一种3,5-二糖类花色苷的制备方法
【专利摘要】本发明涉及天然色素制备【技术领域】，尤其涉及一种3,5-二糖类花色苷的制备方法。该方法包括超声辅助提取、萃取、纯化的步骤。该方法以超声辅助提取减少了提取剂的使用、缩短提取时间、提高了提取效率。采用凝胶柱与大孔树脂相结合的方法，去除杂质、分离花色苷单体，从而避免了制备或半制备高效液相色谱的使用，简化了操作；并且，凝胶柱和大孔树脂填料可反复使用，能够节约资源。实验证明：本发明提供的方法提取3,5-二糖类花色苷，每g山葡萄皮干粉能够得到7.36mg的3,5-二糖类花色苷，提取效率和纯度皆较高。
【专利说明】—种3, 5- 二糖类花色苷的制备方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及天然色素制备【技术领域】，尤其涉及一种3，5- 二糖类花色苷的制备方法。
【背景技术】
[0002]近年来，随着食品药品安全问题的日益严重，天然色素的开发与应用己成为各行业科技工作者普遍关注的课题。近年来，天然色素在国际市场上的增长率一直都保持在10%以上。天然色素大多来源于天然植物的根、茎、叶、花、果实等，因此，采用这些天然色素更加安全，也更能得到消费者的青睐。花色苷类色素作为天然色素的一大类，因其丰富艳丽的色泽和抗氧化活性，目前在食品、医药等领域已有广泛应用。
[0003]花色苷(anthocyanin)是一类羟基和甲基化的2_苯基-苯并吡喃烊离子(花色素，anthocyanidin)与糖分子通过糖苷键结合而成的多酹类化合物。花色素属于类黄酮，是一种酚类物质，因苯环取代基、羟基和甲氧基数量与位置的不同，花色素单体主要包括以下六类:花翠素、甲基花翠素、二甲基花翠素、花青素、甲基花青素、花葵素。这些花色素单体中，花翠素最不稳定，二甲花翠素最为稳定。而根据成苷糖基位置和数量的不同可将主要的花色苷分为四类，分别是3-单糖类花色苷，3-双糖类花色苷，3，5- 二糖类花色苷和3，7- 二糖类花色苷等。这四种类型的花色苷中，双糖苷类色素因分子中含有双糖分子，其稳定性明显高于相应的单糖类物质。因此，双糖花色苷作为天然色素，在食品药品行业中具有很高的研究价值和应用前景。但是，由于缺乏低成本的制备工艺导致在我国花色苷类作为天然食用色素的生产很少，且价格十分昂贵，很难应用于工业化生产。
[0004] 花色苷广泛存在于紫甘薯、葡萄、血橙、红球甘蓝、蓝莓、茄子皮、樱桃、红橙、红莓、草莓、桑葚、山楂皮、紫苏、黑(红)米、牵牛花等植物的组织中。其中以葡萄中的含量较为丰富。近年来的研究结果表明，欧亚种葡萄(VitisamurensisL.)中仅含有单糖类花色苷，而山葡萄(VitisamurensisRupr.)中双糖花色苷的含量十分丰富。且山葡萄在我国分布面积广阔，利用山葡萄作为材料提取双糖类花色苷具有良好的应用前景。目前虽然对花色苷的提取方法已有多方报道，但是，将这些现有的方法应用于双糖花色苷的提取却往往存在提取率低、纯度不足等问题，因此，探究双糖类花色苷的提取纯化分离方法具有重要意义。
【发明内容】
[0005]有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供一种3，5-二糖类花色苷的制备方法。该方法提取率高，所得3.5- 二糖类花色苷纯度较高；且无需借助制备型或半制备型高效液相色谱，操作简单；该方法所用试剂毒性较低，对环境友好。
[0006]本发明提供的3，5- 二糖类花色苷的制备方法，包括以下步骤:
[0007]步骤1:以乙醇溶液超声提取山葡萄皮粉，提取液去除乙醇，制得第一提取液；
[0008]步骤2:以乙酸乙酯萃取第一提取液，取水层，去除乙酸乙酯制得第二提取液；
[0009]步骤3:将第二提取液上样于XAD-7大孔树脂柱，以蒸馏水冲洗后，以乙醇溶液洗脱，获得第一洗脱液，经干燥，制得粗提物；
[0010]步骤4:将粗提物以甲醇溶液溶解，过滤后上样于S印hadex LH-20凝胶柱，以甲醇溶液洗脱，获得第二洗脱液，经干燥，即得；
[0011]其中，乙醇溶液中各组分的体积分数为:乙醇60%，甲酸2%，水38% ;
[0012]甲醇溶液中各组分的体积分数为:甲醇20%，甲酸2%，水78% ;
[0013]山葡萄皮粉与乙醇溶液的质量体积比为:lg:1OmL ；
[00 14]超声提取的温度为53.5°C，时间为20min，次数为3次。
[0015]本发明提供的方法，以超声辅助提取葡萄皮中的的花色苷，利用超声波在溶液中形成气穴效应，使更多溶剂渗透到样品基质，增加固液相之间的接触面积，将溶质尽快的溶解到溶剂，从而减少了提取剂的使用、缩短提取时间、提高了提取效率。
[0016]经超声提取的第一提取液中仍含有糖、蛋白以及其他非花色苷酚类物质，本发明通过采用凝胶柱与大孔树脂相结合的方法，去除杂质、分离花色苷单体，从而避免了制备或半制备高效液相色谱的使用，简化了操作；并且，凝胶柱和大孔树脂填料可反复使用，能够节约资源。
[0017]本发明所采用的山葡萄皮粉的制备方法为:取山葡萄果实剥离果皮，果皮经液氮速冻、匀浆机磨粉、冻干机24h冷冻干燥，即得。
[0018]本发明通过经实验证明:
[0019]乙醇溶液中醇的体积分数会影响提取效果，花色苷的提取率随着醇体积分数的增加，花色苷提取量增加，然而当醇体积分数在60%之后时，花色苷含量增加幅度趋于平缓；
[0020]山葡萄皮粉与乙醇溶液的质量体积比会影响提取效果:提取率随液料比的增大而增加，当增加到10:1时上升不再增加。
[0021]超声提取的温度对提取效果造成影响:对于提取温度的影响，经响应面分析结果表明，提取效率在53.5°C时达最高值。
[0022]超声提取的时间对提取效果造成影响:在20min内，随提取时间延长提取量逐渐增加，此后提取量略微下降，可能是由于长时间高温提取，导致花色苷受热分解。
[0023]提取次数对提取效果造成影响:随着提取次数的增加，花色苷提取率增加，第三次提取时，花色苷提取率达到98.6%，但再增加提取次数对提取率影响不大。
[0024]对XAD-7、XAD-2、NKA-9、AB-80和D151树脂对花色苷的吸附性能和解吸性能进行评价，结果表明，XAD-7具有较高的吸附性能，其次是XAD-2，而NKA_9、AB_80和D151这三种树脂的效果均不理想。利用60%乙醇进行解析，XAD-7，AB-8都具有较高的解吸率，但后者吸附量较低。
[0025]溶剂对XAD-7大孔吸附树脂柱的洗脱效果有影响:对乙醇溶液而言，随着乙醇溶液中醇的体积分数的增加，树脂中花色苷解吸率呈上升趋势，且当体积分数达到60%时，达到较大程度的解吸(解吸率为88% )。甲醇溶液的洗脱效果与此相似，本发明采用低毒的乙醇溶液作为洗脱液。
[0026]作为优选，超声提取的频率为59kHz，功率为500W。
[0027]作为优选，步骤I中去除乙醇具体为:取提取液经离心、真空旋转蒸发。
[0028]作为优选，乙酸乙酯与第一提取液的体积比为1:1。
[0029]作为优选，步骤2中去除乙酸乙酯为取水层真空旋转蒸发。
[0030]作为优选，步骤2中萃取的次数为3次。
[0031]作为优选，XAD-7大孔树脂柱的规格为1.6cmX40cm。
[0032]作为优选，蒸馏水的量为5倍柱体积。
[0033]作为优选，步骤3中干燥具体为:第一洗脱液经旋转蒸发后，真空冷冻干燥24h ;其中，旋转蒸发的温度不超过40°C。
[0034]作为优选，步骤3具体为:第二提取液上样与XAD-7大孔树脂柱后，保持lh，以5倍柱体积的蒸馏水冲洗后，柱中加入乙醇溶液保持Ih后洗脱，获得第一洗脱液，旋转蒸发、真空冷冻24h。
[0035]作为优选，Sephadex LH-20凝胶柱的规格为1.6cmX60cm。
[0036]作为优选，步骤4中洗脱的流速为I滴/秒。
[0037]作为优选，步骤4中，溶解于上样之间还包括以0.45 μ m微孔滤膜过滤的步骤。
[0038]作为优选，步骤4中干燥具体为:第二洗脱液经旋转蒸发后，真空冷冻干燥24h ;其中，旋转蒸发的温度不超过40°C。
[0039]本发明还提供了以本发明提供的制备方法制得的3，5- 二糖类花色苷。
[0040]作为优选，以本发明提供的制备方法制得的3，5_ 二糖类花色苷为二甲花翠素_3，5-0-双匍萄糖昔。
[0041]本发明还提供了本发明提供方法制备的3，5- 二糖类花色苷在制备食品或药品中的应用。
[0042]本发明提供的3，5-二糖类花色苷的制备方法，包括超声辅助提取、萃取、纯化的步骤。以超声辅助提取减少了提取剂的使用、缩短提取时间、提高了提取效率。采用凝胶柱与大孔树脂相结合的方法，去除杂质、分离花色苷单体，从而避免了制备或半制备高效液相色谱的使用，简化了操作；并且，凝胶柱和大孔树脂填料可反复使用，能够节约资源。实验证明:乙醇溶液和甲醇溶液中纯的体积分数、超声提取的温度和时间是影响提取效果的关键因素，改变这些条件中的任一种都会显著降低提取效率。而步骤2~4的纯化过程中，大孔吸附树脂的种类、洗脱条件是提高纯化效果的关键因素。采用本发明提供的方法提取每g山葡萄皮干粉能够得到7.36mg 二甲花翠素-3，5-0-双葡萄糖苷，占所提取花色苷的98.7%，另外，还包括0.324%的花翠素-3，5-0-双葡萄糖苷和0.841%的甲基花翠素3，5-0-双葡萄糖苷。检测过程未见其他物质峰，表明本发明提供方法提取的3，5-二糖类花色苷纯度接近100%。
【专利附图】
【附图说明】
[0043]图1示固定乙醇浓度(60% )，超声处理温度和提取剂体积对花色苷提取效果的影响；
[0044]图2示固定超声处理温度(50V )，乙醇浓度和提取剂体积影响花色苷提取效果的影响；
[0045]图3示乙醇浓度和提取剂体积对花色苷含量的交互影响；
[0046]图4示HPLC检测结果；其中，图4_a示本发明实施例3制备的粗提物的色谱图；图4-b示本发明实施例4制备的3，5- 二糖类花色苷的色谱图。
【具体实施方式】
[0047]本发明提供了一种3，5-二糖类花色苷的制备方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本
【发明内容】
、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
[0048]本发明采用的仪器皆为普通市售品，皆可于市场购得。
[0049]其中，山葡萄成熟果实样品2011年取自中国农业大学上庄试验站。
[0050]山葡萄皮粉的制备具体为:室温下将果皮剥离且不带果肉，于液氮中速冻，经搅拌器打粉，于_40°C条件下保存。每g新鲜山葡萄果皮约制备0.3g山葡萄皮干粉。
[0051]下面结合实施例，进一步阐述本发明:
[0052]实施例1山葡萄皮中花色苷的超声提取条件筛选
[0053]分别研究提取液种类、体积分数、料液比、超声提取条件对山葡萄皮中总花色苷提取量的影响。花色苷含量的定量分析采用高效液相色谱。
[0054]1、提取溶剂种类和体积分数对山葡萄皮总花色苷提取量的影响
[0055]准确称取0.5g山葡萄皮粉，按液料比10:1 (mL/g)加入2%甲酸甲醇溶液或2%甲酸乙醇溶液，50°C超声振荡温度，超声提取20min。提取溶剂体积分数分别为60%、70%、80%、90%、100%。各组实验设三次重复，以花色苷提取量(mg/g，干粉)为考察指标，研究提取溶剂种类和体积分数对山葡萄皮粉中总花色苷提取率的影响，选取最适溶剂种类和体积分数，结果如表1所示:
[0056]表1提取试剂种类和体积分数对山葡萄皮总花色苷提取量的影响
[0057]
【权利要求】
1.一种3，5- 二糖类花色苷的制备方法，其特征在于，包括以下步骤: 步骤1:以乙醇溶液超声提取山葡萄皮粉，提取液去除乙醇，制得第一提取液； 步骤2:以乙酸乙酯萃取所述第一提取液，取水层，去除乙酸乙酯制得第二提取液；步骤3:将所述第二提取液上样于XAD-7大孔树脂柱，以蒸馏水冲洗后，以乙醇溶液洗脱，获得第一洗脱液，经干燥，制得粗提物； 步骤4:将所述粗提物以甲醇溶液溶解，上样于S^hadex LH-20凝胶柱，以甲醇溶液洗脱，获得第二洗脱液，经干燥，即得； 其中，所述乙醇溶液中各组分的体积分数为:乙醇60%，甲酸2%，水38% ； 所述甲醇溶液中各组分的体积分数为:甲醇20%，甲酸2%，水78% ； 所述山葡萄皮粉与所述乙醇溶液的质量体积比为:lg:10mL ； 所述超声提取的温度为53.5°C，时间为20min，次数为3次。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述超声提取的频率为59kHz，功率为 500W。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述乙酸乙酯与所述第一提取液的体积比为1:1。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述XAD-7大孔树脂柱的规格为1.6cmX40cm。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述SephadexLH-20凝胶柱的规格为 1.6cmX60cm。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤3中所述干燥具体为:第一洗脱液经旋转蒸发后，真空冷冻干燥24h ;其中，旋转蒸发的温度不超过40°C。
7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤4中所述洗脱的流速为I滴/秒。
8.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤4中所述干燥具体为:第二洗脱液经旋转蒸发后，真空冷冻干燥24h;其中，旋转蒸发的温度不超过40°C。
9.以权利要求1~9任一项所述制备方法制得的3，5-二糖类花色苷。
10.以权利要求1~9任一项所述制备方法制得的3，5-二糖类花色苷在制备食品或药品中的应用。
【文档编号】C07H1/08GK104177460SQ201410341208
【公开日】2014年12月3日 申请日期:2014年7月17日 优先权日:2014年7月17日
【发明者】段长青, 张波, 何非, 吴广枫, 李美仪 申请人:中国农业大学