专利名称：生产疏水多肽、蛋白质或肽的方法
以基因技术制备杂合基因的可能性为组构重组体蛋白质打开了新的途径。将编码所需蛋白质的基因序列与对配基有高亲和性之蛋白质片段的基因编码序列相连接，有可能使用亲和肽以一个步骤纯化融合蛋白质形式的所需重组体蛋白质。借助位点特异性诱变，也有可能在亲和肽和所需重组体蛋白质的连接点上引入特异性化学或酶切位点，这样在借助适当的亲和树脂纯化融合蛋白质后即可经化学或酶促裂解来回收所需的重组体蛋白质。
然而，当所需的重组体蛋白质在其氨基酸序列中也含有这样的化学或酶促裂解位点时，则对所需重组体蛋白质的回收就将是极其困难的。在这种情况下，所需的重组体蛋白质很容易被迅速降解。
为了抑制这种降解，本发明提供了融合蛋白质和可以在不影响所需重组体蛋白质的情况下在特定的化学或酶促裂解位点上进行选择性裂解的方法。本发明的方法可特异地应用于生产疏水多肽、蛋白质或肽。
更具体地说，本发明涉及有下列通式的融合蛋白质A-B-C其中A是大体积亲水肽，B是选择性裂解位点，C是所需的疏水多肽、蛋白质或肽。
与根据本发明的融合蛋白质结合使用的术语“大体积亲水肽”涉及以其大小和产生良好结构区域之亲水氨基酸含量为特征的亲水肽。
根据本发明的融合蛋白质的大体积亲水肽A具有双重功能a)有利于融合蛋白质的高表达和b)使裂解位点C暴露于疏水基质柱上的流动相。根据本发明的融合蛋白质的优选大体积亲水肽是具有下式肽序列的亲水肽(NANP)x其中X是10-40，且最好是19。
选择性裂解位点可以是化学或酶促裂解位点。适当的选择性酶促裂解位点可以是氨基酸序列-(Asp)n-Lys-，其中n代表2，3或4，或可分别被蛋白酶肠激酶和凝血因子Xa特异性识别的-Ile-Glu-Gly-Arg-，被胰蛋白酶裂解的精氨酸残基或赖氨酸残基、被赖氨酰肽链内切酶裂解的赖氨酸残基或被V8蛋白酶裂解的谷氨酰胺残基。作为适当的选择性化学裂解位点，可考虑有被3-溴-3-甲基-2-(2-硝基苯基巯基)-3H-吲哚裂解的色氨酸残基、被2-亚硝基-5-硫氰基苯甲酸裂解的半胱氨酸、可分别被酸和羟胺裂解的氨基酸二肽Asp-Pro或Asn-Gly，以及较好可被溴化氰(CNBr)特异地裂解的蛋氨酸残基。
与根据本发明的融合蛋白质结合使用的术语“疏水多肽、蛋白质或肽”是指以浓度为30-60%，较好约40%的加在含水缓冲液中的有机溶剂，如加在含水缓冲液中的浓度高于40%的乙醇，从反相HPLC柱上洗脱的疏水多肽、蛋白质或肽。
作为疏水多肽、蛋白质或肽，例如考虑有表面抗原、淋巴激活素受体、HIV-1和HIV-2被膜和结构蛋白质、丙型肝炎被膜和结构蛋白质或有膜锚地序列的任何蛋白质。优选的疏水多肽、蛋白质或肽是具有下示序列的b-淀粉状蛋白肽(bA4-淀粉状蛋白)1 42DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVVIA(Seq ID No1)在35位上有亮氨酸(Seq ID No3)、丝氨酸(Seq ID No4)、谷氨酰胺(Seq ID No5)或谷氨酸(Seq ID No6)残基代替蛋氨酸或蛋氨酸亚砜残基的bA4-肽点突变，以及有下示序列的HIV-1被膜肽1 35RILAVERYLKDQQLLGIWGCSGKLICTTAVPWNAS(Seq ID No11)可将根据本发明的融合蛋白质的大体积亲水肽和选择性裂解位点连接到疏水多肽、蛋白质或肽的氨基末端氨基酸或羧基末端氨基酸上。
本发明的融合蛋白质可以含有优选结合于亲和载体材料上的特异性序列。这样的序列例如可以是含有至少两个相邻组氨酸残基的序列(可参见欧洲专利申请No.282 042)。这些序列可特异地结合到次氮基三乙酸镍络合树脂上(Hochuli and D beli，Biol. Chem. Hoppe-Seyler 368，748(1987);欧洲专利No. 253 303)。因此可以从保留的多肽中选择性地分离出含有这种特异序列的本发明的融合蛋白质。可以将此特异性序列连接到大体积亲水肽的氨基酸序列上或者亲水多肽、蛋白质或肽的氨基酸序列上。
本发明还涉及编码这些融合蛋白质的基因、含有这些基因的表达载体、用这些表达载体转化的微生物以及制备所说的基因、表达载体和被转化微生物的方法。
按照文献中描述的重组DNA技术的方法制备本发明的融合蛋白质。较好首先合成编码所需疏水多肽、蛋白质或肽的核苷酸序列，然后再将此序列与编码大体积亲水肽和选择性裂解位点的核苷酸序列连接。
也可按照已知的方法将如此得到的杂合基因掺入到表达载体中。例如可参考Maniatis等人("Molecular Cloning"，Cold Spring Harbor Laboratory，1982)的教科书和Sambrook等人("Molecular Cloning-A Laboratory Manual"，2nd. ed.， Cold Spring Harbor Laboratory，1989)的教科书。
表达本发明融合蛋白质的方法也是已知的，并在上述教科书中有详细的描述。它们包括下述步骤a)用其中上述杂合基因已可操纵地结合到表达控制序列上的表达载体转化适当的宿主生物体，特别是大肠杆菌;
b)在适当的生长条件下培养如此得到的宿主生物体;
c)从宿主生物体中提取并分离所需的融合蛋白质。
作为宿主生物体，可以是革兰氏阴性或革兰氏阳性细菌，例如大肠杆菌和枯草芽胞杆菌菌株。大肠杆菌菌株M15是本发明的特别优选的宿主生物体。但也可以使用与上述大肠杆菌菌株不同的、一般可以得到的大肠杆菌菌株，例如大肠杆菌294(ATCC No. 3144)、大肠杆菌RR1(ATCC No. 31343)和大肠杆菌W3110(ATCC No. 27325)。
本发明融合蛋白质允许在不影响所需疏水多肽、蛋白质或肽的情况下在特定化学或酶促裂解位点上进行选择性裂解。所需的疏水多肽、蛋白质或肽扩散到疏水基质柱的固相中，便能够定位本发明的融合蛋白质，以便隐藏所需的疏水多肽、蛋白质或肽。另一方面，大体积亲水肽将选择性裂解位点暴露于含水流动相。这样就允许经选择性裂解除去大体积亲水肽而只留下结合到柱上的所需的疏水多肽、蛋白质或肽。然后可经加入有机溶剂而洗脱掉所需的疏水多肽、蛋白质或肽。
因此，本发明还提供了允许生产和纯化所需疏水多肽、蛋白质或肽的方法，该方法包括下列步骤a)使含有本发明融合蛋白质的水溶液通过疏水基质柱，b)用含有裂解试剂或酶的溶液冲洗该柱，以及c)用与水混溶的溶剂除去由此得到的所需疏水多肽、蛋白质或肽。
作为疏水基质柱，可以是结合到硅胶基质柱上的氰基丙基、环己基、苯基、辛基或十八基基团。在本发明的实践中，较好使用在反相高效液相层析(HPLC)条件下的RP-18(十八基结合的硅胶微颗粒柱)。
在用根据本发明的融合蛋白质装柱之前，用缓冲液常规平衡疏水基质柱。平衡缓冲液可含有变性剂或高离液序列剂(Chaotropic agent)如盐酸胍、尿素，或去污剂如Triton。加入这样的变性剂、高离液序列剂或去污剂，既使用根据本发明的极难于溶解于水溶液的融合蛋白质，也不会有操作上的问题。
将本发明的融合蛋白质加到也可含有变性剂或去污剂例如盐酸胍、尿素或Triton的缓冲液中，然后上疏水基质柱。
用含有裂解剂或酶的缓冲液洗柱以完成裂解。最适宜缓冲液组成取决于所使用的裂解剂或酶，并基于不同情况来常规确定之。
可使用水混溶性溶剂的梯度洗脱所需的疏水多肽、蛋白质或肽。用于这一目的的水混溶性溶剂包括链烷醇如正丙醇、2-丙醇、乙醇、甲醇、叔丁醇或环醚如二噁烷。最适宜洗脱条件取决于待纯化的所需疏水多肽、蛋白质或肽、疏水基质，柱大小等因素，并可基于不同情况常规确定之。
也可以间断地进行上述生产和纯化所需疏水多肽、蛋白质或肽的方法。然后将根据本发明的融合蛋白质吸附到加在缓冲液中的疏水基质上。将疏水基质与含有裂解剂或酶的缓冲液一起保温以完成裂解。可在除去裂解剂或酶和大体积亲水肽后，将疏水基质和水混溶性溶剂一起保温而得到所需的疏水多肽。
在本发明的优选特定实施方案中，也利用允许生产和纯化所需疏水多肽、蛋白质或肽的新方法将单体形式的b-淀粉状蛋白纯化到均一态。
用于生产作为均质肽之单体b-淀粉状蛋白的特定方法包括下列步骤a)使含有本发明融合蛋白质的水溶液(其中所需的疏水肽是b-淀粉状蛋白肽)通过疏水基质柱，b)用含有裂解剂或酶的溶液洗柱，c)用水混溶性溶剂洗脱，得到单体b-淀粉状蛋白肽，d)用蒸馏水洗脱单体b-淀粉状蛋白肽，然而冻干，并且e)在必要时于冻干后将此单体b-淀粉状蛋白纯化达到最大均质性在实施生产作为均质肽的单体b-淀粉状蛋白肽的特定方法中，使含有融合蛋白质的溶液-其中所需疏水肽是b-淀粉状蛋白肽，该肽较好是在含有变性剂如盐酸胍或尿素的缓冲液中
-通过疏水基质柱。实践中，较好使用反相高效液相层析(HPLC)条件下的RP-18(十八基结合的硅胶微颗粒柱)。为此目的而使用的其他适宜的柱包括氰基丙基、环己基、苯基或辛基结合的柱(珠大小＝5-30mm)。这些柱可作为商标为Vydac'或Nucleosil的商品得自Vydac或macherey-Nagel。用含有裂解剂或酶的缓冲液冲洗该柱以完成裂解。在实践中，较好使用加在缓冲水混溶性溶剂中的溴化氰冲洗该柱以完成裂解。使用水混溶性溶剂梯度，较好是乙醇梯度洗脱单体b-淀粉状蛋白肽。直接用蒸馏水稀释单体b-淀粉状蛋白肽，例如将洗脱物滴加到含水容器内，然后冻干。必要时可在冻干后用已知方法如制备性凝胶电泳法或排阻层析法纯化单体b-淀粉状蛋白肽以使之达到最大均质性。在实践中，较好应用制备非变性凝胶电泳法(分离大量的单体b-淀粉状蛋白肽)和在HPLC条件下的凝胶过滤法(分离小量的单体b-淀粉状蛋白肽)。
本发明还涉及用该新方法制得的纯的和均一的、毒性单体b-淀粉状蛋白肽。
根据本发明的b-淀粉状蛋白肽可用于筛选早老性痴呆药物。
也可使用如用于纯化单体b-淀粉状蛋白肽的相类条件，利用生产和纯化所需疏水多肽、蛋白质或肽的新方法将HIV-1被膜肽Seq ID No11纯化到均质状态(实施例7)。
按该新方法制得的HIV-1被膜肽Seq ID No11可用于诊断HIV感染。
在对本发明进行了如上的一般性描述之后，将借助下列实施例详细举例说明本发明，但这些实施例并不以任何方式限制本发明。
结合附图阅读可以更好地了解这些实施例。附图中出现有下列符号“N250PSN250P29”代表可调节的启动子/操纵基因元件N250PSN250P29;“RBSⅡ”代表合成的核糖体结合位点RBSⅡ;“[His]6”、“[NANP]19”和"amy"代表编码本发明6xHis-NANP-淀粉状蛋白融合蛋白质的基因;"bla"、"cat"、"LacI"和"neo"分别代表编码β-内酰胺酶、氯霉素乙酰转移酶、lac阻遏子和新霉素磷酸转移酶的基因;"to"、"TE"和"T1"分别代表噬菌体的转录终止子to、T7噬菌体的TE和大肠杆菌rrnB操纵子的T1"repl."代表质粒pBR322和pREP4的复制区域。
图1是质粒pREP4的示意图。
图2是质粒p6xHis-NANP-Met-Amy的示意图。
图3显示质粒p6xHis-NANP-Met-Amy(Seq ID No7)的核苷酸序列的一部分，该质粒编码融合蛋白质6xHis-NANP-Met-Amy(Seq ID No8)。在该序列中，标出了图2中所示某些限制酶的识别序列。所示的氨基酸序列以三字母代码表示融合蛋白质6xHis-NANP-Met-Amy的序列，其中标出了相当于bA4-肽的氨基酸的编号。
图4是质粒pB/E1-6xHis-NANP-Met-huAmy的示意图。
图5显示质粒pB/E1-6xHis-NANP-Met-huAmy的核苷酸序列的一部分(Seq IN No9)，该质粒编码融合蛋白质6xHis-NANP-Met-huAmy(Seq ID No10)。该序列中标出了图4所示一些限制酶的识别序列。所示氨基酸序列以三字母代码表示融合蛋白质6xHis-NANP-Met-huAmy的序列，其中给出了相当于bA4肽之氨基酸的编号。图中底下部分显示了与质粒pB/E1-6xHis-NANP-Met-huAmy不同的核苷酸序列和所编码的氨基酸，它们分别属于编码融合蛋白质6xHis-NANP-Met-huAmy[M35E]的质粒pB/E1-6xHis-NANP-Met-huAmy[M35E]，编码融合蛋白质6xHis-NANP-Met-huAmy[M35L]的质粒pB/E1-6xHis-NANP-Met-huAmy[M35L]、编码融合蛋白质6xHis-NANP-Met-huAmy[M35Q]的质粒pB/E1-6xHis-NANP-Met-huAmy[M35Q]，和编码融合蛋白质6xHis-NANP-Met-huAmy[M35S]的质粒pB/E1-6xHis-NANP-Met-huAmy[M35S]。
图6给出用非变性琼脂糖凝胶电泳法分析bA4的结合。用得自Beckman的“血清蛋白质电泳(SPE)系统Paragon”，按照供应者推荐的方法进行该分析。上样的每种肽均为8μg(在2μl水中)。用考马斯亮兰染色3小时并用10%乙酸、45%甲醇和45%水脱色。实验前直接在蒸馏水中制备样品(f)，或者使它老化2天(a)。被试样品在下列表中给出。
凝胶a 凝胶b泳道1 人 bA4 洗涤 1f 泳道1 M35S bA4 洗涤 1f泳道2 人 bA4 洗涤 2f 泳道2 M35S bA4 洗涤 2f泳道3 人 bA4 洗涤 3f 泳道3 M35S bA4 洗涤 3f泳道4 人 bA4 洗涤 4f 泳道4 M35S bA4 洗涤 4f泳道5 人 bA4 洗涤 4a 泳道5 M35S bA4 洗涤 4a泳道6 标准品BSA2mg 泳道6 标准品BSA10mg泳道7 M35L bA4 洗涤 1f 泳道7 M35Q bA4 洗涤 1f泳道8 M35L bA4 洗涤 2f 泳道8 M35Q bA4 洗涤 2f泳道9 M35L bA4 洗涤 3f 泳道9 M35Q bA4 洗涤 3f泳道10 M35L bA4 洗涤 3a 泳道10 大鼠 bA4凝胶C给出点突变体M35Q bA4和M35E bA4的比较结果。点突变体M35E bA4含有额外的负电荷而导致在Beckman凝胶上的高迁移率(泳道8M35E bA4;泳道9M35Q bA4)。当裂解后将M35E bA4与M35Q bA4混合时(泳道1)或当含有M35Q bA4的融合蛋白质与含有M35E bA4的融合蛋白质混合并按照本发明的方法裂解时(泳道3、4、5和6(洗涤1、2、3和4))，则观察到一个指示单体bA4存在的清晰的间隔区。
图7给出在体积排阻柱上对bA4进行层析分离的结果。
各收集250ml部分并用非变性电泳法分析它。泳道1上柱的bA4。泳道2至10峰值部分。
用于确定bA4大小的标志蛋白质是血清白蛋白(MW＝65000;滞留时间＝19.98分钟)，卵白蛋白(MW＝45000;滞留时间＝20.10分钟)，乳清蛋白(MW＝14200;滞留时间＝21.43分钟)，胰岛素(MW＝5734;滞留时间＝21.68分钟)。
滞留时间22.54分钟指示分子量约4500道尔顿的单体。这是与光扫描数据和按Yphantis方法(D. A. Yphantis，Annals of the N. Y. Acad. Sci. 88，586-601(1960))进行的超滤实验结果相一致的。
实施例1用于制备融合蛋白质6xHis-NANP-Met-Amy的表达质粒使用表达质粒p6xHis-NANP-Met-Amy(参见图2和3)制备融合蛋白质6xHis-NANP-Met-Amy。根据布达佩斯条约，己于1993年5月18日将用质粒pREP4和p6xHis-NANP-Met-Amy转化的大肠杆菌M15细胞保藏在Braunschweig，BRD的Deutsche Sammlung von Mikroorganismen(DSM)，保藏登记号为DSM 8310。
实施例2用于制备融合蛋白质6xHis-NANP-Met-huAmy的表达质粒使用表达质粒pB/E1-6xHis-NANP-Met-huAmy(参见图4和5)制备融合蛋白质6xHis-NANP-Met-huAmy。用质粒pREP4和pB/E1-6xHis-NANP-Met-huAmy转化的大肠杆菌M15细胞己按照布达佩斯条约规定，于1993年5月18日被保藏在Braunschweig，BRD的Deutsche Sammlung von Mikroorganismen(DSM)，保藏登记号为DSM 8311。
实施例3用于制备融合蛋白质6xHis-NANP-Met-huAmy[M35L]、6xHis-NANP-Met-huAmy[M35Q]、6xHis-NANP-Met-huAmy[M35S]和6xHis-NANP-Met-huAmy[M35E]的表达质粒分别使用只是编码bA4淀粉状蛋白肽之氨基酸35的核苷酸不同于质粒pB/E1-6xHis-NANP-Met-huAmy的表达质粒pB/E1-6xHis-NANP-Met-huAmy[M35L]、pB/E1-6xHis-NANP-Met-huAmy[M35Q]、pB/E1-6xHis-NANP-Met-huAmy[M35S]和pB/E1-6xHis-NANP-Met-huAmy[M35E](参见图5)制备融合蛋白质6xHis-NANP-Met-huAmy[M35L]、6xHis-NANP-Met-huAmy[M35Q]、6xHis-NANP-Met-huAmy[M35S]和6xHis-NANP-Met-huAmy[M35E]。已按照布达佩斯条约的规定，于1993年5月18日将分别用质粒pREP4和pB/E1-6xHis-NANP-Met-huAmy[M35L]、pREP4和pB/E1-6xHis-NANP-Met-huAmy[M35Q]、pREP4和pB/E1-6xHis-NANP-Met-huAmy[M35S]，以及pREP4和pB/E1-6xHis-NANP-Met-huAmy[M35E]转化的大肠杆菌M15细胞保藏在Braunschweig，BRD的Deutsche Sammlung von Mikroorganisismen(DSM)，保藏登记号分别是DSM 8313、DSM 8314、DSM 8315和DSM 8312。
实施例4融合蛋白质的发酵生产和纯化发酵按照标准方法(Sambrook et al.，文献同上)分别将质粒p6xHis-NANP-Met-Amy、pB/E1-6xHis-NANP-Met-huAmy、pB/E1-6xHis-NANP-Met-huAmy[M35L]、pB/E1-6xHis-NANP-Met-huAmy[M35Q]、pB/E1-6xHis-NANP-Met-huAmy[M35S]和pB/E1-6xHis-NANP-Met-huAmy[M35E]转化到经含有质粒PREP4的大肠杆菌M15细胞中。使被转化的细胞在100升发酵罐中，37℃下生长在含有100mg/1氨苄青霉素和25mg/1卡那霉素的Süper培养基(Stüper et al.， Immunological Methods，eds. Lefkovits and Pernis， Academic Press，Inc.，Vol. Ⅳ 121-152(1990))中。在600nm光密度约为1.0时，加入IPTG至终浓度为2mM。在37℃继续培养3小时后离心收获细胞。在一典型发酵过程中，得到至少含3g重组体融合蛋白质的约500g生物量。
纯化向细胞内加入2.5L含有6M盐酸胍的0.1M磷酸氢二钠，pH8，并搅拌24小时。离心除去粗细胞碎片，然后使用0.3mm滤膜以交叉流动过滤法进一步澄清上清液。然后使含在滤液中的蛋白质吸附到Ni-NTA柱(5cm×24cm，流速20ml/分)上。选用8M尿素，pH7.5洗涤除去污染的大肠杆菌蛋白质。再用8M尿素，pH4进行洗脱。用SDS-PAGE法监测层析谱，并合并含融合蛋白质的部分。将小等分的该合并物与EDTA混合并对水透析脱盐，冻干后用电子流质谱法进行分析(表1)。
表1融合蛋白质的特征融合蛋白质 每个100L发酵罐 理论质量 以电子流MS的纯化产率(克) 测得的平均质量人WT 3.0 13817 13820人Mut.M35S 5.5 13773 13776人Mut.M35L 5.7 13799 13802人Mut.M35Q 4.5 13814 13817人Mut.M35E 6.0 13813 无试大鼠WT 6.0 13724 13728WT＝野生型，Mut＝突变体，如M35S(35位上的Met突变成Ser)实施例5裂解融合蛋白质以产生1-42 b-淀粉状蛋白肽首先以2ml/分钟的流速，用8M尿素，pH4平衡半制备性RP-18HPLC(Vidac，说明书218TP 152010，250mm×10mm)柱。然后将1等份含有400mg融合蛋白质(在8M尿素，pH4中)的NTA洗脱物以1ml/分钟的流速泵到柱上。然后用8M尿素，pH4，以2ml/分钟的流速洗柱。用水以2ml/分钟的流速洗出尿素，直到柱出口处的吸光率达到基线水平。用加在由20%乙醇、40%甲酸和40%水组成的溶液中的45mg/ml CNBr，在20℃下以0.5ml/分钟的流速将柱冲洗24小时，以实现裂解。然后用0.1M EDTA以2ml/分钟的流速洗该柱，并用0.05%三氟乙酸以2.0ml/分钟的流速洗出CNBr连同已释放的MRGSHHHHHHGS-(NANP)19-RSM。使用在时间点上给出的下列乙醇梯度，以2ml/分钟的流速洗脱1-42残基b-淀粉状蛋白肽(分钟/O/O乙醇)0/0、，40/40，45/50，50/65，55/100，60/100，65/0。
含有b-淀粉状蛋白肽的宽峰出现在45分钟和60分钟之间。该肽为单体的关键是立即用蒸馏水稀释(如将洗脱物溶加到含200mlH2O的搅拌的烧杯中)，并立即冻干。所得粉末称为W1。因为有相当量的b-淀粉状蛋白肽仍留在柱上，故使用上述方法重复洗脱三次，得到样品W2，W3和W4。检验这些样品的纯度(表2)和单体bA4的量(图6)。用电子流质谱法(表3)、氨基酸分析法和氨基末端序列测定法(表3)证实肽的正确化学结构。
表21-42 b-淀粉状蛋白肽的产生肽 检验序号 洗涤数 产生的质量 纯度(mg) (%)大鼠WT 4 1 100±14 90±2(Seq ID No:2) 2 28±8 89±23/4 9±3 90±1人WT 3 1 96±23 79±9(Seq ID No:1) 2 52±10 73±53 32±9 78±44 15±8 86±5人M35S 3 1 71±13 80±8(Seq ID No:4) 2 31±5 74±23 18±7 83±24 2±7 88±2人M35L 3 1 59±15 72±8(Seq ID No:3) 2 23±9 71±43 8±3 78±3人M35Q 4 1 37±4 70±2(Seq ID No:5) 2 10±5 82±3人M35E 1 1 95 未检验(Seq ID No:6) 2 68 未检验3 46 未检验4 31 未检验纯度是基于氨基酸分析得出的，融合蛋白质的含量根据Asp对Glu的比值测得。纯的1-42 b-淀粉状蛋白肽有4个Glu和4个Asp残基，纯的融合蛋白质具有42个Asp对4个Glu的比例。
表31-42 b-淀粉状蛋白肽的鉴定样品 质 谱 Edman 降解理论值 实测值 10-15次循环人 WT 4515.1 4531**DAEFRHDSGYEVHHQ人 M35S 4471.0 4472 DAEFRHDSGY人 M35L 4497.1 4498 DAEFRHDSGY人 M35Q 4512.0 4512 未检测人 M35E 4513.0 4512 未检测大鼠WT 4417.0 4435**DAEFGHDSGF＊＊人WT和大鼠WT的蛋氨酸在裂解过程中被转化成蛋氨酸亚砜。
实施例6单体1-42 bA4的纯化小规模方法将含有1mg bA4的样品上LKB UltroPac HPLC柱(直径7.5mm，长度600mm，流速0.5ml/分，缓冲液12mM三(羟甲基)氨基甲烷含有200mM甘氨酸，pH7.8)。bA4出现在尖峰中，且峰值部分在图7所示的琼脂糖电泳凝胶上含有考马斯亮兰条带。光扫描实验没给出存在高分子量形式(聚集物或纤维)的证据，而在同一条件下层析的校正标准则指出分子量约为4500，表明bA4是作为单体存在的。
制备规模方法使用BioRad生产的“连续洗脱电泳系统491型Prep Cell”。非变性不连续丙烯酰胺凝胶由4%丙烯酰胺/2.7%N，N'-亚甲基-双丙烯酰胺分离胶(在0.375M三(羟甲基)氨基甲烷(pH8.8)中)组成，长度3cm，直径37mm，并装配有20mm直径的冷冻管。
堆积胶由4%丙烯酰胺/2.7%N，N'-亚甲基-双丙烯酰胺(在0.125M三(羟甲基)氨基甲烷(pH6.8)中)组成，长度为2cm。电泳缓冲液是25mM三(羟甲基)氨基甲烷/0.2M甘氨酸，pH8.3。使用同一缓冲液以0.75ml/分钟的流速进行洗脱。将通常得自洗涤2、3或4的45mg bA4肽溶解在7ml H2O和1ml甘油中。以12瓦电压(恒定，限制在500V和40mA)进行电泳，一般需进行4小时。典型的电泳结果示于图7中。
实施例71-35 HIV-1肽的纯化将按照制备和纯化含单体1-42 bA4之融合蛋白质时所述的同样方法(实施例1-4)制备并纯化的400mg融合蛋白质MRGS(H)5GS(NANP)19RSM RILA VERYLKDQQLLGIWGCSGKLICTTAVPWNAS (Seq ID No12)加于Vydac RP18柱(说明书218 TP152010，250mm×10mm)上，并使用上述裂解1-42bA4融合蛋白质的同样条件(实施例5)进行裂解。得到大约20-30mg冻干的粉末。用电子流分析法分析该粉末。检测出相当于1-35 HIV-1肽(Seq ID No11)的3902±2Da峰。
序列表(1)一般资料(ⅰ)申请人(A)姓名 F. HOFFMANN-LA ROCHE AG(B)街道 Grenzacherstrasse 124(C)城市 Basle(D)州 BS(E)国家 Switzerland(F)邮政号 CH-4002(G)电话 061-688 42 56(H)传真 061-688 13 95(I)电传 962292/965542 hlr ch(ⅱ)发明题目Process for producing hydrophobic polypeptides， proteins or peptides(ⅲ)序号12(ⅳ)电脑可读形式(A)介质类型 Floppy disk(B)计算机 IBM PC compatible(C)操作系统 PC-DOS/MS-DOS(D)软件 PatentIn Release ＃1.0，Version ＃1.25(EPO)(2)SEQ ID NO1的资料(ⅰ)序列特征(A)长度42氨基酸
(B)类型氨基酸(D)拓扑学线性(ⅱ)分子类型肽(V)片段类型N-末端(xi)序列描述SEQ ID NO∶1 (2)SEQ ID NO∶2的资料(ⅰ)序列特征(A)长度42氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑学线性(ⅱ)分子类型肽(Ⅴ)片段类型N-末端(xi)序列描述SEQ ID NO∶2
(2)SEQ ID NO∶3的资料(ⅰ)序列特征(A)长度42氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑学线性(ⅱ)分子类型肽(Ⅴ)片段类型N-末端(xi)序列描述SEQ ID NO∶3 (2)SEQ ID NO∶4的资料(ⅰ)序列特征(A)长度42氨基酸(B)类型氨基酸
(D)拓扑学线性(ⅱ)分子类型肽(Ⅴ)片段类型N-末端(xi)序列描述SEQ ID NO∶4 (2)SEQ ID NO5的资料(ⅰ)序列特征(A)长度42氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑学线性(ⅱ)分子类型肽(Ⅴ)片段类型N-末端(xi)序列描述SEQ ID NO5
(2)SEQ ID NO6的资料(ⅰ)序列特征(A)长度42氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑学线性(ⅱ)分子类型肽(Ⅴ)片段类型N-末端(xi)序列描述SEQ ID NO∶6 (2)SEQ ID NO∶7的资料(ⅰ)序列特征(A)长度520碱基对(B)类型核酸(C)链股单股(D)拓扑学线性(ⅱ)分子类型DNA(基因组)
(ix)特征(A)名称/关键词CDS(B)定位115..516(D)其他信息/产物＝“淀粉状蛋白质AA”(xi)序列描述SEQ ID NO∶7
(2)SEQ ID NO∶8的资料(ⅰ)序列特征(A)长度133氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑学线性(ⅱ)分子类型蛋白质(xi)序列描述SEQ ID NO∶8
(2)SEQ ID NO∶9的资料(ⅰ)序列特征(A)长度520碱基对(B)类型核酸(C)链股单股(D)拓扑学线性
(ⅱ)分子类型DNA(基因组)(ⅸ)特征(A)名称/关键词CDS(B)定位115..516(D)其他信息/产物＝“淀粉状蛋白质AA”(xi)序列描述SEQ ID NO∶9
(2)SEQ ID NO∶10的资料(ⅰ)序列特征(A)长度133氨基酸(B)类型氨基酸
(D)拓扑学线性(ⅱ)分子类型蛋白质(xi)序列描述SEQ ID NO∶10 (2)SEQ ID NO∶11的资料(ⅰ)序列特征(A)长度35氨基酸
(B)类型氨基酸(D)拓扑学线性(ⅱ)分子类型肽(xi)序列描述SEQ ID NO∶11 (2)SEQ ID NO∶12的资料(ⅰ)序列特征(A)长度126氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑学线性(ⅱ)分子类型蛋白质(xi)序列描述SEQ ID NO∶12
权利要求
1.有下列通式的融合蛋白质A-B-C其中A是大体积亲水肽，B是选择性裂解位点，C是所需的疏水多肽、蛋白质或肽。
2.根据权利要求1的融合蛋白质，其中大体积亲水肽具有下列通式的肽序列(NANP)x其中x是10-40，较好是19。
3.根据权利要求1或2的融合蛋白质，其中选择性裂解位点是化学裂解位点，较好是被溴化氰特异性裂解的该位点的蛋氨酸残基。
4.根据权利要求1-3的融合蛋白质，其中所需的疏水多肽、蛋白质或肽是b-淀粉状蛋白肽或在35位上具有亮氨酸、丝氨酸、谷氨酰胺或谷氨酸而不是蛋氨酸或蛋氨酸亚砜残基的b-淀粉状蛋白肽的点突变体。
5.根据权利要求1-3的融合蛋白质，其中所需的疏水多肽、蛋白质或肽是1-35 HIV-1肽。
6.对权利要求1-5中任何一项的融合蛋白质编码的基因。
7.根据权利要求6的基因其中可被操纵地连接到表达控制序列上的表达载体。
8.用根据权利要求7的表达载体转化的细菌。
9.权利要求8的细菌是大肠杆菌。
10.制备和纯化所需疏水多肽、蛋白质或肽的方法，该方法包括下列步骤(a)使含有根据权利要求1-5中任一项之融合蛋白质的水溶液通过疏水基质柱，(b)用含有裂解试剂或酶的溶液冲洗柱，并(c)用水混溶性溶剂除去所得到的所需疏水多肽、蛋白质或肽。
11.根据权利要求10的方法，其中疏水基质柱是十八基结合的硅胶微颗粒柱。
12.根据权利要求10或11的方法，其中裂解试剂是溴化氰。
13.生产作为均质肽的单体b-淀粉状蛋白肽的方法，该方法包括下列步骤(a)使含有根据权利要求4的融合蛋白质的溶液通过疏水基质柱，(b)用含有裂解试剂或酶的溶液冲洗柱，(c)用水混溶性溶剂洗脱得到单体b-淀粉状蛋白肽，并(d)用蒸馏水稀释单体b-淀粉状蛋白肽，然后冻干，以及(e)必要时，在冻干后将单体b-淀粉状蛋白肽纯化达到最大均质性。
14.根据权利要求13的方法，其中疏水基质柱是十八基结合的硅胶微颗粒柱。
15.根据权利要求13或14的方法，其中裂解试剂是溴化氰。
16.均一的单体b-淀粉状蛋白肽。
17.根据权利要求16的单体b-淀粉状蛋白肽在35位上具有亮氨酸(Seq ID NO3)、丝氨酸(Seq ID NO4)、谷氨酰胺、(Seq ID NO5)或谷氨酸残基(Seq ID NO6)而不是蛋氨酸或蛋氨酸亚砜残基。
18.根据权利要求10-12的方法，其中所需的疏水多肽、蛋白质或肽是1-35 HIV-1肽。
19.用于生产和纯化所需的疏水多肽、蛋白质或肽。
20.根据权利要求16和17的单体b-淀粉状蛋白肽。
21.根据权利要求1-5的融合蛋白质用于生产和纯化所需的疏水多肽、蛋白质或肽。
22.根据权利要求16和17的单体b-淀粉状蛋白肽用于筛选早老性痴呆药物。
全文摘要
本发明提供了适用于生产和纯化疏化多肽、蛋白质或肽的方法。本发明进一步提供了用于生产和纯化疏水多肽、蛋白质或肽的融合蛋白质。此外，本发明还提供了均一的单体b-淀粉状蛋白肽和使用所说的单体b-淀粉状蛋白肽筛选淀粉状蛋白毒性抑制药物的试验。
文档编号C07K19/00GK1098416SQ94108110
公开日1995年2月8日 申请日期1994年7月4日 优先权日1993年7月6日
发明者H·德贝利, N·德雷格, G·H·特罗特曼, P·雅各, D·施图伯 申请人:霍夫曼-拉罗奇有限公司