生产成熟的人促红细胞生成素的方法以及包含获自该方法的人促红细胞生成素的组合物的制作方法
【专利摘要】本发明涉及在巴斯德毕赤氏酵母中生产缺乏与针对宿主细胞抗原的抗体的可检测交叉结合活性的蛋白质的方法。描述了在巴斯德毕赤氏酵母中生产重组糖蛋白的方法，所述重组糖蛋白缺乏与针对宿主细胞抗原制得的抗体的可检测的交叉结合活性，所述方法包括提供重组巴斯德毕赤氏酵母宿主细胞，其不展现对于N-聚糖或O-聚糖的β-甘露糖基转移酶2活性，不展现对于N-聚糖或O-聚糖的选自β-甘露糖基转移酶1活性和β-甘露糖基转移酶3活性的至少一种活性，并且其包括编码所述重组糖蛋白的核酸分子；在培养基中生长所述宿主细胞；和从所述培养基中回收所述重组糖蛋白。
【专利说明】生产成熟的人促红细胞生成素的方法以及包含获自该方法的人促红细胞生成素的组合物
[0001]本申请是申请日为2010年10月11日的中国专利申请201080057790.7 “在巴斯
德毕赤氏酵母中生产缺乏与针对宿主细胞抗原的抗体的可检测交叉结合活性的蛋白质的方法”的分案申请。
【技术领域】
[0002]本发明涉及在巴斯德毕赤氏酵母GcYcAia中生产蛋白质和糖蛋白的方法，所述蛋白质和糖蛋白缺乏与针对宿主细胞抗原制得的抗体的可检测的交叉结合活性。特别地，本发明涉及使用重组的巴斯德毕赤氏酵母菌株，其不展现对于聚糖或O-聚糖的β -甘露糖基转移酶2活性，并且不展现选自由对于聚糖或O-聚糖的β -甘露糖基转移酶1、3和4的活性构成的组的至少一种活性。这些重组巴斯德毕赤氏酵母菌株可以产生蛋白质和糖蛋白，在其上缺乏可检测的α-甘露糖苷酶抗性的β-甘露糖残基。本发明进一步涉及在巴斯德毕赤氏酵母GcYcAia pastor is")中生产双唾液酸化的人促红细胞生成素的方法，所述双唾液酸化的人促红细胞生成素缺乏与针对宿主细胞抗原的抗体的可检测交叉结合活性。
[0003]【背景技术】
生产重组的人蛋白质的能力引起了人体健康护理领域的很大发展，仍然是药物开发的活跃领域。许多治疗蛋白质需要向蛋白质的特定天冬酰胺残基翻译后添加聚糖GV-糖基化)以确保适当的结构-功能活性和随后在人血清中的稳定性。对于在人类中的治疗用途，糖蛋白需要人类样的糖基化。可以模拟人类样糖蛋白加工的哺乳动物细胞系(例如，CHO细胞、人类视网膜细胞)具有几个缺点，包括低的蛋白质滴度、长发酵时间、异源产物、以及持续的病毒防范。因而希望的是使用不仅在短发酵时间中产生高的蛋白质滴度、而且还产生人类样糖蛋白的表达系统。真菌宿主例如甲基营养型酵母巴斯德毕赤氏酵母具有用于治疗蛋白质表达的独特优点，例如，它们不分泌高量的内源蛋白质，生产异源蛋白质的可诱导的强启动子是可用的，它们可以在化学成分已知的培养基中生长并且不使用动物血清，它们可以生产高滴度的重组蛋白质(Creggei a7.，FEMS Microb1l.Rev.24: 45-66 (2000))。然而，在巴斯德毕赤氏酵母中表达的糖基化蛋白质一般含有额外的甘露糖糖类，产生“高甘露糖”的聚糖，以及在糖蛋白上赋予负电荷的甘露糖基憐酸基团。具有闻甘露糖聚糖或具有带电甘露聚糖的糖蛋白存在着在人类中引起不希望的免疫反应的风险(Takeuchi, Trendsin Glycosc1.Glycotechnol.9:S29-S35 (1997) ；Rosenfeld and Ballou, J.B1l.Chem.249: 2319-2321 (1974))。因而，希望的是在真菌宿主细胞中生产治疗性糖蛋白，在所述宿主细胞中糖蛋白上的糖基化模式相同于、或类似于在人类中产生的糖蛋白上发生的模式，并且不具有可检测的β_甘露糖基化。
[0004]如在未感染的个体中保护性抗体的存在所证明的，β -连接的甘露聚糖可能是免疫原性的，或不利地影响施用包含β_连接的甘露聚糖的治疗蛋白质或糖蛋白的个体。另外，在治疗蛋白质上暴露的甘露糖基团被巨噬细胞上的甘露糖受体快速地清除，导致低药物效力。因而，在真菌宿主例如巴斯德毕赤氏酵母中表达的异源治疗蛋白质的或化连接的聚糖上β-连接的甘露糖残基的存在不是期望的，考虑到它们的免疫原性可能性以及它们与清除因子结合的能力。
[0005]在巴斯德毕赤氏酵母中制造的糖蛋白已经被报道含有β_连接的甘露糖残基。在2003年，Trimble等(Glycob1l.14: 265-274，Epub Dec 23)报道了在巴斯德毕赤氏酵母中表达的重组的人胆汁盐刺激脂肪酶(hBSSL)中β_1，2-连接的甘露糖残基的存在。已经在巴斯德毕赤氏酵母和白色念珠菌(Candida albicans)中鉴定了编码几种β _甘露糖基转移酶的基因(参见美国专利 N0.7，465，577 和 Milleei a人，J.B1l.Chem.283: 9724-9736(2008))。
[0006]根据上文，需要提供在甲基营养型酵母例如巴斯德毕赤氏酵母中制造重组治疗蛋白质或糖蛋白的方法，所述重组治疗蛋白质或糖蛋白缺乏在施用所述重组治疗蛋白质或糖蛋白的个体中可能引发不良反应的表位。确定重组治疗蛋白质或糖蛋白在施用给个体时是否提供了引发不良反应的风险的方法，是将重组治疗蛋白质或糖蛋白与针对总宿主细胞抗原制备的抗体接触。对于预期长期施用的蛋白质或糖蛋白这是特别关注的。缺乏与抗体的交叉结合表明所述重组治疗蛋白质或糖蛋白缺乏与所述抗体的可检测的交叉结合活性，并且当施用给个体时不太可能引发不良反应。因而，需要生产重组治疗蛋白质或糖蛋白的方法，所述重组治疗蛋白质或糖蛋白缺乏与所述抗体的可检测的交叉结合活性，并且当施用给个体时不太可能引发不良反应。
[0007]
【发明内容】
本发明提供了在甲基营养型酵母例如巴斯德毕赤氏酵母中生产蛋白质和糖蛋白的方法，所述蛋白质和糖蛋白缺乏与针对宿主细胞抗原制得的抗体的可检测的交叉结合活性。特别地，本发明提供了利用重组的甲基营养型酵母例如巴斯德毕赤氏酵母菌株来生产重组蛋白质和糖蛋白的方法，所述酵母不展现对于N-聚糖或O-聚糖的β -甘露糖基转移酶2活性，并且不展现选自β_甘露糖基转移酶1、β_甘露糖基转移酶3和β_甘露糖基转移酶4的对于Ar-聚糖或聚糖的至少一种活性。在一个方面,所述宿主细胞是巴斯德毕赤氏酵母菌株，其中编码甘露糖基转移酶2的基因，以及编码选自β-甘露糖基转移酶1、3和4的β -甘露糖基转移酶的至少一种基因(分别为基因ΒΜΤ1』ΜΤ3』ΜΤ4、被删除或破坏或突变以产生无活性的β_甘露糖基转移酶，来生产重组蛋白质和糖蛋白。在其他方面β -甘露糖基转移酶1、β -甘露糖基转移酶3和β -甘露糖基转移酶4的一种或更多种的活性利用β -甘露糖基转移酶抑制物来取消，所述抑制物包括但不限于化合物、针对编码β -甘露糖基转移酶的一种或更多种mRNA的反义DNA，针对编码β -甘露糖基转移酶的一种或更多种mRNA的siRNA。
[0008] 这些重组巴斯德毕赤氏酵母菌株可以生产蛋白质和糖蛋白，在其上缺乏可检测的 甘露糖苷酶抗性的β_甘露糖残基。本发明进一步提供了在巴斯德毕赤氏酵母中生产
双唾液酸化的人促红细胞生成素的方法，所述双唾液酸化的人促红细胞生成素缺乏与针对宿主细胞抗原的抗体的可检测的交叉结合活性。所述方法和宿主细胞允许产生重组治疗蛋白质和糖蛋白，与此处公开的未修饰的菌株中生产的相比，其在施用所述重组治疗蛋白质和糖蛋白的个体中具有引发不良反应的降低的风险。所述方法和宿主细胞对于生产具有结合清除因子的更低可能性的重组蛋白质或糖蛋白也是有用的。[0009]在一个方面，本发明提供了重组甲基营养型酵母例如巴斯德毕赤氏酵母宿主细胞，其不展现对于N-聚糖或聚糖的β-甘露糖基转移酶2活性，并且不展现选自β-甘露糖基转移酶I活性和β -甘露糖基转移酶3活性的、对聚糖或O-聚糖的至少一种活性，并且其包括编码所述重组糖蛋白的核酸分子。在进一步的实施方式中，所述宿主细胞不展现对于N-聚糖或O-聚糖的β -甘露糖基转移酶2活性、β -甘露糖基转移酶I活性和β -甘露糖基转移酶3活性。在进一步的实施方式中，所述宿主细胞进一步不展现对聚糖或O-聚糖的β_甘露糖基转移酶4活性。在另一个方面，本发明提供了重组甲基营养型酵母例如巴斯德毕赤氏酵母宿主细胞，其具有编码β-甘露糖基转移酶2活性的基因的删除或破坏，以及选自编码β_甘露糖基转移酶I活性和β_甘露糖基转移酶3活性的基因的至少一种基因的删除或破坏，并且其包括编码所述重组糖蛋白的核酸分子。在进一步的实施方式中，所述宿主细胞具有编码β -甘露糖基转移酶2活性、β -甘露糖基转移酶I活性和β-甘露糖基转移酶3活性的基因的删除或破坏。在进一步的实施方式中，所述宿主细胞具有编码β-甘露糖基转移酶4活性的基因的删除或破坏。
[0010]在另一个方面，本发明提供了重组巴斯德毕赤氏酵母宿主细胞，其中β-甘露糖基转移酶2基因和选自β-甘露糖基转移酶I (S#77)和β-甘露糖基转移酶3
的至少一种基因被删除或破坏，并且其包括编码所述重组蛋白质或糖蛋白的核酸分子。在进一步的实施方式中，β -甘露糖基转移酶2 CBMm, β -甘露糖基转移酶I (MTl)和甘露糖基转移酶3 (沒#7^)基因被删除。在进一步的实施方式中，所述宿主细胞进一步包括甘露糖基转移酶4 (S#7￥)基因的删除或破坏。
[0011]在另一个方面，本发明提供了在甲基营养型酵母例如巴斯德毕赤氏酵母中生产重组糖蛋白的方法，所述重组糖蛋白缺乏与针对宿主细胞抗原制得的抗体的可检测的交叉结合活性，所述方法包括提供重组宿主细胞，所述重组宿主细胞不展现对于聚糖或O-聚糖的β-甘露糖基转移酶2活 性，不展现选自β-甘露糖基转移酶I和β-甘露糖基转移酶3的对于聚糖或聚糖的至少一种活性，以及其包括编码所述重组蛋白质或糖蛋白的核酸分子；在对表达所述重组糖蛋白有效的条件下在培养基中生长所述宿主细胞；以及从所述培养基中回收所述重组糖蛋白，以产生缺乏与针对宿主细胞抗原制得的抗体的可检测的交叉结合活性的重组糖蛋白。在进一步的实施方式中，所述宿主细胞不展现对于聚糖或O-聚糖的β -甘露糖基转移酶2活性、β -甘露糖基转移酶I活性和β -甘露糖基转移酶3活性。在进一步的实施方式中，所述宿主细胞进一步不展现对于聚糖或O-聚糖的β -甘露糖基转移酶4活性。
[0012]在另一个方面，本发明提供了在甲基营养型酵母例如巴斯德毕赤氏酵母中生产重组糖蛋白的方法，所述重组糖蛋白缺乏与针对宿主细胞抗原制得的抗体的可检测的交叉结合活性，所述方法包括提供重组宿主细胞，所述重组宿主细胞具有编码β -甘露糖基转移酶2活性的基因的删除或破坏，以及编码选自β-甘露糖基转移酶I活性和β-甘露糖基转移酶3活性的活性的至少一种基因的删除或破坏，以及其包括编码所述重组蛋白质或糖蛋白的核酸分子；在对表达所述重组糖蛋白有效的条件下在培养基中生长所述宿主细胞；以及从所述培养基中回收所述重组糖蛋白，以产生缺乏与针对宿主细胞抗原制得的抗体的可检测的交叉结合活性的重组糖蛋白。在进一步的实施方式中，所述宿主细胞具有编码β-甘露糖基转移酶2活性、β -甘露糖基转移酶I活性和β-甘露糖基转移酶3活性的基因的删除或破坏。在进一步的实施方式中，所述宿主细胞具有编码β_甘露糖基转移酶4活性的基因的删除或破坏。
[0013]在另一个方面，本发明提供了在巴斯德毕赤氏酵母中生产重组糖蛋白的方法，所述重组糖蛋白缺乏与针对宿主细胞抗原制得的抗体的可检测的交叉结合活性，所述方法包括提供重组巴斯德毕赤氏酵母宿主细胞，其中甘露糖基转移酶2 (沒#720基因和选自β -甘露糖基转移酶I (MT卿β -甘露糖基转移酶3 (ΒΜ13)的至少一种基因被删除或破坏，并且其包括编码所述重组蛋白质或糖蛋白的核酸分子；在对表达所述重组糖蛋白有效的条件下在培养基中生长所述宿主细胞；以及从所述培养基中回收所述重组糖蛋白，以产生缺乏与针对宿主细胞抗原制得的抗体的可检测的交叉结合活性的重组糖蛋白。在进一步的实施方式中，所述甘露糖基转移酶2 CBMm, β-甘露糖基转移酶I (S#77)和β-甘露糖基转移酶3 (沒#7^)基因被删除或破坏。在进一步的实施方式中，所述宿主细胞进一步包括β -甘露糖基转移酶(Α#7￥)基因的删除或破坏。一般地，与针对宿主细胞抗原制得的抗体的可检测的交叉结合活性在例如夹心ELISA或Western印迹的分析中测定。所述方法对于生产治疗蛋白质或糖蛋白是特别有用的。治疗蛋白质或糖蛋白的实例包括但不限于促红细胞生成素(EP0);细胞因子例如干扰素α、干扰素β、干扰素Y和干扰素ω ;以及粒细胞-集落刺激因子(GCSF) ;GM-CSF;凝血因子例如因子VII1、因子IX和人类蛋白质C ;抗凝血酶III ;凝血酶；可溶的IgE受体α链；免疫球蛋白例如IgG、IgG片段、IgG融合物和IgM ;免疫粘附素和其他Fe融合蛋白，例如可溶的TNF受体-Fe融合蛋白；RAGE_Fc融合蛋白；白细胞介素；尿激酶；胃促胰酶；和脲胰蛋白酶抑制物；IGF-结合蛋白；表皮生长因子；生长激素释放因子；annexin V融合蛋白；血管抑素；血管内皮生长因子_2 ;骨髓祖代抑制因子-1 ;护骨素(osteoprotegerin); α _1_抗胰蛋白酶；a -feto蛋白；DNase II ;人类血纤蛋白溶解酶原的kringle 3 ;葡糖脑苷脂酶；TNF结合蛋白I ;促滤泡激素；细胞毒T淋巴细胞相关抗原4 -1g ;跨膜激活物和钙调节物和亲环蛋白(cyclophilin)配体；高血糖素样蛋白质I ;和IL-2受体激动剂。 [0014]在宿主细胞或方法的特定实施方式中，编码所述重组蛋白质或糖蛋白的核酸分子的核酸序列的密码子为了在巴斯德毕赤氏酵母表达而被优化。
[0015]在宿主细胞或方法的再进一步的实施方式中，所述宿主细胞被遗传工程化来产生具有人类样聚糖的糖蛋白。
[0016]在宿主细胞或方法的进一步的实施方式中，宿主细胞进一步不展现对于糖蛋白上的聚糖的α 1，6-甘露糖基转移酶活性，并且包括与细胞靶向信号肽融合的α 1，2-甘露糖苷酶催化结构域，所述细胞靶向信号肽通常不与所述催化结构域相连，并且被选择以将α I, 2-甘露糖苷酶活性靶向宿主细胞的ER或高尔基体。
[0017]在宿主细胞或方法的再进一步的实施方式中，所述宿主细胞进一步包括与细胞靶向信号肽融合的GlcNAc转移酶I催化结构域，所述细胞靶向信号肽通常不与所述催化结构域相连，并且被选择以将GIcNAc转移酶I活性靶向宿主细胞的ER或高尔基体。
[0018]在宿主细胞或方法的再进一步的实施方式中，所述宿主细胞进一步包括与细胞靶向信号肽融合的甘露糖苷酶II催化结构域，所述细胞靶向信号肽通常不与所述催化结构域相连，并且被选择以将甘露糖苷酶II活性靶向宿主细胞的ER或高尔基体。
[0019]在宿主细胞或方法的再进一步的实施方式中，所述宿主细胞进一步包括与细胞靶向信号肽融合的GlcNAc转移酶II催化结构域，所述细胞靶向信号肽通常不与所述催化结构域相连，并且被选择以将GlcNAc转移酶II活性靶向宿主细胞的ER或高尔基体。
[0020]在宿主细胞或方法的再进一步的实施方式中，所述宿主细胞进一步包括与细胞靶向信号肽融合的半乳糖基转移酶催化结构域，所述细胞靶向信号肽通常不与所述催化结构域相连，并且被选择以将半乳糖基转移酶活性靶向宿主细胞的ER或高尔基体。
[0021]在宿主细胞或方法的再进一步的实施方式中，所述宿主细胞进一步包括与细胞靶向信号肽融合的唾液酸转移酶催化结构域，所述细胞靶向信号肽通常不与所述催化结构域相连，并且被选择以将唾液酸转移酶活性靶向宿主细胞的ER或高尔基体。
[0022]在宿主细胞或方法的再进一步的实施方式中，所述宿主细胞进一步包括与细胞靶向信号肽融合的岩藻糖基转移酶催化结构域，所述细胞靶向信号肽通常不与所述催化结构域相连，并且被选择以将岩藻糖基转移酶活性靶向宿主细胞的ER或高尔基体。
[0023]在宿主细胞或方法的再进一步的实施方式中，所述宿主细胞进一步包括选自由GnTI 11, GnTIV, GnTV, GnTVI和GnTIX构成的组的一种或更多种GlcNAc转移酶。
[0024]在宿主细胞或方法的再进一步的实施方式中，所述宿主细胞被遗传工程化以产生糖蛋白，所述糖蛋白主要具有选自Man5Gl cNAc2、GlcNAcMan5G I cNAc2、GalGlcNAcMan5GlcNAc2, NANAGalGlcNAcMan5GlcNAc2, GlcNAcMan3GlcNAc2, GlcNAc(1_4)Man3GlcNAc2、Gal (1_4)G1cNAc (1_4)Man3GlcNAc2、和 NANA (1_4)Gal (1_4)G1cNAc (1_4)Man3GlcNAc2的聚糖，其中下标表示聚糖结构上特定糖残基的数目。聚糖结构的实例包括但不限于 Man5GlcNAc2^ GlcNAcMan5GlcNAc2、GlcNAcMan3GlcNAc2、GlcNAc2Man3GlcNAc2、GlcNAc3Man3GlcNAc2、GlcNAc4Man3GlcNAc2、GalGlcNAc2Man3GlcNAc2、Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2^ Gal2GlcNAc3Man3GIcNAc2、Gal2GlcNAc4Man3GIcNAc2、Gal3GlcNAc3Man3GlcNAc2^ Gal3GlcNAc4Man3GlcNAc2^ Gal4GlcNAc4Man3GIcNAc2、NANAGa12GIcNAc2Man3GIcNAc2, NANA2GaI2GIcNAc2Man3GIcNAc2、NANA3Gal3GlcNAc3Man3GlcNAc2和 NANA4G al4GlcNAc4Man3GlcNAc2。
[0025]进一步的提供的是组合物，其包含使用上述宿主细胞的任一种通过上述方法获得的一种或更多种重组糖蛋白。
[0026]在进一步的方面中，本发明提供了重组甲基营养型酵母例如巴斯德毕赤氏酵母宿主细胞，其不展现β-甘露糖基转移酶2活性和选自β-甘露糖基转移酶I活性和β-甘露糖基转移酶3活性的至少一种活性，以及其包括两种或更多种核酸分子，各自编码融合蛋白，所述融合蛋白包含融合到信号肽的成熟的人促红细胞生成素，所述信号肽靶向ER，并且当所述融合蛋白处于ER中时被除去。在特定的实施方式中，所述宿主细胞进一步不展现β -甘露糖基转移酶4活性。
[0027]在进一步的方面中，本发明提供了重组甲基营养型酵母例如巴斯德毕赤氏酵母宿主细胞，其具有编码β -甘露糖基转移酶2活性、β -甘露糖基转移酶I活性和β -甘露糖基转移酶3活性的基因的删除或破坏，并且其包括两种或更多种核酸分子，各自编码融合蛋白，所述融合蛋白包含融合到信号肽的成熟的人促红细胞生成素，所述信号肽靶向ER，并且当所述融合蛋白处于ER中时被除去。在特定的实施方式中，所述宿主细胞进一步包括编码β_甘露糖基转移酶4活性的基因的删除或破坏。
[0028]在进一步的方面中，本发明提供了重组巴斯德毕赤氏酵母宿主细胞，其具有β -甘露糖基转移酶2 {ΒΜΤ2)基因和选自β -甘露糖基转移酶I (BMTTl)和β -甘露糖基转移酶3 (ΒΜT3)基因的至少一种基因的删除或破坏，并且其包括两种或更多种核酸分子，各自编码融合蛋白，所述融合蛋白包含融合到信号肽的成熟的人促红细胞生成素，所述信号肽靶向ER，并且当所述融合蛋白处于ER中时被除去。在特定的实施方式中，所述宿主细胞进一步包括编码甘露糖基转移酶4 (BMT4)基因的基因的删除或破坏。
[0029]在再进一步的方面中，本发明提供了在甲基营养型酵母例如巴斯德毕赤氏酵母中生产成熟的人促红细胞生成素的方法，所述酵母主要包含唾液酸封端的双分枝聚糖，并且没有与针对宿主细胞抗原制得的抗体的可检测的交叉结合活性，所述方法包括:提供重组宿主细胞，其不展现对于N-聚糖或O-聚糖的β -甘露糖基转移酶2活性，不展现选自β -甘露糖基转移酶I活性和β -甘露糖基转移酶3活性的对于聚糖或O-聚糖的至少一种活性，被遗传工程化以产生唾液酸封端的双分枝聚糖，并且其包括两种或更多种核酸分子，各自编码融合蛋白，所述融合蛋白包含融合到信号肽的成熟的人促红细胞生成素，所述信号肽靶向ER，并且当所述融合蛋白处于ER中时被除去；在对表达和加工所述第一和第二融合蛋白有效的条件下在培养基中生长所述宿主细胞；以及从所述培养基回收所述成熟的人促红细胞生成素，来产生所述成熟的人促红细胞生成素，其主要包含唾液酸封端的双分枝聚糖并且没有与针对宿主细胞抗原制得的抗体的可检测的交叉结合活性。在进一步的实施方式中，所述宿主细胞不展现对于聚糖或O-聚糖的甘露糖基转移酶2活性、β -甘露糖基转移酶I活性和β -甘露糖基转移酶3活性。在进一步的实施方式中，所述宿主细胞进一步不展现β-甘露糖基转移酶4活性。
[0030] 在再进一步的方面中，本发明提供了在甲基营养型酵母例如巴斯德毕赤氏酵母中生产成熟的人促红细胞生成素的方法，所述酵母主要包含唾液酸封端的双分枝聚糖，并且没有与针对宿主细胞抗原制得的抗体的可检测的交叉结合活性，所述方法包括:提供重组宿主细胞，其被遗传工程化以产生唾液酸封端的双分枝聚糖，其中编码β -甘露糖基转移酶2活性的基因以及编码选自β_甘露糖基转移酶I活性和β_甘露糖基转移酶3活性的活性的至少一种基因被删除或破坏，并且其包括两种或更多种核酸分子，各自编码融合蛋白，所述融合蛋白包含融合到信号肽的成熟的人促红细胞生成素，所述信号肽靶向ER，并且当所述融合蛋白处于ER中时被除去；在对表达和加工所述第一和第二融合蛋白有效的条件下在培养基中生长所述宿主细胞；以及从所述培养基回收所述成熟的人促红细胞生成素，来产生所述成熟的人促红细胞生成素，其主要包含唾液酸封端的双分枝聚糖并且没有与针对宿主细胞抗原制得的抗体的可检测的交叉结合活性。在进一步的实施方式中，所述宿主包含编码β-甘露糖基转移酶2活性、β -甘露糖基转移酶I活性和β-甘露糖基转移酶3活性的基因的删除或破坏。在进一步的实施方式中，所述宿主细胞进一步包括编码β-甘露糖基转移酶3活性的基因的删除或破坏。
[0031]在再进一步的方面中，本发明提供了在巴斯德毕赤氏酵母中生产成熟的人促红细胞生成素的方法，所述巴斯德毕赤氏酵母主要包含唾液酸封端的双分枝聚糖，并且没有与针对宿主细胞抗原制得的抗体的可检测的交叉结合活性，包括:提供重组巴斯德毕赤氏酵母宿主细胞，其被遗传工程化以产生唾液酸封端的双分枝聚糖，其中β -甘露糖基转移酶2 基因和选自β -甘露糖基转移酶I (MTl)和β -甘露糖基转移酶3 (ΒΜΤ3)基因的至少一种基因被删除或破坏，并且其包括两种或更多种核酸分子，各自编码融合蛋白，所述融合蛋白包含融合到信号肽的成熟的人促红细胞生成素，所述信号肽靶向ER，并且当所述融合蛋白处于ER中时被除去；在对表达和加工所述第一和第二融合蛋白有效的条件下在培养基中生长所述宿主细胞；以及从所述培养基回收所述成熟的人促红细胞生成素，来产生所述成熟的人促红细胞生成素，其主要包含唾液酸封端的双分枝聚糖并且没有与针对宿主细胞抗原制得的抗体的可检测的交叉结合活性。在进一步的实施方式中，所述宿主包含甘露糖基转移酶2 (沒#720基因、β-甘露糖基转移酶I (沒#77)基因和β-甘露糖基转移酶3 (沒#7^)基因的删除或破坏。在进一步的实施方式中，所述宿主细胞进一步包括β -甘露糖基转移酶3基因(ΜΜΤ4)的删除或破坏。
[0032]在宿主细胞或方法的特定的实施方式中，融合到促红细胞生成素的末端的信号肽是酿酒酵母(5: cerevisiae) a MATpre信号肽或鸡溶菌酶信号肽。
[0033]在宿主细胞或方法的进一步的实施方式中，至少一种核酸分子编码融合蛋白，其中促红细胞生成素融合到酿酒酵母a MATpre信号肽，以及至少一种核酸分子编码融合蛋白，其中促红细胞生成素融合到酿酒酵母a MATpre信号肽、鸡溶菌酶信号肽。
[0034]在 宿主细胞或方法的进一步的实施方式中，编码促红细胞生成素的核酸分子的核酸序列的密码子为了在巴斯德毕赤氏酵母中表达而被优化。
[0035]在方法的进一步的实施方式中，从所述培养基回收所述成熟的人促红细胞生成素包括阳离子交换层析步骤，所述成熟的人促红细胞生成素主要包含唾液酸封端的双分枝
聚糖并且没有与针对宿主细胞抗原制得的抗体的可检测的交叉结合活性。
[0036]在方法的进一步的实施方式中，从所述培养基回收所述成熟的人促红细胞生成素包括羟磷灰石层析步骤，所述成熟的人促红细胞生成素主要包含唾液酸封端的双分枝
聚糖并且没有与针对宿主细胞抗原制得的抗体的可检测的交叉结合活性。
[0037]在方法的进一步的实施方式中，从所述培养基回收所述成熟的人促红细胞生成素包括阴离子交换层析步骤，所述成熟的人促红细胞生成素主要包含唾液酸封端的双分枝
聚糖并且没有与针对宿主细胞抗原制得的抗体的可检测的交叉结合活性。
[0038]在方法的进一步的实施方式中，从所述培养基回收所述成熟的人促红细胞生成素包括阳离子交换层析步骤，随后是羟磷灰石层析步骤，其任选地跟随着阴离子交换层析步骤，所述成熟的人促红细胞生成素主要包含唾液酸封端的双分枝聚糖并且没有与针对宿主细胞抗原制得的抗体的可检测的交叉结合活性。
[0039]本发明进一步提供了组合物，其包含利用上述宿主细胞从上述方法获得的成熟的人促红细胞生成素以及药学上可接受的盐，所述成熟的人促红细胞生成素主要包含唾液酸封端的双分枝聚糖并且没有与针对宿主细胞抗原制得的抗体的可检测的交叉结合活性。在特定的实施方式中，约50到60%的聚糖包含位于两个分枝上的唾液酸残基；在进一步的实施方式中，大于70%的聚糖包含位于两个分枝上的唾液酸残基；在进一步的实施方式中，大于80%的聚糖包含位于两个分枝上的唾液酸残基。在进一步的方面中，小于30%的N-聚糖是中性的N-聚糖(即，在N-聚糖的非还原末端处的至少一个末端上不是唾液酸化的)。在再进一步的方面中，小于20%的N-聚糖是中性的N-聚糖。在特定的方面中，约99%的N-聚糖含有一个或更多个唾液酸残基，以及小于1%的N-聚糖是中性的聚糖。在进一步的方面中，提供了组合物，其中存在每摩尔rhEPO 4.5摩尔或更多的唾液酸。在进一步的方面中，提供了组合物，其中存在每摩尔rhEPO至少5.0摩尔的唾液酸。[0040]在组合物的进一步的实施方式中，所述成熟的人促红细胞生成素共轭到亲水性聚合物，在特定的方面中所述亲水性聚合物是聚乙二醇聚合物，所述成熟的人促红细胞生成素主要包含唾液酸封端的双分枝聚糖并且没有与针对宿主细胞抗原制得的抗体的可检测的交叉结合活性。在特定的实施方式中，所述聚乙二醇聚合物共轭到所述成熟的人促红细胞生成素的末端，所述成熟的人促红细胞生成素主要包含唾液酸封端的双分枝聚糖并且没有与针对宿主细胞抗原制得的抗体的可检测的交叉结合活性。
[0041]定义
如在此使用的，术语“N-聚糖”和“糖形式”可互换地使用，是指连接的低聚糖，例如，通过天冬酰胺乙酰葡萄糖胺连键与多肽的天冬酰胺残基连接的低聚糖。连接的糖蛋白含有与蛋白质中的天冬酰胺残基的酰胺氮连接的N-乙酰葡萄糖胺残基。糖蛋白中存在的主要糖类是葡萄糖、半乳糖、甘露糖、岩藻糖、乙酰半乳糖胺(GalNAc)、#-乙酰葡萄糖胺(GlcNAc)和唾液酸(例如，N-乙酰-神经氨酸(NANA))。对于N-连接的糖蛋白，糖基团的加工与翻译共同地发生于ER的腔中，并在翻译后在高尔基体中继续。
[0042]N-聚糖具有共同的Man3GlcNAc2的五糖核心(“Man”是指甘露糖；“Glc”是指葡萄糖；“NAc”是指乙酰基；GlcNAc是指乙酰葡萄糖胺)。聚糖根据包含外周糖类(例如，GlcNAc、半乳糖、岩藻糖和唾液酸)的分枝(触角)的数目而不同，所述外周糖类被添加到Man3GlcNAc2 (“Man3”)核心结构，所述核心结构也称作“三甘露糖核心”、“五糖核心”或“少甘露糖核心”。聚糖根据它们的分枝成分来分类(例如，高甘露糖、复合的或杂合的)。“高甘露糖”型N-聚糖具有五个或更多个甘露糖残基。“复合”型聚糖一般具有连接到1，3甘露糖臂的至少一个GlcNAc，和连接于“三甘露糖”核心的1，6甘露糖臂的至少一个GlcNAc。复合聚糖也可以具有半乳糖(“Gal”)或乙酰半乳糖胺(“GalNAc”)残基，其任选地用唾液酸或衍生物修饰(例如，“NANA”或“NeuAc”，其中“Neu”是指神经氨酸，“Ac”是指乙酰基)。复合聚糖还可以具 有链内的取代，其包含“二分的(bisecting^GlcNAc和核心岩藻糖(“Fuc”)。复合聚糖还可以具有“三甘露糖核心”上的多分枝，常称为“多分枝聚糖”。“杂合聚糖具有在三甘露糖核心的1，3甘露糖臂的末端上的至少一个GlcNAc，以及三甘露糖核心的1，6甘露糖臂上的零个或更多个甘露糖。各种聚糖也被称为“糖形式”。
[0043]在此使用的缩写具有本领域通用的用途，参见，例如，上述的糖类缩写。其他常见的缩写包括“PNGase”或“聚糖酶”或“糖苷酶”，其都是指肽糖苷酶F (EC 3.2.2.18)。
[0044]如在此使用的，术语“重组宿主细胞(“表达宿主细胞”、“表达宿主系统”、“表达系统”或简称“宿主细胞”)意图指已经导入重组载体的细胞。要理解的是，这种术语不仅仅意图指特定的主题细胞，还指这种细胞的子代。由于突变或环境影响在继承的代中可能出现某些改变，实际上，这种子代可能不与母细胞相同，但仍然包括在此处使用的术语“宿主细胞”的范围内。重组宿主细胞可以是在培养物中生长的分离的细胞或细胞系，或可以是存在于活组织或生物体中的细胞。优选的宿主细胞是酵母和真菌。
[0045]“不展现”酶活性的宿主细胞是指一种宿主细胞，其中所述酶活性已经被取消或破坏。例如，通过删除或破坏编码酶活性的基因(包括删除或破坏控制基因表达的上游或下游调节序列)可以取消或破坏酶活性；通过突变编码酶活性的基因使得编码酶活性的基因无功能来取消或破坏酶活性；通过使用酶活性化学、肽或蛋白质抑制物来取消或破坏酶活性；通过使用基于核酸的表达抑制物，例如反义DNA和siRNA来取消或破坏酶活性；以及，通过使用转录抑制物或调节因子的表达或活性的抑制物来取消或破坏酶活性，所述调节因子控制或调节编码酶活性的基因的表达。
[0046]当涉及糖蛋白制品中存在的聚糖的“摩尔百分比”时，该术语是指当蛋白质制品用PNG’ ase处理、然后通过不受糖形式组成影响的方法来定量时，所释放的连接的寡聚糖的库中存在的特定聚糖的摩尔百分比(例如，用荧光标签例如2-氨基苯甲酰胺标记PNG’ ase释放的聚糖库，然后通过高效液相层析法或毛细管电泳分离，然后通过荧光强度定量聚糖)。例如，50摩尔百分比的NANA2Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2是指，释放的聚糖的百分之50是NANA2Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2，其余百分之50包含其他N-连接的寡聚糖。在实施方式中，糖蛋白的制品中特定聚糖的摩尔百分比将在20%到100%之间，优选的高于25%、30%、35%、40%或45%，更优选的高于50%、55%、60%、65%或70%，以及最优选的高于75%、80%、85%、90% 或 95%。
[0047]如在此使用的，术语“主要地”或变体如“主要”或“主要的是”将被理解为意思是，在糖蛋白用PNGase处理、通过质谱法例如MALD1-TOF MS分析释放的聚糖之后，在总的聚糖中具有最高摩尔百分比(％)的聚糖种类。换句话说，用语“主要地”被定义为单个实体，例如特定的糖形式，其以比任何其他的单独实体更高的摩尔百分比存在。例如，如果组合物由40摩尔百分比的A种类、35摩尔百分比的B种类和25摩尔百分比的C种类组成，该组合物主要地包含A种 类。
[0048]术语“治疗有效量”是指本发明的重组促红细胞生成素的量，其给予了为患者提供益处的血细胞比容的提高。所述量将在一个个体与另一个之间不同，将取决于许多因素，包括患者的总体身体状态以及贫血的基础病因。例如，对于患有慢性肾衰竭的患者，本发明的促红细胞生成素的治疗有效量可以基于治疗的适应症在20到300单位/kg或0.5 μ g/kg到500 μ g/kg的范围内。术语“单位”是指用于评估促红细胞生成素组合物的活性的领域公知的单位。一毫克纯的促红细胞生成素大约相当于150，000单位。给药日程表可以是每周约三次到每四周或六周约一次。实际的日程表将取决于许多因素，包括向患者施用的促红细胞生成素的类型(ΕΡ0或聚乙二醇化的-ΕΡ0)以及各个患者的响应。更高的剂量范围一般不在贫血应用中使用，但是对于其他治疗应用是有用的。对于患者实现和建立合适的促红细胞生成素剂量的手段是本领域公知的和常规实践的。
[0049]患者与患者之间给予的量和给药日程表的变化，通过与量或日程表一起地提及术语“约”来包括。用于治疗的促红细胞生成素的量给出了可接受的血细胞比容提高速率，并且将血细胞比容维持在有益的水平(例如，通常至少约30%，一般在30%到36%的范围内)。当前组合物的治疗有效量可以由本领域技术人员使用公众可获得的材料和操作来容易地确定。另外，在治疗期间可以给予患者铁来维持提高的红细胞生成。给予的量可以通过本领域技术人员通常使用的方法来容易地确定。
[0050]【专利附图】
【附图说明】
附图1A-J显示了从野生型菌株NRRL-Yl 1430 (附图1A)开始的、巴斯德毕赤氏酵母菌株YGLY3159 (附图1E)和菌株YGLY7113到YGLY7122 (附图1I)的家系。
[0051]附图2显示了质粒pGLY6的图谱。质粒pGLY6是靶向做^座位的整合载体，含有包含酿酒酵母转化酶基因或转录单元iScSUC2、的核酸分子，其一侧是包含来自巴斯德毕赤氏酵母基因的5’区域(PpURA5-5’ )的核苷酸序列的核酸分子，另一侧是包含来自巴斯德毕赤氏酵母做基因的3’区域(PpURA5-3’ )的核苷酸序列的核酸分子。
[0052]附图3显示了质粒pGLY40的图谱。质粒pGLY40是靶向OCHl座位的整合载体，含有包含巴斯德毕赤氏酵母URA5基因或转录单元(PpURA5)的核酸分子，其侧翼是包含IacZ重复的核酸分子(hcZ重复)，随后在一侧是包含来自OCHl基因的5’区域(PpOCHl-5’ )的核苷酸序列的核酸分子，在另一侧是来自OCHl基因的3’区域(PpOCHl-3’ )的核苷酸序列的核酸分子。
[0053]附图4显示了质粒pGLY43a的图谱。质粒pGLY43a是靶向沒座位的整合载体，含有句念乳酸克鲁维酵母UDPtV-乙酰葡萄糖胺(UDP-GlcNAc)转运蛋白基因或转录单元(KlGlcNAc Transp.)的核酸分子，其邻近于侧翼是包含重复的核酸分子重复)的、包含巴斯德毕赤氏酵母做^基因或转录单元(PPURA5)的核酸分子，所述邻近的基因一侧是包含来自现化?基因的5’区域(PpPBS2-5’ )的核苷酸序列的核酸分子，另一侧是包含来自基因的3’区域(PpPBS2-3’ )的核苷酸序列的核酸分子。
[0054]附图5显示了质粒pGLY48的图谱。质粒pGLY48是靶向座位的整合载体，含有表达盒，所述表达盒包含编码UDP-GlcNAc转运蛋白的小鼠同源物(MmGlcNAc Transp.)开放阅读框(ORF)的核酸分子，其在5’末端可操作地连接到包含酿酒酵母GAPDH启动子(PpGAPDHProm)的核酸分子，和在3’末端可操作地连接到包含酿酒酵母CTC1终止序列(ScCYC TT)的核酸分子，邻近于侧翼是重复重复)的、包含巴斯德毕赤氏酵母做^基因或转录单元(PpURA5)的核酸分子，其中所述表达盒整体上在一侧是包含来自巴斯德毕赤氏酵母麗#也7基因的5’区域(PpMNN4Ll-5 ’ )的核苷酸序列的核酸分子，并且在另一侧包含来自MNN4L1基因的3’区域(PpMNN4Ll-3’ )的核苷酸序列的核酸分子。
[0055]附图6显示了质粒pGLY45的图谱。质粒pGLY45是靶向ΡΜ)1/ΜΝ4座位的整合载体，含有包含巴斯 德毕赤氏酵母做^基因或转录单元(PPURA5)的核酸分子，其侧翼是包含hcZ重复的核酸分子QacZ重复)，随后在一侧是包含来自PNOl基因的5’区域(PpPN01-5’)的核苷酸序列的核酸分子，在另一侧是来自基因的3’区域(PpMNN4-3’ )的核苷酸序列的核酸分子。
[0056]附图7显示了质粒pGLY247的图谱。质粒pGLY247是靶向MET16座位的整合载体，含有包含巴斯德毕赤氏酵母做^基因或转录单元(PPURA5)的核酸分子，其侧翼是包含h cZ重复的核酸分子(h cZ重复)，随后在一侧是包含来自6基因的5’区域(PpMET16-5’)的核苷酸序列的核酸分子，在另一侧是来自基因的3’区域(PpMET16_3’ )的核苷酸序列的核酸分子。
[0057]附图8显示了质粒pGLY248的图谱。质粒pGLY248是靶向做^座位的整合载体，含有包含巴斯德毕赤氏酵母基因或转录单元(PpMET16)的核酸分子，其一侧是包含来自基因的5’区域(PpURA5-5’ )的核苷酸序列的核酸分子，另一侧是包含来自URA5基因的3’区域(PpURA5-3’ )的核苷酸序列的核酸分子。
[0058]附图9显示了质粒pGLY582的图谱。质粒pGLY582是靶向扭分座位的整合载体，含有串联的四个表达盒，它们编码(I)酿酒酵母m)P-葡萄糖差向异构酶(2)在N-末端与酿酒酵前导区肽(33)融合的人半乳糖基转移酶I (Afe/1)催化结构域，
(3)侧翼是IacZ重复ilacZ重复)的巴斯德毕赤氏酵母URA5基因或转录单元(PpURA5)，和
(4)黑腹果蝇(ftffidaflogasier) UDP-半乳糖转运蛋白(Zfe?i/KT)。所有的表达盒侧面都是HISl基因的5’区域(PpHISl-5’ )和扭分基因的3’区域(PpHISl_3’)。PMAl是巴斯德毕赤氏酵母.7启动子；PpPMAl TT是巴斯德毕赤氏酵母.2终止序列;G4HW是巴斯德毕赤氏酵母GADPH織子,ScCYC TT是酿酒酵母CTC终止序列；PpOCHl Prom是巴斯德毕赤氏酵母OCHl启动子，PpALG12 TT是巴斯德毕赤氏酵母ALG12终止序列。
[0059]附图10显示了质粒pGLY167b的图谱。质粒pGLY167b是靶向他价座位的整合载体，含有串联的三个表达盒，它们编码(I)在末端与酿酒酵母麗呢?前导区肽融合的黑腹果蝇甘露糖苷酶II催化结构域(密码子优化的)(C0-KD53)，(2)巴斯德毕赤氏酵母扭基因或转录单元，以及(3)在末端与酿酒酵母麗呢?前导区肽融合的大鼠乙酰葡萄糖胺(GlcNAc)转移酶II催化结构域(密码子优化的)(C0-TC54)。所有的表达盒侧面都是基因的5’区域(PpARGl-5’ )和他价基因的3’区域(PpARGl-3’)。PpPMAl Prom是巴斯德毕赤氏酵母启动子；PpPMAl TT是巴斯德毕赤氏酵母/*47终止序列；PpGAPDH是巴斯德毕赤氏酵母GADPH關子,ScCYC TT是酿酒酵母CTC1终止序列；PpOCHl Prom是巴斯德毕赤氏酵母况?启动子；PpALG12 TT是巴斯德毕赤氏酵母ALG12终止序列。
[0060]附图11显示了质粒pGLY1430的图谱。质粒pGLY1430是靶向ADEl座位、不破坏该座位表达的KINKO整合载体，含有串联的四个表达盒，它们编码(I)在末端与巴斯德毕赤氏酵母前导区肽融合的人GlcNAc转移酶I催化结构域(密码子优化的)(C^-NAlO),
(2)UDP-GlcNAc转运蛋白的小鼠同源物(MmTr)，(3)在末端与酿酒酵母前导区肽融合的小鼠甘露糖苷酶IA催化结构域(FB) (FB8),以及(4)侧翼是重复(7acZ)的巴斯德毕赤氏酵母做^基因或转录单元(PPURA5)。所有的表达盒侧面都是ADEl基因的5’区域和ORF (ADEI 5’和0RF)和ADEl基因的3’区域(PpADEl-3，)。PpPMAl prom是巴斯德毕赤氏酵母启动子；PpPMAl TT是巴斯德毕赤氏酵母终止序列；SEC4是巴斯德毕赤氏酵母SEC4启动子；0CH1 TT是巴斯德毕赤氏酵母OCHl终止序列；ScCYC TT是酿酒酵母CTC终止序列；PpOCHl Prom是巴斯德毕赤氏酵母况启动子；PpALG3 TT是巴斯德毕赤氏酵母JZ似终止序列；以及PpGAPDH是巴斯德毕赤氏酵母GADPHB.。
[0061]附图12显示了质粒pGFI165的图谱。质粒pGFI165是靶向PROl座位、不破坏该座位的表达的KINKO整合载体，含有表达盒，它们编码(I)在末端与酿酒酵母a MATpre信号肽融合的李氏木霉α -1, 2-甘露糖苷酶催化结构域(aMATTrMan)，以将嵌合蛋白靶向分泌途径并从细胞分泌；以及(2)侧翼是重复重复)的巴斯德毕赤氏酵母_5基因或转录单元。所有的表达盒侧面都是PROl基因的5’区域和ORF (5’ PROlorf)以及PROl基因的3’区域(3’ PRO)。ScCYC TT是酿酒酵母CTC1终止序列；PpALG3 TT是巴斯德毕赤氏酵母ALG3终止序列；以及PpGAPDH是巴斯德毕赤氏酵母GADPH启动子。
[0062]附图13显示了质粒pGLY2088的图谱。质粒pGLY2088是靶向TRP2或JAT7座位的整合载体，含有编码以下的表达盒(I)在末端与酿酒酵母a MATpre信号肽(alphaMF-pre)融合以将嵌合蛋白靶向分泌途径并从细胞分泌的、密码子优化的成熟人促红细胞生成素(co-hEPO),和(2) zeocin抗性蛋白(ZeocinR)。表达盒在一端侧面是巴斯德毕赤氏酵母启动子(PpAOXl Prom)，在另一端是巴斯德毕赤氏酵母7--?基因或转录单元(PpTRP2)。ScCYC TT是酿酒酵母CTC终止序列，ScTEF Prom是酿酒酵母TEFl启动子。
[0063]附图14显示了质粒pGLY2456的图谱。质粒pGLY2456是靶向TRP2座位而不破坏座位表达的KINKO整合载体，含有编码以下的六个表达盒(I)密码子优化的小鼠CMP唾液酸转运蛋白(CO mCMP-Sia Transp), (2)密码子优化的人UDP-GlcNAc 2-差向异构酶IN-乙酰甘露糖胺激酶(CO hGNE)，(3)巴斯德毕赤氏酵母WPa基因或转录单元，(4)密码子优化的人CMP-唾液酸合酶(CO hCMP-NANA S)，(5)密码子优化的人乙酰神经氨酸_9_磷酸合酶(CO hSIAP S)，和(6)在末端与酿酒酵母似￡^前导肽融合的密码子优化的小鼠a-2，6-唾液酸转移酶催化结构域(comST6-33)。所有的表达盒侧面都是7--?基因的5’区域和ORF(PpTRP2 5’)和T1U基因的3’区域(PpTRP2-3’)。PpPMAl prom是巴斯德毕赤氏酵母/*47启动子；PpPMAl TT是巴斯德毕赤氏酵母.2终止序列；CYC TT是酿酒酵母CTC终止序列；PpTEF Prom是巴斯德毕赤氏酵母TEFl启动子；PpTEF TT是巴斯德毕赤氏酵母TEFl终止序列；PpALG3 TT是巴斯德毕赤氏酵母也似终止序列；以及pGAP是巴斯德毕赤氏酵母GAPDH启动子。
[0064]附图15 显示了质粒 pGLY3411 (pSH1092)的图谱。质粒 pGLY3411 (pSH1092)是含有表达盒的整合载体，所述表达盒包含侧翼是IacZ重复UacZ重复)的巴斯德毕赤氏酵母观^基因或转录单元(PpURA5)，其一侧是巴斯德毕赤氏酵母沒#7￥基因的5’核苷酸序列(PpPBS4 5’)，另一侧是巴斯德毕赤氏酵母沒#7￥基因的3’核苷酸序列(PpPBS4 3’)。
[0065]附图16 显示了质粒 pGLY3430 (pSH1115)的图谱。质粒 pGLY3430 (pSH1115)是包含表达盒的整合载体，所述表达盒包含核酸分子，其编码与棉阿舒囊霉(Ashbya gossypii)TEFl启动子(PTEF)和棉阿舒囊霉TEFl终止序列(TTEF)可操作连接的诺尔丝菌素抗性ORF(NAT)，在一侧是巴斯德毕赤氏酵母沒#77基因的5’核苷酸序列(PBS1 5’)，在另一侧是巴斯德毕赤氏酵母基因的3’核苷酸序列(PBS1 3’)。
[0066]附图1 7 显示了质粒 pGLY4472 (pSH1186)的图谱。质粒 pGLY4472 (pSH1186)含有表达盒，所述表达盒包含核酸分子，其编码与棉阿舒囊霉TEFl启动子(pTEF)和棉阿舒囊霉TEFl终止序列(TRFtt)可操作连接的疋coli潮霉素B磷酸转移酶基因ORF (Hyg)，在一侧是巴斯德毕赤氏酵母基因的5’核苷酸序列(PpPBS3 5’)，另一侧是巴斯德毕赤氏酵母BMT3基因的3’核苷酸序列(PpPBS3 3’)。
[0067]附图18显示了质粒pGLY2057的图谱。质粒pGLY2057是靶向^座位的整合质粒，含有编码侧翼是重复重复)的巴斯德毕赤氏酵母基因或转录单元(PpURA5)的表达盒。所述表达盒一侧是包含来自基因的5’区域的核苷酸序列的核酸分子(PPADE2-5’)，另一侧是包含来自泛基因的3’区域的核苷酸序列的核酸分子(PpADE2-3，)。
[0068]附图19显示了质粒pGLY2680的图谱。质粒pGLY2680是可以靶向TRP2iA0Xl座位的整合载体，含有编码以下的表达盒(I)在末端与鸡溶菌酶信号肽(鸡溶菌酶ss)融合的、密码子优化的人成熟促红细胞生成素(co-hEPO)，和(2)没有启动子的巴斯德毕赤氏酵母^基因(PpADE2)。表达盒在一端侧面是巴斯德毕赤氏酵母启动子(PpAOXlProm)，在另一端是巴斯德毕赤氏酵母7--?基因或转录单元(PpTRP2)。ScCYC TT是酿酒酵母CTC终止序列。
[0069]附图20显示了质粒pGLY2713的图谱。质粒pGLY2713是含有邻近于表达盒的巴斯德毕赤氏酵母ORF (PpPNOl 0RF)的整合载体，所述表达盒包含侧翼是重复重复)的巴斯德毕赤氏酵母做^基因或转录单元(PPURA5)，其一侧是巴斯德毕赤氏酵母/--基因的5’核苷酸序列(PpPEP4 5’)，另一侧是巴斯德毕赤氏酵母/--基因的3’核苷酸序列(PpPEP4 3’)。
[0070]附图21显示了说明发酵过程流程的示意图。
[0071]附图22是HCA抗体Western印迹，是大约在rhEPO的大小处的蛋白质的检测，显示了在菌株YGLY3159中产生的rhEPO具有与抗HCA抗体的交叉结合活性。左侧画面显示了 Commassie Blue染色的4-20% SDS-PAGE凝胶，显示了 rhEPO的位置，右侧画面显示了用1:3, 000稀释度的兔抗-HCA抗体(SL rProA纯化的兔:9161)探测的类似凝胶的Western印迹。结合抗-HCA抗体使用PBS中1: 5，000稀释度的、与辣根过氧化酶(HRP )缀合的山羊抗兔抗体来检测。结合的二级抗体的检测使用底物3’ 3 二氨基联苯胺(DAB)。
[0072]附图23是抗-HCA抗体Western印迹,显示了当rhEPO使用PNAGase F脱糖基化时，在菌株YGLY3159中生产的rhEPO对抗-HCA抗体的交叉结合活性不被检测出。左侧画面显示了 Commassie Blue染色的4-20% SDS-PAGE凝胶,显示了糖基化的和脱糖基化形式的rhEPO的位置，右侧画面显示了如附图22中用抗-HCA抗体探测的类似凝胶的Western印迹。
[0073]附图24显示了野生型巴斯德毕赤氏酵母中以及糖工程化的巴斯德毕赤氏酵母GS2.0菌株中生产的重组抗体(rhlgG)显示了与抗-HCA抗体的交叉结合活性，在所述巴斯德毕赤氏酵母GS2.0菌株中沒基因被破坏或删除。左侧画面显示了 Commassie Blue染色的4-20% SDS-PAGE凝胶，右侧画面显示了如附图22中用抗-HCA抗体探测的类似凝胶的Western印迹。GS 2.0是产生主要具有Man5GlcNAc2N-聚糖的糖蛋白的巴斯德毕赤氏酵母菌株。显示的GS 2.0菌株产生具有约5% Man9GlcNAc2N-聚糖的rhlgG。WT是野生型巴斯德毕赤氏酵母。
【权利要求】
1.一种在巴斯德毕赤氏酵母中生产成熟的人促红细胞生成素的方法，所述成熟的人促红细胞生成素主要包含唾液酸封端的双分枝聚糖，并且没有与针对宿主细胞抗原制得的抗体的可检测的交叉结合活性，所述方法包括: Ca)提供重组巴斯德毕赤氏酵母宿主细胞，其被遗传工程化以生产唾液酸封端的双分枝聚糖，并且不展现对于聚糖或O-聚糖的β -甘露糖基转移酶2活性，并且不展现选自对于聚糖或O-聚糖的β -甘露糖基转移酶I活性和β -甘露糖基转移酶3活性的至少一种活性，并且其包括两种或更多种核酸分子，各自编码包含融合到信号肽的成熟的人促红细胞生成素的融合蛋白，所述信号肽靶向ER并且当所述融合蛋白处于ER中时被除去; (b)在对表达和加工所述第一和第二融合蛋白有效的条件下在培养基中生长所述宿主细胞；以及 (c)从所述培养基回收所述成熟的人促红细胞生成素，来产生所述成熟的人促红细胞生成素，其主要包含唾液酸封端的双分枝聚糖并且没有与针对宿主细胞抗原制得的抗体的可检测的交叉结合活性。
2.权利要求1的方法，其中所述宿主细胞不展现对于聚糖或聚糖的甘露糖基转移酶2活性、 β-甘露糖基转移酶I活性和β-甘露糖基转移酶3活性。
3.权利要求2的方法，其中所述宿主细胞进一步不展现对于聚糖或聚糖的β-甘露糖基转移酶4活性。
4.权利要求1的方法，其中所述信号肽是酿酒酵母aMATpre信号肽或鸡溶菌酶信号肽。
5.权利要求1的方法，其中至少一种核酸分子编码下述融合蛋白，其中促红细胞生成素融合到酿酒酵母a MATpre信号肽，并且至少一种核酸分子编码下述融合蛋白，其中促红细胞生成素融合到酿酒酵母a MATpre信号肽鸡溶菌酶信号肽。
6.权利要求1的方法，其中编码促红细胞生成素的核酸分子的核酸序列的密码子为了在巴斯德毕赤氏酵母中表达而被优化。
7.权利要求1的方法，其中与针对宿主细胞抗原制得的抗体的可检测的交叉结合活性在夹心ELISA中测定。
8.权利要求1的方法，其中与针对宿主细胞抗原制得的抗体的可检测的交叉结合活性在Western印迹中测定。
9.权利要求1的方法，其中从所述培养基回收所述成熟的人促红细胞生成素包括阳离子交换层析步骤，所述成熟的人促红细胞生成素主要包含唾液酸封端的双分枝聚糖并且没有与针对宿主细胞抗原制得的抗体的可检测的交叉结合活性。
10.权利要求1的方法，其中从所述培养基回收所述成熟的人促红细胞生成素包括羟磷灰石层析步骤，所述成熟的人促红细胞生成素主要包含唾液酸封端的双分枝聚糖并且没有与针对宿主细胞抗原制得的抗体的可检测的交叉结合活性。
11.权利要求1的方法，其中从所述培养基回收所述成熟的人促红细胞生成素包括阴离子交换层析步骤，所述成熟的人促红细胞生成素主要包含唾液酸封端的双分枝聚糖并且没有与针对宿主细胞抗原制得的抗体的可检测的交叉结合活性。
12.—种包含获自权利要求8的方法的成熟的人促红细胞生成素和药学上可接受的盐的组合物，所述成熟的人促红细胞生成素主要包含唾液酸封端的双分枝聚糖并且没有与针对宿主细胞抗原制得的抗体的可检测的交叉结合活性。
13.权利要求12的组合物，其中所述成熟的人促红细胞生成素共轭到亲水性聚合物，所述成熟的人促红细胞生成素主要包含唾液酸封端的双分枝聚糖并且没有与针对宿主细胞抗原制得的抗体的可检测的交叉结合活性。
14.权利 要求13的组合物，其中所述亲水性聚合物是聚乙二醇聚合物。
【文档编号】C07K1/18GK104031961SQ201410094457
【公开日】2014年9月10日 申请日期:2010年10月11日 优先权日:2009年10月16日
【发明者】P.多布罗维奇, S.戈马蒂纳亚加姆, S.哈密尔顿, H.李, N.塞图拉曼, T.A.斯塔黑姆, S.维尔德特 申请人:默沙东公司