化合物及其制备方法和应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了化合物及其制备方法和应用，其中，该化合物具有如式1所示的结构：利用该化合物能够将多肽N端的氨基转化为叠氮基团，进而在短肽连接制备蛋白时，将用于连接的短肽N端的半胱氨酸氨基掩蔽为叠氮基团，能够实现一次将三个短肽进行连接，即连接两个短肽后不需要立即进行分离纯化处理，在解除掩蔽后可直接进行下一个短肽的连接。
【专利说明】化合物及其制备方法和应用
【技术领域】
[0001]本发明属于多肽合成【技术领域】，具体地，涉及化合物及其制备方法，以及制备多肽的方法。
【背景技术】
[0002]酸敏性离子通道(Acid sensing ion channels, ASICs)主要分布于中枢和外周神经系统，是一类在痛觉产生过程中起重要作用的PH敏感型离子通道。因此，寻找这种离子通道的抑制剂成为研发新型止痛药的重要方向。黑曼巴毒肽(Mambalgins)，被发现可以通过抑制ASICs而发挥镇痛作用(Diochot.Nature, 2012)。在Diochot的研究表明，Mambalgins具有与吗啡相似的镇痛作用。但由于该毒肽具有与吗啡完全不同的镇痛机制(吗啡是通过结合于阿片受体而起作用)，所以其可耐受吗啡拮抗剂纳洛酮的作用，且不会产生阿片样呼吸抑制作用，也不会像吗啡那样快速产生耐药性和依赖性，因此，Mambalgins具有较好的开发成为新型止痛药的医用前景。
[0003]黑曼巴蛇毒肽为含有四对二硫键的57肽，基于第四个氨基酸的不同可以分为两种，即第四个氨基酸为Tyr的mambalgins-Ι和第四个氨基酸为Phe的mambalgins-2。具体
结构如下所示:
[0004]
【权利要求】
1.一种化合物，其特征在于，具有如式I所示的结构:
2.一种制备权利要求1所述化合物的方法，其特征在于，包括: (O使叠氮化钠与三氟甲磺酸酐接触，以便获得三氟甲磺酸叠氮； (2)使所述三氟甲磺酸叠氮与S-三苯甲基-L-半胱氨酸反应，以便得到权利要求1所述的化合物。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(1)进一步包括: (1-1)将叠氮化钠水溶液与二氯甲苯混合； (1-2)将步骤(1-1)所得到的混合物进行冰浴冷却； (1-3)在冰浴条件下，向步骤(1-2)中所得到的经过冷却的混合物中添加三氟甲磺酸酐；以及 (1-4)在室温下，使步骤(1-3)中所得到的混合物反应，以便获得所述三氟甲磺酸叠氮。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(2)进一步包括: (2-1)将所述三氟甲磺酸叠氮与含有S-三苯甲基-L-半胱氨酸、碳酸钾、五水硫酸铜和甲醇的溶液混合，以及 (2-2)在室温下，将步骤(2-1)所得到的混合物搅拌过夜，以便获得权利要求1所述的化合物。
5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，包括: 将154mmol叠氮化钠溶于25ml去离子水，向所获得的叠氮化钠水溶液中加入40ml 二氯甲烷，以便获得第一混合物； 将所述第一混合物进行冰浴冷却lOmin，以便获得经过冰浴冷却的第一混合物； 在冰浴条件下，向所述经过冰浴冷却的第一混合物中添加30mmol三氟甲磺酸酐，以便获得第二混合物； 在室温下，使所述第二混合物反应3h，以便获得所述三氟甲磺酸叠氮； 将15mmol S-三苯甲基-L-半胱氨酸、22.5mmol碳酸钾、0.15mmol五水硫酸铜溶于50ml去离子水和100ml甲醇的混合溶液中，向所获得的混合物中加入所述三氟甲磺酸叠氮，以便获得第三混合物；以及 在室温下，将所述第三混合物搅拌过夜，将所得到的产物旋干有机相，将所获得的水相稀释至100ml，利用浓盐酸将经过稀释的水相的pH调节至2后，利用乙二酸二乙酯进行萃取，将所获得的有机相通过硅胶柱进行纯化处理，以便获得权利要求1所述的化合物。
6.一种制备多肽的方法，其特征在于，包括: Ca)提供第一短肽和第二短肽，所述第一短肽的C端形成有酰肼基团，所述第二短肽的N端为叠氮半胱氨酸，所述叠氮半胱氨酸是利用权利要求1所述的化合物形成的； (b)将所述第二短肽进行还原处理，以便将所述叠氮半胱氨酸转化为半胱氨酸；以及 (c)将所述第一短肽和步骤(b)中所得到的经过还原处理的第二短肽进行连接，以便获得所述多肽。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，利用三(2-羧乙基)膦对所述第二短肽进行所述还原处理， 任选地，所述还原处理是在6.8-7.2的pH下进行I小时。
8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤(c)进一步包括: (c-1)将所述第一短肽和亚硝酸钠接触，以便对所述第一短肽的酰肼基团进行氧化处理； (c-2)将步骤(c-1)中所得到的氧化处理产物与4-巯基苯乙酸溶液混合，并将所得到混合物的PH调节至5;以及 (c-3)向步骤(c-2)所得到的混合物中添加步骤(b)中所得到的经过还原处理的第二短肽，并在6.2-6.5的pH下进行连接反应， 任选地，进一步包括: Cd)将步骤(C)中所得到的多肽与还原型谷胱甘肽、氧化型谷胱甘肽进行混合，并将所得到的混合物搅拌过夜，以便对所得到的多肽进行氧化折叠处理， 其中， 氧化型谷胱甘肽的终浓度为100 μ M，还原型谷胱甘肽的终浓度为ImM，所述多肽的终浓度为10 μ M.
9.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述第二短肽是通过以下步骤获得的: (a-Ι)通过固相多肽合成方法制备第三短肽和第四短肽，所述第三短肽的N端形成有半胱氨酸基团，所述第四短肽的C端形成有酰肼基团； (a-2)将所述第四短肽与权利要求1所述的化合物接触，以便在所述第四短肽的N端形成叠氮半胱氨酸基团；以及 (a-3)将N端形成叠氮半胱氨酸基团的第四短肽与所述第三短肽进行连接，以便获得所述第二短肽。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于， 所述第一短肽具有如SEQ ID NO:1或SEQ ID NO: 2所示的氨基酸序列， 所述第三短肽具有如SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列， 所述第四短肽具有如SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列。
【文档编号】C07K1/08GK103787938SQ201410043816
【公开日】2014年5月14日 申请日期:2014年1月29日 优先权日:2014年1月29日
【发明者】刘磊, 潘漫, 黄轶超, 李宜明, 李奕潼 申请人:清华大学