一种抗金黄色葡萄球菌eLtaS蛋白的单克隆中和性抗体E4-2的制备及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了属于免疫用抗体制备【技术领域】的一种抗金黄色葡萄球菌eLtaS蛋白的单克隆中和性抗体E4-2。本发明从制备的eLtaS中和性单克隆抗体E4-2杂交瘤细胞中克隆了抗体轻、重链可变区基因，所得轻链和重链可变区基因可编码正确的小鼠抗体可变区。基于上述单克隆抗体的轻、重链可变区基因，可构建和表达多种小分子基因工程抗体，基于上述基因所编码的多肽或蛋白质，可以交联多种生物活性分子，用于制备抗金黄色葡萄球菌感染的药物，具有广阔的应用前景。
【专利说明】一种抗金黄色葡萄球菌eLtaS蛋白的单克隆中和性抗体E4-2的制备及其应用
【技术领域】
[0001]本发明属于免疫用抗体制备【技术领域】，具体涉及一种抗金黄色葡萄球菌eLtaS蛋白的单克隆中和性抗体E4-2及其制备方法以及其在制备抗金黄色葡萄球菌感染的药物中的应用。
【背景技术】
[0002]金黄色葡萄球菌(金黄色葡萄球菌，Staphylococcus aureus)属葡萄球菌属，是人类的一种重要病原菌，能够引起肺炎、心内膜炎、烧伤及战伤感染、败血症、中毒性休克等多种严重感染(Lowy FD.New Engl J Med.1998 ;339，520-532)，它是革兰氏阳性菌脓毒血症的主要致病菌，也是烧伤创面感染、急性肝衰竭的重要病原菌(姚咏明等，脓毒症研究的若干新动态2000 ;13，517-519)。其能够在人群密集的区域通过飞沫、接触进行大规模传播。更为严重的是，金黄色葡萄球菌耐药性不断增强，如1961年发现的对β -内酰胺类抗生素耐药的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)，2002年10月又发现了耐万古霉素的金黄色葡萄球菌(VRSA)。2007年10月，Klevens R M等调查表明美国2005年感染MRSA的人数超过9万人，感染MRSA的病人死亡率为19.8%，死亡人数超过HIV感染的死亡人数(KlevensRM，et al.JAMA.2007 ；298:1763—1771)。更为严重的是，临床已经没有有效的抗生素应对多重耐药的MRSA，抗金黄色葡萄球菌感染亟需新的更有效的治疗策略。 [0003]LtaS(LTA合成酶)是金黄色葡萄球菌的细胞膜蛋白之一，全长646aa，N端位于胞内，C端位于胞外，有5个跨膜区，其功能区位于胞外，与金黄色葡萄球菌细胞壁主要成分LTA的合成密切相关。I型多肽酶SpsB可以水解全长LtaS并将其胞外区eLtaS (218-646aa)释放于细菌生长上清中。 申请人:在实验过程中证实在小鼠急性腹膜炎模型和肺炎模型中eLtaS可以显著加重金黄色葡萄球菌对小鼠的感染，从而证实其为金黄色葡萄球菌重要毒力因子之一；进一步还证实针对eLtaS蛋白的中和性单克隆抗体可以在小鼠腹膜炎模型和肺炎模型中显著减缓金黄色葡萄球菌对小鼠的感染，且证实其抗感染功能的发挥依赖于其对金黄色葡萄球菌LTA合成的抑制。目前关于利用抗细菌毒力蛋白的特异性抗体进行抗细菌感染治疗的研究还未见相关报道。
【发明内容】
[0004]本发明的目的在于提供一种抗金黄色葡萄球菌eLtaS蛋白的单克隆中和性抗体E4-2。
[0005]本发明的目的还在于提供上述单克隆中和性抗体E4-2的制备方法以及其在制备抗金黄色葡萄球菌感染的药物中的应用。
[0006]本发明的抗eLtaS的单克隆抗体E4_2的轻、重链蛋白质分子，其可变区氨基酸序列分别如序列表中SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4所示，其编码基因分别如序列表中SEQ IDN0:1, SEQ ID N0:2所示。该单克隆抗体的轻链蛋白质分子可变区的互补决定区⑶R1、CDR2、CDR3的氨基酸序列，分别如序列表中SEQ ID NO:5,SEQ ID NO:6,SEQ ID NO:7所示。该单克隆抗体的重链蛋白质分子可变区的互补决定区CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别如序列表中 SEQ ID NO:8，SEQ ID NO:9，SEQ ID NO:10 所示。
[0007]上述单克隆抗体E4-2的制备方法，主要内容如下:
[0008]1.抗eLtaS单克隆抗体杂交瘤细胞株的构建。
[0009]首先利用eLtaS蛋白免疫Balb/c小鼠，常规方法进行细胞融合。用ELISA法筛选，阳性细胞克隆再反复亚克隆，直到所有杂交瘤细胞培养上清检测为100%阳性。
[0010]2.抗eLtaS单克隆抗体杂交瘤细胞株E4-2的筛选。
[0011]通过检测抗eLtaS单克隆抗体对金黄色葡萄球菌LTA合成能力的影响筛选eLtaS中和性抗体。利用脑心浸液培养基常规条件培养金黄色葡萄球菌，分别在培养体系中加入抗eLtaS单克隆抗体及对照IgG至100 μ g/ml，继续培养6小时后收集细菌，利用玻璃珠研磨获得细菌细胞壁LTA，SDS-PAGE分离所获LTA并转移至PVDF膜，使用LTA特异性抗体检测不同处理条件下细菌LTA水平。结果表明抗eLtaS单克隆抗体E4-2可以有效抑制金黄色葡萄球菌LTA合成。
[0012]3.抗eLtaS单克隆抗体杂交瘤细胞株E4_2的鉴定。
[0013]用双相琼脂扩散实验证明E4-2杂交瘤细胞所分泌的免疫球蛋白亚型为IgG2a。
[0014]4.抗eLtaS单克隆抗体杂交瘤细胞株E4_2的亲和力和特异性检测
[0015]亲和柱纯化Balb/c小鼠杂交瘤细胞腹水，紫外分光光度计测量，计算蛋白质含量。利用ELISA方法检测E4-2与eLtaS亲和力，结果显示EC50 = 31ng/ml。利用western-blot对E4-2特异性进行评价,结果显示E4-2可特异性识别eLtaS线性表位。
[0016]5.抗eLtaS单克隆抗体E4-2对感染金黄色葡萄球菌的BALB/C小鼠保护作用的检测。
[0017]利用腹腔注射金黄色葡萄球菌制备小鼠急性腹膜炎模型并注射单克隆抗体E4-2，记录小鼠存活情况，结果显示单克隆抗体E4-2可以显著降低金黄色葡萄球菌对小鼠的致死率。利用金黄色葡萄球菌灌注小鼠气管制备肺炎模型并注射单克隆抗体E4-2，72小时后制备肺部病理切片并进行HE染色，结果表明E4-2可以显著降低金黄色葡萄球菌对小鼠肺部的感染。
[0018]6.抗eLtaS单克隆抗体杂交瘤细胞E4-2轻、重链基因的钓取
[0019]取对数生长期的中和性单克隆抗体E4-2细胞，提取RNA，经RT-PCR，用两对特异性引物血1^(:4和血(^，MuHCl和MuIgG2a钓取抗体的轻重链基因。常规法连接入载体，转化感受态细菌，培养后挑取单个菌落，提取质粒PCR鉴定后进行DNA测序分析。通过本部分实验，构建了抗eLtaS单克隆抗体E4-2轻、重链基因的载体，经序列分析、比对，编码序列为小鼠免疫球蛋白轻、重链基因(序列表中SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2)。
[0020]7.单克隆抗体E4-2轻、重链可变区基因序列和氨基酸序列的确定
[0021]用www.expasy.0rg在线软件将编码eLtaS单克隆抗体E4-2轻、重链可变区核苷酸序列翻译为其编码的氨基酸序列，单克隆抗体E4-2轻、重链可变区氨基酸序列如序列表中 SEQ ID NO:3 和 SEQ ID N0:4 所不。根据 Kabat 数据库(ElvinA.Kabat.《Sequencesof Proteins of Immunological Interest》.1991)确定轻链可变区序列中的互补决定区CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别如序列表中SEQ ID NO:5，SEQ ID NO:6和SEQ IDNO:7所示。重链可变区序列中的互补决定区⑶R1XDR2和⑶R3的氨基酸序列分别如序列表中 SEQ ID NO:8，SEQ ID NO:9 和 SEQ ID NO:10 所示。
[0022] 上述抗金黄色葡萄球菌eLtaS蛋白的单克隆中和性抗体E4_2在制备抗金黄色葡萄球菌感染的药物中的应用。
[0023]本发明的有益效果:本发明应用一套设计的引物成功地从培养的抗eLtaS单克隆抗体E4-2杂交瘤细胞中克隆了抗体轻、重链可变区基因。所得轻链和重链可变区基因可编码正确的小鼠抗体可变区。本发明的单克隆抗体基于上述已克隆到的抗eLtaS单克隆抗体E4-2轻、重链可变区基因，可构建和表达多种小分子基因工程抗体，如单链抗体、单域抗体、嵌合抗体、Fab抗体、抗体融合蛋白等，用于抗金黄色葡萄球菌感染的治疗药物，具有非常广阔的应用前景。
【专利附图】
【附图说明】
[0024]图1为eLtaS基因钓取产物琼脂糖电泳分析图；其中泳道I为DNA分子量标准，泳道2为eltaS基因PCR钓取产物。
[0025]图2为免疫用eLtaS的SDS-PAGE结果图谱；其中泳道I为蛋白质分子量标准，泳道2为纯化的eLtaS蛋白。
[0026]图3为单克隆抗体经Protein G纯化后的SDS-PAGE结果图谱；其中泳道I为蛋白质分子量标准，泳道2为经Protein G纯化的中和性单克隆抗体，A为重链，B为轻链。
[0027]图4Western-blot检测E4_2对金黄色葡萄球菌LTA合成影响的检测图；其中泳道1，2，3为细菌培养过程中分别加入PBS、E4-2和对照IgG。
[0028]图5ELISA鉴定单克隆抗体E4-2亲和力线形图。
[0029]图6单克隆抗体E4-2结合特性的Western-blot鉴定图谱；其中泳道I为单克隆抗体E4-2检测结果，泳道2为对照小鼠IgG检测结果，结果显示中和性单克隆抗体E4-2可识别eLtaS线性表位。
[0030]图7急性腹膜炎模型检测E4-2抗金黄色葡萄球菌感染效果图；结果显示中和性单克隆抗体E4-2可以有效抵抗金黄色葡萄球菌对小鼠的感染。
[0031]图8肺炎模型检测E4-2抗金黄色葡萄球菌感染效果图；结果显示中和性单克隆抗体E4-2可以有效抵抗金黄色葡萄球菌对小鼠的感染。
[0032]图9抗eLtaS单克隆抗体E4_2杂交瘤细胞RNA提取结果电泳图。
[0033]图10为eLtaS中和性单克隆抗体E4_2杂交瘤细胞轻重链基因的PCR结果图谱，其中泳道I为DL2000 ;泳道2为轻链基因；为泳道3为重链基因。基因大小分别约为690bp和 780bp。
【具体实施方式】
[0034]下面通过附图和具体实施例对本发明做进一步说明，通过参阅下述实施例可以更容易地了解本发明的内容，这些实施例只是为进一步说明，并不限定本发明的保护范围。
[0035]实施例1抗eLtaS单克隆抗体杂交瘤细胞株的构建
[0036]材料:福氏完全佐剂及不完全佐剂，TMB为Sigma公司产品，20%胎牛血清为北京元亨圣马生物技术研究所产品，无血清RPMI1640为Gibco公司产品，SP2/0细胞从ATCC引进，本实验室保存，Balb/c小鼠、昆明小鼠购自军事医学科学院实验动物中心。其余试剂均为市购。
[0037]方法结果:
[0038]1，eLtaS蛋白表达及纯化。利用eLtaS编码区特异性引物钓取金黄色葡萄球菌8325-4基因组中eLtaS基因(其调取电泳检测如图1所示)，并克隆入pET_28a载体诱导、表达、纯化获得eLtaS蛋白(其SDS-PAGE结果如图2)所示。
[0039]2，Balb/c小鼠免疫。选用4-6周龄的雌性Balb/c小鼠6只，用100 μ g eLtaS蛋白腹股沟皮下免疫，第一针加福氏完全佐剂，第2针加福氏不完全佐剂，每3周免疫I次，共免疫3次。第3次免疫后尾静脉采血，ELISA检测抗体产生情况，融合前3天，以100 μ geLtaS蛋白腹腔加强免疫一次，第3天融合。[0040]3，细胞融合。将免疫的小鼠摘眼球后脱颈处死，无菌摘取小鼠脾细胞，按常规方法进行细胞融合。具体方法:①将免疫的小鼠摘眼球放血后脱颈处死，75%酒精浸泡3min，无菌取出脾脏，用200目钢网研磨单个细胞悬液，无血清RPMI1640洗两次并记数；②收集对数生长期的SP2/0细胞，用无血清RPMI1640洗两次并记数；③按SP2/0细胞:脾细胞=I: 5的比例混合两种细胞，用RPMI1640洗I次，弃尽上清，轻轻将细胞打散；④在Imin时间里缓慢加入 lml50% PEG(MW1500)溶液，置 37°C水浴 Imin ;⑤在 lmin、2min、2min、5min 时间内加无血清RPMI1640lml、5ml、10ml、IOml ;?800r/min离心7min,弃上清,尽可能轻轻将细胞悬起；⑦加含20% FCS的HAT (Sigma)-RPMI1640培养液，调整细胞浓度为2 X 106/ml，混匀后，滴加在铺有滋养细胞(1X104细胞/孔)96孔培养板(Gibco)中，100 μ I/孔，37。。5%CO2孵箱中培养。
[0041]4, ELISA筛选抗eLtaS单克隆抗体杂交瘤细胞。用10 μ g/ml eLtaS包被ELISA板，于4°C过夜并封闭。依次加入待测细胞培养上清液(37°C lh，PBST洗板4次)，及1: 40000稀释的50 μ I HRP-GAM(37°C 45min，PBST洗板4次)。以TMB底物显色后，于450nm波长测定吸光值。
[0042]5，杂交瘤细胞克隆化。筛选获得中和性抗体细胞克隆再反复亚克隆，直到所有杂交瘤细胞培养上清检测为100%阳性。杂交瘤细胞的克隆化用有限稀释法:(I)在克隆化的当天或前I天制备滋养细胞:脱颈处理昆明小鼠，75%酒精浸泡消毒皮肤，无菌剥离腹部皮肤，注射器抽取5mll640培养液注入小鼠腹腔，反复冲洗后吸出腹腔洗液，用20%胎牛血清1640培养液稀释后滴入96孔板，每孔约0.1ml0 (2)取少许待作克隆化的杂交瘤细胞移至另一无菌试管中，并准确计数。(3)有限稀释法进行亚克隆。(4)将培养板置于5% CO2,37°C孵箱中培养，5天左右在显微镜下可观察到细胞克隆。适时换液，检测，取阳性单克隆细胞株进行扩大培养，及时冻存细胞株。
[0043]通过本部分工作，构建了 8株抗eLtaS单克隆抗体杂交瘤细胞株。
[0044]实施例2抗eLtaS中和性单克隆抗体杂交瘤细胞株的筛选和鉴定
[0045]材料:ProteinG Sepharose CL4B 柱:GE healthcare 公司产品；余同上。
[0046]方法结果:
[0047]l，eLtaS单克隆抗体纯化。在2毫升小鼠腹水中加入I毫升PH8.0,0.1moL/L磷酸缓冲液并用PH9.0, ImoL/L TRIS-HCL调整PH为9。把小鼠腹水加入已经用0.1moL/L磷酸缓冲液PH8.0平衡好的Protein G Sepharose CL4B柱蛋白柱中，用上述缓冲液洗柱子，直到流出液中测不到杂蛋白为止。用PH3.0的柠檬酸缓冲液洗脱，收集流出液，并立即用ImoL/LTRIS-HCL PH8.5缓冲液中和，用PH7.2,0.01M PBS透析72h。取样进行SDS-PAGE检测(图3)。
[0048]2，中和性抗体的筛选。使用脑心浸液培养基培养金黄色葡萄球菌8325— 4，37°C，200rpm，在Iml培养上清中分别加入1640培养基和不同细胞株上清IOOul，培养细菌6小时后离心收集菌体，加入4倍体积玻璃珠震荡破碎细菌，离心收集上清并使用15% SDA-PAGE分离所获裂解产物，使用半干转移法将分离产物转移入PVDF膜(20V，30min)，使用LTA特异性抗体检测不同处理方式后细菌LTA水平的差异，其中E4-2具有阻断细菌LTA生成活性(图 4)。
[0049]3，杂交瘤细胞E4-2免疫球蛋白亚型的确定。用羊抗鼠IgG1、IgG2a、IgG2b和IgG3，就杂交瘤细胞浓缩后的培养上清作双相琼脂扩散实验，证明E4-2杂交瘤细胞所分泌的免疫球蛋白亚型为IgGl。
[0050]4, eLtaS单克隆抗体E4-2亲和力鉴定。用10 μ g/ml eLtaS包被ELISA板,于4°C过夜并封闭。加入待测不同浓度E4-2(37°C lh，PBST洗板4次)，及1: 40000稀释的50 μ IHRP-GAM (37°C 45min,PBST洗板4次)。以TMB底物显色后，于450nm波长测定吸光值(图5)。
[0051]5，eLtaS单克隆抗体E4-2特异性鉴定。SDS-PAGE分离eLtaS蛋白(图5)并转移至硝酸纤维素膜上，滴加含5%奶粉的PBS于4°C封闭过夜，用含0.5ml/L Tween-20的PBS洗膜3次。将膜剪成相同宽度，依次滴加eLtaS单克隆抗体E4_2 (37°C结合lh，PBST洗膜3次，再用含0.5ml/L Twee n-20的TBS洗涤3次)及HRP-GAM IgG(37°C结合lh，洗膜3次)以DAB显色后，观察结果。结果显不E4~2为eLtaS特异性单克隆抗体(图6)。
[0052]通过本部分工作，筛选到抗eLtaS中和性单克隆抗体E4_2，所分泌的免疫球蛋白亚型为IgGl。单克隆抗体E4-2与eLtaS蛋白具有极高亲和力，且单克隆抗体E4-2可特异性识别eLtaS线性表位。
[0053]实施例3单克隆抗体E4-2对⑶I小鼠的保护性实验
[0054]材料:同上实施例1和2。
[0055]方法结果:
[0056]1，急性腹膜炎模型检测抗eLtaS单克隆抗体E4_2抵抗金黄色葡萄球菌感染效果。以6周龄雌性⑶I小鼠为处理对象，分别腹腔注射PBS、对照IgG (100 μ g)和Ε4-2(100μ g)；挑取金黄色葡萄球菌8325— 4单克隆培养于脑心浸液培养基中，37°C，200rpm培养12hr。收集细菌后使用PBS洗涤细菌一次，并将细菌浓度调节至0D600 = 1.5，吸取500 μ I腹腔注射入小鼠，观察不同时间点小鼠存活数量(图7)。
[0057]2，肺炎模型检测抗eLtaS单克隆抗体Ε4-2抵抗金黄色葡萄球菌感染效果。以6周龄雌性CDl小鼠为处理对象，分别腹腔注射PBS、对照IgG (100 μ g)和E4-2 (100 μ g);挑取金黄色葡萄球菌8325-4单克隆培养于脑心浸液培养基中，37°C，200rpm培养12hr。收集细菌后使用PBS洗涤细菌一次，并将细菌浓度调节至0D600 = 1，吸取100 μ I经气管注射入小鼠肺部，72小时后短颈处死小鼠，取肺部组织制备切片，HE染色观察炎症反应水平(图8)。
[0058]实施例4eLtaS中和性单克隆抗体杂交瘤细胞E4_2轻、重链基因的钓取
[0059]材料:弓丨物:MuIX4:见序列表中序列11 ；MuC κ:见序列表中序列12 ；MuHC1:见序列表中序列13 ；MuIgGl:见序列表中序列14。DNA片段纯化试剂盒=OMEGA生物科技公司产品；T4DNA 连接酶:New England Biolabs 产品；载体 PGEM Teasy:Promega 公司产品；TRIzol:1nvitrogen公司产品；感受态细菌JM109:购自Promega公司。余同上。
[0060]方法结果:
[0061]取对数生长期的中和性单克隆抗体E4-2细胞5X106-107个，离心去除上清，将细胞均匀弹起。加lmlTRIzol反复吹打使细胞充分裂解，振荡5分钟后，加入0.2ml氯仿，振荡15秒，室温放置2-3分钟，2 — 8°C 12000r/min，离心15分钟，取上清于另一新管中，加500 μ I异丙醇混匀后室温放置10分钟，2-80C 12000r/min离心10分钟。75%乙醇洗涤沉淀，干燥后，用20 μ I无RNA酶的去离子水溶解沉淀(图9)。
[0062]取含I μ g总RNA的溶液，依次加入AMV5 X缓冲液4 μ I，01 igo (dT) (500ng/μ 1)0.5μ 1,2.5mmol/L dNTP2 μ 1，Rnasin (50U/μ 1)0.5 μ I，去离子水补至 20 μ 1、反转录酶2-5U，42°C延伸I小时。95°C变性5分钟，置冰浴中，产物为cDNA第一链。用2对特异性引物MuLC4和MuCk，MuHCl和MuIgGl，在20 μ I PCR反应体系中，分别加入反转录产物2 μ I，Taq 酶 10 Xbuffer2 μ 1，上下游引物各 I μ 1,2.5mmol/L dNTPl μ 1，加 Taq 酶 1-2U，去离子水补至20 μ I。95°C变性2分钟，循环参数为:94°C I分钟，55°C I分钟，72°C I分钟，共30个循环，72°C后延伸10分钟(图10)。
[0063]用分离出欲回收的DNA片段，在长波紫外光下切下含目的DNA片段的胶块，放入离心管中，加入三倍胶体积的化胶液，55°C水浴完全溶解胶块。用DNA片段纯化试剂盒回收DNA片段并将纯化的DNA片段在水溶液里，将回收的PCR产物在T4DNA连接酶缓冲液中按2:1的比例(摩尔比)和载体PGEM Teasy混合后，加入0.5U的T4DNA连接酶于16°C连接过夜，连接反应的总体积为10 μ L。
[0064]取连接液10μ 1，加入200μ I感受态细菌JM109中并轻柔混匀，冰浴30分钟，42°C水浴热休克90秒，迅速转入冰浴2分钟，加800 μ I LB培养基，转入37°C恒温摇床，以150转/分钟的速度摇动45分钟，4000r/min离心I分钟，弃去800 μ I上清，取沉淀涂布于含Amp (终浓度为100 μ g/ml)的固体LB平板，将平板倒置于37°C孵箱12~18小时。
[0065]在上述平板中挑取单个克隆，接种于含氨苄青霉素(100μg/ml)的LB培养基中。37°C恒温摇床170rpm,震荡培养过夜。取3ml菌液加入1.5ml Eppendorf管中，1000Orpm离心lmin，弃上清。将沉淀菌体重悬于100 μ L溶液I中，加新鲜配制的溶液ΙΙ200 μ L，轻缓地上下颠倒数次，至液体变清澈为止。随后，再加入150 μ L溶液III，轻柔地上下颠倒数次使液体混匀，此时出现大量白色絮状沉淀。4°C，12000rpm离心5min，取上清加至另一Eppendorf管中，加入等体积的Tris-HCl饱和酹,剧烈震荡后，12000rpm离心5min,将上层水相移至一新管中。再加入500 μ L氯仿，重新抽提一次。其后，小心吸取上层水相，移至一新管中，加2倍体积的无水乙醇混匀，于_20°C放置3h。4°C，12000rpm离心10min，弃上清，用70%乙醇洗沉淀2次，室温干燥20min，以40 μ L无菌双蒸水溶解，进行PCR鉴定及DNA测序分析。
[0066]构建了含有eLtaS中和抗体Ε4-2轻、重链基因的载体，经测序分析、序列比对为小鼠免疫球蛋白轻、重链基因(序列表中SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2)。
【权利要求】
1.一种抗金黄色葡萄球菌eLtaS蛋白的单克隆中和性抗体E4-2,其特征在于,所述单克隆中和性抗体E4-2的轻，重链蛋白质分子可变区编码基因如序列表中SEQ ID N0:1,SEQID NO:2所示；其氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO:3，SEQ ID NO:4所示。
2.根据权利要求1所述一种抗金黄色葡萄球菌eLtaS蛋白的单克隆中和性抗体E4-2，其特征在于，所述轻链蛋白质分子可变区的互补决定区CDR1，CDR2，CDR3的氨基酸序列如序列表中 SEQ ID NO:5，SEQ ID NO:6，SEQ ID NO:7 所示。
3.根据权利要求1所述一种抗金黄色葡萄球菌eLtaS蛋白的单克隆中和性抗体E4-2，其特征在于，所述重链蛋白质分子可变区的互补决定区CDR1，CDR2，CDR3的氨基酸序列如序列表中 SEQ ID NO:8，SEQ ID NO:9，SEQ ID NO:10 所示。
4.权利要求1所述一种抗金黄色葡萄球菌eLtaS蛋白的单克隆中和性抗体E4-2的制备方法，其特征在于，按照如下步骤进行: (1)利用eLtaS蛋白免疫Balb/c小鼠，常规方法进行细胞融合，用ELISA法筛选，阳性细胞克隆再反复亚克隆，直到所有杂交瘤细胞培养上清检测为100%阳性； (2)通过检测抗eLtaS单克隆抗体对金黄色葡萄球菌LTA合成能力的影响筛选eLtaS中和性抗体，利用脑心浸液培养基常规条件培养金黄色葡萄球菌，分别在培养体系中加入抗eLtaS单克隆抗体及对照IgG至100 μ g/ml，继续培养6小时后收集细菌； (3)取对数生长期的中和性单克隆抗体E4-2细胞，提取RNA，经RT-PCR，用两对特异性引物MuLC4和MuC K，MuHCl和MuIgGl钓取抗体的轻重链基因，常规法连接入载体，转化感受态细菌，培养后挑取单个菌落，提取质粒PCR鉴定后进行DNA测序分析，构建抗eLtaS单克隆抗体E4-2轻、重链基因的载体，经序列分析、比对，编码序列为小鼠免疫球蛋白轻、重链基因，其基因序列如序列表中SEQ ID NO: I和SEQ ID NO:2所不； (4)用www.expasy.0rg在线软件将编码eLtaS单克隆抗体E4-2轻、重链可变区核苷酸序列翻译为编码的氨基酸序列，单克隆抗体E4-2轻、重链可变区氨基酸序列如序列表中 SEQ ID NO:3 和 SEQ ID NO:4 所不，根据 Kabat 数据库(ElvinA.Kabat.《Sequencesof Proteins of Immunological Interest》.1991)确定轻链可变区序列中的互补决定区CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别如序列表中SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6和SEQ IDNO:7所示，重链可变区序列中的互补决定区⑶R1、⑶R2和⑶R3的氨基酸序列分别如序列表中 SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9 和 SEQ ID NO:10 所示。
5.根据权利要求4所述一种抗金黄色葡萄球菌eLtaS蛋白的单克隆中和性抗体E4-2的制备方法，其特征在于，所述特异性引物MuLC4和MuCk的核苷酸序列如序列表中SEQ IDNO:11和SEQ ID NO:12所示；所述特异性引物MuHCl和MuIgGl的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:13 和 SEQ ID NO:14 所示。
6.权利要求1所述抗金黄色葡萄球菌eLtaS蛋白的单克隆中和性抗体E4— 2在制备抗金黄色葡萄球菌感染的药物中的应用。
【文档编号】C07K16/12GK103951749SQ201410156050
【公开日】2014年7月30日 申请日期:2014年4月18日 优先权日:2014年4月18日
【发明者】杨光, 刘玉, 高亚萍, 董洁, 冯健男 申请人:中国人民解放军军事医学科学院基础医学研究所