一种猪瘟病毒阻断elisa抗体检测试剂盒及应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种猪瘟病毒阻断ELISA抗体检测试剂盒及应用，试剂盒包括：利用杆状病毒表达系统及细胞悬浮培养工艺表达出猪瘟病毒E2蛋白，将其纯化后作为包被板抗原，同时作为免疫原，制备出抗猪瘟病毒E2蛋白的单克隆抗体并标记辣根过氧化物酶（杂交瘤细胞株 4A7 CCTCC NO.C2014229），抗原包被板、阳性对照、阴性对照、样品稀释液、洗涤液、显色液A、显色液B、终止液；一种猪瘟病毒阻断ELISA抗体检测试剂盒在检测猪瘟病毒抗体中的应用。试剂盒检测瘟病毒属中除猪瘟病毒以外的其它阳性血清，无交叉反应，特异性强，灵敏度高，检测时间短，重复性好，与进口试剂盒相比，检测符合率达95%以上。CCTCC NO.C20142292014.12.05
【专利说明】-种猪瘟病毒阻断ELISA抗体检测试剂盒及应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及动物疫病检测，具体涉及一种可规模化生产的，检测猪瘟病毒抗体的 酶联免疫试剂盒，同时还涉及一种猪瘟病毒阻断ELISA抗体检测试剂盒在检测猪瘟病毒抗 体中的应用。适用于检测猪血清中的猪瘟病毒抗体水平。
【背景技术】
[0002] 猪瘟（ClassicalSwineFever，CSF)是严重危害养猪业的传染病之一，具有高传 染性和高致病性的特点，给全世界养猪业造成巨大的经济损失，被世界动物卫生组织（OIE) 列为A类16种传染病之一，为必须报告的动物传染病，我国也将其列为一类传染病，是发生 最多、危害最大、流行最广的动物传染病之一。近年来，猪瘟症状已由典型逐渐转为非典型， 隐性感染，持续感染，临床症状非常不明显，出现了所谓的非典型猪瘟、温和型猪瘟和无名 高热综合征等，目前对猪瘟的综合防治主要还是依赖于疫苗免疫，对猪瘟抗体水平的检测 是疫苗免疫效果评价的主要方法。
[0003]按照农业部国家动物疫病强制免疫计划要求，猪瘟免疫抗体检测采用正向间接血 凝试验（IHA)或者酶联免疫吸附试验（ELISA)两种方法，其中，ELISA检测方法以其操作简 便，检测样本量大等优点已经成为猪瘟抗体检测的主要手段。在实际生产中，一方面，抗体 的动态监测和免疫效果评价要求ELISA试剂盒有较高的敏感性；另一方面，引种监测以及 个体淘汰则要求试剂盒有较高的特异性。目前，国内建立的检测猪瘟抗体的ELISA方法大 多是间接ELISA方法，虽然间接ELISA检测猪瘟抗体的方法出现较早，并且有良好的敏感 性，但往往不可避免的会存在较高的非特异性。其次，已经建立的检测猪瘟抗体ELISA方法 中所用的包被抗原，大多是采用原核系统表达，而猪瘟病毒的结构蛋白E2是糖基化蛋白， 原核表达产物无法进行糖基化等蛋白后修饰，它与天然的E2蛋白无论在构象和反应原性 方面都区别较大。
[0004]发明人此前已公开的检测猪瘟病毒抗体的阻断ELISA试剂盒(刊登在《中国畜 牧兽医学会动物传染病学分会第八届全国会员代表大会暨第十五次学术研讨会论文集》 2013. 10)，与进口同类试剂盒相比，由于还存在阴性符合率偏低、重复性欠佳、检测时间长 等不足，所以还需从抗原制备工艺、单克隆抗体制备、试剂盒反应条件等方面实施改进工 作。
【发明内容】
[0005]本发明的目的是在于提供了一种规模化生产的检测猪瘟病毒抗体的阻断ELISA试剂盒。在于利用BactoBac杆状病毒表达系统，将猪瘟病毒E2基因克隆至杆状病毒表 达载体中，并通过昆虫细胞悬浮培养工艺，稳定大批量获得可溶性表达抗原，表达出的蛋白 浓度高、活性好，蛋白构象接近天然E2蛋白。用辣根过氧化物酶标记以E2蛋白作为免疫原 制备出的单克隆抗体，在此基础上，建立了猪瘟病毒阻断ELISA抗体检测方法，并组装成猪 瘟病毒阻断ELISA抗体检测试剂盒。
[0006] 本发明的另一个目的在于提供了一种猪瘟病毒阻断ELISA抗体检测试剂盒在检 测猪瘟病毒抗体中的应用。本试剂盒应用的是阻断ELISA原理，灵敏度高、特异性好、与牛 病毒性腹泻病毒（BVDV)阳性血清无交叉反应，批内和批间变异系数小。与美国IDEXX公司 猪瘟病毒抗体检测试剂盒相比，检测符合率达95%以上。为更加准确的对猪瘟做出诊断及 免疫评价提供了更加科学、高效、可靠的抗体检测试剂盒。
[0007] 为了实现上述的目的，本发明采用以下技术措施： 申请人:对本试剂盒做了实质性的改进：第一，重新筛选得到一株分泌效价更高、阻 断效果更好的抗猪瘟病毒E2蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株4A7 (保藏编号为：CCTCC NO.C2014229)替代原来的AH9 ;第二，用细胞悬浮培养替代了贴壁静置培养，使得细胞培养 密度明显提高，猪瘟病毒E2蛋白得到高水平表达；第三，对试剂盒的反应条件和组分配方 进行了优化改进，使得试剂盒稳定性提高，检测时间缩短。从整体上看，经改进后的猪瘟病 毒阻断ELISA抗体检测试剂盒，其特异性增强，重复性提高，检测时间缩短，批内差和批间 差均降至5%以内，与进口同类试剂盒检测总符合率提高至95%以上。
[0008] 本发明利用BactoBac杆状病毒表达系统以及昆虫细胞悬浮培养技术，可稳定大 批量获得可溶猪瘟病毒E2蛋白，并以纯化后的猪瘟E2蛋白作为免疫原，制备出抗猪瘟病毒 E2蛋白的单克隆抗体，在此基础上建立了检测猪瘟病毒抗体的阻断ELISA方法，并实现了 成品试剂盒的批量生产， 申请人:与进口同类试剂盒进行了大量的试验数据对比，证明本发 明中的试剂盒具有较高的敏感性和特异性，并与黄病毒科瘟病毒属中其他病毒产生的抗体 不存在交叉反应，在BVDV存在的地区也能真实反映出猪瘟抗体的水平，为猪瘟免疫监测工 作的顺利开展提供了有力保障。
[0009] -种规模化生产的猪瘟病毒阻断ELISA抗体检测试剂盒，该试剂盒包括：利用杆 状病毒表达系统以及昆虫细胞悬浮培养工艺，将表达出的猪瘟病毒E2蛋白经亲和层析纯 化后作为包被板抗原，辣根过氧化物酶标记的抗猪瘟病毒E2蛋白的单克隆抗体，单克隆抗 体是以表达并纯化后的猪瘟病毒E2蛋白为免疫原制备。
[0010] 所述的试剂盒还包括：抗原包被板、阳性对照、阴性对照、样品稀释液、洗涤液、显 色液A、显色液B、终止液； 所述抗原包被板是用0.lmol/L，pH9. 6的碳酸氢钠溶液作为包被液，将表达并纯化后 的E2蛋白稀释一定浓度后，包被ELISA板； 所述的阳性对照为猪瘟活疫苗(兔源）免疫的高免血清； 所述的阴性对照为未感染过猪瘟病毒和未经猪瘟疫苗免疫的健康猪血清； 所述的样品稀释液为含有5mg/mL牛血清白蛋白（BSA)、0. 05%体积比Tween-20的磷酸 盐缓冲液； 所述的洗涤液为含有〇. 05%体积比Tween-20的磷酸盐缓冲液； 所述的显色液A为含有50mg/ml过氧化氢脲的柠檬酸盐缓冲液，显色液B为含有 0· 2mg/mlTMBpH5. 0的柠檬酸/柠檬酸钠缓冲液； 所述的终止液为含有〇. 25%体积比氢氟酸溶液。
[0011] 所述的包被抗原和制备猪瘟病毒Ε2蛋白单克隆抗体的免疫原，是将猪瘟病毒Ε2 基因进行PCR扩增，将扩增好的猪瘟病毒Ε2基因序列用HindIII/EcoRI双酶切，克隆至 供体载体PFastBacHTB(Invitrogen公司产品)，转化筛选，经测序鉴定正确后，将构建的 载体命名为pFastBacHTB-E2。将构建好的载体pFastBacHTB-E2转化至大肠杆菌DHlOBac (Invitrogen公司产品)，与菌体中的基因组发生同源重组后，经挑斑，PCR鉴定，转染Sf9细 胞(武汉科前生物股份有限公司保存)，再重复两轮感染Sf9细胞，获得高滴度的重组杆状病 毒,将重组病毒粒子接种至已经驯化好的能够进行悬浮培养的Sf9细胞培养物中，待80%的 细胞发生明显病变后，离心收集细胞，重悬细胞经高压破碎后，将细胞上清进行亲和层析纯 化并鉴定，获得猪瘟病毒E2基因可溶性表达抗原，此抗原用于免疫BALB/c小鼠，制备抗猪 瘟病毒E2蛋白的单克隆抗体，同时用于猪瘟病毒阻断ELISA抗体检测试剂盒中抗原包被板 的包被抗原。
[0012] 所述的抗猪瘟病毒E2蛋白的单克隆抗体，其制备过程是采用杂交瘤细胞技术 (王文章、苏钟浦，细胞杂交技术与单克隆抗体的应用[M].沈阳：辽宁科学技术出版社， 1986. 3)。用纯化过的猪瘟病毒E2蛋白，免疫BALB/c小鼠，取其脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞 (SP2/0)进行细胞融合，用HAT选择性培养基进行培养后，再用猪瘟病毒E2蛋白包被板进行 间接ELISA筛选，筛选的阳性细胞株经有限稀释法克隆，再用猪瘟疫苗免疫的猪阳性对照 血清和未感染过猪瘟病毒的健康猪阴性血清进行阻断ELISA筛选，最终筛选到一株具有阻 断效果并且与BVDV阳性血清无交叉反应的单克隆抗体，分泌此抗体的细胞株命名为4A7 (杂交瘤细胞株4A7,保藏编号为：CCTCCNO.C2014229)。
[0013] 一种猪瘟病毒阻断ELISA抗体检测试剂盒在检测猪瘟病毒抗体中的应用，其步骤 是： 1) 从试剂盒中取出已包被有猪瘟病毒E2蛋白的抗原包被板，将待检血清用样品稀释 液按1:4稀释，每孔100μL加入到抗原包被板中，同时设阴、阳性对照孔，各设2孔，每孔 100μL； 2) 轻轻振匀孔中样品，置37°C45分钟，甩掉孔中的溶液，用洗涤液洗板3次，200μL每 孔，最后一次在吸水纸上拍干； 3) 每孔加酶标单抗100μL，置37°C30分钟，洗涤3次，方法同步骤（2)，每孔加显色液 A、显色液B各50μL，混匀，室温（20~25°C)避光显色10分钟，每孔加终止液50μL，15分钟 内用酶标仪测定每孔OD63tol读值。
[0014] 本发明试剂盒判定标准为：试验成立条件是阴性对照的平均OD63tol值大于0. 50， 阳性对照的阻断率（ΡΙ%)大于50%。若样品的阻断率（ΡΙ%)大于或等于40%，判为猪瘟抗体 阳性。若样品的阻断率（ΡΙ%)小于或等于30%，判为猪瘟抗体阴性。若样品的阻断率（ΡΙ%) 在30°/『40%之间，该样品必须重测，如果结果相同，则过一段时间后重新从动物取样进行检 测。
[0015] 阻断率（ΡΙ%)=(阴性对照平均OD63tlnm值-样品OD63_值）/阴性对照平均OD63Qnm 值X100%。
[0016] 本发明与现有技术相比，具有以下优点和效果： 1.本发明所述的包被抗原E2蛋白为真核系统表达，猪瘟病毒E2蛋白是该病毒的主要 保护性抗原蛋白，也是建立猪瘟病毒血清学检测方法的首选抗原。杆状病毒系统表达的外 源蛋白，可进行正确的折叠、翻译后修饰等，表达产物更接近天然蛋白。
[0017] 2.本发明所述的昆虫细胞悬浮培养工艺，细胞培养密度高，较传统的贴壁静置培 养方法，显著获得更高水平的外源蛋白表达。从破碎后的细胞上清中纯化目的蛋白，蛋白浓 度高达7mg/L，是细胞培养物上清中蛋白浓度的32倍。破碎后的细胞上清成分单一，易于提 取纯度更高的E2蛋白。
[0018] 3.本发明所述的单克隆抗体是以上述纯化的猪瘟病毒E2蛋白为免疫原，应用细 胞杂交瘤技术制备得到，并经辣根过氧物酶标记，与猪瘟E2蛋白的亲和力高，具有很好的 反应原性。
[0019] 4.本发明试剂盒检测其它瘟病毒属阳性血清，无交叉反应，特异性强，灵敏度高， 重复性好，批内和批间变异系数均小于5%。与进口试剂盒相比，检测符合率达95%以上。
【具体实施方式】
[0020] 实施例1 : 一种规模化生产的猪瘟病毒阻断ELISA抗体检测试剂盒，该试剂盒包括：利用Bacto Bac杆状病毒表达系统以及Sf9细胞悬浮培养工艺表达并纯化的猪瘟病毒E2蛋白作为包被 板抗原，辣根过氧化物酶标记的抗猪瘟病毒E2蛋白的单克隆抗体，单克隆抗体是以表达并 纯化的猪瘟病毒E2蛋白为免疫原制备。
[0021] 所述的试剂盒还包括：抗原包被板、阳性对照、阴性对照、样品稀释液、20倍浓缩 洗涤液、显色液A、显色液B、终止液； 所述抗原包被板是用0.lmol/L，pH9. 6的碳酸氢钠溶液作为包被液，将表达并纯化的E2蛋白稀释一定浓度后，包被ELISA板； 所述的阳性对照为猪瘟活疫苗(兔源）免疫的高免血清，是将获得的猪瘟病毒标准阳性 血清按l〇〇〇U/mL加入青霉素和链霉素，无菌过滤，作为阳性对照； 所述的阴性对照为未感染过猪瘟病毒和未经猪瘟疫苗免疫的健康猪血清，是将获得的 猪标准阴性血清按1000U/mL加入青霉素和链霉素，无菌过滤，作为阴性对照； 所述的样品稀释液是称取牛血清白蛋白（BSA) 5g、吐温20 (Tween-20) 0. 5ml、氯化钠 (NaCl) 8. 0g、氯化钾（KCl) 0· 2g、磷酸二氢钾（KH2PO4) 0· 24g、磷酸氢二钾（K2HPO4)I. 8g加 注射用水溶解并定容至1000ml; 所述的20倍浓缩洗涤液是称取氯化钠（NaCl) 160g、氯化钾（KCl) 4g、磷酸二氢钾 (KH2PO4) 4. 8g、磷酸氢二钾（K2HPO4) 36g、吐温20 (Tween-20) 10ml，加注射用水溶解并定容 至 1000ml; 所述的显色液A为含有50mg/ml过氧化氢脲的柠檬酸盐缓冲液，显色液B为含有 0· 2mg/mlTMBρΗ5· 0的柠檬酸/柠檬酸钠缓冲液； 所述的终止液为含有〇. 25%体积比氢氟酸溶液。
[0022] 所述的抗原包被板的制备，其步骤是： Ε2蛋白表达及纯化：将已经驯化好的Sf9细胞经克氏瓶静止培养复苏后，以传代后初 始密度不低于2. 5XIO5个/mL的接种量逐步放大到IOOOmL摇瓶，摇瓶装液体积为500mL，培 养基为Sf900II无血清培养基，培养温度27°C，摇床转速为（90~110)r/min.当细胞生长密 度达到2. 0XIO6个/mL时，用感染复数(Μ0Ι)5~10的重组杆状病毒粒子贮存液，对细胞进行 感染。培养96~108h后，当80%的细胞出现明显病变后，800Xg离心5min沉淀收集细胞。使 用IOOmL含20mmol咪唑的磷酸盐缓冲液（pH7. 4)重悬细胞，高压匀浆破碎细胞，12000Xg 离心20min，弃沉淀，上清经0. 45μηι滤膜过滤，在10mL层析柱中加入4mLNi2+-NTAResin, 用20mmol咪唑的磷酸盐缓冲液（pH7. 4)平衡层析柱，将过滤好的细胞裂解液上清过柱，再 次平衡层析柱，用含200mmol咪唑的磷酸盐缓冲液（pH7. 4)洗脱，在仪器显示UV值的波峰 处收集蛋白，Bradford法测定洗脱液蛋白浓度。加入终浓度为10% (体积分数）的甘油，调 整蛋白浓度为lmg/mL，-80°C贮存备用。
[0023] 将纯化好的E2蛋白用pH9. 6的碳酸氢钠溶液稀释为0. 78μg/mL，按100μL/孔 加入96孔酶标板中，4°C放置过夜，甩干，按120μL/孔用5mg/mLBSA的磷酸盐缓冲液 (pH7. 4)，37°C封闭2小时，甩干，置干燥室干燥后，装入含干燥剂的包装中密封保存。
[0024]所述的抗猪瘟病毒E2蛋白单克隆抗体的制备，其步骤是： 1)饲养细胞的制备：在融合前一天，取一只7周龄雌性BALB/c小鼠，颈椎脱臼处死，75% 体积比酒精消毒5分钟，甩干后移入超净工作台，固定于经紫外消毒的泡沫板上，用灭菌眼 科剪，弯头镊子剪开腹部皮肤，不可损伤腹膜，经钝性剥离使腹膜充分暴露。用IOml-次性 注射器吸满含HAT选择性培养基注入小鼠腹腔，右手固定注射器不动，左手用镊子夹取酒 精棉轻揉小鼠腹部，再用注射器抽出腹腔内的培养基，注入灭菌平皿中，加上述培养基调整 细胞密度至IO6个/ml，用多道移液器分种至4块96孔细胞培养板，每孔100μL，置37°C， 二氧化碳培养箱中培养待用。
[0025] 2)制备免疫脾细胞：取浓度为0. 5mg/ml的纯化过的猪瘟病毒E2蛋白150μL与 等体积佐剂充分混匀，免疫5周龄的BALB/c小鼠，每间隔两周皮下免疫1次，连续免疫3次 后，融合前3天腹腔加强免疫。第一次免疫时使用弗氏完全佐剂，第二次和第三次使用弗氏 不完全佐剂，加强免疫时不使用佐剂。取经最后加强免疫的BALB/c小鼠。将小鼠按上述方 法进行消毒和剥离皮肤，无菌取出脾脏，放入已盛有基础培养液的平皿中清洗，剥离结缔组 织。将脾脏移入另一盛有IOml基础培养液的平皿中，用针头在顶端穿孔，用一次性无菌注 射器吸取5ml基础培养液，从脾脏一端缓慢注入，使液体从脾脏另一端针孔流出，重复3次。 将脾细胞悬液转至IOml无菌离心管中，IOOOrpm离心10分钟，细胞沉淀用基础培养基离心 洗涤1次，然后将细胞重悬，计数后待步骤4使用。
[0026] 3)制备骨髓瘤细胞：在融合前两周将在液氮中冻存的SP2/0骨髓瘤细胞取出复 苏，用加有8-氮鸟嘌呤的1640完全培养基选择培养三代，以保持HGPRT缺陷型。选择生 长旺盛，形态良好的细胞作种子细胞用1640完全培养基进行扩大培养。融合当天，取刚好 处于对数生长期，形态良好的细胞(细胞浑圆、透亮、大小均一、排列整齐、呈半致密分布)， IOOOrpm离心10分钟，弃去培养液，用1640培养基洗2次后将细胞重悬，计数后待步骤4使 用。
[0027]4)细胞融合：将上述制备的免疫脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞按10:1比例混匀于 50ml离心管中，IOOOrpm离心5分钟，去掉上清。用灭菌的滤纸吸干管壁，轻轻敲击管底，使 细胞沉淀略加松动。将装有细胞混合物的离心管放于37°C水浴锅中。然后在1分钟内慢慢 滴入预温至37°C的PEGO. 8ml，边加边轻轻用吸管尖搅拌，加完继续搅拌1分钟。然后慢慢 加入37°C预温的1640培养基40ml。具体方法为，第1分钟逐滴滴入lml。第2分钟加lml， 第3到4分钟加3ml，第5分钟加5ml，最后加入30mll640培养基，每次加时需缓慢加入，并 不断轻轻地搅拌，然后800rpm离心5分钟，弃上清。用40mlHAT培养基悬浮沉淀细胞，分种 于上述步骤1中含饲养细胞的96孔培养板中。于37°C二氧化碳培养中培养。融合后第二 天开始观察，有无污染，于第5天补加1滴HAT培养基，第8天吸去100μL培养基换HT培 养基100μL。待融合细胞集落长至培养孔1/4,培养基略变黄时，此时细胞分泌较多抗体， 可以进行阳性细胞的筛选和克隆。
[0028] 5)阳性细胞的筛选和克隆：在包被有猪瘟病毒E2蛋白的抗原包被板中加入96孔 细胞培养板上的细胞上清，于37°C温育1小时，洗涤液洗3次后，加入1:5000稀释的羊抗鼠 IgG-HRP，37°C反应30分钟，洗涤3次后，加入显色液显色，终止反应之后，用酶标仪测每孔 OD63to读值。同时设SP2/0细胞的培养上清作为阴性对照，OD63tol值3倍于阴性对照，判为 阳性。选取生长旺盛，形态良好的阳性细胞孔用有限稀释法进行克隆。
[0029] 6)阻断作用单抗的筛选鉴定：将初步筛选的阳性细胞孔的上清收集起来，在包 被好抗原的酶标板上加100μL稀释好的猪瘟阴、阳性对照血清，于37°C温育45分钟，洗 涤3次后，再加上述阳性细胞孔的上清100μL，37°C反应30分钟，洗涤3次，加稀释好的 羊抗鼠IgG-HRP，再洗板3次，加入显色液，10分钟后用酶标仪测每孔OD63tol读值。当加 入阳性血清孔的OD63tlnm值低于加入阴性血清孔OD63tol值一半左右时，此单抗即为具有阻断 作用的单抗。分泌此抗体的细胞株命名为4A7(杂交瘤细胞株4A7,保藏编号为：CCTCC NO.C2014229)。
[0030] 7)单克隆抗体生产：大量生产单克隆抗体，可采用小鼠体内诱生法，首先用1640 培养基大量培养上述杂交瘤细胞4A7。按每只小鼠腹腔注入IO6个细胞量(小鼠注入细胞前 5天需经弗氏不完全佐剂处理)。10天后收集腹水，离心除去固体成分，其上清液即为含有 抗猪瘟病毒E2蛋白的单克隆抗体。
[0031] 所述的抗猪瘟病毒E2蛋白单克隆抗体的标记，其步骤是： 1)抗体的纯化：向一份腹水中加入两份〇· 〇6mol/L(pH=5. 0)的乙酸缓冲液，用0·Imol/L的盐酸调pH值至4. 7。室温搅拌下在30分钟内逐滴加入辛酸(每毫升稀释前的腹水加 33μL)，4°C静置2小时，12000rpm离心30分钟，弃沉淀。上清经滤纸过滤后调pH至7. 4。 在4°C冰浴下缓慢加入pH为7. 4的饱和硫酸铵，使硫酸铵最终饱和度不超过45%，搅拌30 分钟，静置2~4小时或4°C过夜。4°C下12000rpm离心20分钟弃去上清。沉淀用0.Olmol/ L的PBS(pH=7. 4)重悬，用pH为8. 0的mmol/LTris-Hcl透析过夜。收集抗体后用分光光 度计检测其浓度。
[0032] 2)猪瘟病毒E2蛋白单克隆抗体的辣根过氧化物酶标记：称取5mg辣根过氧化物 酶（HRP)溶于ImL双蒸水中，加500μL新配置的0. 06mol/L的NaIO4,4°C放置30分钟，勿 超过此时间，此时溶液呈早绿色，加入0. 5mL乙二醇（0. 16mol/L)室温避光反应30分钟。再 加入5mg/mL的纯化单克隆抗体ImL,在0. 05mol/LpH9. 5的碳酸盐缓冲液中4°C透析过夜。 吸出后加5mg/mL新配置的NaBH4 0. 2mL，4°C放置2小时，再加等体积的饱和硫酸铵溶液， 4°C放置30分钟，7000rpm离心10分钟，弃上清，用生理盐水重悬，再在0. 15mol/LpH7. 4的 PBS中透析过夜。收集透析袋中标记的抗体进行工作浓度标定，然后分装于20mL瓶中，4°C 保存备用。（每个批次的酶标抗体都要进行工作浓度标定)。
[0033] 实施例2: 一种猪瘟病毒阻断ELISA抗体检测试剂盒在检测猪瘟病毒抗体中的应用，其步骤是： 1)从试剂盒中取出已包被有猪瘟病毒E2蛋白的抗原包被板，将待检血清用样品稀释 液按1:4稀释，每孔100μL加入到抗原包被板中，同时设阴、阳性对照孔，各设2孔，每 孔 100μL; 2) 轻轻振匀孔中样品，置37°C45分钟，甩掉孔中的溶液，用洗涤液洗板3次， 200μL每孔，最后一次在吸水纸上拍干； 3) 每孔加酶标单抗100μL，置37°C30分钟，洗涤3次，方法同步骤（2)，每孔加显色液 A、显色液B各50μL，混匀，室温（20 - 25°C)避光显色10分钟，每孔加终止液50μL，15分 钟内用酶标仪测定每孔OD63tol读值。
[0034] 本发明试剂盒判定标准为：试验成立条件是阴性对照的平均OD63tol值大于0. 50， 阳性对照的阻断率（ΡΙ%)大于50%。若样品的阻断率（ΡΙ%)大于或等于40%，判为猪瘟抗体 阳性。若样品的阻断率（ΡΙ%)小于或等于30%，判为猪瘟抗体阴性。若样品的阻断率（ΡΙ%) 在30°/『40%之间，该样品必须重测，如果结果相同，则过一段时间后重新从动物取样进行检 测。
[0035] 阻断率（ΡΙ%)=(阴性对照平均OD63tlnm值-样品OD63_值）/阴性对照平均OD63tol 值X100%。
[0036] 1.特异性试验用猪瘟病毒阻断ELISA抗体检测试剂盒检测猪瘟（CSFV)、牛病毒性 腹泻（BVDV)、猪伪狂犬（PRV)、猪蓝耳（PRRSV)、猪圆环病毒2型（PCV2)、猪细小病毒（SIV) 等标准阳性血清和猪瘟阴性血清，除了猪瘟病毒标准阳性血清的阻断率（PI%)明显大于 50%外，其余血清的阻断率（PI%)在_5%~25%之间，符合阴性血清的判定标准，表明这种方法 特异性良好，而且与BVDV阳性血清不存在交叉反应。
[0037] 表1特异性血清的检测
【权利要求】
1. 一种猪瘟病毒阻断ELISA抗体检测试剂盒，该试剂盒包括：利用杆状病毒表达系统 以及昆虫细胞悬浮培养工艺表达出的猪瘟病毒E2蛋白经亲和层析纯化后作为包被板抗 原，辣根过氧化物酶标记的抗猪瘟病毒E2蛋白的单克隆抗体； 所述的试剂盒还包括：抗原包被板、阳性对照、阴性对照、样品稀释液、洗涤液、显色液 A、显色液B、终止液； 所述的抗原包被板是用〇. lmol/L，pH9. 6的碳酸氢钠溶液作为包被液，将表达并纯化 后的E2蛋白稀释一定浓度后，包被ELISA板； 所述的阳性对照为猪瘟活疫苗免疫的高免血清； 所述的阴性对照为未感染过猪瘟病毒和未经猪瘟疫苗免疫的猪血清； 所述的样品稀释液为含有5mg/mL牛血清白蛋白、0. 05%体积比Tween-20的磷酸盐缓冲 液； 所述的洗涤液为含有〇. 05%体积比Tween-20的磷酸盐缓冲液； 所述的显色液A为含有50mg/ml过氧化氢脲的柠檬酸盐缓冲液，显色液B为含有 0? 2mg/ml TMB pH5. 0的柠檬酸/柠檬酸钠缓冲液； 所述的终止液为含有〇. 25%体积比氢氟酸溶液。
2. 根据权利要求1所述的一种猪瘟病毒阻断ELISA抗体检测试剂盒，其特征在于：所述的包被抗原和制备猪瘟病毒E2蛋白单克隆抗体的免疫原，是将猪瘟病毒E2基因进 行PCR扩增，将扩增的猪瘟病毒E2基因序列用Hind III /EcoR I双酶切，克隆至供体载体 pFastBacHTB，转化筛选，经测序鉴定后，将构建的载体命名为PFastBacHTB-E2,将构建的载 体PFastBacHTB-E2转化至大肠杆菌DHlOBac，与菌体中的基因组发生同源重组后，经挑斑， PCR鉴定，转染Sf9细胞，再重复两轮感染Sf9细胞，获得高滴度的重组杆状病毒，将重组病 毒粒子接种至已经驯化悬浮培养的Sf9细胞培养物中，待80%的细胞发生病变后，离心收集 细胞，重悬细胞经高压破碎后，将细胞上清进行亲和层析纯化并鉴定，获得猪瘟病毒E2基 因可溶性表达抗原，此抗原用于免疫BALB/c小鼠，制备抗猪瘟病毒E2蛋白的单克隆抗体， 同时用于猪瘟病毒阻断ELISA抗体检测试剂盒中抗原包被板的包被抗原。
3. 根据权利要求1所述的一种猪瘟病毒阻断ELISA抗体检测试剂盒，其特征在于：所 述的抗猪瘟病毒E2蛋白的单克隆抗体，其制备过程是采用杂交瘤细胞技术，用纯化过的猪 瘟病毒E2蛋白，免疫BALB/c小鼠，取其脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞进行细胞融合，用HAT选 择性培养基进行培养后，再用猪瘟病毒E2蛋白包被板进行间接ELISA筛选，筛选的阳性细 胞株经有限稀释法克隆，再用猪瘟疫苗免疫的猪阳性对照血清和未感染过猪瘟病毒的猪阴 性血清进行阻断ELISA筛选，最终筛选到一株有阻断效果并且与BVDV阳性血清无交叉反应 的单克隆抗体，分泌此抗体的细胞株命名为4A7,保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编 号为：CCTCC NO. C2014229。
4. 权利要求1所述的一种猪瘟病毒阻断ELISA抗体检测试剂盒在检测猪瘟病毒抗体中 的应用。
【文档编号】C07K14/18GK104483490SQ201410744993
【公开日】2015年4月1日 申请日期:2014年12月9日 优先权日:2014年12月9日
【发明者】华俊清, 王艳伟, 但汉并, 周明光, 董晓辉, 徐高原, 金梅林, 陈焕春 申请人:武汉科前生物股份有限公司