免疫球蛋白的方法，其中 (a)对O天到7天的初乳进行热处理，脱去乳脂， (b)在约50°C至约70°C的温度下对这样获得的脱脂乳进行无菌微滤从而产生含有酪蛋白的第一滞留物R1、以及第一渗透物Pl， (c)在约5°C至约15°C的温度下对所述第一渗透物Pl进行超滤从而产生含有乳糖和矿物质的第二渗透物P2、以及第二滞留物R2，其中所述免疫球蛋白被浓缩，以及 Cd)由此从所述第二滞留物获得的所述免疫球蛋白通过利用阴离子交换剂的处理被分离出来。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述初乳在约70°C至约80°C的温度下进行处理。
3.如权利要求1所述的方法，其中所述初乳被处理约10秒至约30秒的时间段。
4.如权利要求1所述的方法,其中利用具有约0.1 μ m至约0.2 μ m的选择性分离机构的膜来执行微滤。
5.如权利要求1所述的方法，其中借助陶瓷膜来执行微滤。
6.如权利要求1所述的方法,其中利用具有约0.01 μ m至约0.1 μ m的选择性分离机构的膜来执行超滤。
7.如权利要求1所述的方法，其中借助螺旋线圈膜来执行超滤。
8.如权利要求1所述的方法，其中借助阴离子交换剂在约2°C至约25°C范围内的温度下执行分离。
9.如权利要求1所述的方法，其中借助阴离子交换剂在约6至约7的pH值下执行分离。
【文档编号】C07K1/34GK103965353SQ201410043688
【公开日】2014年8月6日 申请日期:2014年1月29日 优先权日:2013年1月31日
【发明者】斯文-雷纳·多林 申请人:Dmk德意志牛奶股份有限公司