生物活性肽在原核细胞中的高效率重组表达和纯化方法
【专利摘要】本发明公开了生物活性肽在原核细胞中的高效率重组表达和纯化方法，包括构建重组表达载体pHGB1-TEV、生长因子重组表达质粒pHGB1-TEV-hEGF、pHGB1-TEV-mEGF和pHGB1-TEV-LL-37并在大肠杆菌JM109菌株中高效表达和纯化抗菌肽LL-37及人和鼠表皮生长因子的技术。本发明采用现代生物技术，实现人表皮生长因子及抗菌肽的生产。通过这一体统表达的重组蛋白N端带有序列His6-GB1-TEV，六个组氨酸标签便于重组蛋白通过Ni-NTA柱得到纯化，TEV酶切序列使得融合标签能被在TEV酶高效切除，从而得到目的生物活性肽。生物活性肽具有多种功能，具有巨大的市场需求，利用该技术重组表达和纯化生物活性肽具有产量高，活性高，工艺简单，生成成本低廉等优点，具有很高的工业开发价值。
【专利说明】生物活性肽在原核细胞中的高效率重组表达和纯化方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及利用融合表达技术在原核表达系统中高效表达和纯化抗菌肽LL-37， 表皮生长因子等生物活性肽，具体涉及生物活性肽在原核细胞中的高效率重组表达和纯化 方法，属于生物工程领域。
【背景技术】
[0002] 抗菌肽LL-37是人体天然免疫系统产生的Cathelicidin类抗菌肽，其前体肽 hCAP-18主要由中性粒细胞释放，经丝氨酸蛋白酶切割产生有活性的LL-37，具有抵御外 来微生物入侵，清除体内突变细胞等多种生理功能。LL-37是以两个亮氨酸起始的37肽，分 子量为4. 5 kDa，空间结构为兼性的α -螺旋。由于LL-37含有较多的 碱性氨基酸，分子表面带正电荷，通过和带负电荷的细菌细胞膜相互作用来杀死细菌。
[0003] 人和鼠表皮生长因子（Epidermal Growth Factor，简称EGF)都含有53个氨基酸， 三对分子内二硫键。EGF是一种多功能细胞生长因子，EGF可以促进细胞有丝分裂以及糖、 蛋白质、DNA、RNA合成，因此有着广泛的促进上皮细胞分裂增殖的作用，在临床上与很多疾 病，如免疫性皮肤病、创面组织修复及牙周炎等。
[0004] 传统的生物提取和纯化生物活性肽工艺复杂，过程繁琐且产量低。多肽化学合成 法的每一步，都要去掉其副产物，所以随着氨基酸序列的长度越长，多肽的化学合成越繁 杂，副产物越多，纯化复杂，价格越昂贵。利用基因工程技术重组表达这些蛋白或多肽是最 经济有效的方法。由于很多来源于高等生物体内的生物活性肽空间结构复杂，含有很多的 二硫键，或带有很多的表面电荷是的很难直接在原核生物体内表达。探索更好的重组表达 系统来表达和纯化生物活性肽具有巨大的理论价值和经济价值。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于克服现有技术的缺陷，提供一种高效、稳定的生物活性肽的重 组表达及分离纯化技术，通过融合表达技术实现生物活性肽在原核表达系统中的高效重组 表达和快速分离纯化，大大降低了生物活性肽的生产成本。
[0006] 本发明所提供的生物活性肽在原核细胞中的高效率重组表达和纯化方法，包括以 下几个方面： (1)构建重组质粒pHGBl-TEV 提取质粒pET-22b (+)，经限制性内切酶和汉3ΜΠ 双酶切处理，胶回收得到大片 段（pET-22b (+)质粒经双酶切后的线性片段）； 合成His6-GB1-TEV(TEV proteinase酶切位点)DNA编码序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示，蛋白序列如图2所示。
[0007] 用分别带有Mfcl和fe?HI酶切位点的引物PCR扩增His6-GB1-TEV编码DNA片 段，和汉3?HI双酶切处理，胶回收得到小片段(带有限制性内切酶酶切位点的DNA片段 (His 6-GB1-TEV 编码序列））。
[0008] 大片段和小片段按1:5用T4 DNA连接酶连接；将连接产物转化大肠杆菌DH5 α感 受态，经过氨苄青霉素抗性筛选，挑取阳性克隆子，提取质粒并进行限制性内切酶#也1和 汉3?HI双酶切鉴定，通过DNA测序确定得到重组质粒：pHGBl-TEV。
[0009] (2)构建重组质粒 pHGBl-TEV-LL-37 (或 pHGBl-TEV-hEGF 或 pHGBl-TEV-mEGF) 提取重组质粒pHGBl-TEV，经限制性内切酶及I和通〇1酶切，1%琼脂糖凝胶电泳， 胶回收得到大片段（PHGB1-TEV经双酶切后的线性片段)。
[0010] 合成 LL-37 (Gene ID: 820)，hEGF (Gene ID: 1950)及 mEGF (Gene ID: 13645) 基因片段，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 2、SEQ ID NO. 3、SEQ ID NO. 4所示。用分别带有 I和沿ol酶切位点的引物PCR扩增LL-37, hEGF及mEGF基因片段；PCR产物经 I和通οI双酶切处理后和大片段连接；将连接产物转化 大肠杆菌DH5ci感受态，经过氨苄青霉素抗性筛选，挑取阳性克隆子，提取质粒 并进行限制性内切酶I和通〇1双酶切鉴定，通过DNA测序确定得到重组质粒 pHGBl-TEV-LL-37 (或 pHGBl-TEV-hEGF 或 pHGBl-TEV-mEGF) (3) LL-37 (或mEGF或hEGF)的表达和纯化 重组质粒 pHGBl-TEV-LL-37 (或 pHGBl-TEV-hEGF 或 pHGBl-TEV-mEGF)转化到大肠杆菌 JM109感受态中，得到融合表达LL-37 (或mEGF或hEGF)的工程菌株。
[0011] 挑LL-37 (或mEGF或hEGF)的单克隆工程菌株于LB液体培养基中，37°C振荡过夜 培养。将过夜培养物按1 :100比例转接到新的含氨苄青霉素的LB液体培养基中，37°C振荡 培养约3-4小时，待0D6(i(i值0. 6时加入IPTG至终浓度0. 2 mM，22°C诱导过夜。
[0012] 5000 rpm 15分钟离心收菌，弃上清倒置1分钟使残余培养基流尽。用破菌缓冲液 (50 mM NaH2P04,500 mM NaCl，pH8. 0)重悬沉淀，5000 rpm 10分钟离心收菌，弃上清。取 50 mL破菌缓冲液加入到沉淀中并吹打均匀，1 :200加入PMSF(苯甲基磺酰氟)，超声波破菌 15-20分钟，至半透明。细菌破碎液15000 rpm 15分钟离心，取上清。上Ni-NTA柱纯化，样 品缓慢滴下使蛋白更好地与柱子结合。上样完毕，先用破菌缓冲液洗5个柱体积。再用洗 脱缓冲液（50 mM NaH2P04,500 mM NaCl，250 mM咪唑，pH8. 0)洗脱，15%SDS-PAGE检测蛋白 洗脱情况。Ni-NTA洗脱下来了的蛋白用快速蛋白液相色谱（FPLC)进一步纯化。纯化的融 合蛋白，加入TEV酶(带有His 6标签）100 yg混匀4 ° C过夜酶切（ENLYFQ丨G)，酶切 缓冲液为：（50 mM Tris-HCl，0. 5 mM EDTA，lmM DTT，pH 8. 0)酶切产物再缓慢流过Ni-NTA 柱，收集流出的蛋白溶液即为切下的没有His6标签的LL-37 (或mEGF或hEGF)。
[0013] 其中，步骤（3)中所述TEV特异性切割酶由以下方法制备得到： 重组表达质粒pET-28b-TEV protease (本实验室保存）转化到大肠杆菌JM109感受态 中，得到表达TEV protease的工程菌株。挑取单克隆于10mL含卡那霉素的LB液体培养基 中，37°C振荡过夜培养。将过夜培养物按1 :100比例转接到新的1L含卡那霉素的LB液体 培养基中，37°C振荡培养约3-4小时，待0D6(i(i值0. 6时加入IPTG至终浓度0. 2 mM，22°C诱 导过夜。
[0014] 5000 rpm 15分钟离心收菌，弃上清倒置1分钟使残余培养基流尽。用破菌缓冲液 (50 mM NaH2P04,500 mM NaCl，pH8. 0)重悬沉淀，5000 rpm 10分钟离心收菌，弃上清。取 50 ml破菌缓冲液加入到沉淀中并吹打均匀，1 :200加入PMSF(苯甲基磺酰氟)，超声波破菌 15-20分钟，至半透明。细菌破碎液15000 rpm离心15分钟，取上清。上Ni-NTA柱纯化，样 品缓慢滴下使蛋白更好地与柱子结合。上样完毕，先用破菌缓冲液洗5个柱体积，再用洗脱 缓冲液（50 mM NaH2P04,500 mM NaCl，250 mM 咪唑，pH8. 0)洗脱，15% SDS-PAGE 检测蛋白 洗脱情况。Ni-NTA洗脱下来了的蛋白用快速蛋白液相色谱（FPLC)进一步纯化。
[0015] 本发明的有益效果： 本发明采用现代生物技术，构建了原核重组表达载体PHGB1-TEV，在此基础上克隆表达 LL-37, mEGF，hEGF等生物活性肽。该融合表达技术中，融合的GB1结构域能大大提高重组 蛋白的表达量和水溶性，His6#签方便纯化，TEV蛋白酶酶切位点的引入使得这些融合表 达的序列很方便的被切除。采用本发明来生产生物活性肽快速高效，成本低，产量高，活性 高，具有非常广阔的市场前景。
【专利附图】
【附图说明】
[0016] 图1为PCR扩增His6-GB1-TEV编码序列结果图，图中，左边泳道为分子量marker， 右边泳道为His6-GB1-TEV编码序列。
[0017] 图2为His6-GB1_TEV编码序列的蛋白序列示意图，图中中间序列部分为GB1编 码序列，前后序列分别为His 6及TEV酶识别位点的编码序列。
[0018] 图3为重组质粒pHGBl-TEV的构建图谱。
[0019] 图4为重组质粒pHGBl-TEV-LL-37的构建图谱。
【具体实施方式】
[0020] 以下通过实施例对本发明进行具体描述或作进一步说明，其目的在于更好的理解 本发明的技术内涵，但是本发明的保护范围不限于以下的实施范围。
[0021] 实施例1 :构建重组表达载体：pHGBl-TEV (1)试验材料 质粒和菌株：质粒pET_22b (+)和大肠杆菌DH5 α分别购自Novagen和Takara生物 科技有限公司。
[0022] 试剂：限制性内切酶I和feMlI，卡那霉素购自NEB公司。
[0023] 基因片段：His6-GB1_TEV编码DNA序列及引物由上海生工合成。
[0024] (2)实施方案 A.质粒pET-22b (+)的酶切： 大量提取质粒pET-22b (+)，纯化后加入限制性内切酶I和置37°C酶切3 小时，酶切产物1%琼脂糖凝胶电泳，切胶回收得到大片段（pET-22b (+)质粒经双酶切后的 线性片段)。
[0025] B. His6-GB1_TEV编码序列酶切片段的获得： 以合成的His6-GB1-TEV编码序列（如SEQ ID NO. 1所示）为模板，设计分别带有 I和酶切位点的正反向引物。PCR扩增后(扩增结果见图1所示，左边泳道为分子 量marker，右边泳道为His6-GB1-TEV编码序列，如箭头所示，片段长度为201bp。）再用 I和汉3?HI双酶切处理，胶回收得到小片段(带有限制性内切酶酶切位点的DNA片段 (His6-GB1 -TEV编码序列））待用。
[0026] 引物序列如下：下划线位置为酶切位点。
[0027] 正向引物 F (Mfe I): CGGGTTAACCATATGCACCATCATCATCATCACCA 反向引物 R UaMH) ：GTTGGATCCCTGGAAATACAGATTTTCTT C.重组质粒pHGBl-TEV的构建： 大片段和小片段按1:5用T4 DNA连接酶连接；将连接产物转化大肠杆菌DH5a感 受态，经过氨苄霉素抗性筛选，挑取阳性克隆子，提取质粒并进行限制性内切酶I和 汉3?HI双酶切鉴定，通过DNA测序确定得到重组质粒：pHGBl-TEV。
[0028] 重组质粒pHGBl-TEV的构建图谱见图3。
[0029] 实施例 2 :重组质粒 pHGBl-TEV-LL-37 (或 pHGBl-TEV-hEGF 或 pHGBl-TEV-mEGF) 的构建 (1)试验材料 质粒和菌株：大肠杆菌DH5 a购自Takara生物科技有限公司。
[0030] 试剂：限制性内切酶I和通ο I，卡那霉素购自NEB公司。
[0031] 基因片段：LL-37 (或 hEGF 或 mEGF)编码 DNA 序列（如 SEQ ID NO. 2、SEQ ID N0. 3、 SEQ ID NO. 4所示）及引物由上海生工合成。
[0032] (2)实施方案 A.质粒pHGBl-TEV的酶切 大量提取质粒pHGBl-TEV，纯化后加入限制性内切酶及I和通ο I置于37°C酶切3 小时，酶切产物1%琼脂糖凝胶电泳，切胶回收得到大片段（pHGBl-TEV经双酶切后的线性片 段)。
[0033] B. LL-37 (或hEGF或mEGF)基因酶切片段的获得 合成 LL-37 (Gene ID: 820)，hEGF (Gene ID: 1950)及 mEGF (Gene ID: 13645)基因 片段，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 2、SEQ ID NO. 3、SEQ ID NO. 4所示。
[0034] 分别以合成的LL-37 (或hEGF或mEGF)编码序列为模板，设计分别带有汉I和 沿〇 I酶切位点的正反向引物。PCR扩增后再用I和沿ο I双酶切处理，胶回收得到 小片段待用。
[0035] 扩增LL-37的引物序列： 正向引物 F UasHI) ：GTTGGATCCCTGCTGGGTGATTTCTTC 反向引物 R (通〇 I) : CCGCTCGAGCTAGGACTCTGTCCTGGGTA 扩增hEGF的引物序列： 正向引物 F UasHI) ：GTTGGATCCAATAGTGACTCTGAATGT 反向引物 R (通〇 I) : CCGCTCGAGCTAGCGCAGTTCCCACCACTT 扩增mEGFF的引物序列： 正向引物 F UasHI) ：GTTGGATCCAATAGTTATCCAGGATGC 反向引物 R (通〇 I) : CCGCTCGAGCTAACGCAGCTCCCACCATCG C.重组质粒 pHGBl-TEV-LL-37 (或 pHGBl-TEV-hEGF 或 pHGBl-TEV-mEGF)的构建 大片段和小片段按1:5用T4 DNA连接酶连接；将连接产物转化大肠杆菌DH5 α感受 态，经过氨苄霉素抗性筛选，挑取阳性克隆子，提取质粒并进行限制性内切酶I和通〇 I双酶切鉴定，通过DNA测序确定得到重组质粒：pHGBl-TEV-LL-37 (或pHGBl-TEV-hEGF或 pHGBl-TEV-mEGF)。
[0036] 重组质粒的构建以pHGBl-TEV - LL-37为例，如图4所示。
[0037] 实施例3 :LL-37 (或hEGF或mEGF)的表达和纯化 (1)试验材料 质粒和菌株：大肠杆菌BL21 (DE3)购自Takara生物科技有限公司。
[0038] 试剂：氨苄青霉素、IPTG购自NEB公司。
[0039] (2)实施方案 A. LL-37 (或hEGF或mEGF)融合蛋白的诱导表达 重组质粒 pHGBl-TEV-LL-37 (或 pHGBl-TEV-hEGF 或 pHGBl-TEV-mEGF)转化到大肠杆菌 JM109感受态中，得到融合表达LL-37 (或mEGF或hEGF)工程菌株。
[0040] 挑LL-37 (或hEGF或mEGF)的单克隆工程菌株于LB液体培养基中，37°C振荡过夜 培养。将过夜培养物按1 :1〇〇比例转接到新的1L含氨苄青霉素的LB液体培养基中，37°C 振荡培养约3-4小时，待0D6(KI值0. 6时加入IPTG至终浓度0. 2mM，22°C诱导过夜。
[0041] B. LL-37 (或 hEGF 或 mEGF)的纯化 5000 rpm 15分钟离心收菌，弃上清倒置1分钟使残余培养基流尽。用破菌缓冲液（50 mM NaH2P04,500 mM NaCl，pH8. 0)重悬沉淀，5000 rpm 10分钟离心收菌，弃上清。取50ml 破菌缓冲液加入到沉淀中并吹打均匀，1 :200加入PMSF(苯甲基磺酰氟)，超声波破菌15-20 分钟，至半透明。细菌破碎液15000 rpm 15分钟离心，取上清。上Ni-NTA柱纯化，样品缓 慢滴下使蛋白更好地与柱子结合。上样完毕，先用破菌缓冲液洗5个柱体积。
[0042] 再用洗脱缓冲液（50 mM NaH2P04,500 mM NaCl，250 mM 咪唑，ρΗ8·0)洗脱，15% SDS-PAGE检测蛋白洗脱情况。Ni-NTA洗脱下来了的蛋白用快速蛋白液相色谱（FPLC)进 一步纯化。纯化的融合蛋白，加入TEV酶(带有His tag) 100 μ g混匀4° C过夜酶切 (ENLYFQ 丨 G),酶切缓冲液为：（50 mM Tris-HCl，0.5 mM EDTA，1 mM DTT，pH 8.0))酶切 产物再缓慢流过Ni-NTA柱，收集流出的蛋白溶液即为酶切下的没有His标签的LL-37 (或 hEGF 或 mEGF)。
[0043] 实施例4 :MTT法测定纯化后的hEGF或mEGF蛋白的活性 (1)试验材料 细胞：小鼠胚胎成纤维细胞（Balb/C 3T3细胞）购自ATCC。
[0044] 试剂： RPMI 1640培养基1000 mL加青霉素105IU和链霉素105IU，再加 NaHC03 2. lg，溶解后，混匀，除菌过滤，4° C保存；取胎牛血清（FBS) 4mL加入lOOOmLRPMI 1640培养基得到维持培养液；取胎牛血清（FBS) 100 mL加入1000 mLRPMI 1640培养基得 到完全培养液；PBS:称 NaCl 8 g，KCl 0.2 g，Na2HP03 L44 g，KH2P03 0 . 24 g，加水至 1000 mL，12Γ C灭菌15分钟；噻唑蓝（MTT)溶液：取MTT粉末0. lg加 PBS 20mL溶解，经0. 22 μ m滤膜过滤除菌，4° C避光保存。
[0045] (2) 实施方案 A. 取重组人表皮生长因子标准品按说明书复溶后，用维持培养液稀释至每lmL含50 IU。在96孔细胞培养板中，做4倍系列稀释，共8个稀释度，每个浓度做2个控。无菌操 作； B. 取样品复溶后，用维持培养液稀释。在96孔细胞培养板中，做4倍系列稀释，共8 个稀释度，每个浓度做2个控。无菌操作； C. Balb/c 3T3细胞株用完全培养液于37° C，5% C02培养，控制细胞浓度为每1 mL含 1.0X 105-5. 0X 105个细胞，传代后24-36 h用于生物活性测定。弃去培养瓶中的培养液， 消化和收集细胞，用完全培养液配成每1 mL含5. 0 X 104-8. 0 X 104个细胞的细胞悬液，接种 于96孔细胞培养板中，每孔100 yL。在37° C，5% 0)2培养培养15-24h。制备的细胞培 养板弃去维持液，加入标准品溶液和样品溶液，每孔100 μ L。于37° C，5% C02培养60-72 h。每孔加入MTT溶液20 yL，于37° C，5% 0)2培养2-8 11。以上操作在无菌条件下进行。 弃去培养液中的液体后，向每孔中加入二甲基亚砜（DMS0) 100 μ L，混匀后在酶标仪上，以 630 nm为参比波长，于波长570 nm处测定吸光度，记录测定结果。
[0046] Balb/C 3T3细胞的活性测定实验显示与标准品相比hEGF样品具有较高生物学活 性，检测到hEGF及mEGF样品的活性分别为3X 105 U/mg及3. 5X 105 U/mg。
[0047] 实施例5 :LL_37的抗菌活性实验 (1)试验材料 细胞：伤寒沙门菌s. typhi，由本实验室保存。
[0048] 试剂：普通LB液体培养基，抗菌肽LL-37,多粘菌素（PxB)。
[0049] (2)实施方案 从LB平板上挑取伤寒沙门菌野生株单菌落于2 mL LB液体培养基中，37°C振摇过夜， 然后以1:100的比例分别转接入20 mL LB液体培养基，加了抗菌肽LL-37(终浓度50 μ g/ mL)以及加了同样浓度多粘菌素（PxB)的20 mL LB液体培养基。37°C振摇培养，每隔1 h 测定各自的〇D6(?，绘制生长曲线图。结果表明用该方法表达纯化的LL-37具有比多粘菌素 (PxB)更高的抑制细菌生长(抗菌）活性。
【权利要求】
1. 一种重组质粒pHGBl-TEV，其特征在于，所述质粒由原始质粒pET-22b (+)和 His6-GB1-TEV DNA编码序列组成。
2. -种重组质粒pHGBl-TEV-LL-37,其特征在于，所述质粒由权利要求1所述的重组质 粒pHGBl-TEV和LL-37基因的核苷酸序列组成，用于抗菌肽LL-37的表达。
3. -种重组质粒pHGBl-TEV-hEGF，其特征在于，所述质粒由权利要求1所述的重组质 粒pHGBl-TEV和hEGF基因的核苷酸序列组成，用于hEGF的表达。
4. 一种重组质粒pHGBl-TEV-mEGF，其特征在于，所述质粒由权利要求1所述的重组质 粒pHGBl-TEV和mEGF基因的核苷酸序列组成，用于mEGF的表达。
5. -种包括如权利要求2所述的重组质粒的重组工程菌。
6. -种包括如权利要求3所述的重组质粒的重组工程菌。
7. -种包括如权利要求4所述的重组质粒的重组工程菌。
8. 生物活性肽在原核细胞中的纯化方法，其特征在于，在纯化过程中，加入了带有His6 标签的TEV酶，所述纯化方法具体操作如下： 挑取如权利要求5或权利要求6或权利要求7所述的重组工程菌株于LB液体培养基 中， 振荡过夜培养；将过夜培养物转接到新的含氨苄青霉素的LB液体培养基中，37°C振荡 培养约3-4小时，待0D_值0. 6时加入IPTG至终浓度0. 2 mM，22°C诱导过夜离心收菌，弃上 清倒置使残余培养基流尽；用破菌缓冲液重悬沉淀，离心收菌，弃上清；取破菌缓冲液加入 到沉淀中并吹打均匀，1 :200加入苯甲基磺酰氟，超声波破菌至半透明；细菌破碎液离心， 取上清；上Ni-NTA柱纯化，样品缓慢滴下使蛋白更好地与柱子结合；上样完毕后，先用破菌 缓冲液洗柱体积，再用洗脱缓冲液洗脱，15% SDS-PAGE检测蛋白洗脱情况；Ni-NTA洗脱下 来了的蛋白用快速蛋白液相色谱FPLC进一步纯化；纯化的融合蛋白，加入带有His 6标签的 TEV酶混匀4 ° C过夜酶切，酶切产物再缓慢流过Ni-NTA柱，收集流出的蛋白溶液即为切 下的没有His6标签的LL-37或mEGF或hEGF。
【文档编号】C07K14/485GK104195157SQ201410410942
【公开日】2014年12月10日 申请日期:2014年8月20日 优先权日:2014年8月20日
【发明者】郑学明, 黄新祥 申请人:江苏大学