一种从蛋壳膜中提取生物活性物质的方法
【专利摘要】本发明公开了一种从蛋壳膜中提取生物活性物质的方法，包括蛋壳膜的分离、粉碎、酶解和生物活性物质的提取，酶解前，对蛋壳膜粉用离子液体进行处理；所述离子液体为1-羟乙基-3-甲基咪唑四氟硼酸盐。该方法既可实现酶解效率的提高，以及角蛋白、透明质酸和硫酸软骨素的联合分离提取，还能够简化生物活性物质的提取方法，满足环保要求。
【专利说明】一种从蛋壳膜中提取生物活性物质的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及禽蛋加工利用【技术领域】，尤其涉及一种从蛋壳膜中提取生物活性物质的方法。
【背景技术】
[0002]蛋壳膜(俗称凤凰衣)是位于蛋壳与蛋清之间的纤维状薄膜，约占蛋壳重的4?5%，它含有约90%的蛋白质、3%的脂质体和2%的糖类。蛋壳I吴的蛋白质有角蛋白、股原蛋白、唾液酸糖蛋白、卵清蛋白、溶解酵素、叶啉蛋白等。蛋壳膜中还含有N-乙酰氨基葡萄糖半乳糖、葡萄糖醛酸、透明质酸、硫酸软骨素等生物活性物质。这些成分对人体有着重要的生理作用，是食品、化妆品、药品、化工等行业的宝贵原料。
[0003]我国是世界第一产蛋大国，2013年我国禽蛋产量2876万吨，按蛋壳重占蛋重的
11%计算，我国每年产出316万吨蛋壳，14万吨蛋壳膜。而目前我国蛋壳加工利用程度却很低，主要作为废弃物抛弃，这不仅污染环境，也造成蛋壳及蛋壳膜资源的浪费。随着我国现代蛋制品加工业的发展，将在很大程度上改变蛋壳来源分散、不易收集、污染严重的现状，为蛋壳及蛋壳膜资源的利用创造条件。但蛋壳膜主要由角蛋白构成，它是硬蛋白，分子链间和链内含较高密度的二硫键，从而使分子结构紧密，在自然条件下性质非常稳定，不溶于水和多种溶剂，因而极大地限制了其开发利用。因此，进行蛋壳膜蛋白的水解是开展蛋壳膜应用的重要基础。
[0004]目前，有关蛋壳膜水解的方法主要有物理法、化学法及酶法。物理法一般都是应用加热(100?200°C )、加压(0.294?0.298MPa)的方法使角蛋白内部的双硫键被断裂水解，从而使它变为可溶、易消化的多肽混合物。化学水解法主要包括酸碱处理法、还原法和氧化法。酸碱处理法先用酸预处理来溶胀角蛋白，然后在一定的温度和碱浓度下溶解角蛋白；氧化法是用氧化剂(如过氧乙酸、卤素、双氧水等)将角蛋白中的双硫键部分氧化成磺酸基团，部分氧化后的角蛋白可用浓硫酸或甲酸酸化，制得角蛋白溶液；还原法是用巯基化合物作用于双硫键，随后向溶液中加入一定量的尿素以使角蛋白溶胀，再离心分离得到角蛋白溶液。酶解法是通过选用合适的蛋白酶，水解蛋白质的多肽链，使其成为角蛋白溶液。物理和化学水解法虽然工艺简单，但难以控制水解程度，参与水解反应的酸、碱浓度高，水解后必须除酸或除碱，工艺较为复杂、麻烦，而且，酸碱化学物质性质较烈，水解出的多肽，结构和功能会遭到破坏，营养价值和功能特性大大降低。采用蛋白酶进行蛋壳膜的酶解，其优点在于反应的温度和PH比较温和，过程易于控制，酶解产物稳定，保留了更多的营养价值和功能特性，是环境友好型的资源化、清洁化工艺技术，但蛋壳膜酶解不但耗时长，且水解率很低，难以满足工业化生产的要求，因而如何提高蛋壳膜酶解的效率是目前蛋壳膜加工利用需要解决的关键技术问题。
[0005]近年来，国内在禽蛋深加工技术方面的研究比较活跃，从蛋壳膜中分离提取角蛋白、透明质酸和硫酸软骨素等生物活性物质的技术研究也有报道，但多是单一产品的提取技术研究，多个产品联合分离提取的技术还未有报道。若从蛋壳膜中仅提取单种生物活性物质，势必造成其它生物活性物质的严重浪费。所以，对蛋壳膜中的多种生物活性物质如何高效地进行联产分离提取，是目前研究的新课题。
[0006]在《使用了酶的蛋壳膜的溶解方法》(申请号:201180040001.3)的专利文献中，提供了将蛋白质分解酶和还原剂联用的方法，能够使蛋壳膜极其有效率地溶解。我们用这种方法来溶解蛋壳膜进行生物活性物质分离提取的尝试，发现还存在一些问题:①还原剂将角蛋白分子中的二硫键还原成巯基，才利于角蛋白的酶解，而巯基性质非常活泼，极易被氧化又重新生成二硫键，需使用十二烷基磺酸钠等表面活性剂作保护剂，常用的巯基化合物等有机还原剂还需使用尿素才可使角蛋白溶胀而溶于水，因此，要分离提取角蛋白，在蛋壳膜酶解时需添加较多的助剂，这在后续的生物活性物质分离提纯时，再脱除这些助剂就非常麻烦。②透明质酸等生物活性物质的分子结构易受还原剂作用而破坏。③含大量助剂的废水需进行排污处理，否则会污染环境。因此，该方法虽已达到蛋壳膜溶解的高效，但未能达到较好地保护生物活性物质的活性和环境友好型的要求。
[0007]因此，如何既能够实现蛋壳膜的高效酶解，实现角蛋白、透明质酸和硫酸软骨素的联合分离提取，又能简化生物活性物质提取方法、满足环境友好型的要求，是本领域的一个重要研究方向。
【发明内容】
[0008]本发明提供了一种从蛋壳膜中提取生物活性物质的方法，在于解决现有酶法提取酶解效率低、不能实现对多种活性物质联合提取的问题。
[0009]本发明的具体实施方案如下:
[0010]一种从蛋壳膜中提取生物活性物质的方法，包括蛋壳膜的分离、粉碎、酶解和生物活性物质的提取，酶解前，对蛋壳膜粉用离子液体进行处理；
[0011]所述离子液体为1-羟乙基-3-甲基咪唑四氟硼酸盐。
[0012]利用上述离子液体的还原性将蛋壳膜主要成分角蛋白分子链间的双硫键还原成巯基，打开双硫键，使角蛋白空间结构被破坏，利于蛋白酶的催化水解，提高酶解效率。离子液体仅作用于蛋白分子链间的双硫键，且比较温和，对蛋白肽链和其它生物活性物质破坏极少，又容易分离回收重复使用。
[0013]所述蛋壳膜的分离包括:清洗蛋壳，将蛋壳破裂成Imm的小片，用酸溶解蛋壳，并过滤分离出蛋壳膜。该蛋壳膜分离方法为常规方法。
[0014]所述蛋壳膜的粉碎包括:清洗分离得到的蛋壳膜，烘干后，粉碎成蛋壳膜细粉。为使蛋壳膜与离子液体充分接触，提高酶解效果，作为优选，所述蛋壳膜细粉为100目。
[0015]所述离子液体处理蛋壳膜粉为:将蛋壳膜粉与离子液体混合，充分接触反应一段时间，分离蛋壳膜粉，清洗后即处理完成。
[0016]作为优选，蛋壳膜粉与离子液体的重量比为1: 20?50。
[0017]反应温度控制在75?95°C，反应时间控制在3?6h。
[0018]清洗蛋壳膜粉可以选择能够溶解离子液体且容易去除的有机溶剂，如乙醇等。
[0019]蛋壳膜粉用离子液体处理完后，回收所述离子液体，处理液中的离子液体可以通过过滤回收。清洗获得的残留离子液体可以通过加热方式除去有机溶剂而得到回收。
[0020]所述酶解为二步法,第一步用碱性蛋白酶酶解,第二步用胰蛋白酶酶解。酶解的温度为55°C，pH值为7。
[0021]常规的蛋壳膜酶水解过程中常采用一种蛋白酶进行水解，本发明采用两者蛋白酶先后水解蛋壳膜，可以在碱性蛋白酶作用下先水解蛋白质羧基侧具有芳香族或疏水性氨基酸(如酪氨酸、苯丙氨酸、丙氨酸等)，再在胰蛋白酶作用下后水解精氨酸或赖氨酸羧基，利用两种酶的作用位点不同，使酶作用位点增加，而提高蛋白质的水解度。
[0022]作为优选，所述碱性蛋白酶的用量为1.1?1.5万单位/g蛋壳膜，所述胰蛋白酶的用量为3.8?4.4万单位/g蛋壳膜。该用量下的蛋白酶可充分水解蛋壳膜，并提高水解物中生物活性物质的含量。
[0023]所述生物活性物质为透明质酸、硫酸软骨素和角蛋白。
[0024]所述生物活性物质的提取过程包括:将蛋壳膜酶解液除渣、浓缩后，加入十六烷基吡啶进行沉淀，分离得到透明质酸和硫酸软骨素的混合物；调节上清液等电点，沉淀分离得到角蛋白。
[0025]所述混合物加入盐溶液，通过溶解度不相同，可以将透明质酸和硫酸软骨素分离，所述盐溶液可以是氯化钠溶液。
[0026]与现有技术相比，本发明的有益效果如下:
[0027]1、本发明采用离子液体预处理蛋壳膜，大大提高了蛋壳膜酶水解的效率，使蛋壳膜水解物中的营养价值得到充分保留，同时，又避免了除酸碱和脱助剂等过程，能满足环境友好型的生产要求。
[0028]2、本发明提供的从蛋壳膜中提取生物活性物质的方法，通过角蛋白、透明质酸和硫酸软骨素的联产分离提取，形成了多种生物活性物质的高效联产分离提取技术，使蛋壳膜的宝贵资源得到充分利用。
[0029]3、本发明采用绿色离子液体代替还原剂处理蛋壳膜，无需添加助剂，蛋壳膜处理后又极易将离子液体分离而可重复使用，既简化生物活性物质分离提纯的工艺，又降低生产成本，真正建立了高效、高质和绿色、清洁的蛋壳膜的酶解催化体系。
【具体实施方式】
[0030]下面结合具体实施例对本发明作进一步阐释。
[0031]实施例1
[0032]1、蛋壳膜分离
[0033]取2kg鸭蛋壳，用自来水洗净，浙干水分，再用粉碎机将蛋壳碎裂成Imm左右的小片。加8kg0.80mol/L的盐酸溶液,在常温下搅拌60min,然后过筛分离出蛋壳膜,约可得蛋壳膜100g。
[0034]2、蛋壳膜粉碎
[0035]分离出的蛋壳膜用清水洗涤，除去残留的酸液，再浙干水分，于55°C恒温干燥8h左右，然后用万能粉碎机将蛋壳膜粉碎成100目左右细粉。
[0036]3、蛋壳膜离子液体处理
[0037]10g蛋壳膜粉加5kgl_羟乙基-3-甲基咪唑四氟硼酸盐离子液体，在85°C下，搅拌处理4.5h，然后过筛分离出蛋壳膜，再用乙醇冲洗除去残留的离子液体。离子液体处理蛋壳膜后，用120目筛子过滤分离，过滤得到的离子液体可直接重复使用。将用乙醇从残留在蛋壳膜上冲洗下来的离子液体加热至90°C，除去乙醇后，可重复使用。
[0038]4、蛋壳膜酶水解
[0039]经离子液体处理的蛋壳膜，加1.5kg的水，升温至55°C，调pH至7，先加碱性蛋白酶1.5万单位/g，搅拌水解6小时，后再加胰蛋白酶4.4万单位/g，再搅拌水解8小时，制得蛋壳膜水解液。
[0040]5、粘多糖提取
[0041]蛋壳膜水解液先用120目筛子过滤，再用离心机以4000r/min离心10分钟，除去残渣后，将其浓缩至原体积的1/8，然后加氯化十六烷基吡啶(CPC) I%，搅拌均匀后室温静置lh，离心分离分別收集上清液和沉淀物。沉淀物为粘多糖复合物，约可得粘多糖复合物3g。
[0042]6、粘多糖分离
[0043]粘多糖复合物加100倍的0.4M氯化钠溶液，搅拌均匀后室温静置I?2h，离心分离分別收集上清液和沉淀物。上清液加2倍体积的95%乙醇，搅拌均匀后，在室温下静置12h，离心收集沉淀，然后用无水乙醇洗涤3?5次，冷冻干燥，制得透明质酸，约可得透明质酸 1.3g。
[0044]沉淀物加100倍的2.5M氯化钠溶液，搅拌均匀后室温静置2h，离心分离收集上清液。在上清液中加入乙醇，使乙醇体积分数达到70%，在室温下静置12h，再离心收集沉淀，然后用无水乙醇洗涤3?5次，置60?65°C的真空干燥箱中干燥，制得硫酸软骨素，约可得硫酸软骨素1.5g。
[0045]7、角蛋白提取
[0046]在步骤5粘多糖提取的上清液中，加盐酸调pH值，达到角蛋白的等电点4.6?4.7，静置2?5h，使角蛋白沉淀，然后离心收集沉淀，置60?65°C的真空干燥箱中干燥，制得角蛋白，约可得角蛋白38g。
[0047]实施例2
[0048]1、蛋壳膜分离
[0049]取3kg鸡蛋壳，用自来水洗净，浙干水分，再用粉碎机将蛋壳碎裂成Imm左右的小片。加6kg0.60mol/L的盐酸溶液,在常温下搅拌40min,然后过筛分离出蛋壳膜,可得蛋壳膜 120g。
[0050]2、蛋壳膜粉碎
[0051]分离出的蛋壳膜用清水洗涤，除去残留的酸液，再浙干水分，于55°C恒温干燥8h左右，然后用万能粉碎机将蛋壳膜粉碎成100目左右细粉。
[0052]3、蛋壳膜离子液体处理
[0053]取10g蛋壳膜粉加2kg的1-羟乙基-3-甲基咪唑四氟硼酸盐离子液体，在75°C下，搅拌处理6h，然后过筛分离出蛋壳膜，再用乙醇冲洗除去残留的离子液体。离子液体处理蛋壳膜后，用120目筛子过滤分离，过滤得到的离子液体可直接重复使用。将用乙醇从残留在蛋壳膜上冲洗下来的离子液体加热至90°C，除去乙醇后，可重复使用。
[0054]4、蛋壳膜酶水解
[0055]经离子液体处理的蛋壳膜,加入1.5kg水,升温至55°C,调pH至7,先加碱性蛋白酶1.1万单位/g，搅拌水解6小时，后再加胰蛋白酶3.8万单位/g，再搅拌水解8小时，制得蛋壳膜水解液。
[0056]5、粘多糖提取
[0057]蛋壳膜水解液先用120目筛子过滤，再用离心机以4000r/min离心10分钟，除去残渣后，将其浓缩至原体积的1/8，然后加氯化十六烷基吡啶(CPC) I%，搅拌均匀后室温静置I?2h，离心分离分別收集上清液和沉淀物。沉淀物为粘多糖复合物，可得粘多糖复合物
3.2g0
[0058]6、粘多糖分离
[0059]粘多糖复合物加100倍的0.4M氯化钠溶液，搅拌均匀后室温静置I?2h，离心分离分別收集上清液和沉淀物。上清液加2倍体积的95%乙醇，搅拌均匀后，在室温下静置12h，离心收集沉淀，然后用无水乙醇洗涤3?5次，冷冻干燥，制得透明质酸，可得透明质酸
1.5g。
[0060]沉淀物加100倍的2.5M氯化钠溶液，搅拌均匀后室温静置I?2h，离心分离收集上清液。在上清液中加入乙醇，使乙醇体积分数达到60%，在室温下静置12h，再离心收集沉淀，然后用无水乙醇洗涤3?5次，置60?65°C的真空干燥箱中干燥，制得硫酸软骨素，约可得硫酸软骨素1.4g。
[0061]7、角蛋白提取
[0062]在步骤5粘多糖提取的上清液中，加盐酸调pH值，达到角蛋白的等电点4.6?
4.7，静置2?5h，使角蛋白沉淀，然后离心收集沉淀，置60?65°C的真空干燥箱中干燥，制得角蛋白，可得角蛋白32g。
[0063]实施例3
[0064]1、蛋壳膜分离
[0065]取2kg鸭蛋壳，用自来水洗净，浙干水分，再用粉碎机将蛋壳碎裂成Imm左右的小片。加6kg0.70mol/L的盐酸溶液,在常温下搅拌80min,然后过筛分离出蛋壳膜,可得蛋壳膜 10go
[0066]2、蛋壳膜粉碎
[0067]分离出的蛋壳膜用清水洗涤，除去残留的酸液，再浙干水分，于55°C恒温干燥8h左右，然后用万能粉碎机将蛋壳膜粉碎成100目左右细粉。
[0068]3、蛋壳膜离子液体处理
[0069]10g蛋壳膜粉加3.5kg的1_轻乙基_3_甲基咪唑四氟硼酸盐,在95°C下,搅拌处理3h，然后过筛分离出蛋壳膜，再用乙醇冲洗除去残留的离子液体。离子液体处理蛋壳膜后，用120目筛子过滤分离，过滤得到的离子液体可直接重复使用。将用乙醇从残留在蛋壳膜上冲洗下来的离子液体加热至90°C，除去乙醇后，可重复使用。
[0070]4、蛋壳膜酶水解
[0071]经离子液体处理的蛋壳膜，加1.5kg的水，升温至55°C，调pH至7，先加碱性蛋白酶1.5万单位/g，搅拌水解6小时，后再加胰蛋白酶4.4万单位/g，再搅拌水解8小时，制得蛋壳膜水解液。
[0072]5、粘多糖提取
[0073]蛋壳膜水解液先用120目筛子过滤，再用离心机以4000r/min离心10分钟，除去残渣后，将其浓缩至原体积的1/8，然后加氯化十六烷基吡啶(CPC) I%，搅拌均匀后室温静置I?2h，离心分离分別收集上清液和沉淀物。沉淀物为粘多糖复合物，可得粘多糖复合物
2.8g0
[0074]6、粘多糖分离
[0075]粘多糖复合物加100倍的0.4M氯化钠溶液，搅拌均匀后室温静置I?2h，离心分离分別收集上清液和沉淀物。上清液加2倍体积的95%乙醇，搅拌均匀后，在室温下静置12h，离心收集沉淀，然后用无水乙醇洗涤3?5次，冷冻干燥，制得透明质酸，可得1.2g。
[0076]沉淀物加100倍的2.5M氯化钠溶液，搅拌均匀后室温静置I?2h，离心分离收集上清液。在上清液中加入乙醇，使乙醇体积分数达到65%，在室温下静置12h，再离心收集沉淀，然后用无水乙醇洗涤3?5次，置60?65°C的真空干燥箱中干燥，制得硫酸软骨素，可得硫酸软骨素1.4g。
[0077]7、角蛋白提取
[0078]在步骤5粘多糖提取的上清液中，加盐酸调pH值，达到角蛋白的等电点4.6?4.7，静置2?5h，使角蛋白沉淀，然后离心收集沉淀，置60?65°C的真空干燥箱中干燥，制得角蛋白，可得角蛋白35g。
[0079]对比例I
[0080]本实施例是将本发明所述离子液体与申请号为201180040001.3的专利文献中所述的还原剂进行比较，分析还原剂与离子液体处理蛋壳膜对粘多糖提取率的影响。
[0081]实验内容和结果如下:
[0082]选择硫代硫酸钠、3-巯基丙酸、硫化钠和亚硫酸钠等常用的还原剂与1-羟乙基-3-甲基咪唑四氟硼酸盐离子液体分别处理鸭蛋壳膜，还原剂添加量为蛋壳膜的80%(w/w)，液比为20，离子液体添加量为蛋壳膜的20倍，均在75°C下处理4h，处理后再用胰蛋白酶水解，酶用量为5万单位/g，在其最佳温度和pH下水解4h后，取水解液测定粘多糖含量。
[0083]蛋壳膜中的粘多糖主要是硫酸软骨素和透明质酸，两者都由重复二糖单位组成的多糖，且二糖中都有D-葡萄糖醛酸，所以，通过测定葡萄糖醛酸的含量即得出粘多糖的含量，葡萄糖醛酸含量采用Bitter-Muir咔唑法测定。测定表明采用硫代硫酸钠、3-巯基丙酸、硫化钠和亚硫酸钠与1-羟乙基-3-甲基咪唑四氟硼酸盐离子液体处理蛋壳膜的葡萄糖醒酸提取率分别为 0.5mg/g、0.62mg/g、2.715mg/g、0.25mg/g 和 4.366mg/g。
[0084]对提取率较高的硫化钠和1-羟乙基-3-甲基咪唑四氟硼酸盐离子液体分别进行工艺优化。通过硫化钠用量、SDS用量、氨水与水的比例、液比和反应时间的单因子试验后，再进行正交试验，得出硫化钠处理蛋壳膜的优选条件为硫化钠用量为蛋壳膜的85%，SDS用量为蛋壳膜的25%，氨水与水比2: 1，液比25，反应时间3h，以此优选条件验证的蛋壳膜中葡萄糖醛酸提取率平均值为4.868mg/g。通过离子液体用量、温度和时间的单因子试验后，再进行正交试验，得出1-羟乙基-3-甲基咪唑四氟硼酸盐离子液体处理蛋壳膜的优选条件为蛋壳膜粉与离子液体的重量比为1: 20?50，搅拌时的温度为75?95°C，搅拌时间为3?6h，以此优选条件验证的蛋壳膜中葡萄糖醛酸提取率平均值为4.697mg/g。对比结果表明采用离子液处理蛋壳膜，其葡萄糖醛酸提取率与硫化钠处理蛋壳膜相当，没有显著差异，完全可以替代还原剂来处理蛋壳膜，以解决使用还原剂处理蛋壳膜存在的问题。
[0085]对比例2
[0086]本实施例是将羊毛和羽毛溶解所用1-羟乙基-3-甲基咪唑双三氟甲磺酰亚胺盐离子液体处理蛋壳膜，与本发明所述离子液体的处理效果进行比较。
[0087]1、蛋壳膜分离
[0088]取6kg鸭蛋壳，用自来水洗净，浙干水分，再用粉碎机将蛋壳碎裂成Imm左右的小片。加18kg0.60mol/L的盐酸溶液,在常温下搅拌40min,然后过筛分离出蛋壳膜,可得蛋壳膜 240g。
[0089]2、蛋壳膜粉碎
[0090]分离出的蛋壳膜用清水洗涤，除去残留的酸液，再浙干水分，于55°C恒温干燥8h左右，然后用万能粉碎机将蛋壳膜粉碎成100目左右细粉。
[0091]3、蛋壳膜离子液体处理
[0092]取200g蛋壳膜粉分成A和B两组，每组100g，分别加2kg的1-羟乙基_3_甲基咪唑双三氟甲磺酰亚胺盐离子液体和5kg的1-羟乙基-3-甲基咪唑双三氟甲磺酰亚胺盐离子液体，分别在75°C和95°C下，搅拌处理6h，然后过筛分离出蛋壳膜，再用乙醇冲洗除去残留的离子液体。
[0093]4、蛋壳膜酶水解
[0094]经离子液体处理的两组蛋壳膜，都分别加入1.5kg 7jC,升温至55°C，调pH至7，先加碱性蛋白酶1.1万单位/g，搅拌水解6小时，后再加胰蛋白酶3.8万单位/g，再搅拌水解8小时，制得蛋壳膜水解液。
[0095]5、粘多糖提取
[0096]两组蛋壳膜水解液分别用120目筛子过滤，再用离心机以4000r/min离心10分钟，除去残渣后，将其浓缩至原体积的1/8，然后分别加氯化十六烷基吡啶(CPC) I %，搅拌均匀后室温静置I?2h，离心分离分別收集上清液和沉淀物。沉淀物为粘多糖复合物，A组可得粘多糖复合物2.5g，B组可得粘多糖复合物2.6g。
[0097]6、粘多糖分离
[0098]两组粘多糖复合物分别加100倍的0.4M氯化钠溶液，搅拌均匀后室温静置I?2h，离心分离分別收集上清液和沉淀物。上清液加2倍体积的95%乙醇，搅拌均匀后，在室温下静置12h，离心收集沉淀，然后用无水乙醇洗涤3?5次，冷冻干燥，制得透明质酸，A组可得透明质酸0.9g，B组可得透明质酸0.95g。
[0099]沉淀物加100倍的2.5M氯化钠溶液，搅拌均匀后室温静置I?2h，离心分离收集上清液。在上清液中加入乙醇，使乙醇体积分数达到60%，在室温下静置12h，再离心收集沉淀，然后用无水乙醇洗涤3?5次，置60?65°C的真空干燥箱中干燥，制得硫酸软骨素，A组约可得硫酸软骨素1.6g，B组可得硫酸软骨素1.65g。
[0100]7、角蛋白提取
[0101]在步骤5粘多糖提取的两组上清液中，分别加盐酸调pH值，达到角蛋白的等电点
4.6?4.7，静置2?5h，使角蛋白沉淀，然后离心收集沉淀，置60?65°C的真空干燥箱中干燥，制得角蛋白，A组可得角蛋白28g，B组可得角蛋白30g。
[0102]对比表明同样的鸭蛋壳膜原料，同样的工艺条件，而采用1-羟乙基-3-甲基咪唑双三氟甲磺酰亚胺盐离子液体处理的粘多糖提取率和角蛋白的提取率都比1-羟乙基-3-甲基咪唑四氟硼酸盐离子液体处理的平均低15%和17.14%，因而本发明选取1-羟乙基-3-甲基咪唑四氟硼酸盐离子液体处理蛋壳膜。
【权利要求】
1.一种从蛋壳膜中提取生物活性物质的方法，包括蛋壳膜的分离、粉碎、酶解和生物活性物质的提取，其特征在于，酶解前，对蛋壳膜粉用离子液体进行处理； 所述离子液体为1-羟乙基-3-甲基咪唑四氟硼酸盐。
2.如权利要求1所述的从蛋壳膜中提取生物活性物质的方法，其特征在于，所述离子液体处理蛋壳膜粉为:将蛋壳膜粉与离子液体混合，充分接触反应一段时间，分离蛋壳膜粉，清洗后即处理完成；蛋壳膜粉与离子液体的重量比为1: 20?50。
3.如权利要求2所述的从蛋壳膜中提取生物活性物质的方法，其特征在于，反应温度控制在75?95°C，反应时间控制在3?6h。
4.如权利要求1所述的从蛋壳膜中提取生物活性物质的方法，其特征在于，蛋壳膜粉用离子液体处理完后，回收所述离子液体。
5.如权利要求1所述的从蛋壳膜中提取生物活性物质的方法，其特征在于，所述酶解为二步法，第一步用碱性蛋白酶酶解，第二步用胰蛋白酶酶解。
6.如权利要求5所述的从蛋壳膜中提取生物活性物质的方法，其特征在于，所述碱性蛋白酶的用量为1.1?1.5万单位/g蛋壳膜。
7.如权利要求5所述的从蛋壳膜中提取生物活性物质的方法，其特征在于，所述胰蛋白酶的用量为3.8?4.4万单位/g蛋壳膜。
8.如权利要求1所述的从蛋壳膜中提取生物活性物质的方法，其特征在于，所述生物活性物质为透明质酸、硫酸软骨素和角蛋白。
9.如权利要求8所述的从蛋壳膜中提取生物活性物质的方法，其特征在于，所述生物活性物质的提取过程包括:将蛋壳膜酶解液除渣、浓缩后，加入十六烷基吡啶进行沉淀，分离得到透明质酸和硫酸软骨素的混合物；调节上清液等电点，沉淀分离得到角蛋白。
10.如权利要求9所述的从蛋壳膜中提取生物活性物质的方法，其特征在于，所述混合物加入盐溶液，将透明质酸和硫酸软骨素分离。
【文档编号】C07K1/30GK104292364SQ201410521600
【公开日】2015年1月21日 申请日期:2014年9月30日 优先权日:2014年9月30日
【发明者】陈有亮, 胡徐登 申请人:浙江大学