鼠曲草中多酚类化合物单体制备方法
【专利摘要】本发明涉及植物中有效成分提取【技术领域】，具体来说是一种鼠曲草中多酚类化合物单体制备方法，步骤包括(1)鼠曲草过柱产物；(2)上样洗脱；(3)结构测定；本发明利用HSCCC与制备HPLC联用技术从鼠曲草中制备分离得到6个化合物，该方法简便、高效无毒，适宜化合物的大量制备，并鉴定了其中5个化合物；同时，对化合物对α-葡萄糖苷酶的抑制作用进行了研究，为鼠曲草进一步药理研究及质量控制奠定基础；本发明方法可快速才鼠曲草中提取多酚类化合物单体，方法操作简单，制备的多酚类单体化合物纯度高。
【专利说明】鼠曲草中多齡类化合物单体制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及植物中有效成分提取【技术领域】，具体来说是一种鼠曲草中多酷类化合 物单体制备方法。
【背景技术】
[000引 鼠曲草（Gnaphalium affine D. Don)为菊科鼠曲草属植物鼠曲草的全草，1977年版 《中华人民共和国药典》一部中就有收载。传统医学认为它具有止咳化姨，巧风除湿，解毒之 功效，主治咳嗽姨多，风湿瘍痛，水肿，赤白带下，痛肿疗疮等症。在墨西哥，鼠曲草属植物常 被用作抗炎药物。现代药理研究进一步表明鼠曲草不仅具有显著的抗炎、抗氧化、抑菌、镇 咳巧姨、保肝等作用，还有杀虫作用，因此具有广泛的开发利用前景。
[0003] 目前，文献报道的鼠曲草的化学成分主要是黄丽及黄丽巧类成分，而对其他化合 物研究较少，深入研究鼠曲草中化合物种类、分离其单体成分并进行化学结构鉴定及结 构一活性关系是极其必要的。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的是针对上述技术存在的问题，提供一种鼠曲草中多酷类化合物单体 制备方法。
[0005] 为实现上述目的，本发明采用的技术方案是；一种鼠曲草中多酷类化合物单体制 备方法，步骤为：
[000引 （1)新鲜的鼠曲草置于6(TC的烘箱中烘干后粉碎至10?20目，然后粉碎的原料 加入鼠曲草粉末量20?30倍、质量浓度为50?70 %的己醇，在70?8(TC条件下回流提 取0. 5?比，过滤，滤渣重复提取1次，合并提取液并减压浓缩至1?1. 5ml/g，同时用盐酸 调节抑=3,过滤除去沉淀，将滤液W 4BVA流速通过装有DlOl树脂的层析柱，上柱体积为 吸附后静置0.化，用水洗至无色，然后用4?她V质量浓度为60%己醇W 2?4BV/h的流 速洗脱，收集己醇洗脱液，减压浓缩后冷冻干燥，得鼠曲草过柱纯化产物；
[0007] (2)将正己焼、己酸己醋、无水甲醇、体积浓度为0. 5%的冰己酸水溶液按体积比 为0. 7:3. 5:1:4的比例充分混合，静置分层过夜，将上相与下相分离，超声脱气，将制得的 鼠曲草过柱纯化产物100?120mg用10?20mL下相超声溶解，作为进样溶液；上相溶剂 W 20mL/min的流速注入高速逆流色谱仪，待上相溶剂充满后，在850?9(K)巧m/min的转 速下将下相W 1. 5mL/min的流速粟入高速逆流色谱仪，设温箱温度20?3(TC，待下相流出 时即系统已经平衡，此时将准备好的进样溶液从进样口注入，同时进行图谱采集，检测波长 为280nm，根据峰形手动分段收集流出液，将收集的流出液减压浓缩后冷冻干燥；该溶剂体 系一次分离得到纯度分别为95. 3%、98. 7%、99. 6%、99. 7%的化合物1、化合物2、化合物 3、化合物6，及化合物4、5的混合物，该混合物用少量甲醇溶解后用制备液相色谱进一步分 离，A粟为质量浓度为0. 5%冰醋酸，B粟为色谱甲醇，洗脱梯度为：在60min有机相W 32% 的体积，水相W 68%的体积等度洗脱，流速15ml/min，柱温3(TC，进样量1ml，检测输出波长 328nm，根据峰形收集化合物4、5 ;
[0008] (3)通过质谱、核磁共振技术对获得的5个化合物进行了结构鉴定，化合物1为 绿原酸，化合物3为3, 5-双咖啡醜基奎宁酸、化合物4为4, 5-双咖啡醜基奎宁酸、化 合物5为3, 4-双咖啡醜基奎宁酸，化合物6为2' ,4,4' -H轻基-6'-甲氧基查尔 丽-4' -0-目-D-葡萄糖巧。
[0009] 本发明中，参照文献方法（GaoH, Kaw油ata J. A-glucosidase inhibition of6-hydroxyflavones. PartS:Synthesis and evaluation of2, 3, 4-trihydroxybenzoyl-containing flavonoid analogs and6-aminoflavones as a -glucosidase inhibitors. Bioorganic&Medicinal Qiemishy. 2005 ;13:1661_1671 ;YE X_P, SONG C-Q, YUAN P,et al. a -glucosidase and a -amylase inhibitory activity of common constituents from traditional Chinese medicine used for diabetes mellitus. Chinese Journal of化化ral Medicines. 2010;8:349-352) W对硝基苯基-a-D-化喃葡萄糖巧为底物测定 化合物对a-葡萄糖巧酶的抑制作用。6个化合物对a-葡萄糖巧酶均有抑制作用，其抑制 活性均与浓度呈正相关，化合物对a -葡萄糖巧酶抑制作用由强到弱为；化合物2〉化合物 6 >化合物1〉化合物3〉化合物5〉化合物4,抑制作用远远大于同等浓度的拜糖平。
[0010] 本发明的有益技术效果是：本发明利用服CCC与制备HPLC联用技术从鼠曲草中制 备分离得到6个化合物，该方法简便、高效无毒，适宜化合物的大量制备，并鉴定了其中5个 化合物；同时，对化合物对a -葡萄糖巧酶的抑制作用进行了研究，为鼠曲草进一步药理研 究及质量控制奠定基础；
[0011] 本发明方法可快速才鼠曲草中提取多酷类化合物单体，方法操作简单，制备的多 酷类单体化合物纯度高。
[001引说明书附图
[0013] 图1鼠曲草提取物HPLC检测图谱；
[0014] 图2鼠曲草提取物服CCC分离色谱图；
[00巧]图3鼠曲草中分离组分的HPLC图谱。
【具体实施方式】
[0016] 下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述， 显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的 实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都 属于本发明保护的范围。
[0017] 实施例1
[0018] 一种鼠曲草中多酷类化合物单体制备方法，步骤为：
[0019] (1)新鲜的鼠曲草置于6(TC的烘箱中烘干后粉碎至10目，然后粉碎的原料加入鼠 曲草粉末量20倍、质量浓度为50%的己醇，在7(TC条件下回流提取0.化，过滤，滤渣重复 提取1次，合并提取液并减压浓缩至无己醇味，同时用盐酸调节抑=3,过滤除去沉淀，将 滤液W 4BVA流速通过装有DlOl树脂的层析柱，上柱体积为吸附后静置0.化，用水洗至无 色，然后用4BV质量浓度为60%己醇W 2BV/h的流速洗脱，收集己醇洗脱液，减压浓缩后冷 冻干燥，得鼠曲草过柱纯化产物；
[0020] (2)将正己焼、己酸己醋、甲醇、体积浓度为0.5%的冰己酸水溶液按体积比为 0.7:3. 5:1:4的比例充分混合，静置分层过夜，将上相与下相分离，超声脱气；将制得的鼠 曲草过柱纯化产物IOOmg用IOmL下相超声溶解，作为进样溶液；上相溶剂W 20mL/min的流 速注入高速逆流色谱仪，待上相溶剂充满后，在85化pm/min的转速下将下相W 1. 5mL/min 的流速粟入高速逆流色谱仪，设温箱温度2(TC，待下相流出时即系统已经平衡，此时将准 备好的进样溶液从进样口注入，同时进行图谱采集，检测波长为280nm，根据峰形手动分段 收集流出液，将收集的流出液减压浓缩后冷冻干燥；该溶剂体系一次分离得到纯度分别为 95. 3%、98. 7%、99. 6%、99. 7%的化合物1、化合物2、化合物3、化合物6,及化合物4、5的 混合物，该混合物用少量甲醇溶解后用制备液相色谱进一步分离，A粟为质量浓度为0. 5% 冰醋酸，B粟为色谱甲醇，洗脱梯度为：在60min有机相W 32%的体积，水相W 68 %的体积 等度洗脱，流速15ml/min，柱温3(TC，进样量1ml，检测输出波长328nm，根据峰形收集化合 物 4、5 ;
[0021] (3)通过质谱、核磁共振技术对获得的5个化合物进行了结构鉴定，化合物1为 绿原酸，化合物3为3, 5-双咖啡醜基奎宁酸、化合物4为4, 5-双咖啡醜基奎宁酸、化 合物5为3, 4-双咖啡醜基奎宁酸，化合物6为2' ,4,4' -H轻基-6'-甲氧基查尔 丽-4' -0-目-D-葡萄糖巧。
[00过 实施例2
[0023] (1)新鲜的鼠曲草置于6(TC的烘箱中烘干后粉碎至10目，然后粉碎的原料加入鼠 曲草粉末量25倍、质量浓度为60%的己醇，在75C条件下回流提取比，过滤，滤渣重复提取 1次，合并提取液并减压浓缩至无己醇味，同时用盐酸调节抑=3,过滤除去沉淀，将滤液W 4BVA流速通过装有DlOl树脂的层析柱，上柱体积为吸附后静置0.化，用水洗至无色，然后 用地V质量浓度为60%己醇W 3BVA的流速洗脱，收集己醇洗脱液，减压浓缩后冷冻干燥， 得鼠曲草过柱纯化产物；
[0024] (2)将正己焼、己酸己醋、甲醇、体积浓度为0.5%的冰己酸水溶液按体积比为 0.7:3. 5:1:4的比例充分混合，静置分层过夜，将上相与下相分离，超声脱气；将制得的鼠 曲草过柱纯化产物IlOmg用15mL下相超声溶解，作为进样溶液；上相溶剂W 20mL/min的流 速注入高速逆流色谱仪，待上相溶剂充满后，在875巧m/min的转速下将下相W 1. 5mL/min 的流速粟入高速逆流色谱仪，设温箱温度25C，待下相流出时即系统已经平衡，此时将准 备好的进样溶液从进样口注入，同时进行图谱采集，检测波长为280nm，根据峰形手动分段 收集流出液，将收集的流出液减压浓缩后冷冻干燥；该溶剂体系一次分离得到纯度分别为 95. 3%、98. 7 %、99. 6 %、99. 7%的化合物1、化合物2、化合物3、化合物6,及化合物4、5的 混合物，该混合物用少量甲醇溶解后用制备液相色谱进一步分离，A粟为质量浓度为0. 5% 冰醋酸，B粟为色谱甲醇，洗脱梯度为：在60min有机相W 32%的体积，水相W 68%的体积 等度洗脱，流速15ml/min，柱温3(TC，进样量1ml，检测输出波长328nm，根据峰形收集化合 物 4、5 ;
[00巧](3)通过质谱、核磁共振技术对获得的5个化合物进行了结构鉴定，化合物1为 绿原酸，化合物3为3, 5-双咖啡醜基奎宁酸、化合物4为4, 5-双咖啡醜基奎宁酸、化 合物5为3, 4-双咖啡醜基奎宁酸，化合物6为2' ,4,4' -H轻基-6'-甲氧基查尔 丽-4' -0-目-D-葡萄糖巧。
[002引 实施例3
[0027] (1)新鲜的鼠曲草置于6(TC的烘箱中烘干后粉碎至20目，然后粉碎的原料加入鼠 曲草粉末量30倍、质量浓度为70%的己醇，在8(TC条件下回流提取比，过滤，滤渣重复提取 1次，合并提取液并减压浓缩至无己醇味，同时用盐酸调节抑=3,过滤除去沉淀，将滤液W 4BVA流速通过装有DlOl树脂的层析柱，上柱体积为吸附后静置0.化，用水洗至无色，然后 用她V质量浓度为60%己醇W 4BVA的流速洗脱，收集己醇洗脱液，减压浓缩后冷冻干燥， 得鼠曲草过柱纯化产物；
[0028] (2)将正己焼、己酸己醋、甲醇、体积浓度为0.5%的冰己酸水溶液按体积比为 0.7:3. 5:1:4的比例充分混合，静置分层过夜，将上相与下相分离，超声脱气；将制得的鼠 曲草过柱纯化产物120mg用20血下相超声溶解，作为进样溶液；上相溶剂W 20mL/min的流 速注入高速逆流色谱仪，待上相溶剂充满后，在90化pm/min的转速下将下相W 1. 5mL/min 的流速粟入高速逆流色谱仪，设温箱温度3(TC，待下相流出时即系统已经平衡，此时将准 备好的进样溶液从进样口注入，同时进行图谱采集，检测波长为280nm，根据峰形手动分段 收集流出液，将收集的流出液减压浓缩后冷冻干燥；该溶剂体系一次分离得到纯度分别为 95. 3%、98. 7%、99. 6%、99. 7%的化合物1、化合物2、化合物3、化合物6,及化合物4、5的 混合物，该混合物用少量甲醇溶解后用制备液相色谱进一步分离，A粟为质量浓度为0. 5% 冰醋酸，B粟为色谱甲醇，洗脱梯度为：在60min有机相W 32%的体积，水相W 68%的体积 等度洗脱，流速15ml/min，柱温3(TC，进样量Iml，检测输出波长328nm，根据峰形收集化合 物 4、5 ;
[0029] (3)通过质谱、核磁共振技术对获得的5个化合物进行了结构鉴定，化合物1为 绿原酸，化合物3为3, 5-双咖啡醜基奎宁酸、化合物4为4, 5-双咖啡醜基奎宁酸、化 合物5为3, 4-双咖啡醜基奎宁酸，化合物6为2' ,4,4' -H轻基-6'-甲氧基查尔 丽-4' -0-目-D-葡萄糖巧。
[0030] 实施例4
[0031] 1 方法
[0032] (1)高效液相色谱（册LC)分析条件
[0033] 流动相为A粟：水（0.5%冰醋酸），B粟：甲醇，采用高压二元梯度洗脱，洗 脱方法如下；〇min(:A70 %，B:30 % ) - 15min(A:55 %，B:45 % ) - 25min(A:55 %， B:45% ) - 40min(A:30%，B:70% )，流速 I血/min,柱温 30°C，进样量 20yL，检测输出波 长 328nm。
[0034] (2)鼠曲草提取液的制备
[0035] 新鲜的鼠曲草于室内自然阴干，置6(TC烘箱中干燥，粉碎，取200g鼠曲草粉碎原 料，用70 %己醇，料液比为1:30,在8(TC回流提取比，提取2次，合并提取液并用盐酸调节 抑3,抽滤去除沉淀，滤液经旋转减压浓缩仪浓缩至无醇味（200ml)，得到鼠曲草提取液。
[0036] (3)鼠曲草提取液的纯化
[0037] 将上述所得提取液通过装有DlOl树脂（3cmX60cm，450ml)的层析柱，流速4BV/h， 吸附后静置0.化，用IBV水洗去水溶性杂质，再用4BV的60%己醇W 3BVA的流速洗脱，收 集60%己醇洗脱部位，减压浓缩后冷冻干燥，得鼠曲草纯化产物6. 44g，4C冰箱中保存，作 为高速逆流进样原料。
[0038] (4)服CCC两相溶剂体系的选择
[0039] 实验通过HPLC测定目标化合物的分配系数化值）来选择高速逆流的溶剂体系， 一般来说各分离组分K值在0. 2-5之间时可W接受。选择方法操作步骤：按照不同比例配 置溶剂体系，充分混匀，30s静置分层，待溶剂体系两相分层彻底后，取适量鼠曲草纯化提取 物粉末用2mL下相溶解，过0. 45um膜，取20 y L过膜溶液经HPLC分离，记录各峰面积为Al ; 取已过膜下相溶液ImL加入等体积已过膜的上相充分混合摇匀萃取，静置分层彻底后，再 取下相20 y L经HPLC分离，记录各峰面积为A2,按下列公式计算K值。
[0040] 对于逆流色谱，选择K值合适的溶剂体系作为HSCCC的固定相与流动相。
[00川 妨高速逆流色谱腿CCC)制备分离鼠曲草中化合物
[004引按正己焼-己酸己醋-甲醇-水（体积浓度为0.5%的冰己酸）=0.7:3. 5:1:4 (V/ V)配制溶剂体系。将所有溶剂按体积比加入到2000mL的分液漏斗中充分震荡得溶剂混合 物，静置一晚，等到两相平衡后，将上相与下相分离，分别装入试剂瓶里，超声脱气40min。然 后将上相溶剂W 20mL/min的流速粟入高速逆流色谱主机管路中，待上相溶剂充满管路后， 开启仪器W 900巧m/min转速正向旋转，同时将下相W 1. 5mL/min的流速粟入主机管路，计 算固定相的保留率Sf。称取鼠曲草服CCC进样原料lOOmg，用IOmL下相溶解，从进样口注 入。设置色谱采集波长340nm，分离温度2(TC，进样比后进行图谱采集。根据流出峰形手 动收集每个峰的尖部流出液，经HPLC鉴定其纯度。
[004引 （6)制备HPLC分离化合物4、5
[0044] 将服CCC分离物中含有组分4、5的流出液部分浓缩至干，用少量甲醇溶解后用制 备型HPLC分离。分离条件为：流动相为A粟：水（0. 5%冰醋酸），B粟；甲醇，洗脱方法如 下；Omin (A:68%，B: 32% ) - 60min (A:68%，B: 32% )，流速 1 SmT,/min.柱温 30°C，进样体 积ImU检测输出波长328nm。
[0045] (7)结构鉴定
[0046] 质谱采用电喷雾电离源巧SI)，负离子模式，核磁共振谱用IN0VA-300核磁共振仪 完成，用CD30D为溶剂，由湖南大学分析测试中也完成。
[0047] (8)化合物对a -葡萄糖巧酶的抑制作用
[0048] W PNPG为底物测定样品对a-葡萄糖巧酶的抑制作用。在试管中加入PBS(PH =6. 8、0. 2mol/L)0. 7血、样品溶液0. 1血（化合物浓度0. 05-0. 7mg/mL，纯化产物、拜糖平 2. 0-10. mg/血）、PNPG(20mmol/L)0. 1血、a -葡萄糖巧酶（0. 57U/ml)0. 1血在 37°C水浴加 热15min，加入5ml0. Imol/L化2〇)3终止反应，在400nm波长下测定吸收值，同时作样品对 照。按下式计算抑制率：
[0049] 酶活性抑制率=
[0050] Ag自；不加待测样品反应后的吸收值；A样。。。：加入待测样品反应后的吸收值；A背景： 只加待测样品的吸收值。
[005。 2结果
[0052] (1) HPLC分析条件的优化
[0053] 实验分别考察了不同溶剂组成W及不同浓度梯度的己膳-水（0. 5%冰醋酸）、甲 醇-水、甲醇-水（0.5%冰醋酸）作为流动相体系对鼠曲草多酷类化合物HPLC分离效果。 结果表明（图1)，W甲醇-水（0.5%冰醋酸）作为流动相时，鼠曲草提取液中化合物的检 测基线比较平稳，分离效果好，色谱峰分布均匀，能实现多个色谱峰之间的分离，因此选择 甲醇-水（0. 5%冰醋酸）作为流动相。
[0054] (2)服CCC的两相溶剂体系选择
[0055] 在高速逆流色谱分离中，最关键的是要选出合适的溶剂体系，实验对多个不同极 性的溶剂体系进行考察，结果发现，由正己焼-己酸己醋-甲醇-水（0.5 %己酸）组成的体 系中各组分的K值较好，再进一步调整溶剂的不同比例，K值结果见表1。
[0056] 表1不同溶剂体系的K值
[0057]
【权利要求】
1.鼠曲草中多酚类化合物单体制备方法，其特征在于，步骤为： (1) 新鲜的鼠曲草置于60°c的烘箱中烘干后粉碎至10?20目，然后粉碎的原料加 入鼠曲草粉末量20?30倍、质量浓度为50?70%的乙醇，在70?80°C条件下回流提取 0. 5?lh，过滤，滤渔重复提取1次，合并提取液并减压浓缩至1?1. 5ml/g，同时用盐酸调 节pH = 3,过滤除去沉淀，将滤液以4BV/h流速通过装有D101树脂的层析柱，上柱体积为吸 附后静置〇. 5h，用水洗至无色，然后用4?6BV质量浓度为60%乙醇以2?4BV/h的流速 洗脱，收集乙醇洗脱液，减压浓缩后冷冻干燥，得鼠曲草过柱纯化产物； (2) 将正己烷、乙酸乙酯、无水甲醇、体积浓度为0.5 %的冰乙酸水溶液按体积比为 0.7:3. 5:1:4的比例充分混合，静置分层过夜，将上相与下相分离，超声脱气，将制得的鼠 曲草过柱纯化产物100?120mg用10?20mL下相超声溶解，作为进样溶液；上相溶剂以 20mL/min的流速注入高速逆流色谱仪，待上相溶剂充满后，在850?900rpm/min的转速 下将下相以1. 5mL/min的流速泵入高速逆流色谱仪，设温箱温度20?30°C，待下相流出 时即系统已经平衡，此时将准备好的进样溶液从进样口注入，同时进行图谱采集，检测波长 为280nm，根据峰形手动分段收集流出液，将收集的流出液减压浓缩后冷冻干燥；该溶剂体 系一次分离得到纯度分别为95. 3%、98. 7%、99. 6%、99. 7%的化合物1、化合物2、化合物 3、化合物6,及化合物4、5的混合物，该混合物用少量甲醇溶解后用制备液相色谱进一步分 离，A泵为质量浓度为0.5%冰醋酸，B泵为色谱甲醇，洗脱梯度为：在60min有机相以32% 的体积，水相以68%的体积等度洗脱，流速15ml/min，柱温30°C，进样量lml，检测输出波长 328nm，根据峰形收集化合物4、5 ; (3) 通过质谱、核磁共振技术对获得的5个化合物进行了结构鉴定，化合物1为绿 原酸，化合物3为3, 5-双咖啡酰基奎宁酸、化合物4为4, 5-双咖啡酰基奎宁酸、化合 物5为3, 4-双咖啡酰基奎宁酸，化合物6为2'，4,4'-三羟基-6'-甲氧基查尔 酮-4' -Ο-β-D-葡萄糖苷。
【文档编号】C07C69/732GK104262154SQ201410349777
【公开日】2015年1月7日 申请日期:2014年7月22日 优先权日:2014年7月22日
【发明者】陆英, 刘仲华, 李觅路, 谭斌, 林海燕, 李佳银 申请人:湖南农业大学